RNA'nın üçte ikisi metilasyonolmak üzere 100'den fazla farklı modifikasyonu vardır. Bu protokol, RNA metilasyon yazar etkinliğinin hassas ve doğru analizi için bir yöntem sağlar. Bu kullanımı kolay teknik, genellikle eserlere yatkın olan antikorlar kullanmadan metillenmiş RNA'yı ölçmemize ve görselleştirmemize olanak sağlar.
Prosedürü gösteren Samantha Shelton, benim laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi olacak. Bu prosedürü başlatmak için, metin protokolünde belirtildiği gibi, buz üzerinde 1,5 mililitrelik bir tüp içinde 100 mikrolitrelik RNA metiltransferaz test ayarlayın. Girdap tüp iyice karıştırmak için, ve tüpün altındaki çözeltiyi toplamak için beş saniye boyunca 200 kez g santrifüj.
Tüpü 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın. Ardından, metin protokolünde belirtildiği gibi sütun arınmasını kullanarak reaksiyonu temizleyin. Sıvı sintillasyon sayısını gerçekleştirmek için, numune başına bir şişe, arka plan ölçümü için bir şişe ve kaydırma testi için bir şişe ile sintillasyon sayımı rafını ayarlayın.
Şişeleri beş mililitre sintilasyon sayma çözeltisi ile doldurun. Bir şişe içine her eluted radyoaktif RNA örnek 10 mikrolitre ekleyin. Kapağı nı sıkın ve hafifçe karıştırın.
Kaydırma testi şişelerini hazırlamak için, işlem sırasında kullanılan tüm yüzeylere ve ekipmanlara pamuklu bezleri iyice ovun. Scintillation çözeltisi ile dolu şişelere bu bezleri ekleyin ve kapağı sıkın. Örnekleri Sintillation sayacında çalıştırmak için, tezgah başlığını açın, rafı makineye takın ve kaputu kapatın.
Count Tek Raf'ı seçin. Kullanıcı Programını Seç'i seçin. 60 saniye boyunca trityum ölçen bir program seçin veya oluşturun ve Count Rack'e çarptı.
Sintillation sayısını üç kez tekrarlayın. Bundan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi, bir üre denaturing poliakrilamid jel, yeniden çalıştırın. 20 mikrolitre radyoaktif RNA materyalini 20 mikrolitre 2X jel yükleme tamponu içeren 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.
Merdiveni hazırladıktan sonra, örnekleri 70 derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın. Jel tanklarından gelen tamponu jelin kuyularına boru layarak numune yüklemesinden hemen önce jelkuyularını bir kez daha yıkayın. Daha sonra, hazırlanan merdivenin 20 mikrolitresini, numunelerin 20 mikrolitresini ve jelin şeritlerine 20 mikrolitre 1X jel yükleme tamponu yükleyin.
Poliakrilamid yüzdesine bağlı olarak, 60 ila 180 dakika boyunca 100 volt jel çalıştırın. Jel çalışma bittikten sonra, kasetten jel çıkarın ve ultrahassas nükleik asit jel leke beş mikrolitre ile 1X TBE tampon 50 mililitre içeren bir kutu ya. RNA'yı lekelemek için bir rockçıya beş dakika kuluçkaya yat.
Bundan sonra, dikkatle kutunun jel almak ve kuyular ve soldaki merdiven ile jel görüntüleme sisteminin UV transilluminator üzerine yerleştirin. Kamerayı jelin üzerine odakla, UV ışığını açın ve jelin görüntüsünü alın. Ardından, UV pozlamasını kapatın ve görüntüyü TIFF dosyası olarak kaydedin.
Jeli kutuya geri yerleştirin, TBE'yi çıkarın ve 30 dakika oda sıcaklığında bir kayaç üzerinde 50 mililitre sabitleme çözeltisi ile jeli düzeltin. Daha sonra jeli, 25 mililitre otoradyografi arttırıcı solüsyon içeren taze bir kara kutuya hafifçe taşıyın. 30 dakika oda sıcaklığında rocker üzerinde kuluçka.
Jeli yavaşça kaldırın ve kuyular yukarı ve sağ taraftaki merdivenle plastik bir sargı üzerine yüz aşağı yerleştirin. Jelin arkasına iki yaprak kromatografi kağıdı yerleştirin ve tüm desteyi çevirin. Jel kurutma makinesini önceden 80 dereceye ısıtın.
Jel kurutucuüzerindeki plastik kapağı geri hareket ettirin. Tüm desteyi plastik kapağın altına yerleştirin ve plastik kapağı bir mühür oluşturmak için aşağı doğru hareket ettirin. Jeli 80 derecede bir saat kurutun.
Sonra, jel kurutucu kapatın ve yavaşça yığını çıkarın. Sarma ve ikinci kromatografi kağıdını çıkarın. Kalan kromatografi kağıdını kurutulmuş jelle birlikte otoradyogram kasete kaydedin.
Karanlık bir odada, otoradyografi film bir sayfa ekleyin. Kaseti negatif 80 santigrat derecede saklayın ve sinyali yoğunluğuna bağlı olarak filmi uygun zamanda geliştirin. Film geliştirildikten sonra, kasetin üzerine yerleştirin ve jelin dört kenarını, her kuyuyu ve XC ve BB boyalarının konumunu dikkatlice işaretlemek için bir laboratuvar işaretçisi kullanın.
Filmi inç başına 300 veya 600 piksel çözünürlükte tarayanın ve görüntüyü TIFF dosyası olarak kaydedin. Bu çalışmada RNA metiltransferaz aktivitesini analiz etmek için antikorsuz bir analiz gösterilmiştir. 7SK küçük nükleer RNA'nın T7 RNA polimeraz ile in vitro transkripsiyon reaksiyonundan tipik bir çalışma nispeten kısa ve yüksek yapılandırılmış RNA gösterir.
7SK'dan daha kısa ve daha uzun, muhtemelen rasgele transkripsiyon elolayı veya sonlandırma olaylarından kaynaklanan birden fazla istenmeyen bant vardır. Bu nedenle, in vitro transkripsiyon reaksiyonu sonrasında jel arıtma temiz bir RNA örneği elde etmek için önemlidir. Bu noktada, ilgi RNA merdivene göre konumu ile tespit edilebilir ve jel arıtma ile saflaştırılmış.
Önerilen RNA ve protein konsantrasyonlarının alt limitini kullanan temsili bir RNA metiltransferaz tayı burada gösterilmiştir. Bu tahsin, hem sintillasyon sayılarından hem nicel sonuçlar hem de otoradyogramdan nitel sonuçlar sağlar. Burada 7SK'yi metilatabildiği bilinen bir RNA metiltransferazın u6'yı da metilatilemlet edebildiği gösterilmiştir. Ayrıca, son zamanlarda 7SK için gösterildiği gibi, MePCE histon H4 bağlanması da U6 metilasyon inhibe.
Bu, hem sintilasyon sayısında hem de bu protokolün sağlamlığını gösteren otoradyogramda görülebilir. RNA bozulmaya karşı hassastır, bu nedenle lütfen RNase içermeyen reaktifleri kullandığınızdan ve tüm yüzeyleri ve ekipmanları iyice temizlediğinden emin olun. Bu metiltransferaz tayından elde edilen radyoaktif etiketli RNA, örneğin elektroforetik hareketlilik kayması tonu ile RNA demethylaz aktivitesini veya RNA bağlama aktivitesini değerlendirmek için doğrudan kullanılabilir.
Bu yöntem, araştırmacıların nokta mutasyonları ve küçük molekül inhibitörü tedavileri de dahil olmak üzere farklı faktörlerin RNA metiltransferaz aktivitesi üzerindeki etkisini test etmesine olanak tanır. Bu yöntem radyoaktif madde kullanır, bu nedenle uygun PPE giymek emin olun, ve taşıma ve radyoaktif maddelerin atılması sırasında dikkatli olun.
