Bu yöntem, nörobiyoloji alanlarında ki temel soruları niçin in vivo olarak çalıştığı gibi cevaplamak için yararlı olabilir. Bu teknik setin in en büyük avantajı, hayvan modeli olarak Xenopus kurbağa yavruları kullanarak koku yollarının işlevini kıçlamak için ücretsiz yaklaşımlar göstermektir. Bu prosedürü göstermek ben, Beatrice Terni ve Paolo Pacciolla olacak.
İki adet selüloz nitel filtre kağıdını %0,02 MS2 22 anestezik çözeltiye ıslatarak ve diseksiyon kapsamına sokarak transection işlemine başlayın. Sonra tankbir kurbağa yavrusu seçin ve anestezik çözelti bir tabak batırın. Kurbağa yavrusu 2-4 dakika içinde yüzmeyi durduracak.
Cımbız kullanarak kuyruk seviyesinde uygulanan mekanik uyaranlara bir reaksiyon olmaması ile uygun anestezi olup olmadığını kontrol edin. Anestezili kurbağa direğini filtre kağıdına kapsam altına yerleştirin. Beyin yapıları görselleştirilebilsin diye sırt tarafı yukarı bakacak şekilde hayvanı konumlandırın.
Davranışsal deneyler için, koku ampul gelen tüm koku bilgileri bastırmak için her iki sinir transect veni makas kullanın. İki mikrolitre kalsiyum yeşili bir dekstrine çözeltisi ile bir poled cam pipet yükleyin ve mikroenjektöryerleştirin. Filtre kağıdıüzerinde diseksiyon mikroskobu altında anestezik bir kurbağa direği yerleştirin, sonra pipetin ucunu burun kapsülünün ana boşluğuna taşıyın ve boyanın 0,15 ila 0,3 mikrolitresini teslim edin.
Kurbağa yavrusunu 2-3 dakika bekletin. Pasteur pipeti kullanarak, kurumasını önlemek için hayvanın daha şımartıcı kısımlarına %0,02 MS2 22 çözeltisi damlatın. Hayvanı, kurbağa yavrusunun 10 dakika içinde normal yüzmeyi kurtarması gereken kurtarma tankına aktarın.
Enjeksiyondan sonraki gün koku ampulünün glomerüler tabakası düzeyinde floresans gözlemleyin. Önce koku ampul üzerinde deri kaldırarak görüntüleme için bir anestezi kurbağa yavrusu hazırlayın. Koku ampul düzeyinde merkezi sinir sisteminin kenarında iribaş derisiüzerinde yanal bir kesi yapmak için veni makas kullanın.
Optik sinirin yeri ile kolayca tespit edilebilen kesiği tektuma uzatmaktan kaçının. Pasteur pipeti kullanarak %0,02 MS2 22 çözeltisi damlaları uygulayarak hayvanı nemli tutun ve cımbız kullanarak kesilen deriyi çimdikleyip sinir sisteminin üzerine çekin. Koku ampul üzerinde melanosit yokluğu ile başarılı kaldırma doğrulayın.
Hücre koruma kaplı çanak kuyuiçine kurbağa yavrusu yerleştirin. Tektumun üst kısmını kuyruğun ucuna kadar kaplayacak şekilde yüksek vakum yağıyla kaplanmış cam kapak lı bir fişi yerleştirin. Koku ampulve placodes ekstrasellüler ortama maruz kalmasını sağlamak.
Kas kasılmaları önlemek için 100 mikromolar tubocurarine içeren Xenopus Ringer çözeltisi ile pitri çanak doldurun. Çanak dik bir mikroskop altında kurbağa yavrusu tutan yerleştirin. Xenopus Ringer çözeltisi içeren rezervuarı, Xenopus Ringer çözeltisinin sürekli profüzyonu için polietilen boru kullanarak çanak ile bağlayın.
Xenopus Ringer'ın çözeltisi ile ilgili başla. Deney boyunca çanak sabitindeki çözeltinin seviyesini koruyun. Sürekli damarlar aracılığıyla kan dolaşımını gözlemleyerek kurbağa yavrusu canlılığını değerlendirmek.
Kurbağa yavrusunu görselleştirmek için düşük büyütme hedefi kullanarak canlı görüntülemeye başlayın. Koku çözeltisini bir burun kapsülünün üstüne yerleştirerek koku siniriyle 90 derecelik bir açı oluşturan kapilleri yerleştirmek için mikromanipülatör eksenini hareket ettirin. Burun kapsülü için ipsilaterally bulunan koku ampul bulun.
Uzun çalışma mesafesi ile yüksek büyütme suyu hedefine geçin. I.Glomerüler yapılar tarafından floresan emisyon kontrol açık olmalıdır. Yükseltilmiş bir rezervuar içine taze amino asit çözeltisi 20 mililitre pipetleme ile başlayın.
Sonra kendi konut tankı ndan altı gıda yoksun iribaşları almak ve koku maddelerine maruz kalma en aza indirmek için temiz iribaş su iki litre yerleştirin. Beyaz LED transilluminator üzerine modifiye edilmiş altı iyi çanak yerleştirin. Her kuyuya 10 mililitre iribaş suyu doldurun.
Kuyu başına bir iribaş yerleştirin, sonra en az üç dakika dinlenmeye bırakın. Görüntü edinimi başlatın ve bazal, uyarıcı ve kurtarma dönemleri içeren filmler edinin. Amino asitlerin çözeltisini sağlayan nozula doğru bir hareket olarak çekici bir tepki tespit edilebilir.
Görüntülemeden sonra hayvanları tanklarına geri döndürün. 35 milimetrelik bir alan içinde kurbağa yavrusu kafa konumlarının 35 milimetre veya piksel cinsinden eşdeğer boyutun izlenmesi, koku güdümlü davranışın nicel analizini sağlar. Noktalı çizgi koku çözeltisi girişine proksimal alanı temsil eder.
Kurbağa yavrusu hareketlerinin münferit çizimleri görüntü analizi ile elde edilen X Y koordinatları kullanılarak oluşturulur. Çıkarılan hareketlilik çizimleri sadakatle video görüntüleri çoğaltmak gerekir. Çözelti girişine odaklanmış 8,75 milimetrelik bir alan, hayvanların koku kaynağına olan yakınlığını sınıflandırmak için kullanılır.
Kokunun memesi çevresinde harcanan daha fazla zaman pozitif tropizm gösterir. Belirli periyotlarda meme kenarındaki iribaşlar tarafından harcanan süre, örneğin, 15 saniyelik aralıklarla, amino asit çözeltilerini tespit etme yeteneğinin belirlenmesini sağlar. Kurbağa yavrularının genel davranışı, tek tek verilerin dağılımının çizilmesiyle elde edilebilir.
Amino asit çözeltisi bir milimolar veya 160 mikromolar hazırlanırken pozitif tropizm saptanabilir. Hayvanlar su uygulamasına yanıt vermezler. Bu işlemin ardından, histolojik teknikler veya elektrofizyoloji gibi diğer yöntemler, yaralanma sonrası sinaptik özelliklerin değiştirilmesi gibi ek soruları cevaplamak için yapılabilir.
Bu teknik, geliştirildikten sonra nörobiyoloji alanındaki araştırmacıların Xenopus kurbağa yavrusundaki koku bilgilerinin işlenmesini keşfetmelerinin önünü açmıştır.
