Name: bronchoalveolar lavage of murine lungs to analyze inflammatory cell infiltration
Uploaded: 2017-05-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration at JoVE.com

LVH è un assistente di ricerca presso il Dipartimento di Biologia Molecolare Biomedica dell&#39;Università di Ghent. ERJ è supportato da UniVacFlu, codice di autorizzazione 607690. KR è supportato da EC-FP7 progetto FLUNIVAC.

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti in questo studio sono stati condotti secondo la legislazione nazionale (legge belga 14/08/1986 e 22/12/2003, decreto belga 06/04/2010) e legislazione europea (Direttive UE 2010/63 / UE e 86 / 609 / CEE). Tutti gli esperimenti sui topi e su tutti i protocolli animali sono stati approvati dal comitato etico dell&#39;Università di Ghent (numeri di autorizzazione LA1400091 e EC2016-027). 1. Preparazione <ol><li> Fluido lavaggio <ol><li> Preparare una soluzione salina equilibrata con 100 μM di acido etilendiammina-tetraecetico (EDTA). NOTA: Per misurare i livelli di proteine ​​nel fluido BAL, si raccomanda di aggiungere inibitori della proteasi per prevenire l&#39;attività proteasi nel fluido BAL. </li></ol></li><li> Catetere <ol><li> Realizzare un catetere inserendo un ago da 23 G in tubo di plastica trasparente in polietilene 21 G (diametro interno: 0,58 mm, diametro esterno: 0,965 mm e lunghezza: 0,5 cm). Possono essere utilizzati anche cateteri Premade. </li></ol></li><li> AnesthETICS <ol><li> Preparare un anestetico terminale, preferibilmente uno che provoca arresto respiratorio (ad esempio, un barbiturico come sodio pentobarbital (&gt; 100 mg / kg) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)). NOTA: Si raccomanda di utilizzare l&#39;anestesia iniettati invece di anestesia inalatoria, come anestesia inalato può avere un&#39;influenza sul contenuto BAL. CO 2, ad esempio, ha un&#39;influenza sul pH del sangue e conseguentemente sulla ridistribuzione di diversi composti 12. </li></ol></li><li> Ammonio-cloruro di potassio (ACK) tampone di lisi dei globuli rossi <ol><li> Preparare un tampone di lisi ACK sciogliendo 8.29 g di NH 4 Cl e 1 g di KHCO 3 in 1 L di H 2 O con 100 mM EDTA; tampone di lisi dei globuli rossi può anche essere acquistato da una fonte esterna. </li></ol></li></ol> 2. Esecuzione del lavaggio broncoalveolare (BAL) <ol><li> Introducendo il catetere nella trachea<ol><li> Eutanizzare il mouse mediante iniezione intraperitoneale di una dose letale di un anestetico a barbiturato a breve durata utilizzando un ago da 26 G. Per confermare l&#39;anestetizzazione letale appropriata, pizzicare la zampa posteriore del mouse con le pinze per controllare il riflesso del piede. </li><li> Posizionare l&#39;animale sulla schiena su una piastra chirurgica e fissare il mouse appiccando gli arti. </li><li> Spruzzare il 70% di etanolo sul collo per disinfettare. Fai un&#39;incisione nella pelle del collo vicino alla trachea usando un bisturi. </li><li> Aprire la pelle per esporre le ghiandole salivari. Separare le ghiandole salivari usando le pinze per esporre il muscolo sternohyoid. Incise il muscolo intorno alla trachea utilizzando le pinze per esporre la trachea. </li><li> Mettere un filo di cotone sotto la trachea utilizzando le pinze. </li><li> Scollegare attentamente il centro della trachea esposta tra due anelli di cartilagine con un ago da 26 G. Fare attenzione a non danneggiare la trachea. </li><li> Inserire il catetere di circa 0,5 cm nella trachea. Assicurarsi che la catheter non è inserito troppo in basso nella trachea, poiché ciò può portare a danni della struttura dei polmoni. </li><li> Stabilizzare il catetere legando la trachea intorno al catetere utilizzando il filo di cotone collocato nel passaggio 2.1.5. Se il catetere non è legata a sufficienza, la soluzione salina bilanciata iniettata può scorrere verso la parte superiore del tratto respiratorio anziché verso il basso nei polmoni. </li></ol></li><li> Raccogliere il liquido di lavaggio <ol><li> Caricare una siringa da 1 ml con 1 mL di soluzione salina bilanciata sterile con 100 pM EDTA. </li><li> Collegare la siringa da 1 ml al catetere e iniettare delicatamente la soluzione salina / EDTA nei polmoni. </li><li> Aspirare la soluzione delicatamente mentre massaggia il torace del mouse. Se il liquido aspirato non è visibile nella siringa, inserire con cautela il catetere un po &#39;più in basso o verso l&#39;alto la trachea. </li><li> Rimuovere la siringa dall&#39;ago e trasferire il liquido di lavaggio recuperato in una provetta da 15 ml posti su ghiaccio. Normalmente, 700-900 &amp;# 181; L di BAL viene recuperato da 1 mL di soluzione iniettata. </li><li> Ripetere i punti 2.2.1 - 2.2.4 altre due volte. NOTA: Se lo scopo è quello di analizzare il contenuto non cellulare, si consiglia di concentrare le campioni aggregati quando ci sono problemi con la sensibilità. </li></ol></li></ol> 3. Raccogliere le componenti cellulari e non cellulari del fluido BAL <ol><li> Centrifugare il liquido di lavaggio per 7 minuti a 400 xg e 4 ° C. </li><li> Raccogliere il surnatante ed utilizzare immediatamente per ulteriore analisi (ad esempio, ELISA) o congelamento a -80 ° C. Tenere il pellet di cellule per analizzare l&#39;afflusso cellulare nei polmoni. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di tampone di lisi ACK. NOTA: Questo passaggio garantisce la lisi degli eritrociti, mantenendo intatte le cellule bianche del sangue. </li><li> Incubare per 2 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Per ridurre la variazione causata da lisi dei globuli rossi, questo passo non deve essere eseguita per più di 2 min. </li&gt; <li> Aggiungere 1 mL di PBS freddo per diluire il tampone di lysing ACK. </li><li> Centrifugare per 7 minuti a 400 xg e 4 ° C. Scartare il supernatante e ri-sospendere le cellule in un adeguato volume di PBS per l&#39;analisi a valle (vedi sotto). NOTA: Il volume del PBS dipende dallo studio a valle che verrà eseguito. </li></ol> 4. Analisi dei diversi tipi di cellule nel liquido BAL mediante citometria di flusso NOTA: Una possibilità è di analizzare la composizione cellulare assoluta e relativa del fluido BAL eseguendo la citometria a flusso. L&#39;obiettivo di questo documento è elaborare la tecnica del BAL. La citometria a flusso è una tecnica specializzata da solo. Si raccomanda di leggere documenti specializzati sulla tecnica della citometria a flusso 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Anticorpi accoppiati ad un fluoroforo tCappello riconoscono antigeni superficiali (vedi tabella 1 ) specifici per un particolare tipo di cellule. Utilizzando una strategia di gating, è possibile identificare le cellule T, i macrofagi, le cellule dendritiche, le cellule B, gli eosinofili ei neutrofili nella frazione cellulare del BAL. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Antigene </td><td> Tipo di cella </td></tr><tr><td> Cluster di differenziazione 3 (CD3) </td><td> Espresso sulle cellule T </td></tr><tr><td> Cluster di differenziazione 11c (CD11c) </td><td> Alta espressione sulla maggior parte delle cellule dendritiche, ma anche su monociti, macrofagi, neutrofili e alcune cellule B. </td></tr><tr><td> Cluster di differenziazione 11b (CD11b) </td><td> Espresso sulla superficie di molti leucociti compresi monociti, neutrofili, cellule killer naturali, granulociti e macrofagi. </td></tr><tr><td> SiglecF </td><td> UNmacrofagi lveolar ed eosinofili. </td></tr><tr><td> MHCII </td><td> Normalmente si trovano solo sulle cellule presentanti l&#39;antigene come le cellule dendritiche, fagociti mononucleati e cellule B. </td></tr><tr><td> CD19 </td><td> B-linfociti antigene </td></tr><tr><td> Ly-6G </td><td> Un marcatore per monociti, granulociti neutrofili e </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Selezione di immunitario antigeni delle cellule superficiali. Questa tabella fornisce un elenco di epitopi di superficie usati per caratterizzare i diversi tipi cellulari. Combinazioni di diversi marcatori dovranno definire affidabile un tipo di cellula specifico. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Campioni </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubo </td><td> Antigen-fluoroforo da aggiungere alle cellule </td&gt; <td> Concentrazione delle concentrazioni degli anticorpi (mg / ml) </td><td> Diluizione dell&#39;anticorpo </td><td> Volume totale (μL) </td></tr><tr><td></td><td> Tintura di vitalità riparabile </td><td> 0.2 </td><td> 1/1000 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> CD11c </td><td> 0.2 </td><td> 1/800 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> SiglecF </td><td> 0.2 </td><td> 1/100 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Campione X </td><td> MHCII </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> CD3 </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> CD19 </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> CD11b </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> Ly6G </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Controlli di tensione </strong&gt; </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubo </td><td> Antigen-fluoroforo da aggiungere alle cellule </td><td> Concentrazione delle concentrazioni degli anticorpi (mg / ml) </td><td> Diluizione dell&#39;anticorpo </td><td> Volume totale (μL) </td></tr><tr><td> Cellule non sottili </td><td> / </td><td> / </td><td> / </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Singole cellule macchiate </td><td> Tintura di vitalità riparabile </td><td> 0.2 </td><td> 1/1000 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Singole cellule macchiate </td><td> CD11c </td><td> 0.2 </td><td> 1/800 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Singole cellule macchiate </td><td> SiglecF </td><td> 0.2 </td><td> 1/100 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Singole cellule macchiate </td><td> MHCII </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Singole cellule macchiate </td><td> CD3 </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Singole cellule macchiate </td><td> CD19 </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Singole cellule macchiate </td><td> CD11b </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Singole cellule macchiate </td><td> Ly6G </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Controlli di compensazione </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubo </td><td> Antigene-fluoroforo da aggiungere alle perle </td><td> Concentrazione delle concentrazioni degli anticorpi (mg / ml) </td><td> Diluizione dell&#39;anticorpo </td><td> Volume totale (μL) </td></tr><tr><td> Perline insoddisfatti </td><td> / </td><td> / </td><td> / </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Perline singole macchiate </td><td> CD11c </td><td> 0.2 </td><td> 1/2000 </td><td> 200 </td&gt; </tr><tr><td> Perline singole macchiate </td><td> SiglecF </td><td> 0.2 </td><td> 1/2000 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Perline singole macchiate </td><td> MHCII </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Perline singole macchiate </td><td> CD3 </td><td> 0.2 </td><td> 1/2000 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Perline singole macchiate </td><td> CD19 </td><td> 0.2 </td><td> 1/2000 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Perline singole macchiate </td><td> CD11b </td><td> 0.2 </td><td> 1/400 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Perline singole macchiate </td><td> Ly6G </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Elenco dei controlli da includere. Questa tabella mostra tutti i controlli necessari per l&#39;interpretazione precisa dei risultati ottenuti. <ol><li> Colorazione della superficie cellulare NOTA: è important per includere tutti i controlli critici per la citometria a flusso di analisi. Sono necessarie tre serie di tubi (vedi Tabella 2): (1) provette contenenti i campioni; (2) tubi con cellule del BAL per ogni anticorpo-fluoroforo per rendere macchie singoli; questo consente la determinazione delle tensioni per ciascun canale del citometro di flusso; e (3) tubi con perline per ogni anticorpo-fluoroforo per rendere macchie singoli; questo è quello di determinare la matrice di compensazione. <ol><li> Realizzare una miscela degli anticorpi e Fc-block (anti-CD16 / CD32) in PBS a diluizioni appropriate (vedere Tabella 2). È necessario determinare la diluizione di lavoro ottimale per ogni anticorpo prima dell&#39;esperimento. </li><li> Risospendere le cellule in 50 pl di miscela di anticorpi per il campione ed aggiungere 50 ml di anticorpo opportunamente diluito ai controlli critici. NOTA: La colorazione può essere eseguita in un pozzo 96, a forma di piatto u. Ciò rende possibile ridurre facilmente il volume macchia unND eseguire notevoli quantità di campioni. </li><li> Incubare per 30 minuti al buio a 4 ° C. </li><li> Centrifugare per 7 minuti a 400 xg e 4 ° C. Eliminare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in PBS ad un volume finale di 200 microlitri. NOTA: Questo volume finale dipende dal volume minimo del citometro di flusso può accedere. Questo può differire leggermente tra macchine. Inoltre, il volume di lettura dipende dal numero di cellule e / o il tempo del campione prenderà a funzionare in citofluorimetro. </li><li> Utilizzare i campioni ei controlli per le analisi di citometria di flusso. NOTA: Per determinare il numero di cella assoluto delle diverse popolazioni di cellule, dovrebbero essere aggiunti conteggio sfere. Aggiungere lo stesso numero di perline (± 25.000 perline) per ciascun campione appena prima della misura. Utilizzando avanti e scatter laterale, contando perline possono essere identificati mediante citometria di flusso (vedere Figura 1). Successivamente, il numero assoluto di cellule nel campione può essere calcolata confrontando the rapporto di eventi branello agli eventi cellulari. La seguente formula può essere utilizzato: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55398/55398eq1.jpg" /></li></ol></li><li> analisi di citometria di flusso NOTA: L&#39;analisi di citometria di flusso deve essere effettuata immediatamente dopo il completamento del protocollo di colorazione. Un citofluorimetro con laser e filtri per il rilevamento del segnale appropriati deve essere utilizzato. La tabella 3 fornisce una panoramica dei laser e filtri necessari per lo studio descritto in questo manoscritto. Per ulteriori informazioni sulle analisi di citometria di flusso, vedi Adan et al. 18. <ol><li> Impostare le porte principali basate sulla avanti e scatter laterale, escluse detriti e doppietti (vedi Figura 1). </li><li> Regolare la tensione e la compensazione per la sovrapposizione spettrale con l&#39;aiuto delle cellule singole macchiati e perline. NOTA: Queste impostazioni sono diverse per ogni citofluorimetro e hanno bisogno di essere controllati prima di ogni esperimento. Fo l&#39;analisi di flusso corretta, le tensioni forward e laterale scatter sono critici. Una corretta e con il lato scatter può aiutare nella identificazione e la conferma dell&#39;identità delle cellule analizzate. Per determinare queste tensioni, un campione non colorato deve essere eseguito prima. </li><li> Impostare cancelli fluorescenza per l&#39;antigene di superficie (vedi Figura 1) e analizzare i campioni. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> tipo di laser </td><td> l&#39;installazione del filtro </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 505 LP </td><td> 525/50 </td></tr><tr><td> Blu (488 nm) </td><td> 550 LP </td><td> 575/26 </td></tr><tr><td> 100 mW </td><td> 670 LP </td><td> 685/35 </td></tr><tr><td></td><td> 750 LP </td><td> 780/60 </td></tr><tr><td> violetto 405 nm </td><td></td><td> 450/50 </td></tr><tr><td> 100 mW </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rosso 633 nm </td><td></td><td> 660/20 </td></tr><tr><td> 70 mW </td><td> 750 LP </td><td> 780/60 </td></tr></tbody></table> Tabella 3: Panoramica dei laser e dei filtri del citometro di flusso utilizzato in questo studio.

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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+from+welding-fume-exposure-induced+lung+fibrosis+and+pulmonary+function+changes+in+sprague+dawley+rats.">Recovery from welding-fume-exposure-induced lung fibrosis and pulmonary function changes in sprague dawley rats.</a> Toxicol Sci. 82 (2), 608-613 (2004).</li><li>Majetschak, M., Sorell, L. T., Patricelli, T., Seitz, D. H., Knoferl, M. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-1-antitrypsin+content+in+the+serum,+alveolar+macrophages,+and+alveolar+lavage+fluid+of+smoking+and+nonsmoking+normal+subjects.">Alpha-1-antitrypsin content in the serum, alveolar macrophages, and alveolar lavage fluid of smoking and nonsmoking normal subjects.</a> J Clin Invest. 55 (2), 427-430 (1975).</li></ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

BAL è una tecnica utile per ottenere citologico e informazioni biochimiche in risposta alle infezioni o farmaci. Inizialmente, BAL è stato utilizzato per gestire l&#39;eccessiva produzione di muco nei pazienti umani affetti da tossicità fosgene 3. Al giorno d&#39;oggi, la tecnica è utilizzata negli esseri umani per studiare la patogenesi del polmone, la diagnosi e la gestione terapeutica delle malattie 3, 24. In animali da laboratorio, BAL è comunemente utilizzato per monitorare risposte infiammatorie, meccanismi immunitari e processi malattie infettive che si verificano nelle vie aeree polmonari 1, 2. Per studiare il modello cellulare infiammatoria in modelli di malattia respiratoria, BAL dovrebbe essere seguito da conta cellulare assoluta e differenziale. Oltre al numero di cella assoluto, i numeri di cella relativi sono interessanti. Ad esempio, i modelli di riparazione e di cancro mostrano very piccolo a nessun BAL aumenta conta delle cellule. In questo modello, la valutazione della composizione cellulare è utile. Utilizzando colorazione della cellula combinata con microscopia ottica, diversi tipi di cellule, come eosinofili, neutrofili, macrofagi e linfociti, possono essere identificati sulla base di morfologia 25, 26, 27, 28, 29, 30. La citometria a flusso può essere utilizzato per valutazioni specifiche, ad esempio per identificare diversi fenotipi cellule T 7, 31. Oltre alla identificazione delle diverse popolazioni cellulari infiltrante, la composizione non cellulare del polmone può essere studiata utilizzando BAL. Metodi come ELISA, immunoblot, matrice citochine perlina, immunoistochimica, e la reazione a catena della polimerasi quantitativa vengono eseguite su BAL determinare citochine, crescitaFattori e altri componenti infiammatori. Per determinare i danni polmonari, i livelli totali di proteine ​​e di lattato deidrogenasi nel fluido BAL possono anche essere misurati 32 , 33 . Con lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici, la caratterizzazione genomica e proteomica dei componenti BAL sarà possibile nel prossimo futuro. La combinazione di funzionalità computazionali in espansione e tecnologie di espressione genica ad alta velocità consentirà di definire profili specifici di espressione genica per vari stati di malattia. L&#39;esecuzione di queste tecniche sul fluido BAL può fornire modelli di espressione genica e proteica per identificare le molecole importanti coinvolte nelle diverse fasi delle malattie polmonari. La limitazione principale dei dati ottenuti con il fluido BAL è la mancanza di comparabilità tra i vari studi di ricerca 3 , 9 . C&#39;è un alto grado divariabilità nella tecnica di lavaggio e il successivo trattamento di BAL. Per poter confrontare ogni prova BAL, è necessario uniformare il tipo di liquido di lavaggio che viene instillata, il sito di instillazione, e la frazione che deve essere analizzato per composizione cellulare e non cellulare. Ci sono differenze significative nel numero di frazioni di lavaggio tra diverse prove, variabile da una a 14 volte 34, 35, 36. Questa differenza può avere un impatto sul numero di cellule totali stimate nei polmoni. E &#39;importante sapere quale frazione BAL contiene la maggior parte delle cellule. Canzone et al. ha mostrato che circa il 70% del numero totale di cellule sono state recuperate in frazione 2:59 22. Tuttavia, altri rapporti hanno suggerito che il secondo lavaggio conteneva più celle rispetto al primo 37, 38 </sup&gt;. Possiamo concludere da questi studi che una lavanda con una sola frazione non rappresenta l&#39;intero polmone, che porta alla errata interpretazione dei risultati. La composizione noncellular del fluido BAL contiene informazioni preziose sullo stato di salute del polmone 33, 39, 40. Variazioni della diluizione del liquido BAL contribuisce alla differenza nella quantificazione della frazione solubile e, di conseguenza, le differenze nei risultati tra prove. Canzone et al. rispetto delle proteine ​​e lattato deidrogenasi di ogni frazione lavanda e concluso che la prima frazione di lavaggio conteneva due a tre volte più della seconda frazione. Per recuperare un campione rappresentativo BAL per l&#39;analisi, alcune considerazioni tecniche sono cruciali. Uno di loro è di eseguire una corretta anestesia. E &#39;molto importante controllare l&#39;arbitro piedelex del mouse per garantire sedazione terminale. Questo è importante non solo per motivi etici, ma anche perché è difficile da posizionare e mantenere il catetere nella posizione corretta se il mouse non è adeguatamente anestetizzato. Una seconda importante considerazione tecnica è la posizione del catetere nella trachea. Quando il catetere viene inserito troppo in profondità, può danneggiare la struttura del polmone. L&#39;estremità distale del catetere non dovrebbe raggiungere i polmoni durante la procedura di BAL. Il catetere deve essere stabilizzata e legato con un filo di cotone. Se il catetere non è stabilizzato, la soluzione salina iniettata può fluire verso l&#39;alto nella cavità nasale anziché verso il basso nei polmoni. Durante l&#39;iniezione e l&#39;aspirazione della soluzione salina, è importante mantenere il catetere costante. I dati ottenuti dal BAL devono rappresentare l&#39;intero polmone murino. Pertanto, è importante infondere un adeguato volume di tampone salino (ie3 mL, suddivisi in 3 aliquote di 1 mL ciascuna). Non esiste una relazione lineare tra la resa cellulare e la resa del fluido BAL. È importante raccogliere la soluzione delicatamente mentre si massaggia il torace del topo. Se le forze di taglio sono troppo forti, la vitalità, la funzione e la struttura delle cellule all&#39;interno delle vie aeree e del fluido BAL possono essere compromesse. Se il liquido aspirato non è visibile nella siringa, spostare con attenzione il catetere più o più in alto nella trachea. Particolare attenzione deve essere rivolta a specifici aspetti dell&#39;elaborazione e dell&#39;analisi BAL. Questo massimizzerà le informazioni conservate dai campioni BAL. Dopo BAL, le cellule sono in un mezzo salino medio povero di nutrienti. È pertanto molto importante elaborare i campioni entro 1 ora dopo il campionamento BAL. Se è necessario uno stoccaggio prolungato, è necessario utilizzare un supporto nutrizionale. Per preservare la vitalità cellulare, evitare tubi che promuovano l&#39;adesione cellulare alla superficie. Evita centrifugation di sospensioni cellulari a velocità che possono compromettere l&#39;integrità cellulare o per prevenire risospensione uniforme delle cellule BAL recuperati. cellule del liquido contenente BAL devono essere centrifugate a 400 xg e 4 ° C per 7 minuti. È importante tenere presente che sospensioni cellulari devono essere tenuti a 4 ° C durante la lavorazione.

Le vie aeree incontrano numerosi insulti, che può portare a infiammazione, patogeno invasione o trasformazione maligna. Le cellule epiteliali che rivestono il lume polmonari costituiscono uno dei principali ostacoli del corpo dei mammiferi. Insieme a macrofagi alveolari, impediscono minacce ambientali da l&#39;ammissione al sistema sistemica attraverso le vie respiratorie. Esempi di tali minacce includono prodotti chimici organici e inorganici, batteri e virus. Analogamente, vaccinazioni specifiche o interventi terapeutici possono essere progettati per indirizzare i polmoni. In tutti questi casi, l&#39;analisi elaborata della risposta evocata è importante capire, intervenire o prevenire processi biologici che avvengono all&#39;interno del sistema respiratorio. lavaggio broncoalveolare (BAL) è un metodo prezioso per analizzare tali risposte, come i campioni risultanti contengono informazioni importanti sulle risposte infiammatorie, meccanismi immunitari, e la progressione della malattia infettivaChe può verificarsi nelle vie respiratorie polmonari 1 , 2 . Utilizzando BAL, è possibile studiare le cellule infiltranti. Questo contrasta con i polmoni digeriti, che danno una popolazione cellulare più &quot;sporca&quot;, con molte cellule morte e appiccicose. BAL viene eseguito introducendo una soluzione salina nei bronchioli terminali e successivamente recuperando questa soluzione. La soluzione recuperata può quindi essere utilizzata per quantificare e analizzare fenotipicamente polmone residente e infiltrare le cellule infiammatorie. Questo metodo è spesso utilizzato per studiare l&#39;afflusso cellulare nei modelli di malattia delle vie aeree, come l&#39;asma, la malattia polmonare cronica ostruttiva (COPD) e modelli di malattie infettive. Oltre alla composizione cellulare, la composizione molecolare delle vie aeree polmonari si riflette anche nel fluido BAL. Per analizzare, si può analizzare l&#39;associazione enzimatica dell&#39;immunosorbente (ELISA), l&#39;immunoblot e l&#39;analisi simultanea di citochine multiple tramite un array di brani di citochineeseguito per valutare la presenza di citochine e chemochine. BAL è un metodo ben consolidata per studiare l&#39;afflusso di cellule infiammatorie in modelli animali di malattia respiratoria infiammatorie. L&#39;osservazione di un afflusso cellulare alterato (ad esempio, livelli aumentati di linfociti, eosinofili, neutrofili o) può portare a migliori intuizioni malattia e può essere un parametro oggettivo per valutare le prestazioni di un intervento terapeutico. L&#39;interpretazione accurata e riproducibile di analisi cellulare BAL richiede che il BAL è eseguita correttamente e che il liquido raccolto viene gestita ed elaborata correttamente. Il termine &quot;lavaggio bronchiale&quot; è stato introdotto più di ottanta anni fa da Stitt 3. Nel 1961, Myrvik ottenuta macrofagi alveolari dal liquido di lavaggio dei polmoni coniglio 3. BAL è ormai un metodo comunemente usato per analizzare e monitorare i polmoni nel modello di topo, ma ilRe è ancora nessun rapporto di una procedura standardizzata BAL nella letteratura scientifica 4, 5. Inoltre, ci sono probabilmente come molti modi per eseguire BAL in quanto vi sono laboratori di ricerca che utilizzano la tecnica del 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11. E &#39;importante che i dati ottenuti dal BAL rappresentano l&#39;intero polmone murino, e non solo una parte del polmone. Questo tipo di variabilità complica l&#39;interpretazione e il confronto dei risultati tra diverse prove. Qui, un procedimento semplice, economico, e riproducibile BAL è descritto che permette la raccolta della frazione cellulare solubile presente nel lume delle vie aeree del mouse. In breve, un catetere viene inserito nella trachea esposto oFa mouse terminalmente anestetizzato. Una siringa è collegata al catetere e viene introdotta nei polmoni una soluzione salina tamponata contenente acido etilendiammina-tetraacetico (EDTA). I lumi del polmone sono campionati con una dolce ripetizione della soluzione salina utilizzando lo stantuffo. La pressione negativa applicata durante questa fase è minima per impedire il crollo delle vie aeree. Dopo la raccolta, il BAL ottenuto dovrebbe essere elaborato ulteriormente per enumerare e identificare le cellule mediante citometria a flusso.

<table><tbody><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175-129</td><td></td></tr><tr><td>ethyleendiaminetetra acetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6511</td><td>irritating</td></tr><tr><td>23 G x 1 1/4 needle</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710006030</td><td>size: 0.60 x 30 mm</td></tr><tr><td>26 G x 1/2 needle</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710004512</td><td>size: 0.45 x 12 mm</td></tr><tr><td>plastic tubing</td><td>BD medical technology</td><td>427411</td><td>Polyethylene Tubing, I.D. 0.58 mm (0.023&quot;) O.D. 0.965 mm (0.38&quot;) 30.5 m (100&#039;)</td></tr><tr><td>sodium pentobarbital</td><td>Kela NV</td><td>514</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>PBS without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; or phenol red; sterile filtered</td></tr><tr><td>1 mL syringes</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5010.200V0</td><td>nonpyrogenic and nontoxic</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools GmbH&amp;nbsp;</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Fine Science Tools GmbH&amp;nbsp;</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>centrifuge tube 50 mL</td><td>TH.Geyer</td><td>7696705</td><td>Free from Rnase/Dnase/endotoxin</td></tr><tr><td>centrifuge tube 15 mL</td><td>TH.Geyer</td><td>7696702</td><td>Free from Rnase/Dnase/endotoxin</td></tr><tr><td>microcentrifuge tube 1.5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>0030 120.094</td><td>polypropylene</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>sterile-filtered</td></tr><tr><td>live/dead - efluor 506</td><td>ebioscience</td><td>65-0866-18 &amp;nbsp;</td><td>fixable viability dye</td></tr><tr><td>CD11c-PE-cy7</td><td>eBiosciences</td><td>25-0114-81</td><td></td></tr><tr><td>SiglecF-PE</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>552126&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MHCII-APCefluor780</td><td>Biolegend</td><td>107628&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PE-cy5</td><td>VWR</td><td>55-0031-U100&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD19-PE-cy5</td><td>eBiosciences</td><td>15-0193-83&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-V450</td><td>BD Pharmingen&amp;nbsp;</td><td>560455&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ly6G-AF700</td><td>Biolegend</td><td>127621</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Counting Beads</td><td>Life Technologies Europe B.V.&amp;nbsp;</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD16/CD32</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>96-well 340 &amp;micro;l storage plate plate</td><td>Falcon</td><td>353263</td><td>V-bottom, natural polypropylene</td></tr><tr><td>flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>catheter</td><td>BD Biosciences</td><td>393202</td><td></td></tr></tbody></table>

bronchoalveolar lavage of murine lungs to analyze inflammatory cell infiltration

Lavaggio Broncoalveolare (BAL) è una procedura sperimentale che viene utilizzata per esaminare il contenuto cellulare e acellulare del lume polmonare ex vivo per ottenere una visione di uno stato di malattia in corso. Qui viene descritto un metodo semplice ed efficiente per eseguire BAL sui polmoni murini senza la necessità di strumenti o attrezzature speciali. Il liquido BAL viene isolato mediante l&#39;inserimento di un catetere nella trachea di topi terminalmente anestetizzati, attraverso i quali viene solcata una soluzione salina nei bronchioli. Il fluido instillato viene ritratto dolcemente per massimizzare il recupero del liquido BAL e per ridurre al minimo le forze di taglio. Questa tecnica consente di preservare la vitalità, la funzione e la struttura delle cellule all&#39;interno delle vie aeree e del fluido BAL. Numerose tecniche possono essere applicate per ottenere una maggiore comprensione dello stato di malattia del polmone. Qui, una tecnica comunemente utilizzata per l&#39;identificazione e l&#39;enumerazione di diversi tipi di cellule immunitarie èdescritto, dove la citometria a flusso è unito con un pannello di selezione di marcatori specifici superficiali cellulari fluorescente. La procedura BAL qui presentata può essere utilizzato anche per analizzare gli agenti infettivi, costituenti del fluido o di particelle inalate all&#39;interno polmoni murini.

Dopo l&#39;esecuzione di BAL con 3x1 mL di soluzione salina tamponata, occorre recuperare un volume compreso tra 2 e 3 mL. Questo fluido BAL può essere analizzato ulteriormente per caratterizzare il contenuto cellulare e non cellulare. Per studiare la presenza di citochine e chemocine, può essere eseguita l&#39;ELISA 19 , l&#39;immunoblot 20 e l&#39;analisi simultanea di citochine multiple mediante una matrice di raggi di citochine 21 . Inoltre, l&#39;albumina e il contenuto proteico totale di questo fluido possono essere determinati 22 . Ad esempio, questo manoscritto descrive come analizzare il contenuto cellulare del fluido BAL mediante citometria a flusso. Il fluido BAL analizzato è stato raccolto da topi femminili Balb / cAnNCrl (età: 7 settimane) 24 h dopo che sono stati intratrachealmente istruiti con lipopolisaccaride. I seguenti anticorpi, accoppiati ad un fluoroforo,Sono stati utilizzati per identificare i diversi tipi di cellule: CD11c, SiglecF, MHCII, CD3ε, CD19, Ly6g e CD11b (vedere tabella 1 e tabella dei materiali ). Viene inoltre utilizzato il colorante di vitabilità fisso. Utilizzando una strategia di gating basata sull&#39;espressione differenziale di antigeni sulle superfici delle diverse popolazioni cellulari ( Figura 1 ), è stato possibile identificare macrofagi, cellule dendritiche, cellule B, cellule T, neutrofili e eosinofili. Innanzitutto, i detriti ei doppi sono stati eliminati in base ai parametri avanti e laterali. Un colorante di vitabilità ha facilitato il gating sulle cellule vive. Successivamente, sono state identificate le cellule alte CD11c e le basse cellule CD11c. Nell&#39;alta popolazione CD11c, i macrofagi e le cellule dendritiche sono stati identificati in base all&#39;espressione MHCII e SiglecF. Nella popolazione bassa CD11c, le cellule T e le cellule B sono state identificate in base all&#39;espressione CD3ε e CD19, rispettivamente. In thE la restante popolazione cellulare, i neutrofili e gli eosinofili sono stati identificati sulla base dell&#39;espressione del marker CD11b e Ly-6G. Le perline di conteggio sono state aggiunte per determinare i numeri di cellule assoluti delle diverse popolazioni di cellule confrontando il rapporto degli eventi di branco agli eventi di cellule 23 . Queste perline di conteggio sono state identificate in base alle loro proprietà di avanzamento e di dispersione laterale ( Figura 1 ). La tabella 4 fornisce una panoramica dei numeri di cellule assoluti delle diverse popolazioni di cellule nel fluido BAL di un topo naïve e di un topo stimolato per 24 h con 5 μg di liposolisaccaride. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55398/55398fig1.jpg" /> Figura 1: Strategia di Gating per la rilevazione citometrica dei flussi di macrofagi, cellule dendritiche, cellule T, cellule B, neutrofili e eosinofili iN Fluido BAL. Le cellule BAL sono state isolate utilizzando il protocollo BAL descritto. Le cellule sono state isolate dai topi 24 h dopo l&#39;instillazione intracranica del lipopolisaccaride. Le perline e le celle di conteggio sono state identificate in base alle proprietà di spostamento avanti e laterale. Nel cancello cellulare sono state identificate singole cellule usando il dispersione avanti e laterale. In questa ultima popolazione, le cellule vive sono state identificate. Allo stesso modo sono state identificate le cellule alte CD11c e le basse cellule CD11c. Nell&#39;alta popolazione CD11c, i macrofagi e le cellule dendritiche sono stati identificati in base all&#39;espressione MHCII e SiglecF. Nella popolazione bassa CD11c, le cellule T e le cellule B sono state identificate in base all&#39;espressione CD3ε e CD19, rispettivamente. Nella restante popolazione cellulare, i neutrofili e gli eosinofili sono stati identificati sulla base dell&#39;espressione CD11b e Ly-6G, rispettivamente. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55398/55398fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una pagina</a>Versione più grande di questa figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Popolazione cellulare </td><td> Numero assoluto di cellule in topi ingenuo </td><td> Numero assoluto di cellule in topi stimolati da LPS </td></tr><tr><td> macrofagi </td><td> 79.612 </td><td> 25.439 </td></tr><tr><td> Cellule dendritiche </td><td> 495 </td><td> 671 </td></tr><tr><td> Cellule T </td><td> 45.271 </td><td> 28.089 </td></tr><tr><td> B cellule </td><td> 4.164 </td><td> 2.926 </td></tr><tr><td> neutrofili </td><td> 632 </td><td> 566.716 </td></tr><tr><td> eosinofili </td><td> 3.483 </td><td> 4.332 </td></tr></tbody></table> Tabella 4: RappresentaI risultati tativi della Citometria a Flusso di analisi sul fluido BAL di topi ingenuo e LPS-stimolati.

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Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Lo stato di salute del polmone si riflette il tipo e il numero di cellule immunitarie che sono presenti nei bronchioli dei polmoni. Descriviamo una tecnica di lavaggio broncoalveolare che consente di isolare e studio delle cellule non aderenti e fattori solubili dal tratto respiratorio inferiore dei topi.

Lavaggio broncoalveolare murini di polmoni per analizzare infiammatoria infiltrazione cellulare

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

66.8K Views.  VIB.  Lo stato di salute del polmone si riflette il tipo e il numero di cellule immunitarie che sono presenti nei bronchioli dei polmoni. Descriviamo una tecnica di lavaggio broncoalveolare che consente di isolare e studio delle cellule non aderenti e fattori solubili dal tratto respiratorio inferiore dei topi. 

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Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

Non chirurgica instillazione di topi con analisi dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante mediante citometria di flusso

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen interactions take advantage of intraperitoneal injections of select bacteria or pathogen associated molecular patterns (PAMPs) in mice. While these techniques have yielded tremendous data associated with infectious disease pathobiology, intraperitoneal injection models are not always appropriate for host-pathogen interaction studies in the lung. Utilizing an acute lung inflammation model in mice, it is possible to conduct a high resolution analysis of the host innate immune response utilizing lipopolysaccharide (LPS). Here, we describe the methods to administer LPS using nonsurgical oropharyngeal intratracheal administration, monitor clinical parameters associated with disease pathogenesis, and utilize bronchoalveolar lavage fluid to evaluate the host immune response. The techniques that are described are widely applicable for studying the host innate immune response to a diverse range of PAMPs and pathogens. Likewise, with minor modifications, these techniques can also be applied in studies evaluating allergic airway inflammation and in pharmacological applications.

The host immune response to pathogen infection is a tightly regulated process. Utilizing a lipopolysaccharide lung exposure model in mice, it is possible to conduct high resolution evaluations of the complex mechanisms associated with disease pathogenesis.

L&#39;utilizzo di orofaringea intratracheale PAMP Amministrazione e lavaggio broncoalveolare per valutare la risposta immunitaria nei topi Host

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated procedures to obtain such measurements in the same animal are generally not feasible.  Here, we demonstrate protocols for obtaining from mice repeated measurements of AHR and bronchoalveolar lavage fluid samples.  Mice were challenged intranasally seven times over 14 days with a potent allergen or sham treated.  Prior to the initial challenge, and within 24 hours following each intranasal challenge, the same animals were anesthetized, orally intubated and mechanically ventilated.  AHR, assessed by comparing dose response curves of respiratory system resistance (RRS) induced by increasing intravenous doses of acetylcholine (Ach) chloride between sham and allergen-challenged animals, were determined.  Afterwards, and via the same intubation, the left lung was lavaged so that differential enumeration of airway cells could be performed.  These studies reveal that repeated measurements of AHR and BAL fluid collection are possible from the same animals and that maximal airway hyperresponsiveness and airway eosinophilia are achieved within 7-10 days of initiating allergen challenge.  This novel technique significantly reduces the number of mice required for longitudinal experimentation and is applicable to diverse rodent species, disease models and airway physiology instruments.  

Repeated measurements of rodent respiratory physiology and sampling of airway inflammatory cells are desirable, but generally not feasible. Here we describe a repeatable method for orally intubating mice that permits repeated measurements of airway hyperreactivity and sampling of airway inflammatory cells.

Un reversibile, metodo non invasivo per le misure di resistenza delle vie aeree e liquido di lavaggio broncoalveolare di campionamento nei topi

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated ...

Biologia

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant preclinical advances in our understanding of the underlying cellular and molecular pathogenesis. In vivo mouse models capture the integrated physiology and resilience of the host defense response in a manner not revealed by alternative, simplified ex vivo approaches. Several methods have been described in the literature for intrapulmonary inoculation of bacteria in mice, including aerosolization, intranasal delivery, peroral endotracheal cannulation under &#39;blind&#39; and visualized conditions, and transcutaneous endotracheal cannulation. All methods have relative merits and limitations. Herein, we describe in detail a non-invasive, technically non-intensive, inexpensive, and rapid method for intratracheal delivery of bacteria that involves aspiration (i.e., inhalation) by the mouse of an infectious inoculum pipetted into the oropharynx while under general anesthesia. This method can be used for pulmonary delivery of a wide variety of non-caustic biological and chemical agents, and is relatively easy to learn, even for laboratories with minimal prior experience with pulmonary procedures. In addition to describing the aspiration pneumonia method, we also provide step-by-step procedures for assaying the subsequent in vivo pulmonary innate immune response of the mouse, in particular, methods for quantifying bacterial clearance and the cellular immune response of the infected airway. This integrated and simple approach to pneumonia assessment allows for rapid and robust evaluation of the effect of genetic and environmental manipulations upon pulmonary innate immunity.

Several methods have been described in the literature for modeling bacterial pneumonia in mice. Herein, we describe a non-invasive, inexpensive, rapid method for inducing pneumonia via aspiration (i.e., inhalation) of a bacterial inoculum pipetted into the oropharynx. Downstream methods for assessment of the pulmonary innate immune response are also detailed.

Un metodo non invasivo e tecnicamente non intensiva per l&#39;induzione e Fenotipizzazione Sperimentale polmonite batterica nei topi

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Immune Cells and Proinflammatory Mediators in the Pulmonary Environment

Immune cell expansion, activation, and trafficking to the lungs, which are controlled by the expression of multiple cytokines and chemokines, may be altered by severe brain injury. This is evidenced by the fact that pneumonia is a major cause of mortality in patients who have suffered from ischemic stroke. The goal of this protocol is to describe the use of multicolor flow cytometric analysis to identify 13 types of immune cells in the lungs of mice, including alveolar macrophages, interstitial macrophages, CD103+ or CD11b+ dendritic cells (DCs), plasmacytoid DCs, eosinophils, monocytes/monocyte-derived cells, neutrophils, lymphoid-derived&#160; T and B cells, NK cells, and NKT cells, following ischemic stroke induction by transient middle cerebral artery occlusion. Moreover, we describe the preparation of lung homogenates using a bead homogenization method, to determine the expression levels of 13 different cytokines or chemokines simultaneously by multiplex bead arrays coupled with flow cytometric analysis. This protocol can also be used to investigate the pulmonary immune response in other disease settings, such as infectious lung disease or allergic disease.

This protocol describes the use of flow cytometry to identify the changes in immune cell composition, cytokine profile, and chemokine profile in the pulmonary environment following transient middle cerebral artery occlusion, a murine model of ischemic stroke.

Caratterizzazione di cellule immunitarie e mediatori proinfiammatori in ambiente polmonare

Immune cell expansion, activation, and trafficking to the lungs, which are controlled by the expression of multiple cytokines and chemokines, may be ...

Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or fungal) inflammatory conditions. An overwhelming host response may result in compromised respiration and acute lung injury, which is characterized by lung neutrophil recruitment as a result of the patho-logical host immune, coagulative and tissue remodeling response. Sensitive microscopic methods to visualize and quantify murine lung cellular adaptations, in response to low-dose (0.05 ppm) ozone, a potent environmental pollutant in combination with bacterial lipopolysaccharide, a TLR4 agonist, are crucial in order to understand the host inflammatory and repair mechanisms. We describe a comprehensive fluorescent microscopic analysis of various lung and systemic body compartments, namely the broncho-alveolar lavage fluid, lung vascular perfusate, left lung cryosections, and sternal bone marrow perfusate. We show damage of alveolar macrophages, neutrophils, lung parenchymal tissue, as well as bone marrow cells in correlation with a delayed (up to 36-72 h) immune response that is marked by discrete chemokine gradients in the analyzed compartments. In addition, we present lung extracellular matrix and cellular cytoskeletal interactions (actin, tubulin), mitochondrial and reactive oxygen species, anti-coagulative plasminogen, its anti-angiogenic peptide fragment angiostatin, the mitochondrial ATP synthase complex V subunits, &#945; and &#946;. These surrogate markers, when supplemented with adequate in vitro cell-based assays and in vivo animal imaging techniques such as intravital microscopy, can provide vital information towards understanding the lung response to novel immunomodulatory agents.

Combined ozone and bacterial endotoxin exposed mice show wide-spread cell death, including that of neutrophils. We observed cellular adaptations such as disruption of cytoskeletal lamellipodia, increased cellular expression of complex V ATP synthase subunit &#946; and angiostatin in broncho-alveolar lavage, suppression of the lung immune response and delayed neutrophil recruitment.

Visualizzazione degli adattamenti cellulari polmonari durante l'ozono combinato e la lesione polmonare acuta murina indotta da LPS

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or ...

Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while suppressing unwanted reactions to environmental antigens. Lungs host several populations of innate and adaptive immune cells that provide immune surveillance but also mediate protective immune responses. These cells, which keep the healthy pulmonary immune system in balance, also participate in several pathological conditions such as asthma, infections, autoimmune diseases, and cancer. Selective expression of surface and intracellular proteins provides unique immunophenotypic properties to the immune cells of the lung. Consequently, flow cytometry has an instrumental role in the identification of such cell populations during steady-state and pathological conditions. This paper presents a protocol that describes a consistent and reproducible method to identify the immune cells that reside in the lungs of healthy mice under steady-state conditions. However, this protocol can also be used to identify changes in these cell populations in various disease models to help identify disease-specific changes in the lung immune landscape.

In this study, we present an effective and reproducible protocol to isolate the immune populations of the murine respiratory system. We also provide a method for the identification of all innate and adaptive immune cells that reside in the lungs of healthy mice, using a 9-color-based flow cytometry panel.

Analisi citometrica a flusso per l'identificazione delle cellule immunitarie innate e adattative del polmone murino

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while ...

Pletismografia non invasiva in tempo reale di tutto il corpo per la sensibilità alla tosse nei topi

Methods for Detecting Cough and Airway Inflammation in Mice

Chronic cough, which lasts for more than 8 weeks, is one of the most common complaints requiring medical attention, and patients suffer from a huge socioeconomic burden and a marked decrement in quality of life. Animal models can mimic the complex pathophysiology of the cough and are important tools for cough research. The detection of cough sensitivity and airway inflammation is of great significance for studying the complex pathological mechanism of cough. This article describes the measurement of cough using a noninvasive and real-time whole-body plethysmography (WBP) system and the normative procedures for harvesting tissue samples (including blood, lung, spleen, and trachea) of mice. It introduces some methods to assess airway inflammation, including pathological changes in hematoxylin and eosin (HE)-stained lung and trachea sections, the total protein concentration, the uric acid concentration, and the lactate dehydrogenase (LDH) activity in the supernatant of bronchoalveolar lavage fluid (BALF), and the leukocytes and differential cell counts of BALF. These methods are reproducible and serve as valuable tools to study the complex pathophysiology of cough.

Autore in primo piano: Indagine sulla fisiopatologia della tosse cronica

Here, we describe the measurement of cough using a noninvasive and real-time whole-body plethysmography (WBP) system and the normative procedures for harvesting tissue samples of mice and introduce some methods to assess airway inflammation.

Metodi per rilevare la tosse e l'infiammazione delle vie aeree nei topi

Chronic cough, which lasts for more than 8 weeks, is one of the most common complaints requiring medical attention, and patients suffer from a huge ...

Lavaggio broncoalveolare murini di polmoni per analizzare infiammatoria infiltrazione cellulare

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Non chirurgica instillazione di topi con analisi dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante mediante citometria di flusso

L'utilizzo di orofaringea intratracheale PAMP Amministrazione e lavaggio broncoalveolare per valutare la risposta immunitaria nei topi Host

Un reversibile, metodo non invasivo per le misure di resistenza delle vie aeree e liquido di lavaggio broncoalveolare di campionamento nei topi

Un metodo non invasivo e tecnicamente non intensiva per l'induzione e Fenotipizzazione Sperimentale polmonite batterica nei topi

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Caratterizzazione di cellule immunitarie e mediatori proinfiammatori in ambiente polmonare

Visualizzazione degli adattamenti cellulari polmonari durante l'ozono combinato e la lesione polmonare acuta murina indotta da LPS

Analisi citometrica a flusso per l'identificazione delle cellule immunitarie innate e adattative del polmone murino

Metodi per rilevare la tosse e l'infiammazione delle vie aeree nei topi

Metodi per rilevare la tosse e l'infiammazione delle vie aeree nei topi