1. Işleminden önce, hazırlamak ve aşağıdaki öğeleri toplamak <ol><li> Lütfen işlem sırasında fare dizginlemek için tahta bir platform oluşturmak için) Şekil 1a resme bakın) ve 1b. </li><li> Sindirim karışımı HBSS + 1.25mg/ml kollajenaz TypeIV veya 2.5 mg / ml kollajenaz D - lenf düğümleri </li><li> Akciğerler için Sindirim karışımı - HBSS + 1 mg / ml kollajenaz </li><li> LDLNs görselleştirmek için intraperitoneal PBS lateks boncuk (1:20) sulandırınız </li></ol> Not: LDLNs bulmak için küçük ve sert. Onları bulmak için öğrenmek için, fare içine kırmızı floresan lateks boncuk ip seyreltilmiş 01:20 200μl enjekte edilir. Periton bu LDLNs 8 akıtır. 24 HPI, yukarıda anlatıldığı gibi fare torasik kavite maruz kalmaktadır. LDLNs periton boşluğuna drene boncuk pembe görünür. <ol start="5"><li> Kırmızı Kan Hücresi (RBC) Lizis Tampon - 0.15m NH 4 Cl, 10mM KHCO 3, 1L dH 2 0 0.1 mM Na 2 EDTA. 7,2-7,4 pH ayarlama ve oda sıcaklığında saklayın. </li><li> 100μm 70μm veya hücre süzgecinden </li><li> Stok çözelti 0,5 M EDTA, pH = 8.0 </li><li> CaCl 2 ve MgCl 2 olmadan HBSS </li><li> Makas ve künt uçlu forseps </li><li> Larengoskop </li><li> Gavaj iğne (22 gauge) bir açıyla bükülmüş (Şekil 2) </li><li> Strafor yönetim kurulu ve fare yaymak için pimleri </li><li> En pan dengesi </li><li> Anilin Mavi Çözüm - H 2 O 10mg/ml </li></ol> Not: Biz bu enjeksiyon tekniği, bu gösteri için çözümünü kullanıyor olacak. 2. Fare anestezi hazırlanması ve yönetimi <ol><li> Son konsantrasyonları sırasıyla 2mg/ml ve 10mg/ml böylece steril PBS Xylazine ve Ketamin bir karışım hazırlayın. </li><li> En pan dengesi üzerinde fare tartılır. </li><li> Her fare için gerekli doz hesaplayın. Hazırlanan karışım uygun hacim kullanarak Xylazine (2-4 mg / kg) ve Ketamin (70-80 mg / kg) vücut ağırlığı dozu ve intaperitoneally enjekte. Her fare suşu anestezik optimizasyonu gerekebilir. Çok anestezi alan Fare inokulum Ciğerlere aşılandığı sonra ölümcül olabilir düşük bir solunum hızı olabilir. </li><li> 3-5 dakika sonra, anestezik etkileri için fare gözlemliyoruz. Fare tam anestezi olduğunu onaylamak için aşağıdaki belirtiler olup olmadığını kontrol edin: <ol><li> Solunum hızını yavaşlatmak gerekir. </li><li> Boyun tarafından yakalandı fare kol germek gerekir. </li><li> Arka bacaklarda uyarılır herhangi bir yanıt olmamalıdır. Bu kriterleri yerine getirilmemesi halinde, birkaç dakika bekleyin ve bir sonraki adıma geçmeden önce tekrar kontrol edin. </li></ol></li></ol> 3. Intratrakeal enjeksiyon <ol><li> Innoculum 50μl tuzlu su hazırlayın. Innoculum, steril bir bükülmüş gavaj iğne ile donatılmış bir 1ml şırınga doldurun. Şırınga sıvı akciğer aşılamış olduğu sağlamak için, innoculum arkasında bir 100μl hava cepli yüklenmiş olması gerekir. </li><li> Fare, tel üzerinde kesici dişler tarafından asılı açılı bir tahta platform üzerinde yerleştirin ve yavaşça kurdelenin bir parçasını bir yere dizginlemek. </li><li> Laringoskop sol elinizle açın (sağ elle) ve künt uçlu forseps, bir çift kapmak. Laringoskop ucu ve forseps, ağzı hafifçe açık gözetlemek için kullanın. </li><li> Forseps, dil çekin ve yan tutun. Ağız arkasına doğru laringoskop bıçak Kılavuzu. Laringoskop trakeanın açılması görene kadar 90 ° açıyla çok hafifçe basılı tutun. Laringoskop bir yerde tutun. Ağzından dil çekerek, herhangi bir doku zedelenmelerinde oluşur bu nedenle bu nazikçe yapılmalıdır zaman dikkat edilmelidir. </li><li> Iğne bend ön kesici dişler kadar diğer elinizle, sağ elleri ile bükülmüş gavaj iğne ile donatılmış innoculum içeren 1 ml şırınga, iğne ve trakea içine eklemek. Innoculum sunmak için eşit pistonu itin. Innoculum kabarcık olmamalı. Mümkün olan en kısa sürede iğne trakea dışarı çekin. Fare boğmak ve trakea, çok uzun süre bloke ise ölecektir. Innoculum Ciğerlere inhale izin vermek için birkaç saniye için fareyi dik tutun. </li><li> Platformun fare çıkarın ve bir ısıtma lambası yakın yerleştirin. Doğrudan ısı altında uzun süre farelere bırakmayın. Fare prosedürü (suşları dayalı iyileşme süresi değişebilir) sonra 30 dakika içinde tamamen uyanık olmalıdır. Fareler bu süre içinde özenle gözlenen ve çok sıcak veya çok soğuk almak için izin verilmemeli, bu da ölüme yol açan solunum sıkıntısı içine fareler koyabilirsiniz. </li></ol> 4. Hasat ve işleme flow sitometri Akciğer drenaj lenf düğümleri ve akciğerler<ol><li> AVMA ötenazi yönergelerine göre istediğiniz yöntemi kullanarak fareleri Kurban. Bu bireysel hasat sonuçları bağlı olarak değişebilir. Pentobarbital sodyum ölümcül bir İdaresi uygun bir ötenazi yöntemi bir örnektir. Biz CO 2 ötenazi negatif akciğer etkileri görmedim. </li><li> Diseksiyonu kurulu kollar ve bacaklar Pin. Makas ile ventral tarafında ortasında boyunca bir kesi olun. Cildi nazikçe çekin ve göğüs duvarındaki kasların maruz. </li><li> Torasik duvarı kasları ile karın içi organların maruz kesiler olun. </li><li> Forseps ve delinme diyafram ile sternum ucu tutun. Göğüs kafesinin iki yanında diyafram kesin. </li><li> Diseksiyon levha yüzeyine paralel makas, her iki tarafta dorso-ventral hattı boyunca göğüs boşluğu kesti. </li><li> Göğüs kafesinin hafifçe yukarı kaldırın. Timus altında, sadece, kalbin sağ tarafında iki lenf düğümleri için bakın. Biraz daha büyük üçüncü lenf nodu trakea dik çalışan küçük bir arteryel kan damarı altında yer almaktadır. Hasat lenf düğümleri, lenf nodu sindirim karışımı içine 1 ml. </li><li> Lenf düğümleri hasat sonra, forseps bir çift kalp tutun ve başka bir ile akciğerlere kapmak. 6 plaka buz PBS 3ml içine Hasat akciğerler. </li><li> , Akciğer lobları ayrı bir PBS aspirat ve loblar forseps ve makas kullanarak küçük parçalar halinde doğrayın. 3ml akciğerler için sindirim karışımı ekleyin. Bu adım sırasında buz üzerinde 6 plaka tutun. </li><li> 37 at, 30 dk 25-30 dk ve akciğerler, lenf düğümleri inkübe ° C. Buz üzerinde reaksiyon ve durdurmak için sindirim karışımların her 10mM nihai konsantrasyonu EDTA ekleyin. </li><li> 3ml bir şırınga kullanarak, bir 18GA iğne yoluyla akciğerlere parçaları 3 kez geçmek. Mash bir 1ml şırınga pistonu arka uç kullanarak 70-100μm hücre süzgeçler ile akciğerler ve LN parçaları. HBSS, 10ml hücre süzgeçler yıkayın olmadan Ca 2 + ve Mg 2 +. 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 5 ml eritrosit lizis tamponu pelletini tekrar ve oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin. Ca 2 olmadan HBSS, 10ml + ve Mg 2 + lizis gidermek için. 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de santrifüjleyin. Sırasıyla akciğer ve LDLN tek hücre süspansiyonları 10ml ve 5ml kadar getirin. Trypan mavisiyle boyama canlı hücreler kullanarak bir hemasitometre güvenin. Hücreler flow sitometri leke hazır. 1 akciğer lob flow sitometri için yeterli olabilir. Diğer loblar histoloji için sitokinler veya doku için homojenatlarında gibi aynı fare içindeki diğer deneysel sorular için kullanılabilir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Hemen enjeksiyonu takiben akciğerlerde en az gelişmiş ülkeler ve alveoler makrofaj akciğerlerde alveolar alanlarda antijen elde. Şekil 3 CD11c + (en az gelişmiş ülkelere ve alveoler makrofajlar ifade) yüzdesi floresan etiketli Bacillus anthracis sporları için pozitif hücreler, 30 dakika yazılan bu enjeksiyon gösterir. Bu zamanda, akciğer tek hücre süspansiyonu CD45 + CD11c + hücreler ~% 15.9, Bacillus anthracis sporları (Şekil 3, alt paneller) barındırmaktaydı . Akciğerlerde CD11c + hücreler daha fazla karakterizasyonu için, Kim ve Braciale 4 bakın. Floresan ile işaretlenmiş boncuk rutin LDLNs 9 partikül antijenlerin kaçakçılığı değerlendirmek için kullanılır. Akciğerlerden LDLNs taşıma değerlendirmek için, floresan lateks boncuk LPS ve LDLNs 24 HPI incelendi ile enjekte edildi. LDLNs CD11c hi hücrelerin yaklaşık% 4 24hpi (Şekil 4) floresan boncuk barındırmaktaydı. Bu temsilcisi deneyler, bu protokol verimli LDLNs akciğerler ve bunları daha sonra trafik inhale partikül antijenleri elde hücreleri izlemek için kullanılabilir olduğunu göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. ) Bu enjeksiyon sırasında fareler frenleyici Ahşap platform tahta blok bir açıyla kesilmiş ve metal çubuklar, önden görünüm Şekil 1a&#39;da takıldı) ve yan görünüm rakam 1b. Küçük bir tel parçası fare ön kesici dişler demirlemek için metal çubuğun etrafına sarılmış. Bir parça şerit, işlem sırasında bir yerde tutmak için fareyi etrafında kravat platforma bağlanmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2. Bu enjeksiyon için sonda iğne sonda bir iğne (sağ) bu enjeksiyon için ~ 135 ° (sol) bir açıyla bükülmüş. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3. Bacillus anthracis ifade enjekte GFP (Sterne-p6GFP), 5 saate yazılan meydan liman akciğerlerde CD11c + hücrelerinin yüzdesi. AJ fareler 1x ile mücadele5 saate yazılan enfeksiyonu 10 8 GFP-Bacillus anthracis sporları ve akciğerler incelendi. Nokta araziler CD11c&#39;nin yüzdesi + Bacillus anthracis için pozitif olan akciğer hücreleri. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Şekil 4. I. T enjeksiyonu takiben 24 saat drenaj lenf düğümleri, akciğer, floresan boncuk Algılama (sarı / yeşil) . AJ fareler ve LDLNs 24hpi incelendi 10μg LPS (sağ panel) ile PBS (sol panel) veya 5x10 9 Fluoresbrite YG Mikroküreler (0.5μm) ya verildi. Temsilcisi nokta araziler, liman floresan boncuklar boş bir kanal karşı çizilen LDLNs CD11c hi hücrelerinin yüzdesini gösteriyor .

<ol>
	<li>Grayson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+lung+dendritic+cell+maturation+and+migration+during+respiratory+viral+infection.">Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection.</a> J Immunol. 179, 1438-1438 (2007).</li><li>GeurtsvanKessel, C. H., Lambrecht, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+of+labor+between+dendritic+cell+subsets+of+the+lung.">Division of labor between dendritic cell subsets of the lung.</a> Mucosal Immunol. 1, 442-442 (2008).</li><li>Bar-Haim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrelationship+between+dendritic+cell+trafficking+and+Francisella+tularensis+dissemination+following+airway+infection.">Interrelationship between dendritic cell trafficking and Francisella tularensis dissemination following airway infection.</a> PLoS Pathog. 4, e1000211-e1000211 (2008).</li><li>Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+dendritic+cell+subsets+differ+in+their+capacity+to+support+the+induction+of+virus-specific+cytotoxic+CD8++T+cell+responses.">Respiratory dendritic cell subsets differ in their capacity to support the induction of virus-specific cytotoxic CD8+ T cell responses.</a> PLoS One. 4, e4204-e4204 (2009).</li><li>Bakocevic, N., Worbs, T., Davalos-Misslitz, A., Forster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-dendritic+cell+interaction+dynamics+during+the+induction+of+respiratory+tolerance+and+immunity.">T cell-dendritic cell interaction dynamics during the induction of respiratory tolerance and immunity.</a> J Immunol. 184, 1317-1317 (2010).</li><li>Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+particle+size+on+the+pathology+and+efficacy+of+vaccination+in+a+murine+model+of+inhalational+anthrax.">Influence of particle size on the pathology and efficacy of vaccination in a murine model of inhalational anthrax.</a> J Med Microbiol. , (2010).</li><li>Kiyono, H., Fukuyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NALT-+versus+Peyer's-patch-mediated+mucosal+immunity.">NALT- versus Peyer's-patch-mediated mucosal immunity.</a> Nat Rev Immunol. 4, 699-699 (2004).</li><li>Parungo, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+drainage+of+the+peritoneal+space:+a+pattern+dependent+on+bowel+lymphatics.">Lymphatic drainage of the peritoneal space: a pattern dependent on bowel lymphatics.</a> Ann Surg Oncol. 14, 286-286 (2007).</li><li>Jakubzick, C., Helft, J., Kaplan, T. J., Randolph, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+methods+to+study+pulmonary+dendritic+cell+migration+reveals+distinct+capacities+of+DC+subsets+to+acquire+soluble+versus+particulate+antigen.">Optimization of methods to study pulmonary dendritic cell migration reveals distinct capacities of DC subsets to acquire soluble versus particulate antigen.</a> J Immunol Methods. 337, 121-121 (2008).</li><li>Higgins, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+levels+of+M-CSF+and+GM-CSF+influence+the+specific+generation+of+macrophage+populations+during+infection+with+Mycobacterium+tuberculosis.">Relative levels of M-CSF and GM-CSF influence the specific generation of macrophage populations during infection with Mycobacterium tuberculosis.</a> J Immunol. 180, 4892-4892 (2008).</li><li>Kool, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alum+adjuvant+boosts+adaptive+immunity+by+inducing+uric+acid+and+activating+inflammatory+dendritic+cells.">Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells.</a> J Exp Med. 205, 869-869 (2008).</li><li>Costa, D. L., Lehmann, J. R., Harold, W. M., Drew, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transoral+tracheal+intubation+of+rodents+using+a+fiberoptic+laryngoscope.">Transoral tracheal intubation of rodents using a fiberoptic laryngoscope.</a> Lab Anim Sci. 36, 256-256 (1986).</li><li>Takahashi, S., Patrick, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+lymphatic+drainage+to+individual+thoracic+and+cervical+lymph+nodes+in+the+rat.">Patterns of lymphatic drainage to individual thoracic and cervical lymph nodes in the rat.</a> Lab Anim. 21, 31-31 (1987).</li><li>Broeck, W. V. a. n. d. e. n., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes:+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB/cAnNCrl+mice.">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-12 (2006).</li></ol>

Bacillus anthracis sporları akciğerlerden LDLNs ticareti incelemek için bu protokol kullanılmaktadır. Benzer uygulamalar için, akciğerlere teslim parçacıkların sayısını dikkatli bir şekilde enjekte edilen malzeme akış sitometri LDLNs tespit edilebilir, böylece seçilmiş olmalıdır. Biz de başarıyla hücreleri ve floresan etiketli antikorlar kullanarak belirli bir akciğer hücre popülasyonlarının etiketleme evlatlık transferi için bu yöntemi kullanmıştır. Ayrıca, bu yöntem rutin ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> 70μm Hücre stariner </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anilin Mavi </td><td> Balıkçı </td><td> A967-25 </td><td></td></tr><tr><td> Hayvan Besleme iğne </td><td> Popper ve Sons Inc. </td><td> 7920 </td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz </td><td> Sigma </td><td> C2139 </td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz TypeIV </td><td> Worthington </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz D </td><td> Roche </td><td> 11088974103 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite YG Mikroküreler (0.5μm) </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 17152 </td><td></td></tr><tr><td> Kalsiyum klorür ve magnezyum klorür olmadan HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamin HCl (100mg/ml) </td><td> Hospira Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laringoskop Blade </td><td> PennCentury, Inc. </td><td> Model LS-1 için </td><td> Bakın <a href="http://www.penncentury.com">www.penncentury.com</a> </td></tr><tr><td> Hafif Fiber Optik Laringoskop </td><td> WelchAllyn </td><td> 80814 </td><td></td></tr><tr><td> Kırmızı Floresan Boncuk (0.5μm) </td><td> Invitrogen </td><td> F8812 </td><td> Ip enjeksiyon için </td></tr><tr><td> Xylazine (100mg/ml) </td><td> Lloyd Laboratuvarları </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry

, Alveoler makrofaj ve akciğer dendritik hücreler (LDC) olarak fagositik hücrelerin sürekli olarak akciğerlerde alveoler boşluklar antijenleri örnek. En az gelişmiş ülkelere, özellikle de akciğer drenaj lenf düğümleri (LDLNs) T hücreleri başlatılması için uygun bir immün yanıt immünojenleri 1,2 çeşitli inhale antijenlere mevcut. Göç etmek bilinmektedir Farelerde akciğer ve havadaki antijenleri arasındaki etkileşimler modeli, antijenler intratrakeal 5 veya aerosoller 6 olarak, intranazal 1,3,4 idare edilebilir. Her güzergah tarafından teslim ayrı teknik beceri ve bir deney tasarımı önce dikkate alınması gereken kısıtlamalar içerir. Örneğin akciğerlerin ve üst solunum yolu, burun içi ve aerosol maruz antijenleri sağlar. Dolayısıyla antijenler potansiyel sonuçların yorumlanması komplike, burun ilişkili lenfoid doku (NALT) 7 erişebilirsiniz. Buna ek olarak, yutkunma, hapşırma ve farenin solunum oranı da teslim edilen dozlar tutarsızlıklara yol açabilir. Üst solunum yolu tutulumu bazı çalışmalar için tercih edilebilir olsa da, özellikle akciğerlerde başlatılan olaylara odaklanan deneyler karmaşık hale getirebilir. Bu ortamda, doğrudan ciğerlerine test materyalleri sunar ve NALT atlar intratrakeal () yol tercih edilir. Birçok bu enjeksiyon protokolleri oral kavite veya akciğerlere erişmek için trakea cerrahi maruz kalma yoluyla trakea ya kör entübasyon içerir. Burada, biz bu instilasyon için basit, tutarlı, cerrahi olmayan bir yöntem açıklanmaktadır. Trakeanın açılması bir laringoskop kullanılarak görüntülendi ve kıvrık bir sonda iğne sonra innoculum teslim trakea doğrudan eklenir. Ayrıca, hasat ve LDLNs ve akciğerler, flow sitometri ile antijen ticareti analiz için işlenmesi için prosedürler açıklanmaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry at JoVE.com

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Biz anestezi farelerin trakea yoluyla ciğerlerine test malzemelerin cerrahi olmayan teslimat göstermektedir. Bu yöntem, bakteriyel ve viral patojenler, sitokinler, antikorlar, boncuk, kimyasallar, ya da boyalar akciğer maruz izin verir. Daha hasat ve flow sitometri akciğer ve akciğer drenaj lenf düğümleri (LDLNs) işlenmesi açıklanmaktadır.

Akış Sitometri Akciğerler ve Akciğer Boşaltma lenf düğümleri Analizi fareler cerrahi olmayan intratrakeal damlatma

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

non-surgical-intratracheal-instillation-mice-with-analysis-lungs-lung

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

57.0K Görüntüleme.  University of Colorado School of Medicine. Biz anestezi farelerin trakea yoluyla ciğerlerine test malzemelerin cerrahi olmayan teslimat göstermektedir. Bu yöntem, bakteriyel ve viral patojenler, sitokinler, antikorlar, boncuk, kimyasallar, ya da boyalar akciğer maruz izin verir. Daha hasat ve flow sitometri akciğer ve akciğer drenaj lenf düğümleri (LDLNs) işlenmesi açıklanmaktadır.

Video: Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Etkileşimi incelenmesi<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Akım Sitometri ve Time Lapse Mikroskopi tarafından Nötrofiller ile

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with &lt;em&gt;Mycobacterium bovis&lt;/em&gt; Bacille Calmette-Gu&amp;#233;rin

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

ile Enfeksiyon sırasında boşaltılması Lenf düğümleri içine Fare Cilt Dendritik Hücre Göç Eğitim Bir KAKE tabanlı Testi<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Basil Calmette-Guerin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.

This article provides detailed methodology to identify and quantify functional T lymphocyte subsets present within murine kidney, aorta and lymph nodes by intracellular staining and flow cytometry. The model of angiotensin II induced hypertension was chosen to explain, step-by-step, the procedures and fundamental principles of flow cytometry and intracellular staining.

Hücre içi Boyama ve Sitometrisi Hipertansiyon Modelinde Fare Aort, Böbrek ve Lenf düğümleri içinde lenfosit alt tanımak

It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

Toplanması ve işlenmesi büyük hayvanlar lenf düğümlerinden RNA analizi için: büyük hayvan türlerinin lenf nodu Transcriptomic çalışmalar için hazırlanıyor

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

İnsan monosit alt kümeleri tam kan tarafından karakterizasyonu Akış Sitometresi Analizi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, thymic derived Treg (tTreg) cells and peripherally induced Treg (pTreg) cells. They are present in different organs of our body and can be distinguished by specific markers, such as Helios and Neuropilin 1. It has been reported that tTreg cells are functionally more suppressive than pTreg cells. Therefore, it is important to determine the proportion of both tTreg and pTreg cells when investigating heterogeneous cell populations. Herein, we collected thymic glands, pancreatic draining lymph nodes and spleens from normoglycemic non-obese diabetic mice to distinguish tTreg cells from pTreg cells using flow cytometry. We manually prepared single cell suspensions from these organs. Fluorochrome conjugated surface CD4, CD8, CD25, and Neuropilin 1 antibodies were used to stain the cells. They were kept in the fridge overnight. On the next day, the cells were stained with fluorochrome conjugated intracellular Foxp3 and Helios antibodies. These markers were used to characterize the two subsets of Treg cells. This protocol demonstrates a simple but practical way to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen and use them for subsequent flow cytometric analysis.

Herein, we present a protocol to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen to further study these cells using flow cytometry. In addition, this protocol was used for determining the subsets of regulatory T cells using flow cytometry.

Düzenleyici T hücre alt kümeleri içinde fare timus, lenf nodu ve dalak akışı sitometresi kullanarak drene pankreas belirlenmesi

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

A Model of Self-limited Acute Lung Injury by Unilateral Intra-bronchial Acid Instillation

Selective intra-bronchial instillation of hydrochloric acid (HCl) to the murine left mainstem bronchus causes acute tissue injury with histopathologic findings similar to human acute respiratory distress syndrome (ARDS). The resulting alveolar edema, alveolar-capillary barrier damage, and leukocyte infiltration predominantly affect the left lung, preserving the right lung as an uninjured control and allowing animals to survive. This model of self-limited acute lung injury enables investigation of tissue resolution mechanisms, such as macrophage efferocytosis of apoptotic neutrophils and restitution of alveolar-capillary barrier integrity. This model has helped identify important roles for resolution agonists, including specialized pro-resolving mediators (SPMs), providing a foundation for the development of new therapeutic approaches for patients with ARDS.

Selective intra-bronchial acid instillation to the left lung in mice results in unilateral and self-limited acute lung injury that models human acute respiratory distress syndrome (ARDS) induced by gastric acid aspiration.

Tek Taraflı Bronşiyal Asit İnstillasyonu ile Kendi Kendine Sınırlı Akut Akciğer Hasarı Modeli

Selective intra-bronchial instillation of hydrochloric acid (HCl) to the murine left mainstem bronchus causes acute tissue injury with histopathologic ...