Name: fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals
Uploaded: 2017-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals at JoVE

Grip Referans ve Araştırma İşbirliği Merkezi Melbourne DSÖ Avustralya Hükümeti Sağlık Bakanlığı tarafından desteklenmektedir.

1. Belirlenmesi bir Fluorometer&#39;de Floresan Ürün 4-MU Lineer Aralığı <ol><li> mutlak etanol, 5 ml 4-MU 11.3 mg eritilmesi ile 6.4 mM 4-MU stok çözeltisi, 10 mL hazırlayın. (Ağırlık / hacim) stok çözeltisi, 10 mL yapmak için% 0.9 NaCl 5 mL ekleyin. 9 mL 1x deney tamponu (33.3 mM 2- (N-morfolino) etansülfonik asit (MES) ve 4 mM CaCl2, pH 6.5) içinde 6.4 mM 4-MU 1 mL seyreltilerek çalışma çözeltisi 640 uM hazırlayın. Not: MES, 13 g damıtık suyun 8 mL 1 M CaCb 2 992 ml ilave edilerek 2 x deney tamponu hazırlayın. NaOH, 10 M ile pH 6,5&#39;e ayarlanır. gözenek boyutu 0.2 um steril selüloz asetat filtre kullanılarak tampon filtre. Dikkat! Sodyum hidroksit, kostik ve deriye ve gözlere kimyasal yanıklara neden olabilir. O tam kişisel koruyucu ekipman yıpranmış olduğundan emin olun. </li><li> 4-MU konsantrasyonda (yani, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, 80 uM, 160 # bir dizi 5 mL hazırlanması181; M ve 1 x deney tamponu kullanılarak 640 uM 4-MU bir, iki kat seri seyreltme ile 320 uM). </li><li> 4-MU (yani, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, 80 uM, 160 uM, 320 uM ve 640 uM), berrak içerisine (seyreltme başına iki oyuk), 96- her seri seyreltme, 50 uL dağıtın gözlü düz tabanlı levhada ve (arka plan sinyallerini ölçmek için boşlukları olarak hizmet eden) geri kalan kuyular içine 1 x deney tamponu 50 uL. Not: reaksiyon hacmi içinde 4-MU son konsantrasyonları (50 uL 4-MU + 50 uL 300 uM Munana), 160 uM ve 320 uM 2.5 uM, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, 80 uM olan . </li><li> damıtılmış suyun 20 mL Munana 25 mg sulandırılması ile 2.5 mM MUNANA stok çözelti hazırlayın. 300 uM Munana çalışma çözeltisi (bir plaka için yeterli hacmi) elde etmek üzere 5.28 mL 1x deney tamponu ile 2.5 mM MUNANA 0.72 mL karıştırın. 300 uM Munana workin içeren tüp Kapakhemen kullanılan sürece g alüminyum folyo ile çözeltisi ve buz üzerinde tutun. herhangi bir artık malzeme atılır. Not: 2.5 mM MUNANA stok çözeltisi, 1 ay boyunca -20 ° C &#39;de muhafaza edilebilir ve bir donma / erime döngüsüne içinde kullanılmalıdır. 4-MU ve Munana çözeltiler ışığa duyarlı olan ve uzun süreli ışığa maruz kalmaktan korunmalıdır. </li><li> hafifçe karıştırmak için dokunun her kuyuya 300 uM Munana 50 mcL ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Buharlaşmayı önlemek için bir plaka kapatıcı ile örtün plaka. NOT: Bu adım, NA engelleme tahlilinde eşiğe hesaba etmektir. </li><li> 0.824 M NaOH 2.225 mL (bir plaka için yeterli hacim) ile mutlak etanol 11 mL karıştırılarak durdurma çözeltisi hazırlayın. </li><li> Reaksiyonu durdurmak ve hafifçe karıştırmak için dokunun her stop solüsyonu 100 mcL ekleyin. </li><li> PE olarak, 355 nm&#39;lik bir eksitasyon dalga boyu ayarı ve 460 nm&#39;lik bir emisyon dalga boyu ayarlı bir florometre kullanılarak plaka okumaÜreticinin talimatlarını r. </li><li> bir 4-MU içeren bütün yuvalara floresans sinyalleri kullanan ortalama arka zemin sinyali hesaplayın. 4-MU ihtiva eden yuvaların her biri bu ortalama arka zemin sinyali çıkarma ve her 4-MU konsantrasyonu için ortalama sinyal (RFU) hesaplar. Şekil 1a&#39;da gösterilen 4-MU konsantrasyonu (uM) karşı RFU bir standart eğri çizilir; Eğrinin yakından lineer kesiti Şekil 1b &#39;de gösterilmiştir. </li><li> doğrusal aralığını ve optimum hedef sinyalini belirlemek için 4-MU konsantrasyonu (uM) karşı RFU arsa Görselleştirin; lineer aralığı olduğu arsa üzerinde 4-MU artan konsantrasyonları ile orantılı olarak floresans sinyali arttıkça, en uygun hedef sinyal doğrusal aralığı içindeki bir rasgele 4-MU konsantrasyonu ise. NOT: doğrusal aralık ve optimal hedef sinyal florimetre özeldir. Örneğin, Melbourne WHOCCRRI de florimetre 2 doğrusal bir aralığı vardır0,5-40 uM 4-MU ve ~ 1.500 RFU tekabül ~ 30 uM 4-MU, optimal hedef sinyal. </li></ol> 2. Virüs NA Etkinliğinin Belirlenmesi NOT: Grip virüsleri Madin-Köpek Böbrek (MDCK) hücreleri veya embriyo halindeki tavuk yumurtalarının 8&#39;de yeterli titrelerine için kültürlenir. <ol><li> % 0.1 TFA içeren 1. sütun içine seyreltilmemiş kültür influenza virüslerinin oyuk başına 120 uL ve 1 x deney tamponu 60 uL dağıtın NP-40, 96 oyuklu U tabanlı bir plakanın geriye kalan 11 sütun halinde. </li><li> Seri olarak plaka boyunca virüslerin, iki kat seyreltme yerine (örneğin, sütun 2 sütun 1 60 uL transferi ve benzeri, sütun 11 kadar) sadece 1 x deney tamponu içeren bir boş olarak kolon 12 bırakarak bir çok kanallı pipet kullanarak. </li><li> berrak, 96-çukurlu, düz-tabanlı bir plakaya oyuklara (seyreltilmiş virüs ve boşluklar) her biri 50 uL aktarın. NOT: Bu c gerekli değildirMalzemeler 1. sütun üzerine kolon 12&#39;den transfer edilmesi halinde hange pipet uçları. </li><li> oyuk başına (1.4 adım göre hazırlanmıştır), 300 uM Munana 50 uL eklenir ve hafifçe karıştırın plaka dokunun. 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe plakası. Buharlaşmayı önlemek için bir plaka kapatıcı ile örtün plaka. </li><li> reaksiyonun sona erdirilmesi ve yavaşça plaka karıştırmak için dokunun göz başına (adım 1.6 uygun olarak hazırlandı) durdurma çözeltisi, 100 uL ekleyin. </li><li> Bir fluorometreyle plakasını okuyun. <ol><li> 355 nm&#39;lik bir uyan dalga boyu ayarı ve 460 nm emisyon dalga boyu ayarını kullanın. </li></ol></li><li> 12. kolonunda floresans değeri göre ortalama arka zemin sinyali belirlemek ve her bir ortalama arka plan sinyali çıkarılır. Virüs dilüsyonları karşı RFU grafiğini çiziniz. Not: WHOCCRRI Melbourne 100 uM Munana için arka plan değerleri 50 ve 120 RFU arasında, tipik olarak, ancak bu florimetre bei bağlı olarak farklılıkng kullanılır. </li><li> Her bir virüs (Şekil 2) için eğrinin doğrusal bölümünün orta-noktasını belirlemek için virüs seyreltmeleri karşı RFU arsa gör. referans noktası olarak (aşama 1 &#39;de belirlenen) en uygun hedef sinyali kullan. Not: Bu bölüm 1 &#39;de tayin florometre 4-MU lineer aralığı uygun olmalıdır ve virüslerin uygun bir konsantrasyon bölüm 3&#39;te kullanılmak üzere sağlar. </li></ol> 3. NA önleme deneyi kullanılarak NA İnhibitörlerine Virüs duyarlılık değerlendirilmesi <ol><li> 300 uM konsantrasyonlarda NA inhibitörlerinin ana stoklarının hazırlanması. <ol><li> 50 ml 2 x deney tamponu (66.6 mM MES ve 8 mM CaCl2, pH 6.5) zanamivir 5.0 mg eritilmesi ile 300 uM zanamivir (molekül ağırlığı, molekül ağırlığı = 332,32 g / Mol) hazırlayın. </li><li> 2 x deney tamponu, 50 mL 5.8 mg çözülmesiyle (MW = 386,44 g / mol D-tartrat) 300 uM oseltamivir karboksilat hazırlayın. </li><li> hazırlamak300 uM peramivir trihidrat (MW = 382,45 g / Mol) 2 x deney tamponu, 50 mL 5.7 mg çözülmesiyle. </li><li> 2 x deney tamponu, 50 mL 5.2 mg çözülmesiyle 300 uM laninamivir (MW = 346,34 g / Mol) hazırlayın. Not: NA inhibitörü ana stoklar 12 ay boyunca -20 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. Doğru ağırlıkları ve hacimleri, yeniden kullanılır sağlamak NA inhibitörü MW edin. Oseltamivir karboksilat ön-ilaç, oseltamivir fosfat aktif bileşiktir. Bu nedenle, sadece oseltamivir karboksilat NA engelleme tahlilinde kullanılmalıdır. </li></ol></li><li> master stoklar kaynaktan, 0.03 nM, 0.3 nM, 3 nM, 30 nM, 300 nM, 3,000 nM konsantrasyonlarda 50 ml lik santrifüj tüpleri içinde NA inhibitörü olarak on kat seri seyreltmeler stokları çalışma hazırlanması ve 2x deneyde 30.000 nM tampon (66.6 mM MES, ve 8 mM CaCl2, pH 6.5); Bu çoklu tahliller arasında kullanım içindir. Not: Reaksiyon volum NA inhibitörü nihai konsantrasyonlarıE (virüs seyreltme 300 uM Munana + 50 uL NA inhibitörü + 50 uL 50 uL), sırasıyla 0.01 nM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1,000 nM ve 10,000 nM bulunmaktadır. nihai konsantrasyon durdurma çözeltisi, 100 uL içermez. 2-8 ° C sıcaklıkta bütün NA inhibitörleri dilüsyonları saklayın. Son kullanma tarihi ana stoklarının aynıdır. </li><li> 96 derin oyuklu blokta% 0.1 NP-40 yüzey aktif madde ihtiva eden 1 x deney tamponu içinde virüs seyreltim dizileri hazırla. Dört NA inhibitörlerini test etmek virüs başına 2 mL toplam hacim kullanma bölüm 2. türetilen NA etkinlik tahlili sonuçlarına göre virüs seyreltmeleri kullanın. NOT: 96 derin oyuklu bloğunda virüs başına iki kuyu (oyuk başına 1 ml) hazırlayın. VİRÜS 1, 2 ve 3 için virüs seyreltmeleri örnekleri Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir. </li><li> 8, derin gözlü rezervuara (adım 3.2 uygun olarak hazırlandı) NA inhibitörlerinin gerekli hacmi koyun. Oradan, değişen seyreltiklerinde 50 uL NA inhibitörlerinin dağıtmak 0 nM (2x deney bUffer sadece) berrak, 96-çukurlu, düz-tabanlı plaka içindeki H&#39;ye kadar olan sıralara A 30,000 nM. Not: levha düzeni, Şekil 3&#39;te gösterilmektedir. </li><li> İyice karıştırın ve 45 dakika için oda sıcaklığında inkübe plaka dokunun yalnızca sütun 12. sütunlar 1-11 ve 1 x deney tamponu oyuk başına 50 uL oyuk başına seyreltilmiş test virüslerinin 50 uL ekleyin. Buharlaşmayı önlemek için bir plaka kapatıcı ile örtün plaka. </li><li> oyuk başına (1.4 adım göre hazırlanmıştır), 300 uM Munana 50 uL eklenir ve hafifçe karıştırın plaka dokunun. 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe plakası. Buharlaşmayı önlemek için bir plaka kapatıcı ile örtün plaka. </li><li> karıştırmak için plaka dokunun de hafifçe her birine (adım 1.6 uygun olarak hazırlandı) durdurma çözeltisi, 100 uL ekleyin. </li><li> Bir fluorometreyle plakasını okuyun. <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi, 355 nm&#39;lik bir eksitasyon dalga boyu ve 460 nm&#39;lik bir emisyon dalga boyunu kullanarak. </li></ol></li></ol> 4. HesaplamaIC 50 Değerler Not: JASPR v1.2 IC50 değerlerinin hesaplanmasını sağlar eğri uydurma yazılımı. yazılım CDC, Atlanta, ABD Grip Bölümü tarafından geliştirildi. Yazılım denklem kullanır: H = Vmaks x (1 - ([I] [l])) / (K +), V max metabolizması maksimum hızı olduğu, [I], V inhibitör konsantrasyonudur olan yanıtı inhibe edilen, ve K inhibisyon eğrisi için IC50. <ol><li> Kopyalama ve 12 kolon plaka biçiminde (96-gözlü) &#39;de bir elektronik tabloya florometre tarafından üretilen ham verileri yapıştırın hücre A1 ile başlanarak hazırlandı. NOT: sonraki her plakadan Ham veri bir sıra boş sendeleyerek edilmelidir. buradaki her bir virüs, dört NA inhibitörü karşı test edilmişse, (her bir plaka arasında boş bir sıra ile) dört bir kümesindeki ham verileri yapıştırın. </li><li> uydurma yazılım ve cl açın&quot;Deney&quot; sekmesine Ick. &quot;Alternatif 2-ilaç Flor 11 Örnekleri&quot; ı seçin. </li><li> &quot;Seçenekler&quot; sekmesini tıklayın ve kene &quot;Grafikler oluşturun.&quot; </li><li> &quot;Seçenekler&quot; tekrar tıklayın ve &quot;Yeni Anahtar&quot; sekmesine tıklayın. Ham veriler tablo dosyası ile aynı klasörde &quot;inhibition_key&quot; .csv dosyası olarak kaydedin. </li><li> inhibition_key dosyasında, ID altındaki tüm örnek adlarını listeler. Her örnek adı benzersiz olmalıdır. </li><li> Dört NA inhibitörleri test edilmiştir ise, Oseltamivir altında iki ek satır için boşluk eklemek ve &quot;peramivir&quot; ve tip &quot;Laninamivir.&quot; inhibition_key dosyaya yapılan değişiklikleri kaydedin. </li><li> &quot;Jaspr v 1.2-İnhibisyon Eğri uydurma&quot; penceresi dönün ve olarak &quot;Deney Dosya&quot; ve inhibition_key olarak ham veri dosyasını seçin &quot;Anahtar Dosyası.&quot; analizini çalıştırın. .csv ve .pdf formatlarında sonuçları kaydedin. NOT: yazılım otomatik bir inhibisyon eğrisini çizmek olacaktır (RFU agaiNST NA inhibitörü konsantrasyonları), Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi. Bu program aynı zamanda tek bir NA inhibitörü (Şekil 4) karşı her bir virüs için IC50 değerlerini hesaplar. Buna ek olarak, JASPR IC50 değerleri ve tablo biçiminde sinyal-arka plan (S / B) oranı sunmaktadır. Arka plan değerleri kullanılır florometrede bağlı laboratuardan laboratuara farklılık gösterebilir. Melbourne WHOCCRRI anda, arka plan 50 ila 120 RFU 100 uM Munana aralığı için değer verir. 10&#39;dan daha az bir oran, özellikle çok düşük bir NA aktiviteye sahip mutant virüs, yine de kabul edilebilir olmasına rağmen güvenilir bir IC50 değeri, ≥10 bir S / B oranı tercih edilir. </li><li> IC50 değerleri ve yazılımı ile üretilen eğri şekiller kontrol edin. Bütün veri noktaları, ilgili düşebilir veya eğrisine yakın olmalıdır; Eğer başaramazlarsa, NA önleme deneyi tekrarlayın. NOT: olağanüstü yüksek IC 50 değerlerini gösteren virüsler için tahlil tekrarı olmalıed sonucu teyit etmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Moscona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuraminidase+inhibitors+for+influenza.">Neuraminidase inhibitors for influenza.</a> N.Engl.J.Med. 353 (13), 1363-1373 (2005).</li><li>Hurt, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+update+on+the+susceptibility+of+human+influenza+viruses+to+neuraminidase+inhibitors.">Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors.</a> Antiviral Res. 132, 178-185 (2016).</li><li>Meijer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+update+on+the+susceptibility+of+human+influenza+viruses+to+neuraminidase+inhibitors.">Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors.</a> Antiviral Res. 110, 31-41 (2014).</li><li>Takashita, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+update+on+the+susceptibility+of+human+influenza+viruses+to+neuraminidase+inhibitors.">Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors.</a> Antiviral Res. 117, 27-38 (2015).</li><li>Lackenby, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+resistance+to+oseltamivir+among+influenza+A(H1N1)+viruses+in+Europe.">Emergence of resistance to oseltamivir among influenza A(H1N1) viruses in Europe.</a> Euro Surveill. 13 (5), (2008).</li><li>Hurt, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+transmission+of+oseltamivir-resistant+A(H1N1)pdm09+influenza.">Community transmission of oseltamivir-resistant A(H1N1)pdm09 influenza.</a> N Engl J Med. 365 (26), 2541-2542 (2011).</li><li>Takashita, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+large+cluster+of+influenza+A(H1N1)pdm09+viruses+cross-resistant+to+oseltamivir+and+peramivir+during+the+2013-2014+influenza+season+in+Japan.">Characterization of a large cluster of influenza A(H1N1)pdm09 viruses cross-resistant to oseltamivir and peramivir during the 2013-2014 influenza season in Japan.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (5), 2607-2617 (2015).</li><li>Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+virus+isolation,+culture+and+identification.">Influenza A virus isolation, culture and identification.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2663-2681 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meetings+of+the+WHO+working+group+on+surveillance+of+influenza+antiviral+susceptibility+-+Geneva,+November+2011+and+June+2012.">Meetings of the WHO working group on surveillance of influenza antiviral susceptibility - Geneva, November 2011 and June 2012.</a> Wkly Epidemiol Rec. 87 (39), 369-374 (2012).</li><li>Okomo-Adhiambo, M., Hurt, A. C., Gubareva, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemiluminescent+neuraminidase+inhibition+assay:+a+functional+method+for+detection+of+influenza+virus+resistance+to+the+neuraminidase+inhibitors.">The chemiluminescent neuraminidase inhibition assay: a functional method for detection of influenza virus resistance to the neuraminidase inhibitors.</a> Methods Mol Biol. 865, 95-113 (2012).</li><li>Hurt, A. C., Okomo-Adhiambo, M., Gubareva, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescence+neuraminidase+inhibition+assay:+a+functional+method+for+detection+of+influenza+virus+resistance+to+the+neuraminidase+inhibitors.">The fluorescence neuraminidase inhibition assay: a functional method for detection of influenza virus resistance to the neuraminidase inhibitors.</a> Methods Mol Biol. 865, 115-125 (2012).</li><li>Analysis of IC50 data. isirv Antiviral Group (isirv-AVG) Available from: <a target="_blank" href="https://isirv.org/site/index.php/methodology/analysis-of-ic50-data">https://isirv.org/site/index.php/methodology/analysis-of-ic50-data</a> (2016)</li><li>Sleeman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R292K+substitution+and+drug+susceptibility+of+influenza+A(H7N9)+viruses.">R292K substitution and drug susceptibility of influenza A(H7N9) viruses.</a> Emerg Infect Dis. 19 (9), 1521-1524 (2013).</li><li>Gubareva, L. V., Robinson, M. J., Bethell, R. C., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+and+framework+mutations+in+the+neuraminidase+active+site+of+influenza+viruses+that+are+resistant+to+4-guanidino-Neu5Ac2en.">Catalytic and framework mutations in the neuraminidase active site of influenza viruses that are resistant to 4-guanidino-Neu5Ac2en.</a> J Virol. 71 (5), 3385-3390 (1997).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

NA inhibitörlerine grip virüsü duyarlılık küresel izleme anda flüoresan veya kimyasal olarak ışık veren NA engelleme deneyleri 11, 12 kullanarak Bir çok laboratuarda ile yürütülmektedir. floresan deneyi daha yaygın kimyasal parlaklık deneyinde daha kullanılır. Her iki testte de sağlam ve tekrarlanabilir olmasına rağmen, flüoresan bazlı deneyde elde edilen IC50 değerleri 13 zor iki deneyden elde edilen verilerin doğrudan bir karşılaştırma yapmak, kimyasal ışıldama bazlı deneyde genellikle daha yüksektir. Hatta aynı protokol kullanılarak, bir laboratuardan elde edilen veri bir arasında değişebilir. Çünkü laboratuarlar arasında bu varyasyonların, WHO Çalışma Grubu Grip Antiviral DUYARLILIKLARININ Gözetim üzerinde laboratuvarlar arası karşılaştırmalar yardımcı olacak bir kılavuz üretti. Daha ziyade, bu kılavuz araç kullanımı mutlak IC50 değerleri karşılaştırarak dahamedyan her bir laboratuarda test NI influenza virüslerinin IC50 IC 50 kat farka dayalı olarak sa karşılaştırması. Beş işbirliği merkezlerinden verileri karşılaştırmak yeteneği küresel Antiinfluenza duyarlılık verileri 2, 3, 4 yıllık yayın ile sonuçlanmıştır. Kamu malı grip duyarlılık verilerin büyük miktarda mevcudiyeti araştırmacılar kendi laboratuarlarında üretilen bu olanlar çalışmalardan IC50 verileri karşılaştırmak için izin verir. benzer bir kavram kabul Diğer NA engelleme analizleri de ticari olarak mevcuttur. Hazır kullanımlı reaktifleri içerir Bu ticari takımlar (NA dahil değildir inhibitörleri) eşit tekrarlanabilir. reaktiflerinin çoğu, in-house yapılabilir Ancak, in-house NA engelleme tahlil, ticari kitler büyük ölçüde daha ucuz olanDaha büyük miktarlarda ve daha önce tayinin büyük maliyeti oluşur Munana substrat, şimdi rekabetçi fiyatlarla çeşitli kaynaklardan satın alınabilir. ilaç başına bir grip izolatı test maliyetinin yaklaşık $ 1 (ABD) &#39;dir. Melbourne WHOCCRRI da gelişmeler tahlilin sıvı işleme bileşenleri için bir robot platformun dahil edilmesinin ardından in-house NA engelleme deneyi yapılmıştır. Yanı sıra virüs seyreltmeleri elle preparattan, prosedürlerin çoğu, sıvı işleme robotunu kullanılarak gerçekleştirilir. Bu el işçiliğini en aza indirmek, ama aynı zamanda bir günde çalıştırılabilir tahliller sayısını artırır kalmaz. NA engelleme deneyi son derece sağlam olmakla birlikte, ek dikkatle tamamlanması gereken kritik adımlar bir dizi vardır. İlk olarak, inhibisyon eğrileri ve IC50 değerleri kayabilir NA inhibitörü konsantrasyonlarında herhangi bir düzensizlik; Dolayısıyla, dikkatli dikkat edilmelidirNA inhibitörü konsantrasyonları hazırlanırken ödenir. İkinci olarak, doğru pipetleme ve hassas inkübasyon süreleri deneyleri tutarlı sonuçlar korunması için önemlidir; Bu kalibre pipetler ve zamanlayıcılar kullanılarak elde edilebilir. Her deneyde kontrol virüsleri dahil edilmesi de tahlilinden tahlile ve uzun süreler boyunca tahlil performansı izlenmesini sağlar. mevsimsel grip virüsleri NA enzim aktivitesi pH değeri 6.5 olan en uygunudur, çünkü Üçüncü olarak, deney tamponu doğru pH değeri önemlidir. Bazı raporlar, düşük değerli pH koşulları kullanılması, R292K mutasyon 14, 15 ihtiva eden bir (H7N9) varyant influenza varyantları belirlenmesini geliştirdiğini bulmuşlardır. Bununla birlikte, deney tamponu pH modifikasyon IC50 değerleri kayacak ve bu lâboratuarlarda ve laboratuarlar arasında veri karşılaştırmasını güçleştirebilir. Diğer modifikasyonlar ve p olabilir sorunerformed Tablo 5&#39;te listelenmiştir. NA inhibitörleri şu anda grip virüsleri dolaşan karşı etkilidir onaylanmış antiviral sadece sınıfıdır. diğer antiviral sınıflar klinik kullanıma hazır hale kadar, grip virüsleri dolaşan antiviral duyarlılık gözetim yalnız NA inhibitörleri üzerinde durulacaktır. Çünkü basitlik ve sonuçların tekrar edilebilirlik, UA inhibisyon deneyinin kullanımı devam edecek NA inhibitörlerine grip virüsü duyarlılığını değerlendirmek için.

Hemaglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA), grip A ve B virüsleri, iki ana yüzeyi glikoproteinleridir. NA, hücre yüzeyi 1 galaktoz sialik asit bölünmesiyle virüsü serbest iken, HA, hücre yüzeyi glikoproteinleri ya da glikolipidler sialik asit-galaktoz bağlanır. UA inhibitörleri rasyonel ve böylece virüs progenisinin salınmasını ve yayılmasını önlemek, UA, enzimatik olarak aktif siteye sıkı bir şekilde bağlamak için tasarlanmıştır grip antiviraller sınıfıdır. Oseltamivir ve zanamivir tedavisi ve grip profilaksisi için dünya çapında birçok ülkede onaylanmıştır iki NA inhibitörleri. Son yıllarda, iki ek NA inhibitörleri, peramivir ve laninamivir, ülkelerin sınırlı sayıda kullanım için onaylanmıştır. NA inhibitörlerine karşı duyarlılık ve direnç kazandıran mutasyonun belirlenmesi için grip virüsleri taranması belirlenmesi ve etkiliğin izlenmesinde önemlidirantiviral bu sınıfın eness. Son 16 yıl içinde, flüoresan bazlı NA engelleme deneyi, grip virüsleri, dolaşımdaki arasında antiviral duyarlılık değişen eğilimini izlemek için Influenza, Melbourne (Melbourne WHOCCRRI) ile Referans ve Araştırma Merkezi WHO rutin gerçekleştirilmiştir. Yıllık olarak yaklaşık 2.000 grip virüsleri antiviral duyarlılık için test edilir. 2007-2008 Kuzey Yarıküre influenza mevsiminde, önceki mevsim A (H1N1) virüs sayısında bir artış vardı, ancak en fazla grip mevsimlerde, virüslerin&gt;% 98, dört NA inhibitörü 2, 3, 4 yatkındır o oseltamivir 5 düşük yatkınlık almıştı. 2008 yılı sonuna kadar dünyanın geri kalanına yayıldı NA amino asit ikamesi H275Y içerdiği virüs grubu, oseltamivir inappropri yapmaBu virüsün tedavisi için küresel yedi. Şu anda, grip B, influenza A (H3N2), ve grip A dolaşan büyük çoğunluğu (H1N1) pdm09 suşları oseltamivire hassas olsalar da, her ne kadar oseltamivir düşük kazandıran NA amino asit ikamesi H275Y ihtiva eden A (H1N1) pdm09 varyantlarının topluluğu kümeleri ve peramivir duyarlılık, dünyanın 6, 7 çeşitli yerlerinde bildirilmiştir. Çünkü yeterince yüksek bir virüs titresi için ihtiyaç, (hayvan nazal yıkama da dahil olmak üzere), klinik numuneler, hücre kültürü içinde geçirilir veya antiviral duyarlılık testi öncesinde tavuk yumurtası embriyolu gerekir. Bu makalede açıklanan NA engelleme deneyi, üç bölüme ayrılabilir: Belirli bir florometrede floresan ürünü 4-metilumbelliferonun (4-MU) doğrusal aralığının belirlenmesi Nedeniyle Fluorometreler arasındaki içsel farklılıklar nedeniyle, tO floresan son ürünün, 4-MU ve nispi floresan ünitesi (RFU) doğrusal aralık oluşturulması gerekmektedir. 4-MU için lineer aralığı bir kez kurulduğunda, en uygun hedef sinyal influenza virüsleri konsantrasyonu, NA aktivitesi deneyinde ayarlanır hangi seçilir. Belirli flüorometrede için Tamamlandığında, bu tekrarlanması gerekmez. virüslerin NA aktivitesini belirleme Seri virüsleri seyreltildi (4Metilumbelliferil) -α-D-N -acetylneuraminic asit (Munana) substratı - yoktur aktivite deneyi 2 &#39;eklenmesini içerir basit bir testtir. NA ile Munana parçalanmasından elde edilen floresan son ürün 4-MU miktarı, bir florometre kullanılarak ölçülür. NA engelleme tahlilinde kullanılacak uygun virüs seyreltme virüsü seyreltme karşı floresans birimleri çizilerek seçilir. üretilen sigmoid eğriden, doğrusal kesitin orta noktası uygun olmalıdırflorometre 4-MU lineer aralığı bölüm 1 &#39;de tayin ve bölüm 3&#39;te kullanılmak üzere virüslerin uygun bir konsantrasyonunu bilgilendirir. NA engelleme analizi kullanılarak NA inhibitörlerine değerlendirilmesi virüs duyarlılığı Belirli bir NA inhibitörü virüslerin duyarlılığını değerlendirmek için, bölüm 2&#39;de belirlenen seyreltide virüs NA inhibitörü bir konsantrasyon aralığında ile inkübe edilir. Munana ile daha sonraki bir inkübasyonun ardından, inhibe edilmemiş virüs tarafından üretilen 4-MU florometre ile RFU ölçülür. Bir virüsün NA enzim aktivitesi NA inhibitörün inhibe edici etkisi, bir IC50 değeri olarak verilir NA aktivitesinin% 50&#39;sini azaltmak için gerekli olan NA önleyici konsantrasyonuna göre hesaplanır.

<table><tbody><tr><td>Influenza A and B viruses</td><td></td><td>Cultured in MDCK cells or 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) eggs</td><td></td></tr><tr><td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells</td><td>ATCC</td><td>PTA-6500</td><td></td></tr><tr><td>2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA)&amp;nbsp;</td><td>Biosynth AG</td><td>M-5507</td><td></td></tr><tr><td>2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M8639</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferone (4-MU)</td><td>Sigma</td><td>M1381-25G</td><td></td></tr><tr><td>2-[N-morpholino]ethanesulphonic acid (MES hydrate) (free acid)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M8250-250G</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride (Ca Cl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)&amp;nbsp;</td><td>APS AJAX Finechem&amp;nbsp;</td><td>127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Surfactant-Amps-NP-40 (10% solution)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>PIE28324</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)&amp;nbsp;</td><td>APS AJAX Finechem</td><td>482-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Ethanol&amp;nbsp;</td><td>APS AJAX Finechem</td><td>214-2.5L GL</td><td></td></tr><tr><td>96-well clear flat-bottom plates</td><td>NUNC</td><td>456537</td><td></td></tr><tr><td>96-well U-bottom plates</td><td>Greiner Bio-one&amp;nbsp;</td><td>4650101</td><td></td></tr><tr><td>8 channel deep well block</td><td>Pacific Laboratory Products</td><td>RES-MW8-HP</td><td></td></tr><tr><td>96-well deep plates, 2.0 mL square wells</td><td>Pacific Laboratory Products</td><td>P-2ML-SQ-C</td><td></td></tr><tr><td>Plate sealers</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>236366</td><td></td></tr><tr><td>Bottle-top vacuum filter system (cellulose membrane (nitrate), pore size 0.2 &amp;mu;m, membrane area 33.2 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, filter capacity 500 mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430758-12EA</td><td></td></tr><tr><td>Single-channel pipettes (1 &amp;micro;L - 1,000 &amp;micro;L)</td><td>Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multi-channel pipettes</td><td>Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius)</td><td>8 or 12 channel electronic and manual pipette (5 - 1250 &amp;micro;L volume)</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips (1 &amp;micro;L - 1,250 &amp;micro;L)</td><td>Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable pipettes (10 mL and 25 mL)</td><td>Greiner Bio-one&amp;nbsp;</td><td>P7740-200EA and P7865-200EA</td><td></td></tr><tr><td>Pipette controller</td><td>Eppendorf</td><td>4430000018</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes 50 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Racked tubes</td><td>Scientific Specialties, Inc.</td><td>1750-00</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometer with excitation wavelength setting of 355 nm and an emission wavelength setting of 460 nm</td><td>TermoFisher Scientific</td><td>ASCENT FL 374</td><td></td></tr><tr><td>Ascent software</td><td>TermoFisher Scientific</td><td>5185410CD</td><td></td></tr><tr><td>Incubator set at 37 &amp;deg;C</td><td>Lab Supply</td><td>Biocell 1000</td><td></td></tr><tr><td>Zanamivir</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>Request directly from the company</td><td></td></tr><tr><td>Oseltamivir carboxylate</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peramivir (BCX-1812)</td><td>BioCryst</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laninamivir (R-125489)</td><td>Daiichi-Sankyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;JASPR v1.2</td><td>Influenza Division at the CDC Atlanta, USA&amp;nbsp;</td><td>freely available upon request (fluantiviral@cdc.gov)</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals

nöraminidaz (NA) önleyicisi, dolaşımdaki suşlara karşı etkili olan grip tedavisi ve profilaksisi için onaylanmış antiviraller sadece sınıfıdır. mevsimsel grip tedavisinde kullanımlarına ek olarak, NA inhibitörleri bir pandemi durumunda kullanılmak üzere bir dizi ülke tarafından biriktirildi. Antiviral bu sınıfa grip virüsleri dolaşan duyarlılığını izlemek için önemlidir. Orada NA inhibitörlerine influenza virüslerinin duyarlılığını değerlendirmek için kullanılabilir deneyleri farklı türleri vardır, ancak bir floresan substrat veya kemilüminesan substrat kullanılarak enzim engelleme tahlilleri en yaygın olarak kullanılan ve tercih edilir. Bu protokol, NA inhibitörlerine influenza virüs duyarlılığı değerlendirmek için bir floresan bazlı tahlilin kullanımını tarif eder. Munana ((4-metilumbelliferil) -α-D-N -acetylneuraminic asit - Deney 2 &#39;yaran NA enzim dayanır) Floresan ürünü 4-metilumbelliferon (4-MU) serbest bırakmak için alt-tabaka. Bu nedenle, influenza virüsü üzerine düzenlenen an NA inhibitörü önleyici etkisi bir IC50 değeri olarak verilir NA aktivitesinin% 50&#39;sini azaltmak için gerekli olan NA önleyici konsantrasyonu, göre belirlenir.

Grip Antiviral Duyarlılıkları 9 Gözetimi üzerine WHO Çalışma Grubu standardize raporlama kurallarına kullanarak, NA inhibitörlerine grip virüslerinin duyarlılık şartlarını normale inhibisyon (NI), azaltılmış engelleme (RI) ve yüksek oranda azaltılmış inhibisyon kullanılarak rapor edilir (HRI) . NI virüsleri 50 değerleri en az 10 kat daha influenza A virüs (veya grip B virüsleri, 5-kat daha az) için IC50 orta referans ile karşılaştırıldığında IC sahip olanlardır. RI virüsleri 10- ve influenza A virüs (veya 5- ve grip B için 50-kat) için IC50 orta referans yaklaşık 100 kat arasında IC50 değerlerine sahip olanlardır. HRI virüsleri 100 kat 50 değerleri, influenza A virüs (veya grip B virüsleri 50 kat üzerinde) IC50 orta referansla yukarıda IC sahip olanlardır; Tablo 2 ye bakınız. 50 değerleri IC50 değerleri küçük değişiklikleri yansıtacak şekilde hesaplanmış ve Melbourne WHOCCRRI de yıllık olarak güncellenir NA inhibitörlerine influenza suşlarına dolaşım (Tablo 3). İnfluenza A (H1N1) medyan IC50 değerleri pdm09 virüsleri dört NA inhibitörleri arasında hemen hemen aynıdır, ancak orta zanamivir ve laninamivir IC A (H3N2) virüs 50 değerleri oseltamivir kıyasla 4 kat daha yüksektir 2- ve peramivir IC50 değerleri (Tablo 3). İnfluenza B virüsleri için orta oseltamivir IC50 değeri, genel olarak 5 ila zanamivir peramivir ve laninamivir IC50 değerleri (Tablo 3) daha yüksek 10-kat fazladır. NA engelleme deneyi genetik değişiklikler Associ hakkında bilgi sağlamaz bir fenotip deneyidirUR veya İHK yol açabileceği. Nedenle, genetik analiz UR veya İHK ile virüslerin tespiti aşağıdaki yapılır önemlidir. Melbourne WHOCCRRI anda, varyantların NA geni Sanger sıralama ve piro-dizileme kullanılarak analiz edilir. R &#39;ve HRI varyantları ile virüslerin NA geninin bulunabilir amino asit ikamelerinin temsili bir listesi, Tablo 4&#39;te sunulmuştur. NAI duyarlılık değiştirebilir amino asit ikamelerinin daha geniş bir listesi de WHO websitesini 10 mevcuttur. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55570/55570fig1.jpg" /> Şekil 1: 4-MU konsantrasyonuna karşı RFU. 4-MU konsantrasyonu (uM) karşı RFU (a) standart eğrisi. noktalı kutu florometre 4-MU doğrusal aralığını gösterir. doğrusal aralığı üzerinde floresan sinyalleri, doymuş ve bu nedenle, herhangi bir s edilebilirfloresan içinde alışveriş merkezi değişiklikler florometreyle tespit edilmeyebilir. (B) tanımlanması için Şekil 1a, standart eğrinin yakın çekim doğrusal bölüm &quot;en uygun hedef sinyali&quot;. Melbourne WHOCCRRI de florimetre 2,5-40 uM 4-MU bir doğrusal aralığı ve ~ 1.500 RFU tekabül ~ 30 uM 4-MU optimal hedef sinyal vardır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55570/55570fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55570/55570fig2.jpg" /> Şekil 2: influenza virüslerinin NA aktivitesi grafikler Örnek. 50.61 RFU ortalama arka plan değeri NA aktivite eğrisi üzerinde, her seyreltme noktasından çıkarılır edilmiştir. Oklar her bir virüs için NA engelleme tahlilinde kullanılacak uygun virüs seyreltme göstermektedir. daha kolay hazırlık içinVirüs dilüsyonları Preparasyonu, tek VİRÜSÜ 3 yerine 1/96 seyreltme için 1/100 seyreltme gerçekleştirmek tercih edebilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55570/55570fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55570/55570fig3.jpg" /> Şekil 3: Mevcut inhibisyon deneyinin kurulumu için plaka düzeni. Her plaka bir virüs sadece 1 x deney tamponu (AB), UA inhibitörü, Munana ihtiva eden bir negatif kontrol olarak görev yapan son sütunu, içerir ve durdurma çözeltisi. NOT: JASPR IC50 değerlerinin hesaplanmasında kullanılan ortalama boş sinyali belirlemek için her bir plakanın 12. kolonunda okumaları kullanır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55570/55570fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> Şekil 4: A (H1N1) pdm09 virüsü A / Perth / 82/2015 bir inhibisyon eğrisi ve IC50 değeri örneği. JASPR yazılım eğrisi içinde her bir nokta bir uyum için, UA inhibitörünün artan bir konsantrasyonu ile (nM) karşı floresan (RFU) ve inhibisyon eğrisini göstermektedir. NA önleyici konsantrasyonu, virüs NA aktivitesinin% 50&#39;sini azaltmak için inhibisyon eğrisine göre, IC50 değeri belirlenir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55570/55570fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Virüs </td><td> Virüs seyreltilmesi gerekli </td><td> 1x değerlendirme tampon maddesi hacmi (uL) </td><td> Yüzey aktif madde-Amp-NP-40 (% 10) (ml) </td><td> Virüs hacmi (ml) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 20/01 </td><td> 940 </td><td> 10 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1/40 </td><td> 965 </td><td> 10 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 1/100 </td><td> 890 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: NA engelleme tahlilinde VİRÜS 1, 2 virüs seyreltmeleri hazırlanması ve 3. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Virüs tipi / alt tip / soy </td><td> Normal engelleme </td><td> Azaltılmış engelleme </td><td> Son derece düşük inhibisyon </td></tr><tr><td> (NI) </td><td> (Rİ) </td><td> (HRI) </td></tr><tr><td> A (H1N1) pdm09 </td><td> &lt;10 kat </td><td> 10-100 kat </td><td> &gt; 100 misli </td></tr><tr><td> A (H3N2) </td><td> &amp;60.; 10 kat </td><td> 10-100 kat </td><td> &gt; 100 misli </td></tr><tr><td> B Yamagata ve B Victoria </td><td> &lt;5 kat </td><td> 5-50 kat </td><td> &gt; 50 kat </td></tr></tbody></table> Tablo 2: WHO Antiviral Çalışma Grubu NA inhibitörlerine grip virüsü duyarlılık sınıflandırılması için kurallar önerilir. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Virüs tipi / alt tip / soy </td><td rowspan="2"> N- </td><td> Zanamivirin </td><td> oseltamivir </td><td> peramivir </td><td> Laninamivir </td></tr><tr><td> Medyan (aralık) nM IC50 </td><td> Medyan (aralık) nM IC50 </td><td> Medyan (aralık) nM IC50 </td><td> Medyan (aralık) nM IC50 </td></tr><tr><td> A (H1N1) pdm09 </td><td> 1326 </td><td> 0.42 (0,1-3,43) </td> &lt;td&gt; 0.36 (0,01-3,48) </td><td> 0.19 (0,07-1,60) </td><td> 0.55 (0,05-2,29) </td></tr><tr><td> A (H3N2) </td><td> 1654 </td><td> 0.9 (0,11-4,0) </td><td> 0.38 (0,01-3,65) </td><td> 0.33 (0,12-3,06) </td><td> 1.38 (0,01-9,38) </td></tr><tr><td> B Yamagata ve B Victoria </td><td> 1115 </td><td> 2,2 (1,24-10,72) </td><td> 15,12 (2.39-70.75) </td><td> 1.36 (0,57-6,67) </td><td> 2.89 (1,62-9,15) </td></tr></tbody></table> Tablo 3: Normal inhibisyon medyan IC50 ve IC50 aralık 2015 (NI) virüsleri WHO CCRRI Melbourne, elde edilen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Amino asit ikamesi </td><td rowspan="2"> Tür / alt tip / soy </td><td colspan="4"> IC50 kat-değişimi komedyan IC50 değerleri referans mpared. </td></tr><tr><td> Zanamivirin </td><td> oseltamivir </td><td> peramivir </td><td> Laninamivir </td></tr><tr><td> H275Y </td><td> A (H1N1) pdm09 </td><td> 1 </td><td> 557 (HRI) </td><td> 123 (HRI) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> E119V </td><td> A (H3N2) </td><td> 1 </td><td> 63 (RI) </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> H134Y </td><td> B Victoria </td><td> 1 </td><td> 4 </td><td> 76 (HRI) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> N151T </td><td> B Victoria </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 42 (HRI) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> G104E </td><td> B Victoria </td><td> 1.220 (HRI) </td><td> 87 (HRI) </td><td> 17.724 (HRI) </td><td> 701 (HRI) </td></tr><tr><td> E105K </td><td> B Victoria </td><td> 3 </td><td> 5 (RI) </td><td> 59 (HRI) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> I222T </td><td> B Victoria </td><td> 2 </td><td> 7 (RI) </td><td> 8 (RI) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> H273Y </td><td> B Yamagata </td><td> 1 </td><td> 230 (HRI) </td><td> 377 (HRI) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> D197N </td><td> B Yamagata </td><td> 4 </td><td> 7 (RI) </td><td> 32 (RI) </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Tablo 4: düşük inhibisyon (RI) veya NA inhibitörlerine oldukça düşük inhibisyon (HRI) bağlanmış bir amino asit ikamelerinin temsili listesi. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sorun </td><td> Olası nedenler) </td><td> Çözüm (ler) </td></tr><tr><td rowspan="2"> Hayır veya düşük NA etkinliği </td><td> Virüs, bu ya da düşük bir virüs verimi. </td><td> Klinik örnek hücre çizgileri kültürlenebilir (yani Madin Darby Köpek Böbrek hücreleri) veya embriyo halindeki tavuk yumurtalarının içinde olmalıdırNA engelleme tahlilinde kullanım için daha yüksek bir virüs yükü. </td></tr><tr><td> Bazı mutant virüsler yüksek virüs yükünde rağmen son derece düşük NA aktiviteye sahiptir. </td><td> Test için düzgün virüs konsantrasyonunu kullanın. Düşük bir pH tamponu (örneğin pH 5.3) kullanılabilir. Verileri karşılaştırırken Ancak, dikkatli alınmalıdır. </td></tr><tr><td rowspan="3"> Resim veya NA engelleme tahlilinde düşük NA aktivitesi </td><td> Hiçbir virüs eklendi. </td><td> virüs yeniden seyreltin. virüs emin direkt olarak 1 x deney tamponu ilave edilir. </td></tr><tr><td> Yanlış virüs seyreltme kullanılmıştır. </td><td> NA aktivite deneyi tekrarlayın. </td></tr><tr><td> Yetersiz inkübasyon süresi. </td><td> İnkübasyon süresi sağlamak izlemektedir. </td></tr><tr><td rowspan="3"> Veri noktaları, IC50 eğri dışında kalan </td><td rowspan="2"> daha yüksek bir konsantrasyonda NA inhibitörü çapraz kirlenme. </td><td> ipuçları NA inhibi ile temas halinde değildir emin oluntor 96 oyuklu bir plaka içerisinde seyreltilmiş virüs püskürtüldüğü zaman. </td></tr><tr><td> 8 derin kuyu deposu kullanılmışsa, atılır ve yeni bir 8 derin kuyu rezervuara inhibitör konsantrasyonu NA yeniden dağıtmak. </td></tr><tr><td> NA inhibitörü veya Munana veya seyreltilmiş virüs hacmi her bir kuyunun içine eşit eklenmedi. </td><td> bir kalibre edilmiş çok kanallı pipet ile tahlil tekrarlayın. her bir reaktifin eşit hacimde her bir kuyunun içine tevzi emin olun. </td></tr><tr><td rowspan="3"> Olağandışı yüksek IC50 değerleri </td><td> virüs çok yüksek konsantrasyonu ilave edildi. </td><td> UA aktivite deneyi ve NA engelleme deneyi tekrarlayın. </td></tr><tr><td> Deney örneği grip A ve grip B&#39;ye karışımlarını ihtiva </td><td> Virüs karışımlarının varlığı tespit etmek real-time PCR gerçekleştirin. </td></tr><tr><td> numunedeki Bakteriyel kontaminasyon </td><td> antibiyotik varlığında ile steril bir durumda kültür virüsü. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Yüksek eşiğe sinyali </td><td> Munana alt-tabaka zaman içinde bozulabilir. </td><td> Munana alt-tabakanın yeni toplu kullanın. </td></tr><tr><td> komşu kuyu floresans saptama. </td><td> siyah 96-gözlü düz dipli plakalar kullanın </td></tr></tbody></table> Tablo 5: NA engelleme tahlilinde potansiyel sorunlar için sorun giderme.

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals at JoVE

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Biz antivirallerin nöraminidaz inhibitörü sınıfına influenza A ve B virüsleri duyarlılığını değerlendirmek için bir fenotipik flüoresan bazlı nöraminidaz inhibisyonu deneyi kullanılmasını tarif eder.

Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

fluorescence-based-neuraminidase-inhibition-assay-to-assess

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.7K Görüntüleme.  Peter Doherty Institute for Infection and Immunity.  Biz antivirallerin nöraminidaz inhibitörü sınıfına influenza A ve B virüsleri duyarlılığını değerlendirmek için bir fenotipik flüoresan bazlı nöraminidaz inhibisyonu deneyi kullanılmasını tarif eder. 

Video: Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of microbial (e.g., viruses, bacteria and parasite) infections, they also play an important role in the pathophysiology of infectious diseases, inflammatory diseases, and possibly in autoimmune diseases. Thus, the intensity and duration of TLR responses against infectious diseases must be tightly controlled. It follows that understanding the structural integrity of sensor receptors, their ligand interactions and signaling components is essential for subsequent immunological protection. It would also provide important opportunities for disease modification through sensor manipulation. Although the signaling pathways of TLR sensors are well characterized, the parameters controlling interactions between the sensors and their ligands still remain poorly defined. We have recently identified a novel mechanism of TLR activation by its natural ligand, which has not been previously observed 1,2. It suggests that ligand-induced TLR activation is tightly controlled by Neu1 sialidase activation. We have also reported that Neu1 tightly regulates neurotrophin receptors like TrkA and TrkB 3, which involve Neu1 and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) cross-talk in complex with the receptors 4. The sialidase assay has been initially use to find a novel ligand, thymoquinone, in the activation of Neu4 sialidase on the cell surface of macrophages, dendritic cells and fibroblast cells via GPCR G&alpha;i proteins and MMP-9 5. For TLR receptors, our data indicate that Neu1 sialidase is already in complex with TLR-2, -3 and -4 receptors, and is induced upon ligand binding to either receptor. Activated Neu1 sialidase hydrolyzes sialyl &alpha;-2,3-linked &beta;-galactosyl residues distant from ligand binding to remove steric hinderance to TLR-4 dimerization, MyD88/TLR4 complex recruitment, NFkB activation and pro-inflammatory cell responses. In a collaborative report, Neu1 sialidase has been shown to regulate phagocytosis in macrophage cells 6. Taken together, the sialidase assay has provided us with powerful insights to the molecular mechanisms of ligand-induced receptor activation. Although the precise relationship between Neu1 sialidase and the activation of TLR, Trk receptors has yet to be fully elucidated, it would represent a new or pioneering approach to cell regulation pathways.

The sialidase assay is a simple technical approach that will elucidate novel molecular mechanism(s) of TLR sensors of microbial infections and involvement in inflammatory diseases at the receptor level on the cell surface of live macrophages.

Toll-like reseptör Etkinleştirme Düzenlenmesi Neu1 Sialidase Faaliyet Algılama

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Tüm Influenza Kantitatif Analiz Basit Slot Blot Tahliller Evrensel Antikorlar kullanarak Viral Hemagglutinins ve nöraminidaz yazın

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Influenza A Virüsü hemaglutininler aviditesi ve özgünlüğünün değerlendirilmesi için Minyatür Glycan Mikroarray Testi

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

Hızlı moleküler algılama ve Nezle Virüsleri A ve B farklılaşması

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Enzim-linked Lektin Testi tarafından Grip Nöraminidaz İnhibisyon antikor titreleri Ölçme

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

Bir Kantitatif Mikro-nötralizasyon Testi optimizasyonu

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak antikor yanıt için Microneutralization tarafından insan Sera A(H3N2) virüsleri nötralize grip ölçme deneyi

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

High-throughput Antiviral Assays to Screen for Inhibitors of Zika Virus Replication

Antiviral drug discovery requires the development of reliable biochemical and cellular assays that can be performed in high-throughput screening (HTS) formats. The flavivirus non-structural (NS) proteins are thought to co-translationally assemble on the endoplasmic reticulum (ER) membranes, forming the replication complex (RC). The NS3 and NS5 are the most studied enzymes of the RC and constitute the main targets for drug development due to their crucial roles in viral genome replication. NS3 protease domain, which requires NS2B as its cofactor, is responsible for the cleavage of the immature viral polyprotein into the mature NS proteins, whereas NS5 RdRp domain is responsible for the RNA replication. Herein, we describe in detail the protocols used in replicon-based screenings and enzymatic assays to test large compound libraries for inhibitors of the Zika virus (ZIKV) replication. Replicons are self-replicating subgenomic systems expressed in mammalian cells, in which the viral structural genes are replaced by a reporter gene. The inhibitory effects of compounds on viral RNA replication can be easily evaluated by measuring the reduction in the reporter protein activity. The replicon-based screenings were performed using a BHK-21 ZIKV replicon cell line expressing Renilla luciferase as a reporter gene. To characterize the specific targets of identified compounds, we established in-vitro fluorescence-based assays for recombinantly expressed NS3 protease and NS5 RdRp. The proteolytic activity of the viral protease was measured by using the fluorogenic peptide substrate Bz-nKRR-AMC, while the NS5 RdRp elongation activity was directly detected by the increase of the fluorescent signal of SYBR Green I during RNA elongation, using the synthetic biotinylated self-priming template 3&#8242;UTR-U30 (5&#39;-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3&#39;).

In this work, we describe the protocols used in replicon-based and viral enzyme-based assays to screen for inhibitors of Zika virus replication in a high-throughput screening format.

Zika Virüs Replikasyonunun inhibitörlerini taramak için yüksek verimli Antiviral Tahliller

Antiviral drug discovery requires the development of reliable biochemical and cellular assays that can be performed in high-throughput screening (HTS) ...

An Assay to Measure Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers

Source: Gao, J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54573">Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates an assay measuring influenza neuraminidase (NA) inhibiting antibody titers in a serum sample. A serum sample containing antibodies against NA is added to a fetuin-coated microwell plate. Upon adding the virus, the antibodies prevent viral NA from cleaving fetuin and exposing its galactose moiety. A peroxidase-conjugated lectin is then added, which binds to the exposed galactose. The NA-inhibiting antibody titer is determined using a colorimetric test, where a peroxidase substrate gets cleaved by the immobilized lectin-conjugated peroxidase to produce color.

İnfluenza Nöraminidaz İnhibisyonu Antikor Titrelerini Ölçmek İçin Bir Test

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Reagents and ...