인플루엔자에 참조 및 연구 협력 센터 멜버른 WHO는 건강의 호주 정부 부서에 의해 지원됩니다.

1. 결정 형광 분석기에 형광 제품 4-MU의 선형 범위 <ol><li> 무수 에탄올 5 mL에 4- MU 11.3 mg을 용해시켜 6.4 mM의 4-MU 스톡 용액 10 ㎖를 준비한다. (V / W) 원액 10 mL로 0.9 % 염화나트륨 5 mL를 추가합니다. 9 ㎖의 1X의 분석 완충액 (33.3 mM의 2- (N- 모르 폴리 노) 에탄 술폰산 (MES) 및 4 mM의 CaCl2를, pH가 6.5)에 6.4 mM의 4-MU 1 mL로 희석 한 용액을 작업 640 μM을 준비한다. 주 : MES 13 g 및 증류수 8㎖를 1 M 염화칼슘 2 992 ㎖를 첨가하여 2 배의 분석 완충액을 준비한다. M의 NaOH (10)를 사용하여 6.5로 pH를 조정한다. 기공 크기 0.2 ㎛의 멸균 된 셀룰로오스 아세테이트 필터를 사용하여 상기 버퍼 필터. 주의! 수산화 나트륨 가성이며, 피부와 눈에 화학적 화상을 입을 수 있습니다. 그 전체 개인 보호 장비를 착용 있는지 확인하십시오. </li><li> MU-4 농도 (즉, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 #의 범위 5 ㎖를 준비181; M, 및 1X 검정 완충액을 사용하여 640 μM 4-MU의 2 배 일련 희석액 내지 320 μM). </li><li> 4-MU (즉, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM, 320 μM 및 640 μM) 맑고로 (희석 당 두 개의 웰), 96의 각각의 일련 희석액 50 μL 분주 웰 평면 바닥 플레이트 (바탕 신호를 측정하는 역할을 공백) 나머지 웰에 1X 검정 완충액 50 μL. 주 : 반응 부피 4-MU의 최종 농도 (50 μL 4-MU + 50 μL 300 μM의 MUNANA)가 160 μM, 320 μM 2.5 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM이다 . </li><li> 증류수 20㎖에 MUNANA 25 mg의 재구성하여 MUNANA 2.5mM의 원액을 준비한다. 300 μM의 MUNANA 작업 용액 (한 접시에 충분한 양)을 얻었다 5.28 ㎖의 1X 검정 완충액 중 2.5 맹 무나나 0.72 mL를 섞는다. 300 μM의 MUNANA의 일하는를 포함하는 튜브를 커버즉시 사용하지 않는 g의 알루미늄 호일로 용액을 얼음에 보관. 남은 재료를 폐기하십시오. 참고 : 2.5 밀리미터 MUNANA 주식 솔루션 1 달 동안 -20 ° C에서 저장 될 수있는 한 동결 / 해동 사이클 내에서 사용되어야합니다. 4-MU와 MUNANA 솔루션은 광 감응성과 장시간 노광으로부터 보호되어야한다. </li><li> 부드럽게 섞어 탭 각 웰에 300 μM의 MUNANA의 50 μL를 추가하고, 30 분 동안 37 ℃에서 배양한다. 증발을 방지하기 위해 판 실러와 함께 접시를 커버. 주의 :이 단계는 NA 억제 분석에서의 형광 배경을 설명한다. </li><li> 0.824 M의 NaOH 2.225 ㎖ (하나의 판에 충분한 양)을 무수 에탄올 11 mL를 혼합하여 정지 용액을 준비한다. </li><li> 반응을 중지하고 부드럽게 섞어 활용할 각 웰에 스톱 솔루션의 100 μL를 추가합니다. </li><li> PE로서, 여기 파장 355 ㎚, 설정의 460 nm의 발광 파장을 갖는 형광 설정을 사용하여 플레이트를 판독제조업체의 지침을 r에. </li><li> 어떠한 4-MU를 포함하지 않는 모든 웰에서 형광 신호를 사용하여, 평균 배경 신호를 계산한다. MU-4를 함유하는 각각의 웰로부터 배경이 평균 신호를 뺀 각 MU-4 농도의 평균 신호 (RFU)를 계산한다. 도 1a에 도시 된 바와 같이, MU-4 농도 (μM)의 RFU에 대하여 표준 곡선을 플롯; 곡선의 근접 선형 부분은도 1b에 도시된다. </li><li> 선형 범위 및 최적 목표 신호를 결정하기 위해 MU-4 농도 (μM) 대 RFU의 플롯을 시각화; 선형 범위는 어디 플롯 4-MU의 농도 증가에 비례하여 형광 신호가 증가함에 따라, 최적의 목표 신호는 선형 범위 내의 임의의 4-MU 농도된다. 주 : 선형 범위 및 최적의 목표 신호는 형광 특정한다. 예를 들어, 멜버른 WHOCCRRI에서 형광은 2의 선형 범위를 갖는다0.5-40 μM 4-MU와 1,500 ~ RFU에 대응 ~ 30 μM 4-MU의 최적 목표 신호. </li></ol> 2. 바이러스의 NA 활동 결정 참고 : 인플루엔자 바이러스는 Madin-다비 개 신장 (MDCK) 세포 또는 발육 계란 8에서 충분한 역가을 배양한다. <ol><li> 0.1 %를 함유하는 컬럼에 희석 한 배양 된 인플루엔자 바이러스의 웰 당 120 μL 및 1X 검정 완충액 60 μL 분주 NP-40, 96 웰, U-바닥 판 (11)의 남은 열로. </li><li> 직렬로 플레이트를 통해 바이러스의 두 배 희석을 수행하는 (즉, 2 열의 컬럼 1 내지 60 μL를 전송하는 등, 열 (11)까지) 만 1X 검정 완충액을 함유하는 블랭크로서 컬럼 (12)을두고, 멀티 채널 피펫을 사용. </li><li> 맑은 96 웰 편평 바닥 플레이트에 웰 (희석 바이러스 블랭크)로부터 각각 50 μL를 옮긴다. 참고 : C에 필요하지 않습니다물질은 제 1 열로 통해 컬럼 (12)로부터 전송되는 경우 hange 피펫 팁. </li><li> 웰 당 (단계 1.4에 따라 제조 됨) 300 μM MUNANA 50 μL를 첨가하고 부드럽게 혼합 할 수있는 플레이트를 탭. 1 시간 동안 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션. 증발을 방지하기 위해 판 실러와 함께 접시를 커버. </li><li> 반응을 종결하고 부드럽게 혼합 판은 탭하여 웰 당 (단계 1.6에 따라 제조 됨)을 정지 용액 100 μL를 추가한다. </li><li> 형광 분석기를 사용하여 판을 읽어보십시오. <ol><li> 여기 파장 355 ㎚, 설정의 460 nm의 발광 파장 설정을 사용한다. </li></ol></li><li> 컬럼 (12)에서의 형광 판독 값에 기초하여, 평균 배경 신호를 결정하고, 각 웰의 평균 배경 신호를 감산. 바이러스 희석에 대한 RFU의 그래프를 그린다. 주 : WHOCCRRI 멜버른 100 μM의 MUNANA의 배경 값은 50과 120 사이 RFU 일반적이지만, 이들은 형광의 BEI 따라 다르고NG 사용. </li><li> 각 바이러스 (그림 2)에 대한 곡선의 선형 부분의 중간 지점을 결정하는 바이러스 희석에 대한 RFU의 줄거리를 볼 수 있습니다. 기준점으로서 (1 단계에서 결정됨) 최적 목표 신호를 사용한다. 주 :이 제 1 항에서 결정된 형광의 4-MU 선형 범위와 일치해야 바이러스의 적정 농도는 (3)에서 사용되는 제공한다. </li></ol> 3. NA 억제 분석을 사용하여 NA 억제제에 바이러스 감수성을 평가 <ol><li> 300 μM의 농도 NA 억제제의 마스터 재고를 준비한다. <ol><li> 2 × 50 ㎖의 분석 완충액 (66.6 mM의 MES의 8 mM의 CaCl2를, pH가 6.5) 나미 비르 5.0 ㎎을 용해시켜 300 μM 나미 비르 (분자량 MW = 332.32 g / 몰)을 준비한다. </li><li> 배 검정 완충액 50ml에 5.8 ㎎을 용해 (MW = 386.44 g / 몰 D 타르트 레이트) 300 μM 오셀 카르복시산을 준비한다. </li><li> 준비300 μM peramivir 삼수화물 (MW = 382.45 g / mol)의 2 배 검정 완충액 50 ml에 5.7 mg의 용해. </li><li> 배 검정 완충액 50ml에 5.2 mg을 용해시켜 300 μM laninamivir (MW = 346.34 g / 몰)을 준비한다. 주 : NA 억제제 마스터 주식 12 개월 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다. 정확한 무게와 볼륨 재구성에 사용되는 보장하기 위해 NA 억제제의 MW를 확인합니다. 오셀 카르복시산은 전구 약물 오셀 타미 비르 포스페이트의 활성 화합물이다. 따라서, 단지 오셀 카르복시산은 NA 억제 분석에 사용한다. </li></ol></li><li> 마스터 주식에서 0.03 nM 내지 0.3 nM의 3 nM 내지 30 nM 내지 300 nM 내지 3,000 nM의 농도에서 50 mL의 원심 분리 튜브 내의 NA 억제제의 10 배 희석액의 주식을 작동 준비하고 배 분석 30,000 nM 내지 버퍼 (66.6 mM의 MES의 8 mM의 CaCl2를, pH가 6.5); 이 여러 분석에서 사용할 수 있습니다. 비고 : 반응에 있습니다 volum NA 억제제의 최종 농도E (바이러스 희석액 300 μM의 MUNANA의 + 50 μL NA의 억제제 + 50 μL의 50 μL)을 각각 0.01 nM 내지 0.1 nM 내지 1 nM 내지 10 nM 내지 100 nM 내지 1,000 nM의, 및 10000 나노 미터이다. 최종 농도는 스톱 솔루션의 100 μL를 포함하지 않습니다. 2-8 ° C에서 모든 NA 억제제의 희석을 저장합니다. 유통 기한은 마스터 주식과 동일합니다. </li><li> 96 딥 - 웰 블록, 0.1 % NP-40 계면 활성제를 함유하는 1X 검정 완충액에 희석 바이러스를 준비한다. 네 NA 억제제 테스트 바이러스 당 2ml의 총 부피를 사용하여 섹션 (2)로부터 유도되는 NA 활성 분석 결과에 기초하여 바이러스를 희석하여 사용한다. 참고 : 96 깊은 우물 블록에 바이러스 당 두 개의 우물 (물론 당 1 mL로) 준비합니다. VIRUS 1, 2 및 3에 대한 바이러스 희석액의 예는 표 1에 나타내었다. </li><li> 8 깊은 웰에 저장한다 (단계 3.2에 따라 제조 됨) NA 억제제의 필요한 양을 분배. 여기에서, 레인 징 희석액 50 μL NA 저해제 분배이 0 ㎚ (2 × 시험 B로부터uffer 만) 맑은 96 웰 편평 바닥 플레이트에서 H로 행 A의 nM 내지 30,000이다. 주 : 플레이트 레이아웃이도 3에 도시되어있다. </li><li> 부드럽게 혼합하고 45 분 동안 실온에서 배양 접시를 탭에만 열 (12)에 열 1-11 및 1X 검정 완충액의 웰 당 50 μL로 희석하여 웰 당 시험 바이러스의 50 μL를 추가한다. 증발을 방지하기 위해 판 실러와 함께 접시를 커버. </li><li> 웰 당 (단계 1.4에 따라 제조 됨) 300 μM MUNANA 50 μL를 첨가하고 부드럽게 혼합 할 수있는 플레이트를 탭. 1 시간 동안 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션. 증발을 방지하기 위해 판 실러와 함께 접시를 커버. </li><li> 믹싱 플레이트를 부드럽게 눌러 웰 각각 (단계 1.6에 따라 제조 됨)을 정지 용액 100 μL를 추가한다. </li><li> 형광 분석기를 사용하여 판을 읽어보십시오. <ol><li> 전술 한 바와 같이, 여기 파장 355 ㎚, 460 나노 미터의 방출 파장을 사용한다. </li></ol></li></ol> 4. 계산IC 50 값 주 : JASPR 1.2가 IC (50) 값의 계산을 가능 곡선 피팅 소프트웨어이다. 소프트웨어는 CDC, 애틀랜타, 미국에서 인플루엔자 부문에 의해 개발되었다. 소프트웨어는 방정식을 활용 : V = V 맥스 × (1 - ([I]는 [I]는)) / (K i가 +), V 최대 대사의 최대 레이트이다은 [I]을, V는 억제제의 농도이다 반응이 억제되고, 및 K의 난 억제 곡선에 대한 IC (50)이다. <ol><li> 복사 및 12 열 플레이트 포맷 (96 웰)에 스프레드 시트로 형광에 의해 출력 된 원시 데이터를 붙여, 전지 A1부터 시작. 참고 : 각 후속 판에서 원시 데이터는 하나의 빈 행에 의해 비틀 거렸다해야합니다. 각각의 바이러스는 네 NA 억제제에 대해 테스트 된 경우 (각 판 사이의 빈 행으로) 네 세트의 원시 데이터를 붙여. </li><li> 피팅 소프트웨어 및 CL을 엽니 다&#39;실험&#39;탭에서 ICK. &quot;대안이 약물 불소 (11) 샘플 &#39;을 선택합니다. </li><li> &quot;옵션&quot;탭을 클릭하고 체크 &quot;그래프를 생성합니다.&quot; </li><li> &quot;옵션&quot;을 다시 클릭하고 &quot;새 키&quot;탭을 클릭합니다. 원시 데이터 스프레드 시트 파일과 같은 폴더에있는 &quot;inhibition_key&quot;.csv 파일을 저장합니다. </li><li> inhibition_key 파일에서 ID 아래의 모든 샘플 이름을 나열합니다. 각 샘플의 이름은 고유해야합니다. </li><li> 네 NA 억제제 테스트 한 경우, 오셀 타미 비르 다음 두 행의 추가 공간을 삽입하여 &quot;Peramivir&quot;에서 입력 &quot;을 Laninamivir.&quot; inhibition_key 파일에 변경 사항을 저장합니다. </li><li> 은 &quot;jaspr의 V 1.2 - 억제 곡선 피팅&quot;창으로 돌아가서으로 &quot;실험 파일&quot;과 inhibition_key와 같은 원시 데이터 파일 선택 &quot;키 파일을.&quot; 분석을 실행합니다. .CSV과 PDF 파일 (* .pdf)의 결과를 저장합니다. 주 : 소프트웨어가 자동으로 억제 곡선을 그릴 것이다 (RFU 전압 강하NST NA 억제제 농도),도 4에 도시 된 바와 같이. 프로그램은 또한 개별 NA 억제제 (도 4)에 대해 각각의 바이러스에 대한 IC 50 값을 계산한다. 또한 JASPR의 IC 50 값은 스프레드 시트 형식의 신호 대 배경 (S / B)의 비율을 나타낸다. 배경 값은 사용 된 형광에 따라 실험실 실험실에서 다를 수있다. 멜버른 WHOCCRRI에서, 배경은 50 내지 120 RFU 100 μM의 범위 MUNANA 값. 10 미만의 비율은 특히 매우 낮은 NA의 활성을 갖는 돌연변이 바이러스가 여전히 허용되지만 신뢰성 IC 50 값, ≥10의 S / B의 비율이 바람직하다. </li><li> 이 IC 50 값은 소프트웨어에 의해 생성 된 곡선 형상을 검사한다. 모든 데이터 포인트에 떨어지거나 곡선에 근접한다 그렇지 않은 경우 NA 억제 분석을 반복합니다. 참고 : 비정상적으로 높은 IC (50) 값을 표시 바이러스의 경우, 분석은 반복해야한다에드는 결과를 확인합니다. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

NA 억제제 인플루엔자 바이러스 감수성의 글로벌 모니터링은 현재의 형광 또는 화학 발광 NA 억제 분석 (11), (12)을 사용하여 실험실들에 의해 수행되고있다. 형광 분석은 더 일반적으로 화학 발광 분석보다 사용된다. 두 분석은 견고하고 재현하지만, 형광 계 분석에서 얻은 IC 50 값은 13 어려운 두 분석으로부터의 데이터의 직접적인 비교를 상기 발광 기반 분석법보다 종종 높다. 심지어 동일한 프로토콜을 사용하여, 한 실험에서 생성 된 데이터가 서로 다를 수있다. 때문에 실험실 사이의 이러한 변화의, 보건기구 (WHO) 워킹 그룹은 인플루엔자 바이러스 감수성의 감시에 실험실 간 비교에 도움이되는 가이드 라인을 만들었다. 오히려,이 가이드 라인을 사용하여 IC (50)의 절대 값을 비교보다중간 각 특정 실험실 테스트에서 NI 인플루엔자 바이러스의 IC (50)에 IC (50) 배의 차이에 기초하여 사행 비교. 다섯 개 협력 센터에서 데이터를 비교하는 능력은 글로벌 인플루엔자 바이러스 감수성 데이터 2, 3, 4의 연간 간행물 가져왔다. 공공 영역에서 인플루엔자 감수성 많은 양의 데이터의 가용성은 연구자가 자신의 실험실에서 생성 된 그와 그 연구에서 IC (50 개)의 데이터를 비교할 수 있습니다. 유사한 개념을 채택 기타 NA 억제 분석도 시판되고있다. 즉시 사용 가능한 시약을 포함하는이 상업 키트 (NA는 포함되지 억제제) 똑같이 재현 할 수 있습니다. 시약의 대부분에서 자체 제작 될 수 있기 때문에, 사내 NA 억제 분석은 상업용 키트보다 실질적으로 저렴더 많은 양의 이전 분석의 주요 비용을 만든 MUNANA 기판은 이제 경쟁력있는 가격으로 다양한 소스에서 구입하실 수 있습니다. 약물 당 하나 개의 인플루엔자 분리 테스트의 비용은 약 $ 1 (USD)이다. 멜버른 WHOCCRRI에서 개선 분석의 액체 처리 구성 요소에 대한 로봇 플랫폼의 혼입 후 실내 NA 억제 분석에 이루어졌다. 외에도 바이러스 희석의 수동 준비에서, 절차의 대부분은 액체 처리 로봇을 사용하여 수행됩니다. 이 수동 조작을 최소화 할뿐만 아니라 하루에 실행할 수있는 분석의 수를 증가 않을뿐만 아니라. 개구 억제 분석은 매우 견고하지만, 추가적인주의 완료 할 중요한 단계의 수있다. 우선, 억제 곡선과 IC 50 값을 이동할 수 NA 억제제 농도 어떠한 불규칙; 따라서 세심한주의를해야한다개구 억제제 농도를 준비 할 때 지불. 둘째로, 정확한 피펫 정확한 배양 기간 분석법 일관된 결과를 유지하는 데 매우 중요하다; 이는 교정 피펫 및 타이머를 사용함으로써 달성 될 수있다. 모든 분석에서 제어 바이러스의 포함은 또한 분석에서 분석 및 장기간에 걸쳐 분석 성능의 모니터링을 가능하게한다. 계절 인플루엔자 바이러스의 NA 효소 활성은 pH가 6.5에서 최적이기 때문에 셋째, 분석 완충액의 pH는 정확한 것이 중요하다. 몇몇 보고서 월 낮은 pH 조건에의 사용 등 R292K 돌연변이 14, 15를 포함하는 A (H7N9) 변종 인플루엔자 변이체의 동정을 향상 것을 발견 하였다. 그러나, 분석 완충액의 pH에 대한 수정은 IC 50 값을 이동하며, 이는 실험실에서 실험실 데이터 사이의 비교를 복잡하게 할 수있다. 기타 수정 및 페이지가 될 수있는 문제 해결erformed 표 5에 나열되어 있습니다. NA 억제제는 현재 인플루엔자 바이러스 순환에 대한 효과적인 승인 바이러스제의 유일한 클래스입니다. 다른 바이러스 클래스 임상 사용을 위해 제공 될 때까지, 인플루엔자 바이러스 순환의 바이러스 감수성 감시 혼자 NA 억제제에 초점을 맞 춥니 다. 단순성 때문에 결과의 재현성은 NA 억제 분석의 사용은 계속 NA 억제제 인플루엔자 바이러스 감수성을 평가.

헤 마글 루티 닌 (HA)과 뉴 라미니다 제 (NA)는 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 두 가지 주요 표면 당 단백질이다. 개구가 세포 표면에 1 갈락토스로부터 시알 산을 절단하여 바이러스를 방출하면서 HA는 세포 표면 당 단백질이나 당지질의 시알 산 - 갈락토스 결합한다. NA 억제제는 합리적하여 바이러스 자손의 방출 및 확산을 방지 NA의 효소 활성 부위에 단단하게 결합하도록 설계되었습니다 인플루엔자 항 바이러스제의 클래스입니다. 오셀 타미 비르와 자 나미 비르는 치료 및 인플루엔자의 예방을 위해 전 세계적으로 많은 국가에서 승인 된 두 NA 억제제이다. 최근 몇 년 동안, 두 개의 추가 NA 억제제, peramivir 및 laninamivir은 제한된 수의 국가에서 사용이 승인되었다. NA 억제제 감수성 및 내성을 부여하는 돌연변이의 식별을 위해 인플루엔자 바이러스의 스크리닝과 결정 effectiv 모니터링에 중요항 바이러스제의이 클래스의 eness. 16 강 년, 형광 기반 NA 억제 분석은 인플루엔자 바이러스 순환 중 바이러스 감수성의 변화 경향을 모니터링 인플루엔자 멜버른 (멜버른 WHOCCRRI)의 참조 및 연구 협력 센터 WHO에서 정기적으로 수행되었다. 매년 2,000 개 이상의 인플루엔자 바이러스는 항 바이러스 감수성 검사를하고 있습니다. 2007-2008 북반구 독감 시즌 동안, 전 계절 A (H1N1) 바이러스의 수가 급증이 있었지만 대부분의 인플루엔자 시즌에서 바이러스&gt; 98 %는 네 NA 억제제 2, 3, 4에 취약 그 오셀 타미 비르 (5)에 감수성을 감소했다. 2008 년 말에 의해 세계의 나머지 확산 NA 아미노산 치환의 H275Y 포함 된 바이러스의이 그룹,,, 오셀 타미 비르의 inappropri을이 바이러스의 치료를 위해 전 세계적으로 먹었다. 현재 인플루엔자 B, 인플루엔자 A (H3N2) 및 인플루엔자 A 순환 대다수 (H1N1) pdm09 균주 오셀에 취약, 비록 오셀 감소 부여 개구 아미노산 치환 H275Y 함유 A (H1N1) pdm09 변형 커뮤니티 클러스터 및 peramivir 감수성, 세계 6, 7의 여러 부분에서보고되었다. 때문에 충분히 높은 바이러스 역가의 필요성, (동물 비강 세척 포함) 임상 검체 중 하나를 세포 배양에서 계대 또는 바이러스 감수성 검사 이전에 계란을 발육해야합니다. 이 문서에서 설명하는 NA 억제 분석은 세 부분으로 나눌 수있다 : 특정 형광의 형광 생성물 4- 메틸 움 (4-MU)에 대한 선형 범위를 결정 때문에 fluorometers 사이의 고유 한 차이, t그 형광 최종 생성물 4-MU 및 상대적인 형광 단위 (RFU) 선형 범위를 확립 할 필요가있다. 4-MU 용 선형 범위가 설정되면, 최적의 목표 신호는 인플루엔자 바이러스의 농도가 NA 활성 분석에서 조정되는 선택된다. 특정 형광 완료되면이 반복 할 필요가 없습니다. 바이러스의 NA 활동을 결정 바이러스 순차적 희석 (4-Methylumbelliferyl) -α-D- N -acetylneuraminic 산 (MUNANA) 기판 - 개구 활성 분석은 (2 &#39;)의 추가를 포함하는 간단한 분석이다. 개구 의해 MUNANA의 분해에서 생성 된 형광 최종 생성물 4-MU의 양은 형광 분석기를 사용하여 측정된다. 개구 억제 분석에 사용할 수있는 적절한 바이러스는 바이러스 희석 희석 대해 형광 단위를 플로팅하여 선택된다. 생성 된 S 자형 곡선에서 선형 부분의 중간 지점에 대응한다형광 분석기의 4-MU 선형 범위 제 1 항에서 결정 부 (3)에 사용되는 바이러스의 적정 농도를 알릴 것이다. 개구 억제 분석을 이용하여 NA 억제제 평가 바이러스 감수성 특정 NA 억제제로 바이러스의 민감성을 평가하기 위해, (2)에서 판정 된 희석 바이러스 NA 억제제 농도의 범위와 함께 배양된다. MUNANA와 후속 배양 후, 억제되지 않은 바이러스에 의해 생성 된 4-MU는 형광 RFU 의해 측정된다. 바이러스의 NA 효소 활성의 NA 억제제의 억제 효과는 IC 50 값으로 주어진 NA 활성의 50 % 감소하는 데 필요한 NA 억제제 농도에 따라 계산된다.

<table><tbody><tr><td>Influenza A and B viruses</td><td></td><td>Cultured in MDCK cells or 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) eggs</td><td></td></tr><tr><td>Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells</td><td>ATCC</td><td>PTA-6500</td><td></td></tr><tr><td>2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA)&amp;nbsp;</td><td>Biosynth AG</td><td>M-5507</td><td></td></tr><tr><td>2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M8639</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferone (4-MU)</td><td>Sigma</td><td>M1381-25G</td><td></td></tr><tr><td>2-[N-morpholino]ethanesulphonic acid (MES hydrate) (free acid)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M8250-250G</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride (Ca Cl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)&amp;nbsp;</td><td>APS AJAX Finechem&amp;nbsp;</td><td>127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Surfactant-Amps-NP-40 (10% solution)&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>PIE28324</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)&amp;nbsp;</td><td>APS AJAX Finechem</td><td>482-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Ethanol&amp;nbsp;</td><td>APS AJAX Finechem</td><td>214-2.5L GL</td><td></td></tr><tr><td>96-well clear flat-bottom plates</td><td>NUNC</td><td>456537</td><td></td></tr><tr><td>96-well U-bottom plates</td><td>Greiner Bio-one&amp;nbsp;</td><td>4650101</td><td></td></tr><tr><td>8 channel deep well block</td><td>Pacific Laboratory Products</td><td>RES-MW8-HP</td><td></td></tr><tr><td>96-well deep plates, 2.0 mL square wells</td><td>Pacific Laboratory Products</td><td>P-2ML-SQ-C</td><td></td></tr><tr><td>Plate sealers</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>236366</td><td></td></tr><tr><td>Bottle-top vacuum filter system (cellulose membrane (nitrate), pore size 0.2 &amp;mu;m, membrane area 33.2 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, filter capacity 500 mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430758-12EA</td><td></td></tr><tr><td>Single-channel pipettes (1 &amp;micro;L - 1,000 &amp;micro;L)</td><td>Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multi-channel pipettes</td><td>Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius)</td><td>8 or 12 channel electronic and manual pipette (5 - 1250 &amp;micro;L volume)</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips (1 &amp;micro;L - 1,250 &amp;micro;L)</td><td>Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable pipettes (10 mL and 25 mL)</td><td>Greiner Bio-one&amp;nbsp;</td><td>P7740-200EA and P7865-200EA</td><td></td></tr><tr><td>Pipette controller</td><td>Eppendorf</td><td>4430000018</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes 50 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Racked tubes</td><td>Scientific Specialties, Inc.</td><td>1750-00</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometer with excitation wavelength setting of 355 nm and an emission wavelength setting of 460 nm</td><td>TermoFisher Scientific</td><td>ASCENT FL 374</td><td></td></tr><tr><td>Ascent software</td><td>TermoFisher Scientific</td><td>5185410CD</td><td></td></tr><tr><td>Incubator set at 37 &amp;deg;C</td><td>Lab Supply</td><td>Biocell 1000</td><td></td></tr><tr><td>Zanamivir</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>Request directly from the company</td><td></td></tr><tr><td>Oseltamivir carboxylate</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peramivir (BCX-1812)</td><td>BioCryst</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laninamivir (R-125489)</td><td>Daiichi-Sankyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;JASPR v1.2</td><td>Influenza Division at the CDC Atlanta, USA&amp;nbsp;</td><td>freely available upon request (fluantiviral@cdc.gov)</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals

뉴 라미니다 (NA) 억제제는 현재 순환 계통에 대한 효과적인 인플루엔자의 치료 및 예방을 위해 승인 된 항 바이러스제의 유일한 클래스입니다. 계절 인플루엔자 치료에의 사용뿐만 아니라, NA 억제제는 세계적 유행병의 경우에 사용하는 국가들에 의해 비축되었다. 항 바이러스제의이 클래스에 인플루엔자 바이러스 순환의 감수성을 모니터링하는 것이 중요하다. 거기 NA 억제제 인플루엔자 바이러스의 민감성을 평가하기 위해 사용될 수있는 분석의 종류가 있지만, 형광 기판 또는 화학 발광 기질을 사용하여 효소 저해 분석은 가장 널리 사용하고 권장된다. 이 프로토콜은 NA 억제제에 인플루엔자 바이러스 감수성을 평가하는 형광 기반 분석의 사용을 설명한다. MUNANA ((4- Methylumbelliferyl) -α-D- N -acetylneuraminic 산 - 상기 분석은 2 &#39;절단 개구 효소에 기초) 형광 생성물 4- 메틸 움 (4-MU)를 해제 기판. 따라서, 인플루엔자 바이러스 NA NA에 대한 억제제의 억제 효과는 IC 50 값으로 주어진 NA 활성의 50 % 감소하는 데 필요한 NA 억제제의 농도에 따라 결정된다.

인플루엔자 바이러스 감수성 9의 감시에 WHO 워킹 그룹에서 표준화 된보고 지침을 사용하여, NA 억제제에 인플루엔자 바이러스의 감수성이 용어 정상 억제 (NI), 감소 억제 (RI), 매우 감소 억제를 사용하여보고 (HRI) . NI 바이러스는 50의 값으로 10 배 이상의 인플루엔자 바이러스 (또는 인플루엔자 B 바이러스 5 배 이하)에 대한 IC (50) 중간의 기준과 비교하여 그와 IC이다. RI 바이러스 10 및 인플루엔자 A 바이러스 (또는 5- 인플루엔자 B, 50 배)에 대한 IC 50 중앙값 기준 상술 100 배 사이의 IC50 값을 갖는 것들이다. HRI 바이러스는 100 배 50 개의 값 A 형 인플루엔자 바이러스 (또는 인플루엔자 B 바이러스는 50 배 이상) IC 50 중앙값 기준으로 상기 IC를 그이고; 표 2 참조. 50 개 값의 IC 50 값의 작은 변화를 반영하기 위해 계산 멜버른 WHOCCRRI에서 매년 업데이트 개구 억제제 인플루엔자 균주를 순환 (표 3). 인플루엔자 A (H1N1)의 중앙값이 IC 50 값 pdm09 바이러스는 네 NA 억제제 걸쳐 거의 동일하지만, 중간 나미 비르와 laninamivir IC는 A (H3N2) 바이러스 50 개 값 오셀에 비해 높은 4 배 2-에 있고 peramivir IC 50 개 값 (표 3). 인플루엔자 B 바이러스에 대한 중앙값 오셀 IC 50 값은 일반적으로 5 행 나미 비르, peramivir 및 laninamivir IC 50 값 (표 3)보다 10 배이다. 개구 억제 분석은 유전자 associ 변경에 대한 정보를 제공하지 않는 표현형 분석이다RI 또는 ​​HRI와 ated에. 따라서 유전자 분석은 RI 또는 ​​HRI와 바이러스의 식별 다음을 수행하는 것이 중요합니다. 멜버른 WHOCCRRI에서 변형의 NA 유전자는 생거 시퀀싱 및 파이로 시퀀싱을 이용하여 분석한다. RI 및 HRI 변종 바이러스의 NA 유전자에서 발견 될 수있는 아미노산 치환의 대표적인 목록은 표 4에 제시되어있다. NAI의 감수성을 변경할 수 있습니다 아미노산 치환의보다 자세한 목록은 또한 WHO 웹 사이트 (10)에서 사용할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55570/55570fig1.jpg" /> 도 1 : 4-MU 농도 대 RFU. MU-4 농도 (μM) 대 RFU의 (a) 표준 곡선. 점선 박스는 형광 4-MU의 선형 범위를 도시한다. 선형 범위 위에 형광 신호가 포화하므로, 임의의 수있다형광 몰의 변화는 형광에 의해 검출되지 않을 수있다. (b)의 식별을위한도 1A의 표준 곡선의 선형 근접 부 &quot;최적 목표 신호.&quot; 멜버른 WHOCCRRI에서 형광은 2.5-40 μM 4-MU의 선형 범위 ~ 1,500 RFU에 대응 ~ 30 μM 4-MU의 최적 목표 신호를 갖는다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55570/55570fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55570/55570fig2.jpg" /> 도 2 : 인플루엔자 바이러스 NA 활성 곡선의 예. 50.61 RFU 평균 배경 값은 NA 활성 곡선에서 모든 희석 점에서 제외되었다. 화살표는 각 바이러스에 대한 NA 억제 분석에 사용할 수있는 적절한 바이러스 희석을 나타낸다. 쉽게 준비에 대한바이러스 희석 aration, 하나는 바이러스 3 대신 1/96 희석에 대한 1/100 희석을 수행하도록 선택할 수 있습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55570/55570fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55570/55570fig3.jpg" /> 도 3 : NA 억제 분석의 셋업 플레이트 레이아웃. 각 접시에는 바이러스 만 1X 검정 완충액 (AB), NA 억제제 MUNANA을 포함하지 않는 음성 대조군으로 작용하는 마지막 열을 포함하고, 용액을 멈춘다. 주 : JASPR는 IC 50 값을 계산에 사용되는 평균 신호 빈을 결정하는 각각의 판의 열 (12)로부터 판독을 사용한다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55570/55570fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 도 4 :는 A (H1N1) pdm09 바이러스 A / 퍼스 / 2,015분의 82의 억제 곡선과 IC 50 값의 예. JASPR 소프트웨어는 곡선 내의 모든 포인트 착용감, NA 억제제의 농도 증가 (㎚) 대 형광 (RFU)로 억제 곡선을 나타낸다. NA 억제제의 농도가 NA 바이러스 활성을 50 % 감소시키기 위해 억제 곡선에 기초하여, IC 50 값이 결정된다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55570/55570fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 바이러스 </td><td> 바이러스 희석이 필요합니다 </td><td> 1X 검정 완충액 용적 (μL) </td><td> 계면 활성제 A-NP-40 (10 %) (mL) 중 </td><td> 바이러스 양 (mL) 중 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 1/20 </td><td> (940) </td><td> (10) </td><td> (50) </td></tr><tr><td> 이 </td><td> 1/40 </td><td> 965 </td><td> (10) </td><td> (25) </td></tr><tr><td> 삼 </td><td> 1/100 </td><td> 890 </td><td> (10) </td><td> (10) </td></tr></tbody></table> 표 1 : NA 억제 분석에 VIRUS 1,2 바이러스 희석액을 제조하고, (3). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> 바이러스 종류 / 하위 / 계보 </td><td> 일반 억제 </td><td> 감소 억제 </td><td> 매우 감소 된 억제 </td></tr><tr><td> (NI) </td><td> (RI) </td><td> (HRI) </td></tr><tr><td> A (H1N1) pdm09 </td><td> &lt;10 배 </td><td> 10 ~ 100 배 </td><td> &gt; 100 배 </td></tr><tr><td> A (H3N2) </td><td> 및# 60 10 배 </td><td> 10 ~ 100 배 </td><td> &gt; 100 배 </td></tr><tr><td> B 야마가타와 B 빅토리아 </td><td> &lt;5 배 </td><td> 5 ~ 50 배 </td><td> &gt; 50 배 </td></tr></tbody></table> 표 2 : WHO 바이러스 워킹 그룹은 NA 억제제에 인플루엔자 바이러스 감수성의 분류에 대한 지침을 권장합니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> 바이러스 종류 / 하위 / 계보 </td><td rowspan="2"> 엔 </td><td> 자 나미 비르 </td><td> 오셀 타미 비르 </td><td> Peramivir </td><td> Laninamivir </td></tr><tr><td> 중간 값 (범위) IC 50 nm의 </td><td> 중간 값 (범위) IC 50 nm의 </td><td> 중간 값 (범위) IC 50 nm의 </td><td> 중간 값 (범위) IC 50 nm의 </td></tr><tr><td> A (H1N1) pdm09 </td><td> 1,326 </td><td> 0.42 (0.1-3.43) </td> &lt;TD&gt; 0.36 (0.01-3.48) </td><td> 0.19 (0.07-1.60) </td><td> 0.55 (0.05-2.29) </td></tr><tr><td> A (H3N2) </td><td> 1,654 </td><td> 0.9 (0.11-4.0) </td><td> 0.38 (0.01-3.65) </td><td> 0.33 (0.12-3.06) </td><td> 1.38 (0.01-9.38) </td></tr><tr><td> B 야마가타와 B 빅토리아 </td><td> 1,115 </td><td> 2.2 (1.24-10.72) </td><td> 15.12 (2.39-70.75) </td><td> 1.36 (0.57-6.67) </td><td> 2.89 (1.62-9.15) </td></tr></tbody></table> 표 3 : 정상적인 억제 메디안 IC (50)와 IC (50)의 범위는 2015 (NI) 바이러스는 WHO CCRRI 멜버른 도출. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> 아미노산 치환 </td><td rowspan="2"> 종류 / 하위 / 계보 </td><td colspan="4"> IC 50 배 변화 CO중간 IC 50 값을 참조하는 mpared. </td></tr><tr><td> 자 나미 비르 </td><td> 오셀 타미 비르 </td><td> Peramivir </td><td> Laninamivir </td></tr><tr><td> H275Y </td><td> A (H1N1) pdm09 </td><td> 1 </td><td> 557 (HRI) </td><td> 123 (HRI) </td><td> 이 </td></tr><tr><td> E119V </td><td> A (H3N2) </td><td> 1 </td><td> 63 (RI) </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> H134Y </td><td> B 빅토리아 </td><td> 1 </td><td> 4 </td><td> 76 (HRI) </td><td> 이 </td></tr><tr><td> N151T </td><td> B 빅토리아 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 42 (HRI) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> G104E </td><td> B 빅토리아 </td><td> 1,220 (HRI) </td><td> 87 (HRI) </td><td> 17,724 (HRI) </td><td> 701 (HRI) </td></tr><tr><td> E105K </td><td> B 빅토리아 </td><td> 삼 </td><td> 5 (RI) </td><td> 59 (HRI) </td><td> 이 </td></tr><tr><td> I222T </td><td> B 빅토리아 </td><td> 이 </td><td> 7 (RI) </td><td> 8 (RI) </td><td> 삼 </td></tr><tr><td> H273Y </td><td> B 야마가타 </td><td> 1 </td><td> 230 (HRI) </td><td> 377 (HRI) </td><td> 이 </td></tr><tr><td> D197N </td><td> B 야마가타 </td><td> 4 </td><td> 7 (RI) </td><td> 32 (RI) </td><td> 삼 </td></tr></tbody></table> 표 4 : 감소 된 억제 (RI) 또는 NA 억제제 매우 감소 억제 (HRI)에 연결된 아미노산 치환의 대표적인 목록. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 문제 </td><td> 가능한 원인 (들) </td><td> 솔루션 (들) </td></tr><tr><td rowspan="2"> 없음 또는 낮은 NA 활동 </td><td> 어떤 바이러스가 존재하거나 낮은 바이러스 수율 없었다. </td><td> 임상 표본 세포주에서 배양 (즉 Madin-다비 개 신장 세포) 또는 발육 계란에해야개구 억제 분석에 사용하기위한 더 높은 바이러스 부하. </td></tr><tr><td> 일부 돌연변이 바이러스 높은 바이러스 부하에도 불구하고 매우 낮은 NA 활동이있다. </td><td> 테스트를 위해 깔끔한 바이러스 농도를 사용합니다. 낮은 pH의 분석 완충액 (예를 들면 pH를 5.3)을 사용할 수있다. 데이터를 비교 그러나주의를 기울여야합니다. </td></tr><tr><td rowspan="3"> NO 또는 NA 억제 분석에서 활성이 낮은 NA </td><td> 어떤 바이러스는 추가되지 않았다. </td><td> 바이러스를 다시 희석. 바이러스를 확인하는 직접 1X 검정 완충액에 첨가 하였다. </td></tr><tr><td> 잘못된 바이러스 희석 사용 하였다. </td><td> 개구의 활성 분석을 반복한다. </td></tr><tr><td> 부족 배양 시간. </td><td> 배양 시간을 확인하는 것이옵니다. </td></tr><tr><td rowspan="3"> 데이터 요소는 IC (50) 곡선 벗어나는 </td><td rowspan="2"> 높은 농도의 NA 억제제의 교차 오염. </td><td> 팁은 NA의 inhibi과 접촉하지 있는지 확인토 96 웰 플레이트에 희석 된 바이러스를 분배 할 때. </td></tr><tr><td> 8 디프 웰 저장조를 사용한 경우, 폐기하고 새로운 8 디프 웰 저장조로 억제제 농도 NA를 재 디스펜스. </td></tr><tr><td> 개구 억제제 또는 MUNANA 희석 바이러스의 양은 각 웰에 첨가하여 균일하게되지 않았다. </td><td> 교정 된 멀티 채널 피펫 분석을 반복한다. 각각의 시약의 동일 부피의 각 웰에 분배 확인. </td></tr><tr><td rowspan="3"> 비정상적으로 높은 IC 50 값 </td><td> 바이러스의 너무 높은 농도가 추가되었습니다. </td><td> 개구의 활성 분석 및 NA 억제 분석을 반복한다. </td></tr><tr><td> 테스트 샘플은 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B의 혼합물을 포함 </td><td> 바이러스 혼합물의 존재를 식별하기 위해 실시간 PCR을 수행합니다. </td></tr><tr><td> 샘플에서 박테리아 오염 </td><td> 항생제의 존재와 무균 상태에서 배양 바이러스. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 높은 배경 형광 신호 </td><td> MUNANA 기판은 시간이 지남에 따라 저하 될 수 있습니다. </td><td> MUNANA의 subtrate의 새로운 배치를 사용합니다. </td></tr><tr><td> 이웃하는 웰에서 형광 검출. </td><td> 블랙 96 웰 평면 바닥 플레이트를 사용하여 </td></tr></tbody></table> 표 5 : NA 억제 분석에서 잠재적 문제를 해결.

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Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

우리는 항 바이러스의 뉴 라미니다 제 억제제 클래스 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 감수성을 평가하는 표현형 형광 계 뉴 라미 억제 분석의 사용을 설명한다.

형광 기반의 뉴 라미니다 아제 억제 분석은 항 바이러스제의 뉴 라미니다 아제 억제제 클래스에 인플루엔자 바이러스의 감수성을 평가하기 위해

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

fluorescence-based-neuraminidase-inhibition-assay-to-assess

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.7K 조회수.  Peter Doherty Institute for Infection and Immunity.  우리는 항 바이러스의 뉴 라미니다 제 억제제 클래스 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 감수성을 평가하는 표현형 형광 계 뉴 라미 억제 분석의 사용을 설명한다. 

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Detection of  Neu1 Sialidase Activity in Regulating TOLL-like Receptor Activation

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of microbial (e.g., viruses, bacteria and parasite) infections, they also play an important role in the pathophysiology of infectious diseases, inflammatory diseases, and possibly in autoimmune diseases. Thus, the intensity and duration of TLR responses against infectious diseases must be tightly controlled. It follows that understanding the structural integrity of sensor receptors, their ligand interactions and signaling components is essential for subsequent immunological protection. It would also provide important opportunities for disease modification through sensor manipulation. Although the signaling pathways of TLR sensors are well characterized, the parameters controlling interactions between the sensors and their ligands still remain poorly defined. We have recently identified a novel mechanism of TLR activation by its natural ligand, which has not been previously observed 1,2. It suggests that ligand-induced TLR activation is tightly controlled by Neu1 sialidase activation. We have also reported that Neu1 tightly regulates neurotrophin receptors like TrkA and TrkB 3, which involve Neu1 and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) cross-talk in complex with the receptors 4. The sialidase assay has been initially use to find a novel ligand, thymoquinone, in the activation of Neu4 sialidase on the cell surface of macrophages, dendritic cells and fibroblast cells via GPCR G&alpha;i proteins and MMP-9 5. For TLR receptors, our data indicate that Neu1 sialidase is already in complex with TLR-2, -3 and -4 receptors, and is induced upon ligand binding to either receptor. Activated Neu1 sialidase hydrolyzes sialyl &alpha;-2,3-linked &beta;-galactosyl residues distant from ligand binding to remove steric hinderance to TLR-4 dimerization, MyD88/TLR4 complex recruitment, NFkB activation and pro-inflammatory cell responses. In a collaborative report, Neu1 sialidase has been shown to regulate phagocytosis in macrophage cells 6. Taken together, the sialidase assay has provided us with powerful insights to the molecular mechanisms of ligand-induced receptor activation. Although the precise relationship between Neu1 sialidase and the activation of TLR, Trk receptors has yet to be fully elucidated, it would represent a new or pioneering approach to cell regulation pathways.

The sialidase assay is a simple technical approach that will elucidate novel molecular mechanism(s) of TLR sensors of microbial infections and involvement in inflammatory diseases at the receptor level on the cell surface of live macrophages.

수신자 같은 수용체 활성화 레굴라팅에 Neu1 Sialidase 활동 감지

Mammalian Toll-like receptors (TLRs) are a family of receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns. Not only are TLRs crucial sensors of ...

연구

면역학 및 감염병학

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

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Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

인플루엔자 바이러스 Hemagglutinins의 결합력 및 특이도를 평가하기위한 소형화 글리 칸 마이크로 어레이 분석

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

빠른 분자 탐지 및 인플루엔자 바이러스 A와 B의 차별화

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

효소 결합 렉틴 분석에 의해 인플루엔자 뉴 라미니다 아제 억제 항체가를 측정

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

정량적 마이크로 중화 분석의 최적화

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

사용 하 여 MDCK SIAT1 세포 분석 실험 측정 인플루엔자 항 체 응답 Microneutralization에 의해 인간의 세라에 A(H3N2) 바이러스를 중화

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

High-throughput Antiviral Assays to Screen for Inhibitors of Zika Virus Replication

Antiviral drug discovery requires the development of reliable biochemical and cellular assays that can be performed in high-throughput screening (HTS) formats. The flavivirus non-structural (NS) proteins are thought to co-translationally assemble on the endoplasmic reticulum (ER) membranes, forming the replication complex (RC). The NS3 and NS5 are the most studied enzymes of the RC and constitute the main targets for drug development due to their crucial roles in viral genome replication. NS3 protease domain, which requires NS2B as its cofactor, is responsible for the cleavage of the immature viral polyprotein into the mature NS proteins, whereas NS5 RdRp domain is responsible for the RNA replication. Herein, we describe in detail the protocols used in replicon-based screenings and enzymatic assays to test large compound libraries for inhibitors of the Zika virus (ZIKV) replication. Replicons are self-replicating subgenomic systems expressed in mammalian cells, in which the viral structural genes are replaced by a reporter gene. The inhibitory effects of compounds on viral RNA replication can be easily evaluated by measuring the reduction in the reporter protein activity. The replicon-based screenings were performed using a BHK-21 ZIKV replicon cell line expressing Renilla luciferase as a reporter gene. To characterize the specific targets of identified compounds, we established in-vitro fluorescence-based assays for recombinantly expressed NS3 protease and NS5 RdRp. The proteolytic activity of the viral protease was measured by using the fluorogenic peptide substrate Bz-nKRR-AMC, while the NS5 RdRp elongation activity was directly detected by the increase of the fluorescent signal of SYBR Green I during RNA elongation, using the synthetic biotinylated self-priming template 3&#8242;UTR-U30 (5&#39;-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3&#39;).

In this work, we describe the protocols used in replicon-based and viral enzyme-based assays to screen for inhibitors of Zika virus replication in a high-throughput screening format.

지카 바이러스 복제억제제에 대한 화면에 높은 처리량 항 바이러스 적 소사

Antiviral drug discovery requires the development of reliable biochemical and cellular assays that can be performed in high-throughput screening (HTS) ...

An Assay to Measure Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers

Source: Gao, J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54573">Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates an assay measuring influenza neuraminidase (NA) inhibiting antibody titers in a serum sample. A serum sample containing antibodies against NA is added to a fetuin-coated microwell plate. Upon adding the virus, the antibodies prevent viral NA from cleaving fetuin and exposing its galactose moiety. A peroxidase-conjugated lectin is then added, which binds to the exposed galactose. The NA-inhibiting antibody titer is determined using a colorimetric test, where a peroxidase substrate gets cleaved by the immobilized lectin-conjugated peroxidase to produce color.

인플루엔자 뉴라미니다아제 억제 항체 역가를 측정하기 위한 분석

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Reagents and ...