Name: protein-trna agarose gel retardation assays for the analysis of the n6-threonylcarbamoyladenosine tcda function
Uploaded: 2017-06-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function at JoVE.com

MCV, CIB İleri Düzey Programı &quot;Daha İyi Yaşam için Moleküler Makineler&quot; (MACBET) üyesidir. Bu sonuçlara götüren araştırmalar, İspanyol Enstitü Salud Carlos III (PI12 / 01667&#39;den MCV&#39;ye), İspanya Ekonomi Bakanlığı Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R ve SAF2015-72961-EXP&#39;den MCV&#39;ye) tarafından finanse edildi. ), Madrid Bölge Hükümeti (S2010 / BD-2316&#39;dan MCV&#39;ye) ve Avrupa Komisyonu (Çerçeve Programı 7 (FP7)) projesi olan ComplexINC (Sözleşme No. 279039&#39;dan MCV&#39;ye). Fon sağlayanlar, çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayın yapma kararı veya el yazmasının hazırlanmasında rol oynamadı.

Dikkat: Kullanmadan önce ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formlarına (MSDS) başvurun. Bu protokolde kullanılan kimyasallardan birçoğu toksik ve aşındırıcıdır. Davlumbaz ve kişisel koruyucu ekipmanlar (emniyet gözlükleri, eldivenler, laboratuar önlükleri, tam pantolonlar, kapalı pabuçlar, vb .) Dahil olmak üzere fenol kullanarak tRNA&#39;nın özümlenmesinde uygun uygulamaları kullanın. Bu protokol, toksik olmayan bir nükleik asit lekesi kullanıyor. Alternatif lekelerin kullanılması, toksik ve / veya kanserojen olan durumlarda ek önlemler ve lekelenme ajanının özel olarak imha edilmesini gerektirebilir ( örn ., Etidyum bromür). 1. Agaroz Jelinin Hazırlanması <ol><li> 2 g agaroz tartın ve bir% 2 w / v agaroz jel hazırlamak için bir cam şişeye ekleyin. </li><li> Agaroz içeren şişeye 100 mL 1x tris-borat-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (TBE) akan tampon ekleyin. Bir mikrodalga fırında ısıtarak eritin. 30 saniyelik aralıklarla içeriği karıştırıp karıştırınIyi ve agaroz tamamen çözünene kadar bu adımı tekrarlayın. Agaroz çözeltisinin yaklaşık 50-60 ° C&#39;ye soğumasını bekleyin. </li><li> Jel tepsisinin açık kenarlarını bir kalıp oluşturmak için bantlayın, kuyuları oluşturmak için uygun bir tarağı yerleştirin ve eritilmiş agarozu içine dökün. Kabarcık oluşumundan kaçının ve oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin. </li><li> Katılaştıktan sonra, jel tepsisini bir elektroforez birimine yerleştirin ve jel tamamen kaplanıncaya kadar TBE tamponuyla doldurun. </li></ol> 2. tRNA&#39;nın hazırlanması <ol><li> E coli&#39;de tRNA (UUU) <ol><li> Sabah, düşük tuzlu Luria Broth (LB) çizgisi oluşturmak için pET23d-EcUUU 2 ifade geni ( E. coli tRNA&#39;sını (UUU) kodlayan liman) ile dönüştürülen donmuş E. coli BL21&#39;in (DE3) bir şişesini kullanın. 100 ug / mL ampisilin ile desteklenmiş plaka. Plakayı ters çevirin ve koloniler görünene kadar 37 ° C inkübatöre yerleştirin (geç dönem)) Oon. </li><li> İyi yetişmiş tek bir koloni, 5 mL LB artı 100 μg / mL ampisilin içinde inoküle edin ve gece boyunca 37 ° C&#39;de 220 rpm&#39;de büyütün. </li><li> Ertesi sabah, hücreleri peletleyin (4 ° C&#39;de 10 dakika 6,500 xg) orta ile 5 mL taze LB artı 100 μg / mL ampisilin ve tekrar süspansiyon ile değiştirin. 200 mL LB artı 100 μg / mL ampisilin inoküle etmek için bu süspansiyon kullanın. 37 ° C&#39;de 220 rpm&#39;de 5 saat büyütün. </li><li> Kültürün 590 nm&#39;de (OD 590 ) optik yoğunluğu 0.6 - 0.8&#39;e ulaştığında, tRNA (UUU) geninin ekspresyonunu tetiklemek için kültüre 1 mM IPTG ekleyin. 37 ° C&#39;de 3 saat inkübe edin. </li><li> Kültürü 6,500 xg&#39;de 4 ° C&#39;de 10 dakika santrifüj ederek hücreleri hasat edin. </li></ol></li><li> Lizis ve ekstraksiyon <ol><li> Hücre peletini 5 mL liziz tamponu (0.3 M sodyum asetat, 10 mM EDTA) içinde tekrar süspanse edin. Bu noktadan sonra otoklavda kullanılan tamponları kullandı ve tüm tRNA içeren örnekleri 4 ° C&#39;de tutarak tRNA bozunması. </li><li> Davlumbazdaki yeniden asılmış hücre pelletine 1 hacim asit fenol (pH 4.3) ilave edin. Hücreleri çözmek için 1 dakika karıştırın ve 10.000 xg&#39;de (10 dakika, 4 ° C) santrifüjleyin. </li><li> Organik (alt) fazı aspirememek için dikkatli bir pipet kullanarak çözünür tRNA (UUU) (ve diğer tRNA havuzlarının daha küçük konsantrasyonları) içeren üst sulu fazı toplayın. Organik faz ve hücre artıklarından oluşan alt tabaka ve peleti uygun bir kaba atın. </li><li> Çözünür (sulu) fazı, hacimce% 100 v / v etanol ile 1 saat süreyle 4 ° C&#39;de ters çevirerek iyice karıştırarak tRNA&#39;yı çökeltin. Karışımı 15,000 xg&#39;de (30 dakika, 4 ° C) santrifüjleyin. </li><li> Süpernatanı dikkatlice boşaltın ve tRNA zengin pelleti 4 mL jel filtrasyon tamponunda (20 mM sodyum fosfat veya potasyum fosfat, pH 7.4, 0.1 mM EDTA) tekrar süspansiyon haline getirin. % 2 w / v agaroz jeli üzerine 5 μL tekrar süspansiyon haline getirilmiş tRNA havuzunu çalıştırın. NOT:Kaliteli tRNA, tek bir bant (50-100 bp arasında molekül boyutu) olarak görünür. </li></ol></li><li> TRNA&#39;nın saflaştırılması (UUU) <ol><li> Standart kromatografi uygulamasını 12 takiben, daha önce jel filtrasyon tamponunda dengelenmiş bir yüksek çözünürlüklü hazırlayıcı jel filtrasyon sütununa (boyutlar: 16 x 600 mm, yatak hacmi: 120 mL, çözünürlük aralığı: 1,000-70,000 Da) yeniden askıya alınmış tRNA&#39;yı (UUU) yükleyin (mobil aşama). Numunelerin ayrılması için akış oranını 1 mL / dakika olarak ayarlayın. NOT: tRNA (UUU) zirvesi yaklaşık 75.5 mL&#39;de elüte edilir. Tipik olarak, 0.5-1.0 mg / L kültür tRNA verimi elde edilebilir. </li><li> Örnekleri% 5 w / v agaroz jeli üzerinde her bir örnekten 5 - 10 uL elektroforezleyerek temsil eden elüsyon hacimlerinde analiz edin. </li></ol></li></ol> 3. Numune Hazırlama <ol><li> López-Estepa ve ark.na göre TcdA&#39;yı ifade edin ve arıtın. 2 . NOT: 250 μm&#39;ye kadarÇalışma için TcdA kullanılabilir. </li><li> Tablo 1&#39;e uygun olarak 1.5 mL santrifüj tüplerine uygun etiketli TcdA&#39;yı karşılık gelen miktarda pipetleyin. 1.6 mM tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP) (nihai konsantrasyon) ilave edin ve bir pipet kullanarak hafifçe karıştırın. Kapağı kapatın ve karışımı oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> 10 uM adenosin trifosfat (ATP) ve 50 mM MgCl2 (nihai konsantrasyonlar) ilave edin. Bir pipetle karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> Tablo 1&#39;e göre saflaştırılmış tRNA (UUU) (bölüm 2.3) ekleyin, bir pipet ile karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> 100 μL son hacme kadar fosfat tamponlu tuz (PBS) ekleyin. Doğru şekilde karıştırın ve% 10 v / v son konsantrasyona kadar gliserol ekleyin. </li><li> Numuneyi vorteksleyin ve tüpün içeriğini kısaca boşaltın (10,000 xg, 1 dakika, 4 ° C). </li></ol> 4. Jel Yükleme ve Elektroforez Geliştirme<ol><li> Elektroforez ünitesi, elektroforez işlemi sırasında bölmeyi 4 ° C&#39;de tutmak için ezilmiş buz dolu bir tepsi içine yerleştirin. </li><li> Dikkatle, ilgili kuyucuğa her bir örneğin 5 μl&#39;unu pipetleyin. Uygun bir DNA boyutu işaretleyicisi ekleyin. </li><li> Elektrotları güç kaynağı ünitesinin ilgili yuvalarına takın. Güç kaynağı birimini açın ve voltajı 100 V olarak ayarlayın ve jeli 90 dakika boyunca çalıştırın. </li></ol> 5. tRNA-Protein Etkileşimini Gözlemlemek İçin Jel Boyaması <ol><li> Boyama solüsyonunu 50 mL TBE&#39;yi 1x uygun bir DNA lekesi ile karıştırarak hazırlayın. Boyama kabını alüminyum folyo ile kaplayarak boyama çözümünü güneş ışığına maruz bırakmayın. NOT: DNA lekeleri genellikle 10.000 veya 20.000x konsantre stok olarak saklanır. </li><li> 90 dakika boyunca elektroforezden sonra jelini tepsiden dikkatlice çıkarın ve boyama solüsyonu içeren bir kaba yerleştirin. Oda sıcaklığında düşük salınan hızda bir rocker üzerine yerleştirin30 dakika bekleyin. </li><li> Agaroz jeli lekelenme kabından çıkarın, fazlalık sıvıyı çıkarmak için bir parça selüloz dokusu veya filtre kağıdına dikkatlice vurun ve doğrudan transilluminator üzerine yerleştirin. TRNA içeren bantları görselleştirmek için UV ışığını açın. Jelin fotoğrafını çekin. </li><li> Protein boyama (isteğe bağlı). <ol><li> DNA boyama solüsyonunu güvenli bir şekilde atın (güvenlik prosedürlerine göre) ve 50 mL Coomassie Brilliant Blue (CBB) solüsyonuyla değiştirin. Tepsiyi oda sıcaklığında bir rocker üzerine koyun ve bir gece boyayın (&gt; 12 saat). CBB boyama çözüm atın ve aşırı boya kaldırmak için 50 ml PBS ile değiştirin. Bir rocker üzerinde 1 saat bekleyin. </li></ol></li><li> Bir ışık transilluminatör altında protein içeren tRNA kompleksleri görselleştirmek ve tRNA UV jel resmi ile karşılaştırmak için jel fotoğraflarını çekin. </li></ol>

<ol>
	<li>Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+retardation+assay.">The gel retardation assay.</a> Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).</li><li>L&#243;pez-Estepa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+and+small-angle+X-ray+analysis+of+CsdL/TcdA+reveal+a+new+tRNA+binding+motif+in+the+MoeB/E1+superfamily.">The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily.</a> Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).</li><li>Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cyclic+form+of+N6-threonylcarbamoyladenosine+as+a+widely+distributed+tRNA+hypermodification.">A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification.</a> Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).</li><li>Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+protein-protein+interactions+within+the+Cysteine+Sulfinate+Desulfinase+Fe-S+cluster+biogenesis+system.">Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system.</a> J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).</li><li>Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+heteromeric+CsdA-CsdE+cysteine+desulfurase,+assisting+Fe-S+cluster+biogenesis+in+Escherichia+coli.">Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).</li><li>Fried, M. G., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrium+studies+of+the+cyclic+AMP+receptor+protein-DNA+interaction.">Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction.</a> J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).</li><li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions:+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system.">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assays+for+RNA-protein+complexes.">Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).</li><li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift.">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li><li>Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+mobility+shift+assays+to+detect+protein-RNA+interactions.">Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions.</a> Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).</li><li>Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+agarose+gel+electrophoretic+mobility+shift+assay+for+quantitating+protein:+RNA+interactions.">Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions.</a> Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).</li><li>Hagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-filtration+chromatography.">Gel-filtration chromatography.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2001).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada tarif edilen protein-tRNA agaroz jel geciktirme deneyi, çeşitli şekillerde modifiye edilebilir. Birincisi, jelin içindeki agaroz yüzdesi, burada analiz edilen protein (120 kDa) &#39;dan önemli ölçüde daha büyük protein-tRNA komplekslerinin ayrılması ve görselleştirilmesine izin vermek için azaltılabilir. İkincisi, hedef protein termolabilitedeyse, elektroforez cihazını soğuk bir odaya taşıyarak veya üretilen ısıyı derhal dağıtmak için elektroforez haznesi içindeki buz paketlerini ku...

<html> Jel gerilik testi 1 (elektroforetik mobilite kaydırma deneyi EMSA olarak da bilinir), protein-nükleik asit etkileşimlerini incelemek ve karakterize etmek için tasarlanmış bir elektroforetik yöntemdir. Protein-DNA&#39;nın yanı sıra protein-RNA etkileşimlerinin ve özellikle de tRNA ve tRNA-bağlayıcı proteinler arasındaki etkileşimlerin saflaştırılmış bileşenleri veya kompleks protein karışımları ( örn. , Hücre lizatları) veya nükleik asitler ( örn. , TRNA havuzları). Antikoodon kök döngüsünde (ASL) A37&#39;ye bağlanan threonylcarbamoyl yan zincirini siklize eden saflaştırılmış tRNA (UUU) ile TcdA, bir N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A) dehidrataz arasındaki etkileşimin incelenmesine jel geciktirme testleri uyguladık TRNA&#39;ların siklik t6&#39;ya (ct 6 A) 2 , 3&#39;e dönüştürülmesi . TcdA ayrıca CsdL 3 olarak bilinir ,Fc &gt; 4. tcdA / csdL geni sistein desulfurase&#39;ı ve sistein sulfinase desulfinate (CSD) sisteminin sülfür akseptörünü kodlayan csdA ve csdE genleri 5 ile bir küme oluşturur ve canlı ortamda TcdA fonksiyonunu sürdürmek için gereklidir 3 . Jel retardasyon deneylerinin ardındaki mantık, serbest nükleik asit molekülleri, büyük negatif yüklerinden ötürü akrilamidin veya agaroz jellerinin önüne hızla göç ederken, aynı nükleik asitlerin protein komplekslerinin elektroforetik hareketliliği dramatik bir şekilde azalır. Hareketlilikteki azalma, ayrı bantlar olarak çözümlenen nükleik asit-protein komplekslerinde &quot;kayma&quot; olarak görülebilir. Pozitif yüklü ve daha büyük nükleik asit-protein kompleksi, bir jel üzerinde hareketlilikte daha büyük bir kayma veya azalma gösterir. Kompleksin yükle nötrleştirilmesi evrensel bir fenomendirProtein-nükleik asit kompleksleri için, jel retardasyon tahlili geniş bir kompleks yelpazesine ve nükleik asit tiplerine uygulanabilir. Yöntem basit, ucuzdur ve minimum ekipmanlarla laboratuvarlarda yürütülebilir. Sadece az miktarda protein ve tRNA gerekir. Bu, genellikle daha büyük miktarlarda numuneyi tüketen alternatif biyofiziksel teknikler üzerinde bir avantajdır. Jel retardasyon tahlili transkripsiyon faktörlerinin incelenmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Deney, birçok farklı DNA dizisi için transkripsiyon faktörlerinin bağlanma kinetiği, mukavemeti ve özgünlüğünü analiz etmek için kullanılmıştır. Gerçekten de bu alanda EMSA ilk önce 6 , 7 geliştirildi. RNA 8 , 9 , 10 , 11 ve tRNA molekülleri ile jel geciktirme testleri ribozom araştırmasında da kullanılmıştırVe burada yaptığımız gibi, transkripsiyonel olarak tRNA nükleozidlerini değiştiren enzimleri analiz etmek. Birçok farklı parametre, sıcaklık, protein kalitesi ve tRNA örneği gibi jel retardasyon tahlilinin sonucunu ve bağlanma kuvvetini etkiler. Deneyin dikkatli planlanması ve uygulanması, serbest nükleik asit ve protein bağlı türlerin sonuçlarının yorumlanması için çok önemlidir. Burada, tRNA&#39;yı (UUU) kodlayan sentetik geni, promotörü Shine-Dalgarno ribozom bağlanma yerinden yoksun bir ifade vektörüne klonlandı ve büyük miktarda tRNA 2 sentezine yol açtı. Bu ayrıntılı protokol, yaygın hatalar önlenirken tRNA jel geciktirme deneyleri gerçekleştirmek için net bir kılavuz sağlamak üzere hazırlanmıştır.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21(DE3)</td><td>Novagen</td><td>70235</td><td>DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction.</td></tr><tr><td>pET23d</td><td>Novagen</td><td>69748-3</td><td>pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter.</td></tr><tr><td>LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated</td><td>Melford</td><td>GL1703</td><td>Conventional LB Broth, High Salt, can also be used.</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10419313</td><td></td></tr><tr><td>Incubator Shaker (Thermostated)</td><td>NBS</td><td>Excella E24&amp;nbsp;</td><td>Any shaker incubator with temperature control can be used.</td></tr><tr><td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), &gt;=99%</td><td>Acros Organics</td><td>BP1755</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate, anhydrous, &gt;99%</td><td>Melford</td><td>B4017</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, &gt;99%</td><td>Acros Organics</td><td>AC327205000</td><td>Harmful if inhaled.</td></tr><tr><td>Centrifuge (refrigerated)</td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge (refrigerated) rotor</td><td>Eppendorf</td><td>5430/5430P</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall</td><td>RC5C</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge rotor</td><td>Sorvall</td><td>SLA-3000</td><td></td></tr><tr><td>Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 &amp;plusmn; 0.2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4682</td><td>Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive</td></tr><tr><td>Ethanol absolute for analysis, 100% v/v</td><td>Merck Millipore</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, &gt;=99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>48,730,250</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex 75&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28989333</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl]</td><td>Melford</td><td>T1513</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Melford</td><td>B0503</td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td>Haier</td><td>HDA-2070M</td><td></td></tr><tr><td>TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td>Corrosive to metals and skin.</td></tr><tr><td>ATP [Adenosine 5&amp;prime;-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, &gt;=99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;), anhydrous, &gt;=98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl), &gt;99%</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl), &gt;99%</td><td>Melford</td><td>P0515</td><td></td></tr><tr><td>NZYDNA Ladder VI</td><td>NZYtech</td><td>MB8901</td><td></td></tr><tr><td>Power supply</td><td>Consort</td><td>EV261</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis unit</td><td>Real Laboratory</td><td>RELSMINI10</td><td></td></tr><tr><td>Real Safe nucleic acid staining</td><td>Real Laboratory</td><td>RBMSAFE</td><td>20,000X stock</td></tr><tr><td>UV Transilluminator (G:Box/EF)</td><td>Syngene</td><td>2216498</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0770</td><td></td></tr><tr><td>Rocker (Gyro-Rocker)</td><td>Stuart</td><td>SSL3</td><td></td></tr><tr><td>Mixer Vortex&amp;nbsp;</td><td>Fisher brand</td><td>13214789</td><td></td></tr></tbody></table>

protein-trna agarose gel retardation assays for the analysis of the n6-threonylcarbamoyladenosine tcda function

Escherichia coli&#39;de tRNA&#39;nın (UUU) eksprese edilmesi ve saflaştırılması için yöntemler ve tRNA&#39;nın (UUU) TcdA, bir N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A) dehidrataz ile bağlanmasının jel geciktirme deneyleri ile analizi, bu, threonylcarbamoyl TRNA&#39;ların antikodon kök döngüsünde (ASL) A37&#39;ye bağlanmış yan zincirin siklik t6A&#39;ya (ct 6 A) dönüştürülmesi. TRNA (UUU) kodlayan sentetik genin transkripsiyonu E. coli&#39;de 1 mM izopropil β-D-l-tiogalaktopiranozit (IPTG) ile indüklenir ve tRNA içeren hücreler indüksiyonun 24 saat sonra hasat edilir. RNA fraksiyonu asit fenol ekstraksiyon yöntemi kullanılarak saflaştırılır. Saf tRNA, küçük boyutlu tRNA moleküllerini bozulmamış veya parçalanmış nükleik asitlerden verimli bir şekilde ayıran bir jel filtrasyon kromatografisiyle elde edilir. TRNA&#39;ya (UUU) TcdA bağlanmasını analiz etmek için, TcdA tRNA&#39;ya (UUU) karıştırılır ve doğal bir agaroz jelinde 4 ° C&#39;de ayrılır.Serbest tRNA (UUU) daha hızlı göç ederken, TcdA-tRNA (UUU) kompleksleri jel boyama sırasında gözlemlenebilen bir mobilite geriliğine uğrarlar. TcdA&#39;nın bir tRNA (UUU) bağlayıcı enzim olduğunu kanıtlıyoruz. Bu jel gerilik testi, TcdA mutantlarını ve katkı maddelerinin ve diğer proteinlerin bağlanma üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir.

Büyük miktarda tRNA (UUU), güçlü bir indüklenebilir T7 promotörü kontrolü altında E. coli&#39;de tRNA geninin eksprese edilmesi ile elde edilebilir. İfade edilen tRNA (UUU), sitoplazmada birikir ve doğal olarak bol miktarda bulunan tRNA&#39;ların havuzunda zenginleştirilir. EMSA dereceli tRNA elde etmek için bir yakalama / ekstraksiyon basamağı ve bir jel filtrasyon / parlatma aşaması içeren iki aşamalı bir saflaştırma işlemi kullanılmıştır. Yakalama...

Watch this Scientific Journal Video about Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function at JoVE.com

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

TRNA (UUU) üretimi ve agaroz jel geciktirme testleri ile TcdA enzimi ile kompleks içinde tRNA (UUU) analizi için bir protokol sunulmuştur.

Analiz için Protein-tRNA Agaroz Jel Retardasyon Testleri<em&gt; K</em<sup&gt; 6</sup&gt; Threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

protein-trna-agarose-gel-retardation-assays-for-analysis-n6

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

9.7K Görüntüleme.  Spanish National Research Council (CSIC).  TRNA (UUU) üretimi ve agaroz jel geciktirme testleri ile TcdA enzimi ile kompleks içinde tRNA (UUU) analizi için bir protokol sunulmuştur. 

Video: Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

Hazırlama ve<em&gt; İn Vivo</em&gt; Bir Faaliyet tabanlı Sondası kullanılması için<em&gt; K</em&gt; -acylethanolamine Asit aminidaz

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Biyokimya

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzyme

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of the three most common causes of death from parasitic disease. The agent of amebiasis is the amoeba parasite Entamoeba histolytica that exists under two stages: the infective cyst found in food or water and the invasive trophozoite living in the intestine. The clinical manifestations of amebiasis range from being asymptomatic to colitis, dysentery or liver abscesses. E. histolytica is one of the rare unicellular parasite with 5-methylcytosine (5mC) in its genome. 1, 2 It contains a single DNA methyltransferase, Ehmeth, that belongs to the Dnmt2 family. 2 A role for Dnmt2 in the control of repetitive elements has been established in E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 and Drosophila. 6 Our recent work has shown that Ehmeth methylates tRNAAsp, and this finding indicates that this enzyme has a dual DNA/tRNAAsp methyltransferase activity. 7 This observation is in agreement with the dual activity that has been reported for D. discoideum and D. melanogaster. 8 The functional significance of the DNA/tRNA specificity of Dnmt2 enzymes is still unknown. To address this question, a method to determine the tRNA methyltransferase activity of Dnmt2 proteins was established. In this video, we describe a straightforward approach to prepare an adequate tRNA substrate for Dnmt2 and a method to measure its tRNA methyltransferase activity.

In vitro tRNA Methylation Assay with the Entamoeba histolytica DNA and tRNA Methyltransferase Dnmt2 Ehmeth Enzyme

This protocol describes the preparation of a synthetic tRNA substrate for the Entamoeba histolytica DNA/tRNA methyltransferase 2 (Dnmt2) homolog Ehmeth and the measure of its methyltransferase activity. This experimental approach can be used for investigating the activity of other Dnmt2 proteins.

Entamoeba histolytica DNA ve tRNA Metiltransferaz Dnmt2 (Ehmeth) Enzim ile in vitro tRNA Metilasyon Testi

Protozoan parasites are among the most devastating infectious agents of humans responsible for a variety of diseases including amebiasis, which is one of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase activity. Although TERT is named as a reverse transcriptase, structural and phylogenetic analyses of TERT demonstrate that TERT is a member of right-handed polymerases, and relates to viral RNA-dependent RNA polymerases (RdRPs) as well as viral reverse transcriptase. We firstly identified RdRP activity of human TERT that generates complementary RNA stand to a template non-coding RNA and contributes to RNA silencing in cancer cells. To analyze this non-canonical enzymatic activity, we developed RdRP assay with recombinant TERT in 2009, thereafter established in vitro RdRP assay for endogenous TERT. In this manuscript, we describe the latter method. Briefly, TERT immune complexes are isolated from cells, and incubated with template RNA and rNTPs including radioactive rNTP for RdRP reaction. To eliminate single-stranded RNA, reaction products are treated with RNase I, and the final products are analyzed with polyacrylamide gel electrophoresis. Radiolabeled RdRP products can be detected by autoradiography after overnight exposure.

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) synthesizes not only telomeric DNA but also double-stranded RNA through RNA-dependent RNA polymerase activity. Here, we describe a newly established assay to detect RNA-dependent RNA polymerase activity of endogenous TERT.

İnsan revers transkriptaz protein RNA'ya bağımlı RNA polimeraz aktivitesinin yarı kantitatif algılama

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Genetik

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these epigenetic marks is accomplished by sequential oxidation by ten-eleven translocation dioxygenases (TET1-3), followed by the thymine-DNA glycosylase-dependent base excision repair. Inactivation of the TET2 gene due to genetic mutations or by other epigenetic mechanisms is associated with a poor prognosis in patients with diverse cancers, especially hematopoietic malignancies. Here, we describe an efficient single step purification of enzymatically active untagged human TET2 dioxygenase using cation exchange chromatography. We further provide a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) approach that can separate and quantify the four normal DNA bases (A, T, G, and C), as well as the four modified cytosine bases (5-methyl, 5-hydroxymethyl, 5-formyl, and 5-carboxyl). This assay can be used to evaluate the activity of wild type and mutant TET2 dioxygenases.

Here, we present a protocol for an efficient single step purification of the active untagged human ten-eleven translocation-2 (TET2) 5-methylcytosine dioxygenase using ion-exchange chromatography and its assay using a liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)-based approach.

Etkili arınma ve on-Eleven Translocation-2 5-metilsitozin Dioxygenase için tahlil LC-MS/MS tabanlı geliştirme

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

TRNA-Isopentenyl transferaz aktivite tespit etmek için bir In Vitro tahlil

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

RNA metiltransferaz aktivite analizi için Antibody Içermeyen tahlil

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Enzimatik Deneyi Galyum (III) ve H Transkripsiyon İnhibisyonunu Tedbir<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentaflüorofenil) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Biyomühendislik

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucleocapsid Tavlama Dolayımlı Elektroforez (ADI) Testi HIV-1 Nükieokapsit inhibitörlerinin Hızlı tanımlanması sağlar

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent advancements in CD spectroscopy have enabled the study of DNA-protein interactions and conformational dynamics of DNA in different microenvironments in detail for a better understanding of transcriptional regulation in vivo. The area around a potential transcription zone needs to be unwound for transcription to occur. This is a complex process requiring the coordination of histone modifications, binding of the transcription factor to DNA, and other chromatin remodeling activities. Using CD spectroscopy, it is possible to study conformational changes in the promoter region caused by regulatory proteins, such as ATP-dependent chromatin remodelers, to promote transcription. The conformational changes occurring in the protein can also be monitored. In addition, queries regarding the affinity of the protein towards its target DNA and sequence specificity can be addressed by incorporating mutations in the target DNA. In short, the unique understanding of this sensitive and inexpensive method can predict changes in chromatin dynamics, thereby improving the understanding of transcriptional regulation.

The interaction of an ATP-dependent chromatin remodeler with a DNA ligand is described using CD spectroscopy. The induced conformational changes on a gene promoter analyzed by the peaks generated can be used to understand the mechanism of transcriptional regulation.

DNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için CD Spektroskopisi

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

Analiz için Protein-tRNA Agaroz Jel Retardasyon Testleri

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Hazırlama ve