LVH è un assistente di ricerca presso il Dipartimento di Biologia Molecolare Biomedica dell&#39;Università di Ghent. ERJ è supportato da UniVacFlu, codice di autorizzazione 607690. KR è supportato da EC-FP7 progetto FLUNIVAC.

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti in questo studio sono stati condotti secondo la legislazione nazionale (legge belga 14/08/1986 e 22/12/2003, decreto belga 06/04/2010) e legislazione europea (Direttive UE 2010/63 / UE e 86 / 609 / CEE). Tutti gli esperimenti sui topi e su tutti i protocolli animali sono stati approvati dal comitato etico dell&#39;Università di Ghent (numeri di autorizzazione LA1400091 e EC2016-027). 1. Preparazione <ol><li> Fluido lavaggio <ol><li> Preparare una soluzione salina equilibrata con 100 μM di acido etilendiammina-tetraecetico (EDTA). NOTA: Per misurare i livelli di proteine ​​nel fluido BAL, si raccomanda di aggiungere inibitori della proteasi per prevenire l&#39;attività proteasi nel fluido BAL. </li></ol></li><li> Catetere <ol><li> Realizzare un catetere inserendo un ago da 23 G in tubo di plastica trasparente in polietilene 21 G (diametro interno: 0,58 mm, diametro esterno: 0,965 mm e lunghezza: 0,5 cm). Possono essere utilizzati anche cateteri Premade. </li></ol></li><li> AnesthETICS <ol><li> Preparare un anestetico terminale, preferibilmente uno che provoca arresto respiratorio (ad esempio, un barbiturico come sodio pentobarbital (&gt; 100 mg / kg) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)). NOTA: Si raccomanda di utilizzare l&#39;anestesia iniettati invece di anestesia inalatoria, come anestesia inalato può avere un&#39;influenza sul contenuto BAL. CO 2, ad esempio, ha un&#39;influenza sul pH del sangue e conseguentemente sulla ridistribuzione di diversi composti 12. </li></ol></li><li> Ammonio-cloruro di potassio (ACK) tampone di lisi dei globuli rossi <ol><li> Preparare un tampone di lisi ACK sciogliendo 8.29 g di NH 4 Cl e 1 g di KHCO 3 in 1 L di H 2 O con 100 mM EDTA; tampone di lisi dei globuli rossi può anche essere acquistato da una fonte esterna. </li></ol></li></ol> 2. Esecuzione del lavaggio broncoalveolare (BAL) <ol><li> Introducendo il catetere nella trachea<ol><li> Eutanizzare il mouse mediante iniezione intraperitoneale di una dose letale di un anestetico a barbiturato a breve durata utilizzando un ago da 26 G. Per confermare l&#39;anestetizzazione letale appropriata, pizzicare la zampa posteriore del mouse con le pinze per controllare il riflesso del piede. </li><li> Posizionare l&#39;animale sulla schiena su una piastra chirurgica e fissare il mouse appiccando gli arti. </li><li> Spruzzare il 70% di etanolo sul collo per disinfettare. Fai un&#39;incisione nella pelle del collo vicino alla trachea usando un bisturi. </li><li> Aprire la pelle per esporre le ghiandole salivari. Separare le ghiandole salivari usando le pinze per esporre il muscolo sternohyoid. Incise il muscolo intorno alla trachea utilizzando le pinze per esporre la trachea. </li><li> Mettere un filo di cotone sotto la trachea utilizzando le pinze. </li><li> Scollegare attentamente il centro della trachea esposta tra due anelli di cartilagine con un ago da 26 G. Fare attenzione a non danneggiare la trachea. </li><li> Inserire il catetere di circa 0,5 cm nella trachea. Assicurarsi che la catheter non è inserito troppo in basso nella trachea, poiché ciò può portare a danni della struttura dei polmoni. </li><li> Stabilizzare il catetere legando la trachea intorno al catetere utilizzando il filo di cotone collocato nel passaggio 2.1.5. Se il catetere non è legata a sufficienza, la soluzione salina bilanciata iniettata può scorrere verso la parte superiore del tratto respiratorio anziché verso il basso nei polmoni. </li></ol></li><li> Raccogliere il liquido di lavaggio <ol><li> Caricare una siringa da 1 ml con 1 mL di soluzione salina bilanciata sterile con 100 pM EDTA. </li><li> Collegare la siringa da 1 ml al catetere e iniettare delicatamente la soluzione salina / EDTA nei polmoni. </li><li> Aspirare la soluzione delicatamente mentre massaggia il torace del mouse. Se il liquido aspirato non è visibile nella siringa, inserire con cautela il catetere un po &#39;più in basso o verso l&#39;alto la trachea. </li><li> Rimuovere la siringa dall&#39;ago e trasferire il liquido di lavaggio recuperato in una provetta da 15 ml posti su ghiaccio. Normalmente, 700-900 &amp;# 181; L di BAL viene recuperato da 1 mL di soluzione iniettata. </li><li> Ripetere i punti 2.2.1 - 2.2.4 altre due volte. NOTA: Se lo scopo è quello di analizzare il contenuto non cellulare, si consiglia di concentrare le campioni aggregati quando ci sono problemi con la sensibilità. </li></ol></li></ol> 3. Raccogliere le componenti cellulari e non cellulari del fluido BAL <ol><li> Centrifugare il liquido di lavaggio per 7 minuti a 400 xg e 4 ° C. </li><li> Raccogliere il surnatante ed utilizzare immediatamente per ulteriore analisi (ad esempio, ELISA) o congelamento a -80 ° C. Tenere il pellet di cellule per analizzare l&#39;afflusso cellulare nei polmoni. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri di tampone di lisi ACK. NOTA: Questo passaggio garantisce la lisi degli eritrociti, mantenendo intatte le cellule bianche del sangue. </li><li> Incubare per 2 minuti a temperatura ambiente. NOTA: Per ridurre la variazione causata da lisi dei globuli rossi, questo passo non deve essere eseguita per più di 2 min. </li&gt; <li> Aggiungere 1 mL di PBS freddo per diluire il tampone di lysing ACK. </li><li> Centrifugare per 7 minuti a 400 xg e 4 ° C. Scartare il supernatante e ri-sospendere le cellule in un adeguato volume di PBS per l&#39;analisi a valle (vedi sotto). NOTA: Il volume del PBS dipende dallo studio a valle che verrà eseguito. </li></ol> 4. Analisi dei diversi tipi di cellule nel liquido BAL mediante citometria di flusso NOTA: Una possibilità è di analizzare la composizione cellulare assoluta e relativa del fluido BAL eseguendo la citometria a flusso. L&#39;obiettivo di questo documento è elaborare la tecnica del BAL. La citometria a flusso è una tecnica specializzata da solo. Si raccomanda di leggere documenti specializzati sulla tecnica della citometria a flusso 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Anticorpi accoppiati ad un fluoroforo tCappello riconoscono antigeni superficiali (vedi tabella 1 ) specifici per un particolare tipo di cellule. Utilizzando una strategia di gating, è possibile identificare le cellule T, i macrofagi, le cellule dendritiche, le cellule B, gli eosinofili ei neutrofili nella frazione cellulare del BAL. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Antigene </td><td> Tipo di cella </td></tr><tr><td> Cluster di differenziazione 3 (CD3) </td><td> Espresso sulle cellule T </td></tr><tr><td> Cluster di differenziazione 11c (CD11c) </td><td> Alta espressione sulla maggior parte delle cellule dendritiche, ma anche su monociti, macrofagi, neutrofili e alcune cellule B. </td></tr><tr><td> Cluster di differenziazione 11b (CD11b) </td><td> Espresso sulla superficie di molti leucociti compresi monociti, neutrofili, cellule killer naturali, granulociti e macrofagi. </td></tr><tr><td> SiglecF </td><td> UNmacrofagi lveolar ed eosinofili. </td></tr><tr><td> MHCII </td><td> Normalmente si trovano solo sulle cellule presentanti l&#39;antigene come le cellule dendritiche, fagociti mononucleati e cellule B. </td></tr><tr><td> CD19 </td><td> B-linfociti antigene </td></tr><tr><td> Ly-6G </td><td> Un marcatore per monociti, granulociti neutrofili e </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Selezione di immunitario antigeni delle cellule superficiali. Questa tabella fornisce un elenco di epitopi di superficie usati per caratterizzare i diversi tipi cellulari. Combinazioni di diversi marcatori dovranno definire affidabile un tipo di cellula specifico. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Campioni </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubo </td><td> Antigen-fluoroforo da aggiungere alle cellule </td&gt; <td> Concentrazione delle concentrazioni degli anticorpi (mg / ml) </td><td> Diluizione dell&#39;anticorpo </td><td> Volume totale (μL) </td></tr><tr><td></td><td> Tintura di vitalità riparabile </td><td> 0.2 </td><td> 1/1000 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> CD11c </td><td> 0.2 </td><td> 1/800 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> SiglecF </td><td> 0.2 </td><td> 1/100 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Campione X </td><td> MHCII </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> CD3 </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> CD19 </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> CD11b </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td></td><td> Ly6G </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Controlli di tensione </strong&gt; </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubo </td><td> Antigen-fluoroforo da aggiungere alle cellule </td><td> Concentrazione delle concentrazioni degli anticorpi (mg / ml) </td><td> Diluizione dell&#39;anticorpo </td><td> Volume totale (μL) </td></tr><tr><td> Cellule non sottili </td><td> / </td><td> / </td><td> / </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Singole cellule macchiate </td><td> Tintura di vitalità riparabile </td><td> 0.2 </td><td> 1/1000 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Singole cellule macchiate </td><td> CD11c </td><td> 0.2 </td><td> 1/800 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Singole cellule macchiate </td><td> SiglecF </td><td> 0.2 </td><td> 1/100 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Singole cellule macchiate </td><td> MHCII </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Singole cellule macchiate </td><td> CD3 </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Singole cellule macchiate </td><td> CD19 </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Singole cellule macchiate </td><td> CD11b </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Singole cellule macchiate </td><td> Ly6G </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Controlli di compensazione </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tubo </td><td> Antigene-fluoroforo da aggiungere alle perle </td><td> Concentrazione delle concentrazioni degli anticorpi (mg / ml) </td><td> Diluizione dell&#39;anticorpo </td><td> Volume totale (μL) </td></tr><tr><td> Perline insoddisfatti </td><td> / </td><td> / </td><td> / </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Perline singole macchiate </td><td> CD11c </td><td> 0.2 </td><td> 1/2000 </td><td> 200 </td&gt; </tr><tr><td> Perline singole macchiate </td><td> SiglecF </td><td> 0.2 </td><td> 1/2000 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Perline singole macchiate </td><td> MHCII </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Perline singole macchiate </td><td> CD3 </td><td> 0.2 </td><td> 1/2000 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Perline singole macchiate </td><td> CD19 </td><td> 0.2 </td><td> 1/2000 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Perline singole macchiate </td><td> CD11b </td><td> 0.2 </td><td> 1/400 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> Perline singole macchiate </td><td> Ly6G </td><td> 0.2 </td><td> 1/200 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Elenco dei controlli da includere. Questa tabella mostra tutti i controlli necessari per l&#39;interpretazione precisa dei risultati ottenuti. <ol><li> Colorazione della superficie cellulare NOTA: è important per includere tutti i controlli critici per la citometria a flusso di analisi. Sono necessarie tre serie di tubi (vedi Tabella 2): (1) provette contenenti i campioni; (2) tubi con cellule del BAL per ogni anticorpo-fluoroforo per rendere macchie singoli; questo consente la determinazione delle tensioni per ciascun canale del citometro di flusso; e (3) tubi con perline per ogni anticorpo-fluoroforo per rendere macchie singoli; questo è quello di determinare la matrice di compensazione. <ol><li> Realizzare una miscela degli anticorpi e Fc-block (anti-CD16 / CD32) in PBS a diluizioni appropriate (vedere Tabella 2). È necessario determinare la diluizione di lavoro ottimale per ogni anticorpo prima dell&#39;esperimento. </li><li> Risospendere le cellule in 50 pl di miscela di anticorpi per il campione ed aggiungere 50 ml di anticorpo opportunamente diluito ai controlli critici. NOTA: La colorazione può essere eseguita in un pozzo 96, a forma di piatto u. Ciò rende possibile ridurre facilmente il volume macchia unND eseguire notevoli quantità di campioni. </li><li> Incubare per 30 minuti al buio a 4 ° C. </li><li> Centrifugare per 7 minuti a 400 xg e 4 ° C. Eliminare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in PBS ad un volume finale di 200 microlitri. NOTA: Questo volume finale dipende dal volume minimo del citometro di flusso può accedere. Questo può differire leggermente tra macchine. Inoltre, il volume di lettura dipende dal numero di cellule e / o il tempo del campione prenderà a funzionare in citofluorimetro. </li><li> Utilizzare i campioni ei controlli per le analisi di citometria di flusso. NOTA: Per determinare il numero di cella assoluto delle diverse popolazioni di cellule, dovrebbero essere aggiunti conteggio sfere. Aggiungere lo stesso numero di perline (± 25.000 perline) per ciascun campione appena prima della misura. Utilizzando avanti e scatter laterale, contando perline possono essere identificati mediante citometria di flusso (vedere Figura 1). Successivamente, il numero assoluto di cellule nel campione può essere calcolata confrontando the rapporto di eventi branello agli eventi cellulari. La seguente formula può essere utilizzato: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55398/55398eq1.jpg" /></li></ol></li><li> analisi di citometria di flusso NOTA: L&#39;analisi di citometria di flusso deve essere effettuata immediatamente dopo il completamento del protocollo di colorazione. Un citofluorimetro con laser e filtri per il rilevamento del segnale appropriati deve essere utilizzato. La tabella 3 fornisce una panoramica dei laser e filtri necessari per lo studio descritto in questo manoscritto. Per ulteriori informazioni sulle analisi di citometria di flusso, vedi Adan et al. 18. <ol><li> Impostare le porte principali basate sulla avanti e scatter laterale, escluse detriti e doppietti (vedi Figura 1). </li><li> Regolare la tensione e la compensazione per la sovrapposizione spettrale con l&#39;aiuto delle cellule singole macchiati e perline. NOTA: Queste impostazioni sono diverse per ogni citofluorimetro e hanno bisogno di essere controllati prima di ogni esperimento. Fo l&#39;analisi di flusso corretta, le tensioni forward e laterale scatter sono critici. Una corretta e con il lato scatter può aiutare nella identificazione e la conferma dell&#39;identità delle cellule analizzate. Per determinare queste tensioni, un campione non colorato deve essere eseguito prima. </li><li> Impostare cancelli fluorescenza per l&#39;antigene di superficie (vedi Figura 1) e analizzare i campioni. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> tipo di laser </td><td> l&#39;installazione del filtro </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 505 LP </td><td> 525/50 </td></tr><tr><td> Blu (488 nm) </td><td> 550 LP </td><td> 575/26 </td></tr><tr><td> 100 mW </td><td> 670 LP </td><td> 685/35 </td></tr><tr><td></td><td> 750 LP </td><td> 780/60 </td></tr><tr><td> violetto 405 nm </td><td></td><td> 450/50 </td></tr><tr><td> 100 mW </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rosso 633 nm </td><td></td><td> 660/20 </td></tr><tr><td> 70 mW </td><td> 750 LP </td><td> 780/60 </td></tr></tbody></table> Tabella 3: Panoramica dei laser e dei filtri del citometro di flusso utilizzato in questo studio.

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bronchoalveolar+lavage:+role+in+the+pathogenesis,+diagnosis,+and+management+of+interstitial+lung+disease.">Bronchoalveolar lavage: role in the pathogenesis, diagnosis, and management of interstitial lung disease.</a> Ann Intern Med. 102 (1), 93-108 (1985).</li><li>Delayre-Orthez, C., Becker, J., de Blay, F., Frossard, N., Pons, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+endotoxins+during+sensitization+prevents+further+endotoxin-induced+exacerbation+of+airway+inflammation+in+a+mouse+model+of+allergic+asthma.">Exposure to endotoxins during sensitization prevents further endotoxin-induced exacerbation of airway inflammation in a mouse model of allergic asthma.</a> Int Arch Allergy Immunol. 138 (4), 298-304 (2005).</li><li>Delayre-Orthez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARalpha+downregulates+airway+inflammation+induced+by+lipopolysaccharide+in+the+mouse.">PPARalpha downregulates airway inflammation induced by lipopolysaccharide in the mouse.</a> Respir Res. 6, 91 (2005).</li><li>Delayre-Orthez, C., de Blay, F., Frossard, N., Pons, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+effects+of+endotoxins+on+allergen+sensitization+and+challenge+in+the+mouse.">Dose-dependent effects of endotoxins on allergen sensitization and challenge in the mouse.</a> Clin Exp Allergy. 34 (11), 1789-1795 (2004).</li><li>Hachet-Haas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+neutralizing+molecules+to+inhibit+actions+of+the+chemokine+CXCL12.">Small neutralizing molecules to inhibit actions of the chemokine CXCL12.</a> J Biol Chem. 283 (34), 23189-23199 (2008).</li><li>Ble, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+lung+S1P(1)+receptor+reduces+allergen-induced+plasma+leakage+in+mice.">Activation of the lung S1P(1) receptor reduces allergen-induced plasma leakage in mice.</a> Br J Pharmacol. 158 (5), 1295-1301 (2009).</li><li>Ble, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergen-induced+lung+inflammation+in+actively+sensitized+mice+assessed+with+MR+imaging.">Allergen-induced lung inflammation in actively sensitized mice assessed with MR imaging.</a> Radiology. 248 (3), 834-843 (2008).</li><li>Reber, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dissociated+glucocorticoid+receptor+modulator+reduces+airway+hyperresponsiveness+and+inflammation+in+a+mouse+model+of+asthma.">A dissociated glucocorticoid receptor modulator reduces airway hyperresponsiveness and inflammation in a mouse model of asthma.</a> J Immunol. 188 (7), 3478-3487 (2012).</li><li>Drent, M., Cobben, N. A., Henderson, R. F., Wouters, E. F., van Dieijen-Visser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+lactate+dehydrogenase+and+its+isoenzymes+as+indicators+of+lung+damage+or+inflammation.">Usefulness of lactate dehydrogenase and its isoenzymes as indicators of lung damage or inflammation.</a> Eur Respir J. 9 (8), 1736-1742 (1996).</li><li>Henderson, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bronchoalveolar+lavage+to+detect+lung+damage.">Use of bronchoalveolar lavage to detect lung damage.</a> Environ Health Perspect. 56, 115-129 (1984).</li><li>Forget, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adherent+cell+perifusion+technique+to+study+the+overall+and+sequential+response+of+rat+alveolar+macrophages+to+toxic+substances.">An adherent cell perifusion technique to study the overall and sequential response of rat alveolar macrophages to toxic substances.</a> Environ Health Perspect. 51, 131-140 (1983).</li><li>Sung, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+from+welding-fume-exposure-induced+lung+fibrosis+and+pulmonary+function+changes+in+sprague+dawley+rats.">Recovery from welding-fume-exposure-induced lung fibrosis and pulmonary function changes in sprague dawley rats.</a> Toxicol Sci. 82 (2), 608-613 (2004).</li><li>Majetschak, M., Sorell, L. T., Patricelli, T., Seitz, D. H., Knoferl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+possible+role+of+proteasomes+in+the+bronchoalveolar+space+of+the+injured+lung.">Detection and possible role of proteasomes in the bronchoalveolar space of the injured lung.</a> Physiol Res. 58 (3), 363-372 (2009).</li><li>Rehn, B., Bruch, J., Zou, T., Hobusch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+rat+alveolar+macrophages+by+bronchoalveolar+lavage+under+normal+and+activated+conditions.">Recovery of rat alveolar macrophages by bronchoalveolar lavage under normal and activated conditions.</a> Environ Health Perspect. 97, 11-16 (1992).</li><li>Kelly, C. A., Ward, C., Stenton, S. C., Hendrick, D. J., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+pulmonary+macrophage+and+neutrophil+function+in+sequential+bronchoalveolar+lavage+aspirates+in+sarcoidosis.">Assessment of pulmonary macrophage and neutrophil function in sequential bronchoalveolar lavage aspirates in sarcoidosis.</a> Thorax. 43 (10), 787-791 (1988).</li><li>Eklund, A., Tornling, G., Blaschke, E., Curstedt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+components+in+bronchoalveolar+lavage+fluid+in+quartz+exposed+rats.">Extracellular matrix components in bronchoalveolar lavage fluid in quartz exposed rats.</a> Br J Ind Med. 48 (11), 776-782 (1991).</li><li>Olsen, G. N., Harris, J. O., Castle, J. R., Waldman, R. H., Karmgard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-1-antitrypsin+content+in+the+serum,+alveolar+macrophages,+and+alveolar+lavage+fluid+of+smoking+and+nonsmoking+normal+subjects.">Alpha-1-antitrypsin content in the serum, alveolar macrophages, and alveolar lavage fluid of smoking and nonsmoking normal subjects.</a> J Clin Invest. 55 (2), 427-430 (1975).</li></ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

BAL è una tecnica utile per ottenere citologico e informazioni biochimiche in risposta alle infezioni o farmaci. Inizialmente, BAL è stato utilizzato per gestire l&#39;eccessiva produzione di muco nei pazienti umani affetti da tossicità fosgene 3. Al giorno d&#39;oggi, la tecnica è utilizzata negli esseri umani per studiare la patogenesi del polmone, la diagnosi e la gestione terapeutica delle malattie 3, 24. In animali da laboratorio, BAL è comunemente utilizzato per monitorare risposte infiammatorie, meccanismi immunitari e processi malattie infettive che si verificano nelle vie aeree polmonari 1, 2. Per studiare il modello cellulare infiammatoria in modelli di malattia respiratoria, BAL dovrebbe essere seguito da conta cellulare assoluta e differenziale. Oltre al numero di cella assoluto, i numeri di cella relativi sono interessanti. Ad esempio, i modelli di riparazione e di cancro mostrano very piccolo a nessun BAL aumenta conta delle cellule. In questo modello, la valutazione della composizione cellulare è utile. Utilizzando colorazione della cellula combinata con microscopia ottica, diversi tipi di cellule, come eosinofili, neutrofili, macrofagi e linfociti, possono essere identificati sulla base di morfologia 25, 26, 27, 28, 29, 30. La citometria a flusso può essere utilizzato per valutazioni specifiche, ad esempio per identificare diversi fenotipi cellule T 7, 31. Oltre alla identificazione delle diverse popolazioni cellulari infiltrante, la composizione non cellulare del polmone può essere studiata utilizzando BAL. Metodi come ELISA, immunoblot, matrice citochine perlina, immunoistochimica, e la reazione a catena della polimerasi quantitativa vengono eseguite su BAL determinare citochine, crescitaFattori e altri componenti infiammatori. Per determinare i danni polmonari, i livelli totali di proteine ​​e di lattato deidrogenasi nel fluido BAL possono anche essere misurati 32 , 33 . Con lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici, la caratterizzazione genomica e proteomica dei componenti BAL sarà possibile nel prossimo futuro. La combinazione di funzionalità computazionali in espansione e tecnologie di espressione genica ad alta velocità consentirà di definire profili specifici di espressione genica per vari stati di malattia. L&#39;esecuzione di queste tecniche sul fluido BAL può fornire modelli di espressione genica e proteica per identificare le molecole importanti coinvolte nelle diverse fasi delle malattie polmonari. La limitazione principale dei dati ottenuti con il fluido BAL è la mancanza di comparabilità tra i vari studi di ricerca 3 , 9 . C&#39;è un alto grado divariabilità nella tecnica di lavaggio e il successivo trattamento di BAL. Per poter confrontare ogni prova BAL, è necessario uniformare il tipo di liquido di lavaggio che viene instillata, il sito di instillazione, e la frazione che deve essere analizzato per composizione cellulare e non cellulare. Ci sono differenze significative nel numero di frazioni di lavaggio tra diverse prove, variabile da una a 14 volte 34, 35, 36. Questa differenza può avere un impatto sul numero di cellule totali stimate nei polmoni. E &#39;importante sapere quale frazione BAL contiene la maggior parte delle cellule. Canzone et al. ha mostrato che circa il 70% del numero totale di cellule sono state recuperate in frazione 2:59 22. Tuttavia, altri rapporti hanno suggerito che il secondo lavaggio conteneva più celle rispetto al primo 37, 38 </sup&gt;. Possiamo concludere da questi studi che una lavanda con una sola frazione non rappresenta l&#39;intero polmone, che porta alla errata interpretazione dei risultati. La composizione noncellular del fluido BAL contiene informazioni preziose sullo stato di salute del polmone 33, 39, 40. Variazioni della diluizione del liquido BAL contribuisce alla differenza nella quantificazione della frazione solubile e, di conseguenza, le differenze nei risultati tra prove. Canzone et al. rispetto delle proteine ​​e lattato deidrogenasi di ogni frazione lavanda e concluso che la prima frazione di lavaggio conteneva due a tre volte più della seconda frazione. Per recuperare un campione rappresentativo BAL per l&#39;analisi, alcune considerazioni tecniche sono cruciali. Uno di loro è di eseguire una corretta anestesia. E &#39;molto importante controllare l&#39;arbitro piedelex del mouse per garantire sedazione terminale. Questo è importante non solo per motivi etici, ma anche perché è difficile da posizionare e mantenere il catetere nella posizione corretta se il mouse non è adeguatamente anestetizzato. Una seconda importante considerazione tecnica è la posizione del catetere nella trachea. Quando il catetere viene inserito troppo in profondità, può danneggiare la struttura del polmone. L&#39;estremità distale del catetere non dovrebbe raggiungere i polmoni durante la procedura di BAL. Il catetere deve essere stabilizzata e legato con un filo di cotone. Se il catetere non è stabilizzato, la soluzione salina iniettata può fluire verso l&#39;alto nella cavità nasale anziché verso il basso nei polmoni. Durante l&#39;iniezione e l&#39;aspirazione della soluzione salina, è importante mantenere il catetere costante. I dati ottenuti dal BAL devono rappresentare l&#39;intero polmone murino. Pertanto, è importante infondere un adeguato volume di tampone salino (ie3 mL, suddivisi in 3 aliquote di 1 mL ciascuna). Non esiste una relazione lineare tra la resa cellulare e la resa del fluido BAL. È importante raccogliere la soluzione delicatamente mentre si massaggia il torace del topo. Se le forze di taglio sono troppo forti, la vitalità, la funzione e la struttura delle cellule all&#39;interno delle vie aeree e del fluido BAL possono essere compromesse. Se il liquido aspirato non è visibile nella siringa, spostare con attenzione il catetere più o più in alto nella trachea. Particolare attenzione deve essere rivolta a specifici aspetti dell&#39;elaborazione e dell&#39;analisi BAL. Questo massimizzerà le informazioni conservate dai campioni BAL. Dopo BAL, le cellule sono in un mezzo salino medio povero di nutrienti. È pertanto molto importante elaborare i campioni entro 1 ora dopo il campionamento BAL. Se è necessario uno stoccaggio prolungato, è necessario utilizzare un supporto nutrizionale. Per preservare la vitalità cellulare, evitare tubi che promuovano l&#39;adesione cellulare alla superficie. Evita centrifugation di sospensioni cellulari a velocità che possono compromettere l&#39;integrità cellulare o per prevenire risospensione uniforme delle cellule BAL recuperati. cellule del liquido contenente BAL devono essere centrifugate a 400 xg e 4 ° C per 7 minuti. È importante tenere presente che sospensioni cellulari devono essere tenuti a 4 ° C durante la lavorazione.

Le vie aeree incontrano numerosi insulti, che può portare a infiammazione, patogeno invasione o trasformazione maligna. Le cellule epiteliali che rivestono il lume polmonari costituiscono uno dei principali ostacoli del corpo dei mammiferi. Insieme a macrofagi alveolari, impediscono minacce ambientali da l&#39;ammissione al sistema sistemica attraverso le vie respiratorie. Esempi di tali minacce includono prodotti chimici organici e inorganici, batteri e virus. Analogamente, vaccinazioni specifiche o interventi terapeutici possono essere progettati per indirizzare i polmoni. In tutti questi casi, l&#39;analisi elaborata della risposta evocata è importante capire, intervenire o prevenire processi biologici che avvengono all&#39;interno del sistema respiratorio. lavaggio broncoalveolare (BAL) è un metodo prezioso per analizzare tali risposte, come i campioni risultanti contengono informazioni importanti sulle risposte infiammatorie, meccanismi immunitari, e la progressione della malattia infettivaChe può verificarsi nelle vie respiratorie polmonari 1 , 2 . Utilizzando BAL, è possibile studiare le cellule infiltranti. Questo contrasta con i polmoni digeriti, che danno una popolazione cellulare più &quot;sporca&quot;, con molte cellule morte e appiccicose. BAL viene eseguito introducendo una soluzione salina nei bronchioli terminali e successivamente recuperando questa soluzione. La soluzione recuperata può quindi essere utilizzata per quantificare e analizzare fenotipicamente polmone residente e infiltrare le cellule infiammatorie. Questo metodo è spesso utilizzato per studiare l&#39;afflusso cellulare nei modelli di malattia delle vie aeree, come l&#39;asma, la malattia polmonare cronica ostruttiva (COPD) e modelli di malattie infettive. Oltre alla composizione cellulare, la composizione molecolare delle vie aeree polmonari si riflette anche nel fluido BAL. Per analizzare, si può analizzare l&#39;associazione enzimatica dell&#39;immunosorbente (ELISA), l&#39;immunoblot e l&#39;analisi simultanea di citochine multiple tramite un array di brani di citochineeseguito per valutare la presenza di citochine e chemochine. BAL è un metodo ben consolidata per studiare l&#39;afflusso di cellule infiammatorie in modelli animali di malattia respiratoria infiammatorie. L&#39;osservazione di un afflusso cellulare alterato (ad esempio, livelli aumentati di linfociti, eosinofili, neutrofili o) può portare a migliori intuizioni malattia e può essere un parametro oggettivo per valutare le prestazioni di un intervento terapeutico. L&#39;interpretazione accurata e riproducibile di analisi cellulare BAL richiede che il BAL è eseguita correttamente e che il liquido raccolto viene gestita ed elaborata correttamente. Il termine &quot;lavaggio bronchiale&quot; è stato introdotto più di ottanta anni fa da Stitt 3. Nel 1961, Myrvik ottenuta macrofagi alveolari dal liquido di lavaggio dei polmoni coniglio 3. BAL è ormai un metodo comunemente usato per analizzare e monitorare i polmoni nel modello di topo, ma ilRe è ancora nessun rapporto di una procedura standardizzata BAL nella letteratura scientifica 4, 5. Inoltre, ci sono probabilmente come molti modi per eseguire BAL in quanto vi sono laboratori di ricerca che utilizzano la tecnica del 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11. E &#39;importante che i dati ottenuti dal BAL rappresentano l&#39;intero polmone murino, e non solo una parte del polmone. Questo tipo di variabilità complica l&#39;interpretazione e il confronto dei risultati tra diverse prove. Qui, un procedimento semplice, economico, e riproducibile BAL è descritto che permette la raccolta della frazione cellulare solubile presente nel lume delle vie aeree del mouse. In breve, un catetere viene inserito nella trachea esposto oFa mouse terminalmente anestetizzato. Una siringa è collegata al catetere e viene introdotta nei polmoni una soluzione salina tamponata contenente acido etilendiammina-tetraacetico (EDTA). I lumi del polmone sono campionati con una dolce ripetizione della soluzione salina utilizzando lo stantuffo. La pressione negativa applicata durante questa fase è minima per impedire il crollo delle vie aeree. Dopo la raccolta, il BAL ottenuto dovrebbe essere elaborato ulteriormente per enumerare e identificare le cellule mediante citometria a flusso.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>balanced salt solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethyleendiaminetetra acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E6511</td>
			<td>irritating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G x 1 1/4 needle</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710006030</td>
			<td>size: 0,60 x 30 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G x 1/2 neelde</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4710004512</td>
			<td>size: 0,45*12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic tubing</td>
			<td>BD medical technology</td>
			<td>427411</td>
			<td>Polyethylene Tubing, I.D 0.58 mm (.023&#34;) O.D. .965 mm (0.38&#34;) 30.5m (100&#39;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium pentobarbital</td>
			<td>Kela NV</td>
			<td>514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td>PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml syringes</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>5010.200V0</td>
			<td>non pyrogenic and non toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH&#160;</td>
			<td>91197-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools GmbH&#160;</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tube 50 ml</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>7696705</td>
			<td>Free from Rnase/Dnase/endotoxin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge tube 15 ml</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>7696702</td>
			<td>Free from Rnase/Dnase/endotoxin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tube 1,5 ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>0030 120.094</td>
			<td>polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>live/dead -efluor506</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>65-0866-18 &#160;</td>
			<td>fixable viability dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c-PE-cy7</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>25-0114-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SiglecF-PE</td>
			<td>BD Pharmingen&#160;</td>
			<td>552126&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHCII-APCefluor780</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>107628&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-PE-cy5</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55-0031-U100&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-PE-cy5</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>15-0193-83&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-V450</td>
			<td>BD Pharmingen&#160;</td>
			<td>560455&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6G-AF700</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Counting Beads</td>
			<td>Life Technologies Europe B.V.&#160;</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD16/CD32</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well 340 &#181;l storage plate plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353263</td>
			<td>V-bottom, natural polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catheter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>393202</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bronchoalveolar lavage of murine lungs to analyze inflammatory cell infiltration

Lavaggio Broncoalveolare (BAL) è una procedura sperimentale che viene utilizzata per esaminare il contenuto cellulare e acellulare del lume polmonare ex vivo per ottenere una visione di uno stato di malattia in corso. Qui viene descritto un metodo semplice ed efficiente per eseguire BAL sui polmoni murini senza la necessità di strumenti o attrezzature speciali. Il liquido BAL viene isolato mediante l&#39;inserimento di un catetere nella trachea di topi terminalmente anestetizzati, attraverso i quali viene solcata una soluzione salina nei bronchioli. Il fluido instillato viene ritratto dolcemente per massimizzare il recupero del liquido BAL e per ridurre al minimo le forze di taglio. Questa tecnica consente di preservare la vitalità, la funzione e la struttura delle cellule all&#39;interno delle vie aeree e del fluido BAL. Numerose tecniche possono essere applicate per ottenere una maggiore comprensione dello stato di malattia del polmone. Qui, una tecnica comunemente utilizzata per l&#39;identificazione e l&#39;enumerazione di diversi tipi di cellule immunitarie èdescritto, dove la citometria a flusso è unito con un pannello di selezione di marcatori specifici superficiali cellulari fluorescente. La procedura BAL qui presentata può essere utilizzato anche per analizzare gli agenti infettivi, costituenti del fluido o di particelle inalate all&#39;interno polmoni murini.

Dopo l&#39;esecuzione di BAL con 3x1 mL di soluzione salina tamponata, occorre recuperare un volume compreso tra 2 e 3 mL. Questo fluido BAL può essere analizzato ulteriormente per caratterizzare il contenuto cellulare e non cellulare. Per studiare la presenza di citochine e chemocine, può essere eseguita l&#39;ELISA 19 , l&#39;immunoblot 20 e l&#39;analisi simultanea di citochine multiple mediante una matrice di raggi di citochine 21 . Inoltre, l&#39;albumina e il contenuto proteico totale di questo fluido possono essere determinati 22 . Ad esempio, questo manoscritto descrive come analizzare il contenuto cellulare del fluido BAL mediante citometria a flusso. Il fluido BAL analizzato è stato raccolto da topi femminili Balb / cAnNCrl (età: 7 settimane) 24 h dopo che sono stati intratrachealmente istruiti con lipopolisaccaride. I seguenti anticorpi, accoppiati ad un fluoroforo,Sono stati utilizzati per identificare i diversi tipi di cellule: CD11c, SiglecF, MHCII, CD3ε, CD19, Ly6g e CD11b (vedere tabella 1 e tabella dei materiali ). Viene inoltre utilizzato il colorante di vitabilità fisso. Utilizzando una strategia di gating basata sull&#39;espressione differenziale di antigeni sulle superfici delle diverse popolazioni cellulari ( Figura 1 ), è stato possibile identificare macrofagi, cellule dendritiche, cellule B, cellule T, neutrofili e eosinofili. Innanzitutto, i detriti ei doppi sono stati eliminati in base ai parametri avanti e laterali. Un colorante di vitabilità ha facilitato il gating sulle cellule vive. Successivamente, sono state identificate le cellule alte CD11c e le basse cellule CD11c. Nell&#39;alta popolazione CD11c, i macrofagi e le cellule dendritiche sono stati identificati in base all&#39;espressione MHCII e SiglecF. Nella popolazione bassa CD11c, le cellule T e le cellule B sono state identificate in base all&#39;espressione CD3ε e CD19, rispettivamente. In thE la restante popolazione cellulare, i neutrofili e gli eosinofili sono stati identificati sulla base dell&#39;espressione del marker CD11b e Ly-6G. Le perline di conteggio sono state aggiunte per determinare i numeri di cellule assoluti delle diverse popolazioni di cellule confrontando il rapporto degli eventi di branco agli eventi di cellule 23 . Queste perline di conteggio sono state identificate in base alle loro proprietà di avanzamento e di dispersione laterale ( Figura 1 ). La tabella 4 fornisce una panoramica dei numeri di cellule assoluti delle diverse popolazioni di cellule nel fluido BAL di un topo naïve e di un topo stimolato per 24 h con 5 μg di liposolisaccaride. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55398/55398fig1.jpg" /> Figura 1: Strategia di Gating per la rilevazione citometrica dei flussi di macrofagi, cellule dendritiche, cellule T, cellule B, neutrofili e eosinofili iN Fluido BAL. Le cellule BAL sono state isolate utilizzando il protocollo BAL descritto. Le cellule sono state isolate dai topi 24 h dopo l&#39;instillazione intracranica del lipopolisaccaride. Le perline e le celle di conteggio sono state identificate in base alle proprietà di spostamento avanti e laterale. Nel cancello cellulare sono state identificate singole cellule usando il dispersione avanti e laterale. In questa ultima popolazione, le cellule vive sono state identificate. Allo stesso modo sono state identificate le cellule alte CD11c e le basse cellule CD11c. Nell&#39;alta popolazione CD11c, i macrofagi e le cellule dendritiche sono stati identificati in base all&#39;espressione MHCII e SiglecF. Nella popolazione bassa CD11c, le cellule T e le cellule B sono state identificate in base all&#39;espressione CD3ε e CD19, rispettivamente. Nella restante popolazione cellulare, i neutrofili e gli eosinofili sono stati identificati sulla base dell&#39;espressione CD11b e Ly-6G, rispettivamente. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55398/55398fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una pagina</a>Versione più grande di questa figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Popolazione cellulare </td><td> Numero assoluto di cellule in topi ingenuo </td><td> Numero assoluto di cellule in topi stimolati da LPS </td></tr><tr><td> macrofagi </td><td> 79.612 </td><td> 25.439 </td></tr><tr><td> Cellule dendritiche </td><td> 495 </td><td> 671 </td></tr><tr><td> Cellule T </td><td> 45.271 </td><td> 28.089 </td></tr><tr><td> B cellule </td><td> 4.164 </td><td> 2.926 </td></tr><tr><td> neutrofili </td><td> 632 </td><td> 566.716 </td></tr><tr><td> eosinofili </td><td> 3.483 </td><td> 4.332 </td></tr></tbody></table> Tabella 4: RappresentaI risultati tativi della Citometria a Flusso di analisi sul fluido BAL di topi ingenuo e LPS-stimolati.

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Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Lo stato di salute del polmone si riflette il tipo e il numero di cellule immunitarie che sono presenti nei bronchioli dei polmoni. Descriviamo una tecnica di lavaggio broncoalveolare che consente di isolare e studio delle cellule non aderenti e fattori solubili dal tratto respiratorio inferiore dei topi.

Lavaggio broncoalveolare murini di polmoni per analizzare infiammatoria infiltrazione cellulare

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

66.4K Views.  VIB.  Lo stato di salute del polmone si riflette il tipo e il numero di cellule immunitarie che sono presenti nei bronchioli dei polmoni. Descriviamo una tecnica di lavaggio broncoalveolare che consente di isolare e studio delle cellule non aderenti e fattori solubili dal tratto respiratorio inferiore dei topi. 

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Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

Peptide: MHC Tetramero basata Arricchimento di epitopi specifici per cellule T

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen interactions take advantage of intraperitoneal injections of select bacteria or pathogen associated molecular patterns (PAMPs) in mice. While these techniques have yielded tremendous data associated with infectious disease pathobiology, intraperitoneal injection models are not always appropriate for host-pathogen interaction studies in the lung. Utilizing an acute lung inflammation model in mice, it is possible to conduct a high resolution analysis of the host innate immune response utilizing lipopolysaccharide (LPS). Here, we describe the methods to administer LPS using nonsurgical oropharyngeal intratracheal administration, monitor clinical parameters associated with disease pathogenesis, and utilize bronchoalveolar lavage fluid to evaluate the host immune response. The techniques that are described are widely applicable for studying the host innate immune response to a diverse range of PAMPs and pathogens. Likewise, with minor modifications, these techniques can also be applied in studies evaluating allergic airway inflammation and in pharmacological applications.

The host immune response to pathogen infection is a tightly regulated process. Utilizing a lipopolysaccharide lung exposure model in mice, it is possible to conduct high resolution evaluations of the complex mechanisms associated with disease pathogenesis.

L&#39;utilizzo di orofaringea intratracheale PAMP Amministrazione e lavaggio broncoalveolare per valutare la risposta immunitaria nei topi Host

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration and differentiation, and cytokine production. All of these events are tightly linked to the energy status of the cell, and therefore studying the energy-producing pathways may give clues about the overall functionality of these cells. The extracellular flux analyzer is a commonly used device for evaluating the performance of glycolysis and mitochondrial respiration in many cell types. This system has been used to study immune cells in a few published reports, yet a comprehensive protocol optimized particularly for lymphocytes is lacking. Lymphocytes are fragile cells that survive poorly in ex vivo conditions. Oftentimes lymphocyte subsets are rare, and working with low cell numbers is inevitable. Thus, an experimental strategy that addresses these difficulties is required. Here, we provide a protocol that allows for rapid isolation of viable lymphocytes from lymphoid tissues, and for the analysis of their metabolic states in the extracellular flux analyzer. Furthermore, we provide results of experiments in which the metabolic activities of several lymphocyte subtypes at different cell densities were compared. These observations suggest that our protocol can be used to achieve consistent, well-standardized results even at low cell concentrations, and thus it may have broad applications in future studies focusing on the characterization of metabolic events in immune cells.

The study of metabolism is becoming increasingly relevant to immunological research. Here, we present an optimized method for measuring glycolysis and mitochondrial respiration in mouse splenocytes, and T and B lymphocytes.

Un protocollo ottimizzato per analizzare glicolisi e mitocondriale respirazione nei linfociti

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.

Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.

Flusso Virometry per analizzare antigenica spettri di virioni e extracellulare vescicole

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

L&#39;induzione di una risposta infiammatoria in colture primarie epatociti di topi

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the transmigration of innate immune monocytes to inflammatory sites of deposited lipid called fatty streaks, which are present in arterial walls of medium to large arteries. The key pathogenic feature of lesions at this early stage of atherosclerosis is the maturation of monocytes which migrate into arteries to form foam cells or lipid-laden macrophages. Considerable evidence supports the hypothesis that risk of atherosclerosis is increased by chronic inflammatory conditions accompanying diseases such as rheumatoid arthritis and HIV, as well as general ageing, and that this risk is predicted by monocyte activation. While mouse models provide a good platform to investigate the role of monocytes in atherogenesis in vivo, they require genetic alteration of natural cholesterol metabolism and drastic alteration of normal mouse diets, and have limited suitability for the study of atherogenic influences of human comorbid diseases. This motivated us to develop a human in vitro model to measure the atherogenic potential of monocytes isolated from individuals with defined disease states. Currently, human in vitro models are limiting in that they evaluate monocyte transmigration and foam cell formation in isolation. Here we describe a protocol in which monocytes isolated from patient blood transmigrate across human endothelial cells into a type 1 collagen matrix, and their propensity to mature into foam cells in the presence or absence of exogenous lipid is measured. The protocol has been validated for the use of human monocytes purified from individuals with HIV infection and elderly HIV uninfected individuals. This model is versatile and allows monocyte transmigration and foam cell formation to be evaluated using either microscopy or flow cytometry as well as allowing the assessment of atherogenic factors present in serum or plasma.

We describe a protocol to measure transmigration by monocytes across human endothelial monolayers and their subsequent maturation into foam cells. This provides a versatile method to assess the atherogenic properties of monocytes isolated from people with different disease conditions and to evaluate factors in blood which may enhance this propensity.

Quantificazione della trasmigrazione del monocito e formazione delle cellule della gomma piuma da individui con condizioni infiammatorie croniche

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Un nuovo sistema privo di alimentatore per la produzione di massa di cellule di assassino naturali murini In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

Monitoraggio a lungo termine In Vivo della cellula infiammatoria dinamica all'interno della drosofila pupe

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during physiological and pathological states. The isolation of EVs continues to be a major challenge in this field, due to limitations intrinsic to each technique. The differential ultracentrifugation with density gradient centrifugation method is a commonly used approach and is considered to be the gold standard procedure for EV isolation. However, this procedure is time-consuming, labor-intensive, and generally results in low scalability, which may not be suitable for small-volume samples such as bronchoalveolar lavage fluid. We demonstrate that an ultrafiltration centrifugation isolation method is simple and time- and labor-efficient yet provides a high recovery yield and purity. We propose that this isolation method could be an alternative approach that is suitable for EV isolation, particularly for small-volume biological specimens.

Here, we describe two extracellular vesicle isolation protocols, ultrafiltration centrifugation and ultracentrifugation with density gradient centrifugation, to isolate extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid samples. The extracellular vesicles derived from murine bronchoalveolar lavage fluid by both methods are quantified and characterized.

Isolamento delle vescicole extracellulari dal fluido di lavaggio broncoalveolare murino usando una tecnica di centrifugazione di ultrafiltrazione

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Bronchoscopy is a medical procedure whereby normal saline is injected into the lungs via a bronchoscope and then suction is applied, removing bronchoalveolar lavage (BAL) fluid. The BAL fluid is rich in cells and can thus provide a 'snapshot' of the pulmonary immune milieu. CD4 T cells are the best characterized HIV reservoirs, while there is strong evidence to suggest that tissue macrophages, including alveolar macrophages (AMs), also serve as viral reservoirs. However, much is still unknown about the role of AMs in the context of HIV reservoir establishment and maintenance. Therefore, developing a protocol for processing BAL fluid to obtain cells that may be used in virological and immunological assays to characterize and evaluate the cell populations and subsets within the lung is relevant for understanding the role of the lungs as HIV reservoirs. Herein, we describe such a protocol, employing standard techniques such as simple centrifugation and flow cytometry. The CD4 T cells and AMs may then be used for subsequent applications, including immunophenotyping and HIV DNA and RNA quantification.

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

We describe a method for processing bronchoalveolar lavage fluid and matched peripheral blood from chronically HIV-infected individuals on antiretroviral therapy to assess pulmonary HIV reservoirs. These methods result in the acquisition of highly pure CD4 T cells and alveolar macrophages that may subsequently be used for immunophenotyping and HIV DNA/RNA quantifications by ultrasensitive polymerase chain reaction.

Trattamento del bronchoalveolar Lavage Fluid e del sangue abbinato per il macrofago alveoere e CD4- Immunofenotyping a cellule T e valutazione del serbatoio dell'HIV

Lavaggio broncoalveolare murini di polmoni per analizzare infiammatoria infiltrazione cellulare

Riepilogo

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