Work in S.M.'s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).

Yetişkin Fare Beyninden nöroküreleri 1. İzolasyonu <ol><li> izofluran aşırı dozda tarafından (yaklaşık 2 aylık) bir yetişkin fare Euthanize. Fare nefes durdu ve ölümden sonra hemen teşrih ettiğini tekrar kontrol edin. </li><li> makas kullanarak, kafatası açmak için bir orta hat kesi yapmak. beyin çıkarın. </li><li> Buz üzerinde 10 cm&#39;lik bir tabak içinde soğuk PBS beyin yerleştirin. Lateral ventrikül 48 SVZ&#39;unda elde etmek için tüm montaj diseksiyon yöntemi takip edin. </li><li> Bir 1.5 ml tüp içine yanal ventrikül yerleştirin PBS içinde% 0.05 tripsin-EDTA 500 uL ekleyin ve bir su banyosu içinde 37 ° C &#39;de 15 dakika süre ile boru inkübe edin. </li><li> 15 dakika sonra, durdurma ortamının 500 uL ekleyin ve hafifçe 20 pipetleyin - 1 ml ucu ile 30 kez. pipetleme sırasında hava kabarcıkları oluşturan kaçının. NOT: Bu adım, hücre hayatta kalması için kritik öneme sahiptir. </li><li> 8 dakika boyunca 500 x g&#39;de hücreleri dönerler. Süpernatantı atın 1 mL PBS ekleyin ve tekrar süspansiyon tyavaşça 1 ml ucu ile 5x pipetleme o hücreleri. </li><li> 8 dakika boyunca 500 x g&#39;de Spin. 1 ml ucu kullanılarak Süpernatant atılır ve bazal ortamın 1 ml. </li><li> (İsteğe bağlı) hücresel kalıntı gözlenirse, 70 um&#39;lik bir hücre süzgecinden-hücreleri geçer. </li><li> hemositometre ile hücrelerinin sayısını; Genel olarak, yaklaşık 30,000 - 60,000 hücre / SVZ elde edilir. </li><li> % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de MGK orta ve kültür 10 mL, 10 cm tabak içine bir SVZ&#39;unda hücreleri Plate. </li><li> Küreler 49 arasında füzyon önlemek için (isteğe bağlı),% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de MGK orta ve kültür 1.5 mL ile doldurulmuş olan bir ultra-düşük-bağlayıcı 6-plaka tek bir bölmesinde 1.000 hücreleri koydu. Not: 5-7 gün sonra, Neurospheres (Şekil 2A) gözlenebilir. kültürleme süresi farenin yaşına veya genetik kökenli farklı olabilir. </li><li> kültürünü korumak için her 3-4 günde MGK orta 2 mL ekleyin(Mevcut ortamı çıkarmayın). </li></ol> Neurospheres ve Ciliogenesis Testleri Farklılaşma Kapasitesinin 2. Analiz <ol><li> farklılaşma kapasitesini analiz etmek için, farklılaşma ortamında yapışkan koşullar altında nöroküreleri analiz eder. </li><li> otoklavda veya kullanımdan önce UV&#39;ye maruz kalma ile 12 mm yuvarlak lamelleri sterilize edin. yapışkan bir hücre kültürü için, aseptik şartlar altında, bir 24-çukurlu plaka iyi bir steril 12 mm yuvarlak kapak cam koydu. </li><li> Kaplama% 0.002 poli-L-lisin (PLL) 500 uL 10 s için cam kapak. çözelti aspire ve 10-15 dakika süre ile kurutulur. </li><li> Laminin çözeltisi (5 ug / ml) 500 ul ilave edin. 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca cam kapak inkübe edin. </li><li> laminin aspire ve farklılaşma orta veya MGK ortamında (farklılaşmamış kontrol) 500 uL ekleyin. </li><li> mikroskop altında 200 uL ucu ile 200 um küre - farklılaşma deneyinde, bir 100 çekme. Eklemekfarklılaşma ortamında 7-10 gün için 24 plaka ve kültür her oyuğuna 5-10 Neurospheres. </li><li> , Farklılaşmamış nöroküreleri analiz MGK ortamda 1-2 gün için 24 plaka ve kültür, her sıra için 5-10 nöroküreleri ekleyin. Ekli Neurospheres yayılmış ve bir tek tabaka (Şekil 2B) gibi büyür. </li><li> dikkatle Ortamın çıkarılmasından sonra, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehit (PFA) ile hücrelerin düzeltmek ve daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika boyunca iki kez PBS ile yıkayın. plakası 1-2 ay için 4 ° C&#39;de saklanabilir. Not: (nöral kök / progenitör hücre işaretleme maddesi) Nestin karşı immun boyama gerçekleştirmek MGK orta nöral kök / progenitör hücreler ve farklılaşma ortamında farklılaşmış hücreleri görselleştirmek için, β-tübülin III (Tuj1 monoklonal nöronal markeri), GFAP (glial fibrilar asidik protein , astrosit markeri), ve O4 (oligodendrosit işaretleme maddesi) (Şekil 2B-D). (Arl13b karşı birincil ci immun boyama gerçekleştirmek, kirpikler analiz etmeklia işaretleme maddesi) ve Gpr161 (siliyer GPCR) (Şekil 3). </li><li> Bir slayt camına montaj çözümü ile kapak camı monte edin. fazla çözeltiyi almak için slayt cam yatırın. </li></ol> Neurospheres içinde Ciliogenesis 3. Analiz <ol><li> immün bozulmamış neurospheres hücreleri analiz etmek için, kültür ortamının transferi 1 mL 1.5 ml tüp birden Neurospheres içeren ve 8 dakika boyunca 500 x g&#39;de aşağı doğru döndürün. 15 dakika boyunca ortam çıkarıldıktan sonra% 4 (PFA) ile küreler düzeltmek ve PBS ile yıkayın. , 8 dakika boyunca 500 x g&#39;de Küreler Spin süpernatant kaldırmak ve 4 ° C&#39;de% 30 sukroz ile küreler O / N inkübe edin. </li><li> 1 ml ucu kullanılarak Süpernatant atılır ve bir kesim 1 ml ucu oct kullanmanın çözeltisinin 500 uL ekleyin. Ekim viskoz olduğu gibi, açma genişletmek için uç kenarını kesin. </li><li> bir tek kullanımlık plastik dondurma kalıp (10 mm x 10 mm x 5 mm) içine Neurospheres içeren Ekim çözeltisini. </li><li> m Freezeen az 15 dakika boyunca kuru buz üzerinde eski. </li><li> (İsteğe bağlı) deney durdurun ve 1 yıla kadar bir -80 ° C dondurucu içinde kalıp saklayın. </li><li> Bir kriyostat ile bölümleri kesme; bölümlerin kalınlığının 15-30 um olmalıdır. </li><li> Bir neurosphere birincil kirpikler görselleştirmek için, Arl13b karşı immun boyama (Şekil 4) gerçekleştirir. </li></ol> 4. Kültür ve nöroküreleri ve Yapışık NSC&#39;lerde Passage <ol><li> Geçiş Neurospheres küre boyutu 100-200 um arasında iken; Neurospheres (300 mm veya üzeri) çok büyük olduğu zaman, bunlar deneyler için ideal değildir. </li><li> 1 ml ucunu kullanarak bir 50 ml tüp içine nöroküreleri aktarın ve 8 dakika boyunca 500 x g&#39;de aşağı doğru döndürün. </li><li> Bir aspiratör kullanılarak Süpernatant atılır, PBS içinde% 0.05 tripsin-EDTA 500 uL ekleyin ve 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edilir. Tripsin miktarı, küre sayısına bağlı olarak değişmektedir. </li><li> yavaşça serum ortamına ve boru 500 mcL1 ml ucu t 20 kez. </li><li> 8 dakika boyunca 500 x g&#39;de Spin. 1 ml ucu kullanılarak Süpernatant atılır ve bazal ortamın 1 ml. </li><li> (İsteğe bağlı) hücresel döküntü veya çözünmemiş Neurospheres görülürse, 70 um&#39;lik bir hücre süzgecinden-hücreleri geçer. </li><li> Geçiş MGK ortamı içinde 10,000 hücre / cm2&#39;lik bir yoğunlukta bir 10 cm&#39;lik bir tabakta hücreleri; Hücreler bir hafta sonra bir sonraki geçişi için hazır olacaktır. </li><li> (İsteğe bağlı) 500.000 ila 1.000.000 hücre / ml süspansiyon elde etmek üzere orta dondurma ekleyin hücreleri dondurmak için. Kriyo-dondurma kaplar kullanılarak hücreler dondurma; ayrışmamış nöroküreler da dondurulabilir. </li><li> Yapışkan kültür için, 50,000 hücre / PLL- ve üzerine cm2 hücreleri dillute 1-2 gün MGK orta lamelleri ve kültür laminin kaplı. </li></ol> 5. Açlık ve kirpikler analizi <ol><li> Starvasyon ortamını (Tablo 1) hazırlayın. </li><li> 1-2 gün, ilk pl sonraayrışma, diğer bir yerde oyuk (kontrol) ve starvasyon ortamlarında MGK ortamına, değişim de (deney) sonra, uçucu hücrelerin ating. </li><li> Kültür 24 saat yapışık hücreleri. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS içinde% 4 PFA hücreleri saptamak ve oda sıcaklığında her biri 5 dakika için PBS ile iki kez yıkanır. </li><li> (İsteğe bağlı) deney durdurun ve 1-2 ay için 4 ° C&#39;de PBS içinde lamelleri ile 24 oyuklu plakalar saklayın. </li><li> 7, 50 boyanması için bir immüno-floresan protokolü gerçekleştirin. </li><li> Montaj çözümü kullanarak lamelleri monte edin. karanlıkta, oda sıcaklığında sürgü cam O / N kurutun. </li><li> Gerekli büyütmede bir bileşik mikroskop görüntüleri elde edin. eşlik yazılımı kullanılarak kontrol edilen bir mikroskop, kamera ve amaçları (40X / 1.3 yağ ve 63X / 1.4 yağ) kullanın. 0.5-0.8 um aralıklarla (Şekil 5) yeterli z bölümleri al. </li><li> siliyer lokalizasyonu kantitatif analizinde içinyapışkan hücreler, DAPI kanalı içine bakarak birleşik hücreler ile 3-8 ardışık alanlardan görüntülerin yığınlarını edinirler. ImageJ / Fiji kullanılarak primer kirpikler sayısını ölçmek. Tipik olarak,&gt; ImageJ Eklentileri &quot;Hücre sayacı&quot; aracını kullanın GPCR pozitif kirpik bulunan hücreleri saymak için iletişim kutusunu analiz; görüntülerin yığınları gelen maksimum çıkıntılar sayımı ve dışa amacıyla aynı deneyden tüm görüntüler için ImageJ / Fiji.Use benzer görüntü yeğinliğinin doğruluğu ve kontrast parametrelerinden de ihraç edilebilir. </li></ol> Neurospheres 6. transfeksiyonu <ol><li> Uyun, 24 saat süreyle kapak slipleri hücreleri ayrışmış. 24 kuyucuklu bir plakanın tek bir bölmesinde 500 uL MGK ortam içinde tipik olarak 75,000 ila 150,000 hücre bir hücre yoğunluğuna kullanın. </li><li> 5 saniye boyunca burgaç halinde bir 0.5 mL mikrotüp düşük serum ortamına 25 uL ve transfeksiyon reaktifi 1.5 uL karıştırın. </li><li> Ayrı bir 0.5 mL microtub endotoksin içermeyen plazmid DNA&#39;nın 2.5 ug eklemedüşük serum ortamında 25 uL içeren ve 5 saniye girdap oluşturarak karıştırın örn. </li><li> İkinci mikrotüp içeren DNA transfeksiyon reaktifi 1 uL ekleyin ve 5 saniye boyunca burgaç halinde karıştırın. </li><li> İlk mikrotüp DNA içeren tüp karışımı ekleyin ve pipetleme karıştırın. </li><li> Oda sıcaklığında 10-15 dakika inkübe karışımı. İnkübasyondan sonra, yavaşça MGK orta en (500 uL / ​​oyuk) ile ilgili oyuklara transfeksiyon karışımı, damla damla ilave edilir. </li><li> ortamı (NSC ortamı) ya da starvasyon ortamını (500 uL / ​​oyuk) kontrol etmek için ortam 24 saat sonra transfeksiyon değiştirin. </li><li> 24 saat sonra% 4 PFA orta değiştirerek hücreleri saptamak ve immun boyama yapmak; tipik olarak,% 10 transfeksiyon verimliliği kadar bu protokolü kullanılarak elde edilir. </li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

Burada, üretmek ve yetişkin fare SVZ&#39;unda gelen neurosphere kültürleri korumak için bir yöntem açıklanmaktadır. aşağıdaki gibi kültürleri ile ilgili birkaç uygun noktalardır. 200 um - İlk olarak, kürelerin büyüklükleri tipik olarak 50 arasındadır. Bir neurosphere çapı daha büyük 300&#39;den um alır Deneyimlerimize göre,, geçiş için en uygun zaman cevapsız edilmiştir. Bu daha büyük küre çekirdek ölü hücreleri ihtiva etmektedir. Neurospheres yaygın sinir kök / progenitör hü...

Birincil kirpik bir mikrotübül tabanlı dinamik hücre içi bölümü olduğu bir embriyonik nöronal gelişim 1, 2 boyunca sonik kirpi (Shh) yolu da dahil olmak üzere, hücresel sinyal yollarını, koordine duyusal anten ve yetişkin nöronal fonksiyon 3 bölmeli hücre içi sinyal, 4 olarak işlev . Örneğin 5 Patched Shh reseptörü gibi, bu yolların, bileşenleri sinyal; yol aktivatör Smoothened (SMO) 6; ve Gpr161 7, negatif Shh yolu düzenler yetim G-protein kenetli reseptör (GPCR), dinamik bir tarzda cilia lokalize. Çoklu GPCR&#39;ler, 10 beyin 7, 8, 9, nöronlarda kirpikler lokalize bildirilmiştir </sup&gt;, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Kirpikler ve kirpikler tarafından oluşturulan sinyal geçiş yollarında bazı kusurların çoklu dokuları etkiler ve birlikte ciliopathies 17, 18, 19 olarak bilinir. Ciliopathy hastalık spektrumu sıklıkla kraniofasial anormallikler 20, 21, 22 olarak nöro kusurları içerir. Buna ek olarak, hipotalamus nöronları birincil kirpikler merkezi tokluk yolları düzenler ve kusurları gibi Bardet Biedel sendromu 24 olarak sendrom ciliopathies şişmanlığın yansıtma, merkezi şişmanlık 23 ile sonuçlanır. Buna ek olarak, kirpikler sinyalleşme, nöropeptit alıcı centr düzenlerark tokluk 14, 11 geçiş yolu. Bu tür hipokampal nöronlar somatostatin reseptör 3 olarak adenilat siklaz III (ACIII) ve GPCR&#39;lerin Siliyer lokalizasyonu yeni nesne tanıma kusurları ve 25, 26 hafıza noksanlıkları neden olur ve siliyer bütünlüğü 27 bir zamanda gelişmiştir. kirpikler tarafından oluşturulan sinyal gelişimsel açıdan yakın bir doku homeostazında bağlanırlar; Özellikle, sil serebellum 28, 29 granül progenitörlerinden kaynaklanan Shh alt tip medulloblastoma ilerlemesi için önemlidir. Böylece, birincil kirpikler embriyonik, postnatal ve erişkin nöronal gelişim ve işlevi sırasında önemli roller oynarlar. Nöral kök hücreler (NSC&#39;lerde) subventriküler bölgede lateral ventrikül (SVZ), hipokampusun dentat girus subgranuler kısmında ve ikametmemelilerde 30, 31, 32&#39;de hipotalamusta üçüncü ventrikül ventriküler bölgesi. NSC&#39;lerde multipotent olan kendini yenileme kapasitesini sahiptir ve beyin gelişimi ve rejeneratif tıpta 30 için önemlidir. SVZ&#39;una en NSC&#39;lerde hareketsiz olan ve, birçok durumda, yan karıncık 33 dışarı uzanan bir tek birinci cilium sahiptirler. Özellikle Shh, TGFp, ve reseptör tirozin kinaz yollarında 2, 34, 35, 36 ile ilgili olarak, alt-hücresel tepkiler oluşturmada farklı reseptörlerinin lokalizasyonu, yoluyla birincil kirpik sinyaller. Birincil kirpikler yanal ventrikil içine uzanan yana, birincil kirpikler beyin-omurilik sıvısı (CSF) NSCs 37 aktif hale getirmek için sitokinleri tespit olduğu hipotezi </s&gt; Yukarı. Son çalışmalar, Shh sinyal yolu ve birinci kirpikler koku epiteli, akciğer ve böbrek 38, 39, 40, 41 dahil olmak üzere birçok dokuda, tamir kök hücrelerin aktivasyonu ve rejenerasyonu için önemli olduğunu düşündürmektedir. Bununla birlikte, CSF mekanizma NSC&#39;lerde ile iletişim kurar ve ana kirpikler olup bilinmemektedir katılmaktadırlar. kültür içinde yapışık NSC&#39;lerde kirpikli edilir; Bu tür siliyalarda Smo&#39;nun ve Gpr161 olarak Shh yolu bileşenlerinin, lokalize; ve 42 tepkili Sus bulunmaktadır. Bu nedenle, NSC&#39;lerde bir Shh yolu incelemek için önemli model sistemi, siliyer ticareti ve nöronal farklılaşma yol olarak hizmet edebilir. Buna ek olarak, NSC&#39;lerde ayırt nöronları da siliyer trafik deneyleri için de kullanılabilir. Neurospheres neura çoğalması kaynaklanan serbest yüzen hücre kümeleri oluşturulurspesifik büyüme faktörleri ve yapışkan olmayan yüzeylerin 43, 44 varlığında büyüme l kök / progenitör hücreler. Neurospheres normal gelişimi ve hastalığın 31, 45, 46, 47 nöral kök / progenitör hücreleri incelemek için in vitro kültür modellerinde önemli vermektedir. Burada, nöral kök / progenitör hücrelerin kültürlenmesi için ve sinir / glia içine farklılaşması için bir neurosphere bazlı analiz tarif eder. Özellikle nöral kök / progenitör hücreler ve farklılaşmış nöronların (Şekil 1) tüycüklere bileşenleri sinyal kaçakçılığı vurgulamaktadır. birincil nöronları kültür aksine, birinci Neurospheres, kültür nispeten kolay birden fazla geçit için uygun olan ve donma-erime döngüleri ve sinir / glia farklılaşmayı geçirebilmektedir. Daha da önemlisi, bu neurosphere türetilmiş nöral tespitkök / progenitör hücreleri ve farklılaşmış nöronların kültür içinde kirpikli ve bu bölmelerin siliyer fonksiyonu ile ilgili sinyal molekülleri yerini belirleyen. Neurosphere tabanlı kültürleme metotları NSC&#39;lerde ve farklılaşmış nöronların ciliogenesis ve siliyer kaçakçılığı çalışmak için ideal bir model sistem olarak hizmet edebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm round cover glass</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-545-80&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95 mm X 15 mm petri dish, slippable lid</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875714G</td>
			<td>10 cm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-545-152</td>
			<td>Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arl13B, Clone N295B/66</td>
			<td>Neuromab</td>
			<td>AB_11000053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504001</td>
			<td>B27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>ST 40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancrease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td>Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Vinyl Specimen Molds</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>4565</td>
			<td>10 mm X 10 mm X 5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10&#215;, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1408-500ML</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G solution</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>mounting solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21127</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21137</td>
			<td>Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gpr161</td>
			<td>home made</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td>FGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>0.100 mm deep</td>
			<td>improved neubauer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>NDC 11695-0500-2</td>
			<td>Isofluorane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Laminin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200mM)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Nalgene&#160;</td>
			<td>5100-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17502001</td>
			<td>N2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT compound</td>
			<td>Sakura Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td>OCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF protein, CF</td>
			<td>R and D systems</td>
			<td>236-EG-200</td>
			<td>EGF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>14060-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution (10X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4174-100</td>
			<td>Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COSTAR 6 Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td>ultra-low binding 6 well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-tubulin III</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td>TUJ1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using primary neurosphere cultures to study primary cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

Bir hafta MGK ortamında SVZ&#39;unda hücreleri kaplama sonra, yüzer Neurospheres (Şekil 2A) gözlenmiştir. kürelerin büyüklükleri 50 ila 200 um arasında değişmektedir. Küreler nöral kök / progenitör hücreler elde edilmiştir olmadığını belirlemek için Neurospheres PLL- ve üzerine plakalanmıştır 2 gün MGK orta lamelleri laminin kaplı. Daha sonra nöral kök / progenitör hücre işaretleyici, Nestin karşı boyama yapıldı. İki gün küreler ...

Watch this Scientific Journal Video about Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia at JoVE.com

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Birincil kirpik nöral projenitör hücre proliferasyonu, nöronal farklılaşma ve yetişkin nöronal fonksiyon temelde önemlidir. Burada, ciliogenesis ve primer neurosphere kültürleri kullanılarak nöral kök / progenitör hücreler ve farklılaşmış nöronların cilia proteinlerin sinyal kaçakçılığı incelemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

İlköğretim Cilia Eğitim için birincil Neurosphere Kültür Kullanımının

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

using-primary-neurosphere-cultures-to-study-primary-cilia

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.3K Görüntüleme.  University of Texas Southwestern Medical Center.  Birincil kirpik nöral projenitör hücre proliferasyonu, nöronal farklılaşma ve yetişkin nöronal fonksiyon temelde önemlidir. Burada, ciliogenesis ve primer neurosphere kültürleri kullanılarak nöral kök / progenitör hücreler ve farklılaşmış nöronların cilia proteinlerin sinyal kaçakçılığı incelemek için bir yöntem açıklanmaktadır. 

Video: Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and Schwann cells in the peripheral nervous system (PNS). We use an in vitro myelination assay, an established model for studying CNS myelination in vitro. To do this, oligodendrocyte precursor cells (OPCs) are added to the purified primary rodent dorsal root ganglion (DRG) neurons to form myelinating co-cultures. In order to specifically interrogate the roles that particular proteins expressed by oligodendrocytes exert upon myelination we have developed protocols that selectively transduce OPCs using the lentivirus overexpressing wild type, constitutively active or dominant negative proteins before being seeded onto the DRG neurons. This allows us to specifically interrogate the roles of these oligodendroglial proteins in regulating myelination. The protocols can also be applied in the study of other cell types, thus providing an approach that allows selective manipulation of proteins expressed by a desired cell type, such as oligodendrocytes for the targeted study of signaling and compensation mechanisms. In conclusion, combining the in vitro myelination assay with lentiviral infected OPCs provides a strategic tool for the analysis of molecular mechanisms involved in myelination.

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.

Üretim ve seçici transduce İlköğretim Oligodendrosit Öncü Hücreler için Lentivirüste kullanımı için<em&gt; İn Vitro</em&gt; Myelinasyon Tahliller

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Gelişim Biyolojisi

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop within the uterus. A newly developed ex vivo upright droplet culture method provides an attractive alternative to studies performed in utero. The ex vivo droplet culture provides the ability to examine and manipulate cellular interactions and diverse signaling pathways through use of various blocking and activating compounds; additionally, the effects of various pharmacological reagents on the development of specific organs can be studied without unwanted side effects of systemic drug delivery in utero. As compared to other in vitro systems, the droplet culture not only allows for the ability to study three-dimensional morphogenesis and cell-cell interactions, which cannot be reproduced in mammalian cell lines, but also requires significantly less reagents than other ex vivo and in vitro protocols. This paper demonstrates proper mouse fetal organ dissection and upright droplet culture techniques, followed by whole organ immunofluorescence to demonstrate the effectiveness of the method. The ex vivo droplet culture method allows the formation of organ architecture comparable to what is observed in vivo and can be utilized to study otherwise difficult-to-study processes due to embryonic lethality in in vivo models. As a model application system, a small-molecule inhibitor will be utilized to probe the role of vascularization in testicular morphogenesis. This ex vivo droplet culture method is expandable to other fetal organ systems, such as lung and potentially others, although each organ must be extensively studied to determine any organ-specific modifications to the protocol. This organ culture system provides flexibility in experimentation with fetal organs, and results obtained using this technique will help researchers gain insights into fetal development.

Using Ex Vivo Upright Droplet Cultures of Whole Fetal Organs to Study Developmental Processes during Mouse Organogenesis

The&#160;ex vivo&#160;upright droplet culture is an alternative to current&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo&#160;experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.

Kullanımı<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tüm Fetal Organları Dik Damlacık Kültürleri Fare Organogenesis sırasında Gelişim Süreçleri Eğitim için

Investigating organogenesis in utero is a technically challenging process in placental mammals due to inaccessibility of reagents to embryos that develop ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell lines. However, primary cell cultures usually have a finite life span and need to be frequently re-established. Fibroblasts are an easily accessible source of primary cells. Here, we discuss a simple and quick experimental procedure to establish primary fibroblast cultures from ears and tails of mice. The protocol can be used to establish primary fibroblast cultures from ears stored at RT for up to 10 days. When the protocol is carefully followed, contaminations are unlikely to occur despite the use of non-sterile tissue stored for extended time in some cases. Fibroblasts proliferate rapidly in culture and can be expanded to substantial numbers before undergoing replicative senescence.

We describe a simple and quick experimental procedure for generating primary fibroblasts from the ears and tails of mice. The procedure does not require special animal training and can be used for the generation of fibroblast cultures from ears stored at RT for up to 10 days.

Fare Kulak ve Kuyruk Dokular Yaratma İlköğretim Fibroblast Kültürleri

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density centrifugation, media gradient isolation and immunomagnetic purification. As observed in vivo, mononucleated villous cytotrophoblast cells in primary culture differentiate into multinucleated syncytiotrophoblast cells after 72 hr. Compared to normoxia (8% O2), villous cytotrophoblast cells that undergo hypoxia/reoxygenation (0.5% / 8% O2) undergo increased oxidative stress and intrinsic apoptosis, similar to that observed in vivo in pregnancy complications such as preeclampsia, preterm birth, and intrauterine growth restriction. In this context, primary villous trophoblasts cultured under hypoxia/reoxygenation conditions represent a unique experimental system to better understand the mechanisms and signalling pathways that are altered in human placenta and facilitate the search for effective drugs that protect against certain pregnancy disorders. Human villous trophoblasts produce melatonin and express its synthesizing enzymes and receptors. Melatonin has been suggested as a treatment for preeclampsia and intrauterine growth restriction because of its protective antioxidant effects. In the primary villous cytotrophoblast cell model described in this paper, melatonin has no effect on trophoblast cells in normoxic state but restores the redox balance of syncytiotrophoblast cells disrupted by hypoxia/reoxygenation. Thus, human villous trophoblast cells in primary culture are an excellent approach to study the mechanisms behind the protective effects of melatonin on placental function during hypoxia/reoxygenation.

This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.

İnsan İlköğretim Trofoblast Melatonin Karşı Hipoksi Koruyucu Etkilerinin Eğitim için Hücre Kültürü Modeli / reoksijenasyon kaynaklı bozulması

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells, represent a unique type of undifferentiated cells with promise in tissue engineering and for reprogramming into iPSC for future pediatric interventions and stem cell banking. The protocol presented here describes an optimized procedure for extracting and culturing primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells and generating episomal induced pluripotent stem cells from these cells in fully chemically defined culture conditions utilizing human recombinant vitronectin and the E8 medium. Characterization of the new lines by applying stringent methods &#8211; flow cytometry, confocal imaging, teratoma formation and transcriptional profiling &#8211; is also described. The newly generated lines express markers of embryonic stem cells &#8211; Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 &#8211; while being negative for the SSEA-1 marker. The stem cell lines form teratomas in scid-beige mice in 6-8 weeks and the teratomas contain tissues representative of all three germ layers. Transcriptional profiling of the lines by submitting global expression microarray data to a bioinformatic pluripotency assessment algorithm deemed all lines pluripotent and therefore, this approach is an attractive alternative to animal testing. The new iPSC lines can readily be used in downstream experiments involving the optimization of differentiation and tissue engineering.

This protocol describes the reprogramming of primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells into induced pluripotent stem cells using a non-integrating episomal approach in fully chemically defined conditions. Procedures of extraction, culture, reprogramming, and characterization of the resulting induced pluripotent stem cells by stringent methods are detailed.

Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in the elderly and end-stage renal disease (ESRD) patients, who commonly suffer from hyperphosphatemia and hypercalcemia. At present, there are no medication therapies that can stop its progression. The mechanisms that underlie this pathological process remain unclear. The aortic valve leaflet is composed of a thin layer of valve endothelial cells (VECs) on the outer surfaces of the aortic cusps, with valve interstitial cells (VICs) sandwiched between the VECs. The use of a rat model enables the in vitro study of ectopic calcification based on the in vivo physiopathological serum phosphate (Pi) and calcium (Ca) levels of patients who suffer from hyperphosphatemia and hypercalcemia. The described protocol details the isolation of a pure rat VIC population as shown by the expression of VIC markers: alpha-smooth muscle actin (&#945;-SMA) vimentin and tissue growth factor beta (TGF&#946;) 1 and 2, and the absence of cluster of differentiation (CD) 31, a VEC marker. By expanding these VICs, biochemical, genetic, and imaging studies can be performed to study and unravel the key mediators underpinning CAVD.

This protocol describes the isolation, culture, and calcification of rat-derived valve interstitial cells, a highly physiological in vitro model of calcific aortic valve disease (CAVD). Exploitation of this rat model facilitates CAVD research in exploring the cell and molecular mechanisms that underlie this complex pathological process.

Birincil fare malzemelerin yalıtım ve Vana interstisyel hücreleri: Aort Kapak kalsifikasyon eğitim için yeni bir Model

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

Oluşturma ve birincil insan lenfositi yetişkin cilt, kültür

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to manipulate gene expression in organoids have made limited progress in this arena. While CRISPR/Cas9 technology allows for precise genome editing of cells for organoid generation, this strategy requires extensive selection and screening by sequence analysis, which is both time-consuming and costly. Here, we provide a detailed protocol for efficient viral transduction of intestinal organoids. This approach is rapid and highly efficient, thus decreasing the time and expense inherent in CRISPR/Cas9 technology. We also present a protocol to generate frozen sections from intact organoid cultures for further analysis with immunohistochemical or immunofluorescent staining, which can be used to confirm gene expression or silencing. After successful transduction of viral vectors for gene expression or silencing is achieved, intestinal stem cell and crypt function can be rapidly assessed. Although most organoid studies employ in vitro assays, organoids can also be delivered to mice for in vivo functional analyses. Moreover, our approaches are advantageous for predicting therapeutic responses to drugs because currently available therapies generally function by modulating gene expression or protein function rather than altering the genome.

We describe step-by-step instructions to: 1) efficiently engineer intestinal organoids using magnetic nanoparticles for lenti- or retroviral transduction, and, 2) generate frozen sections from engineered organoids. This approach provides a powerful tool to efficiently alter gene expression in organoids for investigation of downstream effects.

Primer fare bağırsak Organoidlerin genetik mühendisliği dondurulmuş bölümleme için Manyetik Nano madde dönüştürücü viral vektörler kullanma

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a hallmark of various pathophysiological conditions including tumor suppression, tissue remodeling and aging. The inducers of cellular senescence in vivo are still poorly characterized. However, a number of stimuli can be used to promote cellular senescence ex vivo. Among them, most common senescence-inducers are replicative exhaustion, ionizing and non-ionizing radiation, genotoxic drugs, oxidative stress, and demethylating and acetylating agents. Here, we will provide detailed instructions on how to use these stimuli to induce fibroblasts into senescence. This protocol can easily be adapted for different types of primary cells and cell lines, including cancer cells. We also describe different methods for the validation of senescence induction. In particular, we focus on measuring the activity of the lysosomal enzyme Senescence-Associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the rate of DNA synthesis using 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) incorporation assay, the levels of expression of the cell cycle inhibitors p16 and p21, and the expression and secretion of members of the Senescence-Associated Secretory Phenotype (SASP). Finally, we provide example results and discuss further applications of these protocols.

Here, we discuss a series of protocols for induction and validation of cellular senescence in cultured cells. We focus on different senescence-inducing stimuli and describe the quantification of common senescence-associated markers. We provide technical details using fibroblasts as a model, but the protocols can be adapted to various cellular models.

İndüksiyon ve birincil insan hücrelerinde hücresel yaşlanma doğrulama

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

İlköğretim Cilia Eğitim için birincil Neurosphere Kültür Kullanımının

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Üretim ve seçici transduce İlköğretim Oligodendrosit Öncü Hücreler için Lentivirüste kullanımı için

Kullanımı