This work was supported by Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unit&#224; per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant: PGR Italy-USA) and by MIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant: 2010W2KM5L_006).

Malzeme, Nükleik Asitler ve Proteinler 1. Hazırlık <ol><li> Nükleik Asitler <ol><li> 1.5 ml tüpler Otoklav ve steril bir kap içinde depolamak. Kirletici maddeleri laboratuvar sarf gelen nükleazlar yani ortadan kaldırmak için steril filtre ipuçlarını kullanarak her adımı gerçekleştirin. </li><li> DEPC ile muamele edilmiş su içinde Tris-HCI, 10 mM tampon pH 7.5 hazırlamak ve bir 0.22 um gözenek boyutlu filtre içinden filtre edilirken çözelti filtre. </li><li> NOT: &quot;TAR&quot; olarak adlandırılan oligonükleotid kısa (29-mer) RNA dizisine karşılık 5&#39;-GGCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGCC-3 &#39;15 cTAR kendi DNA tamamlayıcı dizisi 5&#39;-GGCAGAGAGCTCCCAGGCTCAGATCTGCC-3 iken&#39;. <ol><li> Yukarıda belirtilen Tris tamponu TAR ve cTAR hem çözünür (1.1.2.) 100 mcM stok çözümleri yapmak. -20 ° C&#39;de saklayın cTAR stok çözeltisi (alikotları bu koşullarda ay depolanabilir). RNA uzun süreli depolama için, TAR 20 ul hacimde yapmakStok çözeltisi, bir vakum yoğunlaştırıcı santrifüj kullanılarak, her bir kısım kurutulur ve -80 ° C&#39;de saklayın. Taze, kullanımdan önce, 20 ul DEPC ile muamele edilmiş su içinde her bir TAR kısım tekrar süspansiyon. Not: Çalışma TAR alikotları, iki hafta boyunca -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol></li></ol></li><li> NC proteini ve (12-55) NC peptit <ol><li> Rapor edilen tam boyunda biraraya getiren NC proteini hazırlanır. 16 mağazası -20 ° C &#39;de parçalar halinde stok çözeltisi. 6410 M -1 cm-1, 280 nm &#39;de bir sönüm katsayısı kullanarak, bir UV-Vis ile tam protein konsantrasyonunu belirleyin. </li><li> Sentetik (12-55) Tris-HCI, 10 mM pH 7.5 içinde Carolina peptid yeniden süspanse edilir ve -20 ° C&#39;de parçalar halinde stok solüsyonu saklayın. 5,700 M, 280 nm &#39;de bir sönüm katsayısı kullanarak, bir UV-Vis doğru peptid konsantrasyonunu belirlemek 1 cm-1. Not: (12-55) NC Peptit HPLC saflaştırıldı ve liyofilize elde edildiÇinko klorür iki eşdeğer ihtiva eden bir çözelti üzerinden ilized. </li></ol></li><li> Bileşik 1 <ol><li> Bir analitik terazi kullanılarak liyofilize bileşik 1 yaklaşık 1 mg tartılır ve yüksek bir konsantrasyon (≈10 mM) stok çözeltisi elde etmek üzere,% 100 DMSO içinde 100 ul, vaktinde tartılır içinde çözülür. Onun sönüm katsayısı kullanılarak UV-Vis spektrofotometre üzerinde tam bileşik konsantrasyonunu belirlemek (354 nm: 11.387 M -1 cm -1). Kullanımdan önce -20 ° C&#39;de karanlıkta stok solüsyonu saklayın. </li></ol></li></ol> 2. Gel Gel cihaz ve Döküm kurma <ol><li> Kuru onlara izin,% 70 etanol ile (uzun diğeri kısa) iki tabak durulama, jel kurmak, ve sonra daha uzun plaka uzun kenarları boyunca iki 1 mm pulları yerleştirmek için; Kısa plaka ile örtün, ve altta iki tabak hizalamak için emin olun. </li><li> Jel dökme için, SUPP tarafından sağlanan yönergeleri izleyinlier (sandviç kelepçeler ve yığınlar her döküm aparatı tarafından sağlanan farklı tedarikçiler biraz farklı cihazı kullanın). Tüm durumlarda, kelepçeler, yığınlar ve contalar temiz olduğundan emin olun, önceki kullanıcılar tarafından sol akrilamid izlerini kaldırmak. </li><li> Döküm standı monte jel sandviç yerleştirin ve tedarikçi tarafından özel talimatları uygulayın. NOT: Genellikle döküm yuvasının altındaki temiz bir silikon conta iyi bir sızdırmazlık sağlar ve jel dökerken sızıntıları önlemek için yardımcı olur. </li><li> Cam plakalar arasında bir pipet kullanarak damıtılmış su dökün, kaçakları kontrol etmek. Sandviç doldurmak ve hiçbir sızıntıları emin olmak için birkaç dakika bekleyin su ekleyin. Sandviç doğru monte edilirse, suyun ayrılması ve gözlük kurumaya iki gözlük arasındaki bir filtre kağıdı yerleştirin. Kağıdı çıkarın ve şimdi sandviç jel döküm için hazırdır. </li><li> Oda sıcaklığında (RT, 25 ° C) &#39;de jel dökün. Poliakrilamid derece nörotoksik olduğundan, eldiven giyin. Bizeolmayan denatüre (yerli) koşullarda e sürekli% 12 poliakrilamid jeller ADI tahlil gerçekleştirmek için. <ol><li> % 12 jel çözeltisi hazırlayın:% 40 akrilamid 12 ml karıştırın / bisakrilamid (19/1) çözümü, 4 ml TBE 10x tampon (10x: Tris-HCl 890 mM, Borat 890 mM EDTA 20 mM) ve 24 ml MilliQ su . 400 ul APS ve kullanımdan hemen önce Temed 50 ul ekleyin. Çözüm karıştırın ve hızla cam plakalar arasındaki çözüm aşağı dökmek bir pipet kullanın. Kabarcıklar kaçınarak, cam plakalar arasındaki tarağı tanıtın. Tam sandviç doldurmak için jel solüsyonu ekleyin. </li></ol></li><li> Jel, 1 saat 45 dakika süreyle polimerize olsun. Hemen örnek yüklemeden önce, yavaş yavaş tarak çıkarın ve distile su ile iyice durulayın kuyu. </li><li> Polimerizasyon ve kuyular durulama adımlarından sonra, dikey jel elektroforezi için aparat jel sandviç yerleştirmek için tedarikçi tarafından özel talimatları uygulayın. Bir soğutma sistemi varsa, cor jel sistemini yerleştirmek için emin olunSoğutma çekirdeğin ru konumu. </li><li> Sistem birden fazla jel işlemek için tasarlanmış, ama sadece bir jel çalıştırmak zorundadır ise, tam üst tampon odasına oluşturmak üzere diğer tarafta soğutma çekirdek tampon baraj gibi bir jel sandviç takın. NOT: Baraj doğru yerleştirilir değilse, üst tampon jel çalıştırmak durdurma muhtemelen sızdırıyor. </li><li> (: Tris-HCl 89 mM, borat 89 mM, EDTA 2 mM 1x), iyonu giderilmiş su içinde çalışan tampon TBE 2.5 L hazırlayın. Üst tampon odası için TBE tamponu ayrı yaklaşık 500 ml Set ve alt tampon odasına geri kalanını dökün. Üst tampon odasına kalan 500 ml TBE tampon dökün. </li><li> Anot ve katot uygun pozisyonda böylece, alt tampon odasının üstüne kapağını yerleştirin. </li><li> Varsa hortumları kullanarak bir su musluğuna, soğutma çekirdek bağlayın. Elektroforez sırasında bir ısı alıcı olarak hareket ve musluk suyu seçecek sırasında çekirdek aracılığıyla dolaşıma izin verir musluk suyu ile çekirdek, Dolgurophoresis. </li></ol> 3. Nükieokapsit Tavlama aracılı Elektroforez (ADI) Deneyi <ol><li> Tamponlar hazırlanması <ol><li> TNMg tamponu hazırlayın (1x: Tris-HCI 10 mM, NaCI, 20 mM Mg (ClO 4) 2 1 mM, pH 7.5), DEPC ile muamele edilmiş su ve 0,22 um gözenek boyutlu filtre içinden filtre edilirken çözelti filtre. Not: TNMg tampon 7 güne kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. En iyi katlama ve tavlama sonuçları için, taze yapılmış tamponlar kullanılmasını tavsiye ederiz. </li><li> SDS ihtiva eden bir jel yükleme tamponu hazırlayın (glb SDS: Tris-HCl, 100 mM EDTA, 4 mM, 50% w / h gliserol,% 2 w / hac SDS,% 0.05 mavi h bromofenol / ağ), DEPC ile muamele edilmiş su içinde. NOT: GLB oligonükleotidler örnekleri jel sistemine çalışan ne kadar izlemek için yardımcı olur ve jel içine örnekleri batmaya sağlar. GLB için SDS eklenmesi ADI tahlil optimal başarısı için kritik bir adımdır. Bu adımı takip değilse, o ge nükleik asitler bant ayırt etmek mümkün değildirl sistemi (Şekil 2). </li></ol></li><li> Hazırlık Kontrolleri <ol><li> Seri oligonükleotidler stok çözümleri sulandırmak ve TAR 1 uM çözeltisinin 10 ul hazırlamak için taze yapılmış 10 mcM çözümler kullanabilirsiniz. Ayrı ayrı, aynı şekilde hazırlayın 1 uM cTAR 10 ul TNMg 1x tamponu içinde. 5 dakika boyunca 95 ° C&#39;ye kadar, her tüp ısıtılması ve daha sonra da kök çıkıntı-döngü yapılarını varsaymak TAR ve cTAR sırayla oda sıcaklığına soğumaya bırakın. </li><li> Kontrol olarak hibrid TAR / cTAR 1 uM çözeltisi hazırlayın. 10 ul bir toplam hacim içinde, TNMg 1x 10 uM cTAR 1 ul 10 uM TAR 1 ul karıştırın. 5 dakika boyunca 95 ° C&#39;ye değin ısıtılması ile oligonükleotitleri denatüre ve bırakmak TAR, tamamlayıcı dizi cTAR tavlanacak şekilde ve çift-şeritli hibrid katran / cTAR oluşturmak için sırayla oda sıcaklığına yavaş yavaş soğumaya bırakılmıştır. </li><li> Çözeltiler, oda sıcaklığına kadar soğutuldu, zaman, bir kısa-eğirme santrifüj uygulayın. GLB SDS 3 ul ekleyin, pipet EACh tüpü 3 kez içinde çözüm ve buz tüpü koymak. Yükleme adım kadar buz üzerinde sabit kontrol örnekleri tutun. </li></ol></li><li> Numuneler hazırlık NC protein ve (12-55) NC peptit aktivitesini analiz etmek <ol><li> Her bir numune için taze 4 uM oligonükleotid çözeltisi 2.5 ul kullanın. Her zaman pipetleme hataları önlemek için her çözümün biraz aşırı miktarda hazırlamak. Yukarıda belirtilen kontroller hazırlanması için bildirilen TNMg 1x tamponu içinde cTAR bölgesinin ayrı ayrı, TAR 4 mcM solüsyonu 32.5 ul katlayın ve (adım 3.2.1.). </li><li> MilliQ su ile 80 uM çözeltisine, her iki NC Stok protein çözeltisi ve (12-55) NC peptit seyreltin. </li><li> TAR, cTAR çözeltiler, oda sıcaklığına kadar soğutulur, her iki tüp kısa-eğirme santrifüj yapmak ve numuneler boruların hazırlanması başlar. </li><li> Tüpler otoklava 12 boş 0.5 ml hazırlayın. Laboratuar örnekleri için rafa 4 tüp 3 satır yerleştirin. Her satır th analiz sırasıyla örnekleri gösterire tam uzunlukta NC proteini, protein olmadan örnekleri ve numuneler (12-55) NC peptit aktivitesini analiz etmek. </li><li> Her zaman farklı reaktif kullanılan ipuçları değiştirin. </li><li> Her bir tüp haline TAR 2.5 ul ve katlanmış cTAR 2.5 ul ekleyin. NC ve (12-55) NC analizi için numuneler 4 ul DEPC arıtılmış su ekleyin. Diğer örnekler 5 ul DEPC arıtılmış su ekleyin. </li><li> Sırasıyla, Örneklerin 80 mcM NC 1 ul veya 80 uM (12-55) 1 ul NC ekle, NC veya (12-55) NC analizi. </li><li> Her boru 3 kez içinde solüsyonu pipetle, (Şekil 1 &#39;de &quot;0 olarak rapor) saat 0 dakika örnekleri glb SDS hemen 3 ul ekleyin ve son olarak buz üzerine tüp koydu. Tüm örnekler ve kontroller için bu adımı tekrarlayın. Yükleme adım kadar buz üzerinde sabit örnekleri tutun. </li><li> 15 dakika, 30 dakika ve oda sıcaklığında inkübasyondan 1 saat sonra, glb SDS 3 ul EAC içindeki çözeltisi pipeth tüpü 3 kez ve buz tüpü koymak. Sırasıyla tüm örnekler ve kontroller için bu adımı yineleyin ve yükleme aşamasına kadar buz üzerinde tutmak. </li><li> Jel cihazının kapağını çıkarın. Yük kuyulara her numunenin 13 ul daha önce iyi oluşturan tarak ile jel döküm tarif Oluşan. Şekil 1&#39;de bildirilen düzeni aşağıdaki örnekleri yükleyin. </li><li> Jel cihazının kapağını değiştirin. Güç kaynağına jel cihazının açar takın. Elektrotlar güç kaynağı doğru yuvalara takılı olduğundan emin olun. </li><li> Güç açma ve Renk verici madde jelin alt yukarıda 1.5 cm göç kadar, 2 saat boyunca karıştırılır ve 200 V sabit gerilimde, 30 dakika boyunca jel üzerinde çalıştırıldı. </li></ol></li><li> Numune hazırlama NC ve (12-55) NC üzerinde antrakinon etkinliğini analiz etmek <ol><li> Bileşik 1 stok solüsyonu sulandırmak. 500 uM, 10 ul, 250 uM, bileşik 50 uM, 5 uM seyreltme hazırlanması &lt;MiliQ suyu 1 strong&gt;. </li><li> Yukarıda belirtildiği gibi, kontrol örnekleri hazırlayın (paragraf 3.2.). </li><li> Her bir numune için taze 4 uM oligonükleotid çözeltisi 2.5 ul kullanın. Her zaman pipetleme hataları önlemek için her çözümün biraz aşırı miktarda hazırlamak. TNMg 1x tamponunda cTAR bölgesinin ayrı ayrı, TAR 4 mcM çözeltisi 27.5 ul katlayın ve yukarıdaki gibi (adım 3.2.1.) Sözü. </li><li> Su içinde 80 uM çözeltisine, her iki NC Stok protein çözeltisi ve (12-55) NC peptit seyreltin. </li><li> TAR ve cTAR çözümleri oda sıcaklığına soğutuldu zaman, her iki tüpler kısa spin santrifüj gerçekleştirmek ve numunelerin hazırlanması başlar. </li><li> Tüpler otoklava 20 boş 0.5 ml hazırlayın. Laboratuar örnekleri için rafa 10 tüplerin her biri 2 satır yerleştirin. </li><li> Her zaman farklı reaktif kullanılan ipuçları değiştirin. </li><li> Katlanmış TAR 2.5 ul ilk sıranın her tüp ekleyin. Katlanmış cTAR 2.5 ul ikinci sıranın her tüp ekleyin. </li><li&gt; Uygun bileşik 2 ul ekleyin 1 seyreltme TAR ve cTAR (500 uM seyreltme için 5 uM konsantrasyonu artar). Bileşiğin olmaması durumunda NC analizi ve (12-55) NC örneklerde, bileşiğin su ile değiştirin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 15 dakika inkübasyondan sonra, muhabir TAR örneklerinde (birinci sıranın tüpleri) ile cTAR örnekleri (ikinci sıranın tüpler) karıştırın. </li><li> Sırasıyla, NC veya (12-55) NC analizi için numuneler 80 mcM NC 1 ul veya 80 uM (12-55) 1 ul NC ekleyin. </li><li> 15 dakika inkübasyondan sonra, GLB SDS 3 ul eklediğiniz her tüpü 3 kez pipet ve buz tüpü koymak. NC ve (12-55) NC analizi için numuneler kullanılarak, sırasıyla, bu adımı tekrarlayın. Yükleme adım kadar buz üzerinde sabit örnekleri tutun. </li><li> Jel cihazının kapağını çıkarın. Kuyulara her numunenin 13 ul yükleyin. Şekil bildirilen sırayla aşağıdaki örnekleri yükleyinure 3B. </li><li> Jel cihazının kapağını değiştirin. Güç kaynağına jel cihazının açar takın. Elektrotlar güç kaynağı doğru yuvalara takılı olduğundan emin olun. </li><li> Güç açma ve Renk verici madde jelin alt yukarıda 1.5 cm göç kadar, 2 saat boyunca karıştırılır ve 200 V sabit gerilimde, 30 dakika boyunca jel üzerinde çalıştırıldı. </li></ol></li><li> Numune hazırlama: NC-preinkübasyon modu vs Oligo-preinkübasyon modu <ol><li> Bileşik seyreltin 1 stok solüsyonu. 500 uM, 10 ul, 250 uM, 50 uM, MiliQ suyu içinde bileşik 1 5 uM seyreltme hazırlayın. </li><li> Yukarıda belirtildiği gibi, kontrol örnekleri hazırlayın (paragraf 3.2.). </li><li> Her bir örnek için 4 uM oligonükleotid çözeltisi 2.5 ul kullanın. Her zaman pipetleme hataları önlemek için her çözümün biraz aşırı miktarda hazırlamak. Yukarıda belirtildiği gibi TNMg 1x tamponu içinde cTAR bölgesinin ayrı ayrı, TAR 4 mcM çözeltisi 27.5 ul katlayın ve (adım 3.20,1.). </li><li> Su içinde 80 uM çözeltisine, her iki NC Stok protein çözeltisi ve (12-55) NC peptit seyreltin. </li><li> TAR ve cTAR çözümleri oda sıcaklığına soğutuldu zaman, her iki tüpler kısa spin santrifüj gerçekleştirmek ve numunelerin hazırlanması başlar. </li><li> Her zaman, her zaman reaktifler değiştirilir ipuçları değiştirmek veya reaksiyon tüpünde bulunan diğer herhangi bir sıvı veya çözelti dokunulursa. </li><li> Bu aşamada açıkça etiket ve iki farklı ön-kuluçka prosedürleri için örnekleri ayırmak için emin olun. <ol><li> Oligo preinkübasyon modu <ol><li> Tüpler otoklava 10 boş 0.5 ml hazırlayın. Laboratuar örnekleri için rafa 5 tüplerin 2 satır yerleştirin. </li><li> Katlanmış TAR ilk satırı 2.5 ul her tüp ekleyin. Katlanmış cTAR ikinci sıra 2.5 ul her tüp ekleyin. </li><li> Uygun bileşik 2 ul ekle 1 seyreltme TAR ve cTAR (500 uM seyreltme için 5 uM konsantrasyonu artar).Bileşiğin olmaması durumunda NC analizi için numune su ile bileşik değiştirin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 15 dakika inkübasyondan sonra, cTAR örnekleri (ikinci sıra) almak ve muhabir TAR örneklerinde (ilk satır) ile koyun. </li><li> Her bir numune için 80 uM NC 1 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 15 dakika için örnek inkübe edin. </li><li> 15 dakika inkübasyondan sonra, GLB SDS 3 ul eklediğiniz her tüpü 3 kez pipet ve buz tüpü koymak. Yükleme adım kadar buz üzerinde sabit örnekleri tutun. </li></ol></li><li> NC-preinkübasyon modu <ol><li> 5 boş 0.5 mL otoklava tüpleri hazırlayın ve laboratuar örnekleri için rafa koyun. </li><li> Uygun bileşik 1 seyreltme her tüp 4 ul ekle (500 uM seyreltme için 5 uM konsantrasyonu artar). Bileşiğin olmaması durumunda NC analizi için numune su ile bileşik değiştirin. </li><li> 80 μ her bir tüp içinde ekleme 1 ulM, Kuzey Carolina, oda sıcaklığında 15 dakika için örnek inkübasyon ve. </li><li> Bir tüp haline cTAR 15 ul katlanmış TAR 15 ul karıştırın ve bir sonraki aşamada bu TAR + cTAR solüsyonu kullanın. </li><li> 15 dakika inkübasyondan sonra, TAR + cTAR karışımı çözeltisi her bir örnek, 5 ul ekle ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca numune inkübe edin. </li><li> 15 dakika inkübasyondan sonra, GLB SDS 3 ul eklediğiniz her tüpü 3 kez pipet ve buz tüpü koymak. Yükleme adım kadar buz üzerinde sabit örnekleri tutun. NOT: aşama ile ilgili 3.5.8 yapılan analizler tüm örneklerde (3.5.7 den devam) ile yapılabilir. </li></ol></li></ol></li><li> Jel cihazının kapağını çıkarın. Kuyulara her numunenin 13 ul yükleyin. Şekil 4 bildirilen düzeni aşağıdaki örnekleri yükleyin. </li><li> Jel cihazının kapağını değiştirin. Güç kaynağına jel cihazının açar takın. Elektrotlar güç Özel Sayı doğru yuvalara takılı olduğundan emin oluny. </li><li> Güç açma ve Renk verici madde jelin alt yukarıda 1.5 cm göç kadar, 2 saat boyunca karıştırılır ve 200 V sabit gerilimde, 30 dakika boyunca jel üzerinde çalıştırıldı. </li></ol></li></ol> 4. Jel ve Jel Boyama Çıkarma <ol><li> Elektroforez sonrasında, güç kaynağını kapatın ve elektrik kablolarını sökün. Soğutma sisteminin su musluğunu kapatın ve çekirdek hortumları ayırın. </li><li> Sistem soğutuldu eğer, soğutma çekirdek kaldırmak ve her iki odalarından tampon kapalı dökün, kapağını kaldırın ve. </li><li> Yavaşça cihazdan jel sandviç sökmeye ve cam plakalar tüm kelepçeleri çıkartın. , Plakalardan jel kaldırmak plakaların yan dışarı aralama birini itmek ve yukarı çekin ve uzak üst cam levha için yavaşça çevirin. Jel iki köşe kavrayın ve camdan çıkarmak için hafifçe kaldırın. </li><li> Için arzu edilen nükleik asitler, boyama çözeltisi ile uygun bir kapta jel yerleştirinKarıştırılarak 30-45 dk. </li><li> Boyama işleminden sonra jel sisteminde nükleik asitler, floresan sinyalini tespit etmek için bir transilluminator&#39;de görüntüleme sisteminde jel koydu. </li></ol>

<ol>
	<li>Druillennec, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mimic+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+impairs+reverse+transcription+and+displays+antiviral+activity.">A mimic of HIV-1 nucleocapsid protein impairs reverse transcription and displays antiviral activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4886-4891 (1999).</li><li>Darlix, J. L., Garrido, J. L., Morellet, N., Mely, Y., de Rocquigny, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+functions,+and+drug+targeting+of+the+multifunctional+nucleocapsid+protein+of+the+human+immunodeficiency+virus.">Properties, functions, and drug targeting of the multifunctional nucleocapsid protein of the human immunodeficiency virus.</a> Adv Pharmacol. 55, 299-346 (2007).</li><li>Thomas, J. A., Gorelick, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocapsid+protein+function+in+early+infection+processes.">Nucleocapsid protein function in early infection processes.</a> Virus Res. 134, 39-63 (2008).</li><li>Mirambeau, G., Lyonnais, S., Gorelick, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features,+processing+states,+and+heterologous+protein+interactions+in+the+modulation+of+the+retroviral+nucleocapsid+protein+function.">Features, processing states, and heterologous protein interactions in the modulation of the retroviral nucleocapsid protein function.</a> RNA Biol. 7, 724-734 (2010).</li><li>Zeng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nucleation,+reverse+annealing,+and+chaperone+function+along+the+reaction+path+of+HIV-1+single-strand+transfer.">Probing nucleation, reverse annealing, and chaperone function along the reaction path of HIV-1 single-strand transfer.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 12651-12656 (2007).</li><li>Basu, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strand+transfer+events+during+HIV-1+reverse+transcription.">Strand transfer events during HIV-1 reverse transcription.</a> Virus Res. 134, 19-38 (2008).</li><li>Guo, J., Henderson, L. E., Bess, J., Kane, B., Levin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+nucleocapsid+protein+promotes+efficient+strand+transfer+and+specific+viral+DNA+synthesis+by+inhibiting+TAR-dependent+self-priming+from+minus-strand+strong-stop+DNA.">Human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid protein promotes efficient strand transfer and specific viral DNA synthesis by inhibiting TAR-dependent self-priming from minus-strand strong-stop DNA.</a> J Virol. 71, 5178-5188 (1997).</li><li>Godet, J., Mely, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+studies+of+the+nucleic+acid+chaperone+properties+of+the+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Biophysical studies of the nucleic acid chaperone properties of the HIV-1 nucleocapsid protein.</a> RNA Biol. 7, 687-699 (2010).</li><li>Darlix, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+nature+and+specific+functions+of+the+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Flexible nature and specific functions of the HIV-1 nucleocapsid protein.</a> J Mol Biol. 410, 565-581 (2011).</li><li>Lapadat-Tapolsky, M., Pernelle, C., Borie, C., Darlix, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+nucleic+acid+annealing+activities+of+nucleocapsid+protein+from+HIV-1.">Analysis of the nucleic acid annealing activities of nucleocapsid protein from HIV-1.</a> Nucleic Acids Res. 23, 2434-2441 (1995).</li><li>Vo, M. -. N., Barany, G., Rouzina, I., Musier-Forsyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+studies+of+mini-TAR+RNA/DNA+annealing+in+the+absence+and+presence+of+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Mechanistic studies of mini-TAR RNA/DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein.</a> J Mol Biol. 363, 244-261 (2006).</li><li>Beltz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+for+cTAR+DNA+binding+and+destabilization,+and+correlation+with+inhibition+of+self-primed+DNA+synthesis.">Structural determinants of HIV-1 nucleocapsid protein for cTAR DNA binding and destabilization, and correlation with inhibition of self-primed DNA synthesis.</a> J Mol Biol. 348, 1113-1126 (2005).</li><li>Mori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocapsid+Protein:+a+Desirable+Target+for+Future+Therapies+against+HIV-1.">Nucleocapsid Protein: a Desirable Target for Future Therapies against HIV-1.</a> Curr Top Microbiol Immunol. , .</li><li>Sosic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis+and+biological+evaluation+of+TAR+and+cTAR+binders+as+HIV-1+nucleocapsid+inhibitors.">Design, synthesis and biological evaluation of TAR and cTAR binders as HIV-1 nucleocapsid inhibitors.</a> MedChemComm. 4, 1388-1393 (2013).</li><li>Tabarrini, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+Anti-HIV+Transcription+Inhibitor+Quinolones:+Identification+of+Potent+N1-Vinyl+Derivatives.">Studies of Anti-HIV Transcription Inhibitor Quinolones: Identification of Potent N1-Vinyl Derivatives.</a> Chemmedchem. 5, 1880-1892 (2010).</li><li>Hagan, N., Fabris, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+mass+spectrometric+determination+of+the+stoichiometry+and+binding+affinity+of+the+complexes+between+nucleocapsid+protein+and+RNA+stem-loop+hairpins+of+the+HIV-1+Psi-recognition+element.">Direct mass spectrometric determination of the stoichiometry and binding affinity of the complexes between nucleocapsid protein and RNA stem-loop hairpins of the HIV-1 Psi-recognition element.</a> Biochemistry. 42, 10736-10745 (2003).</li><li>Ivanyi-Nagy, R., Davidovic, L., Khandjian, E. W., Darlix, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+RNA+chaperone+proteins:+from+functions+to+disease.">Disordered RNA chaperone proteins: from functions to disease.</a> Cell Mol Life Sciences: CMLS. 62, 1409-1417 (2005).</li><li>Zagotto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+G-quadruplex+vs+double-stranded+DNA+recognition+in+regioisomeric+lysyl-peptidyl-anthraquinone+conjugates.">Tuning G-quadruplex vs double-stranded DNA recognition in regioisomeric lysyl-peptidyl-anthraquinone conjugates.</a> Bioconjug Chem. 22, 2126-2135 (2011).</li><li>Carlson, C. B., Vuyisich, M., Gooch, B. D., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferred+RNA+binding+sites+for+a+threading+intercalator+revealed+by+in+vitro+evolution.">Preferred RNA binding sites for a threading intercalator revealed by in vitro evolution.</a> Chem Biol. 10, 663-672 (2003).</li><li>Gooch, B. D., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+duplex+RNA+by+helix-threading+peptides.">Recognition of duplex RNA by helix-threading peptides.</a> J Am Chem Soc. 126, 10603-10610 (2004).</li><li>Kanevsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+TAR+RNA-DNA+annealing+in+the+absence+and+presence+of+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Structural determinants of TAR RNA-DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein.</a> Nucleic Acids Res. 39, 8148-8162 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

ADI hızla HIV-1, yeni anti-HIV ilaçlarının arayışında olan bir ilginç hedef nükleokapsid protein şaperon aktivitesinin inhibisyonunu değerlendirmek için izin veren bir deneydir. NC hızlı ve kararlı olan katlama aksi dikkatli tavlama ardından yüksek sıcaklıkta termal denatürasyon gerektirecek oda sıcaklığı nükleik asitler de tavlanan. Deney iki tam uzunlukta NC ya da kesik (12-55) NC ile gerçekleştirilebilir: her iki durumda da, iki nükleik asitler (RNA ve onun tamamlayıcı DNA kopyası) hızlı bir şekilde tavlanır. Bu tepe bölümü kesik Kuzey Carolina peptidi ile literatür gözlemiyle tutarlıdır tavlama TAR apikal döngünün tamamlayıcı dizisi ile, zayıf bir Kuzey Carolina bağlanma yeri onun tamamlayıcı apikal döngünün ilişkiler üzerinde cTAR gövdesinin etkin bir şekilde eritme ile başlatılır, genişletilmiş tavlı hibrid birkaç kararsız ara ürünler ile biten. 21 NC çok kararlı bir prot olduğunuein ve birkaç sorun performans ADI oluşabilir ise. Bu sağlanamadığı takdirde, jel doğru pozisyonlarda nükleik asit bantları göstermez: Ancak Tampon reaksiyonu durdurmak için kullanılan Jel Yükleniyor taze yapılmış SDS eklemek için çok önemlidir. Bu proteini doğru bir şekilde denatüre ve nükleik asit ile sıkı kompleks serbest bırakmak için bir jel yükleme tamponu içinde mevcut olması gerekir jel elektroforezi SDS katran / cTAR heterodubleksin görselleştirmek için çok Aslında, Kuzey Carolina, bir nükleik asit bağlayıcı bir proteindir. Bu da jel çalışması sırasında kaymıştır bantların oluşumu, yani deney olası bir sorun giderme, olduğunu. Bu etki tam uzunluktaki NC Şekil 2&#39;deki gibi, kullanılan zaman özellikle belirgin olup, nükleik asitlerin üzerinde güçlü bir etkiye sahip olan agregasyon, yüksek oranda bazik N-terminal ucunun varlığına bağlıdır. Terminal temel kuyruk varlığı gösterisi olarak, tavlama reaksiyonu daha zor inhibe yaparn Şekil 3 kullanılarak bileşik 1, bir temsilci diş ara katkı, TAR ve cTAR kök-döngü yapılarını stabilize özellikle verimli, yani bir ara katkı olarak. Aslında, nükleik asitler ile bu etkileşim çıkıntı ve döngüler baz çifti şeklindeki kütleli ikame daha kolay bir iş parçacığı sağlayan, çift sarmal sürekliliğinin kesintiye zaman tercih edilir. Bu nükleik asit bağlayıcı ile TAR ve cTAR stabilizasyonu daha önceleri, iki oligonükleotid erime sıcaklığı artış belirlenmesi ile analiz edilmiştir. 14 Ayrıca, erime sıcaklığı artışı, HIV-1 NC tarafından katalize edilen tavlama inhibisyonu ile bağlantılı olmasına karşın, hetero katran / cTAR oluşumunun yol ve diş ara katkılar örneğin TAR elemanı olarak RNA dinamik yapılar için bağlayıcıların ilginç bir sınıfı olduğuna işaret etmektedir. 14. Etki mekanizması, bu kaçakları için çağrılırŞekil 4&#39;te gösterildiği gibi unds Ayrıca, farklı alternatif biçimlerde ADI tahlili yapılarak geçerli olabilir: araya durumunda tavlanmış heterodubleksin inhibisyonu geliştirilmiş ilaç katlanmış iki oligo ile inkübe edildiği zaman. Böyle NC proteinin doğrudan bağlayıcı olarak farklı etki mekanizması ile hareket eden bileşikler, farklı preinkübasyon modu daha az etkilenen olacaktır. ADI tahlil bu nedenle, Kuzey Carolina inhibitörlerinin belirlenmesi için bileşiklerin kütüphaneleri taramak için kullanılabilir iki yöntem uygulanır, ve NC hedefleyen anti-HIV ilaçlarının ararken pozitif isabet etki farazi mekanizmanın belirlenmesi. Açıktır ki, tespit Kuzey Carolina inhibitörlerinin spesifik bir eylem mekanizması için iddia tek başına bu tekniklerin kullanımı yeterli değildir ve başka uygun deneyler, biyokimyasal çalışma hipotezi sürdürmek için ihtiyaç vardır. 14 Son olarak, bu ADI yüksek kullandığı vurguladı gerekirTest edilen bileşimler NC &quot;in vitro&quot; engellenmesi değerli bilgi veren yeniden birleştirici ya da sentetik ya da saflaştırılmış enzimler. Bu &quot;güç ve zayıflık&quot; testinin ise: ADI iyi sanal tarama tamamlayabilir ve moleküler modelleme hızla yapı-aktivite ilişkileri kurmak ve analiz sağlayan ve sonunda sentez ve ilaç tasarımı yönlendirerek, ilaç keşif programlarının ön adımlarla yaklaşır. Diğer biyokimyasal analizler HIV ilaç geliştirme projelerinde kullanılan Ancak, ADI virüs ile enfekte hücrelerde varsayılan inhibitörlerinin etkileri hakkında bilgi vermez.

insan bağışıklık eksikliği virüsü tip 1 (HIV-1) nükleokapsid protein NCp7 (NC) ters transkripsiyon sırasında bir kofaktör olarak virüs çoğalmasında önemli bir rol oynuyor sıkıca olgun bulaşıcı virüsün genomik RNA ile ilişkili olan, küçük, bazik protein, bir genom tanıma ve ambalaj. 1-3 NC istikrarlı nükleik asit yapılarının istikrarsızlaştırma ve tamamlayıcı dizilerin tavlanmasını katalize bir nükleik asit hastabakıcı olarak görev yapar. Çift yönlü destabilize edici aktivitesi çinko parmak yapıları (12-55 peptid) eşlenmiş ise onun nükleik asit toplayıcı aktivitesi 11 amino asit temel olarak N-terminal bulunur. 4, pozitif yüklü bir protein bağlanma reaksiyonunun elektrostatik bariyer düşürür ve İki ayrı tamamlayıcı dizileri bir araya gelip hızını artırır. Kararlı bir şekle katlanmış nükleik asitler facilitat için NC hastabakıcı faaliyetlerini gerektirirE bunların tavlama 5 Bu NC şerit aktarma olayları çok önemlidir ters transkripsiyon, özellikle önemlidir:. eksi ip aktarımı giderildi, eksi ip durdurma DNA gibi retrotranscribed R bölgesinde, bir tamamlayıcı diziye aktarılan ve tavlanmış olmalıdır termodinamik olarak tercih edilen olmakla birlikte, RNA genomunun 3 &#39;ucunda şablonu. 6, bu reaksiyon sonucu R bölgelerinde trans-aktivasyon duyarlı bölgesi (TAR), RNA ve kararlı bir yapının varlığı NC yokluğunda geniş bir oluşmaz bu da, DNA kopyası (cTAR DNA). karakteristik sap-halka yapısındaki 7 cTAR ve TAR, aslında, yüksek düzeyde yapılanmış olan bölgeler ile ilişkili olmalıdır. Kuzey Carolina proteini, bu toka denatüre, ve tamamlayıcı nükleik asit iplikçikleri arasındaki moleküller arası tavlama hızını arttırarak eksi-kordonlu transferini teşvik eder. TAR ve cTAR NC tavlama mekanizması iyice incelenmiş ve de olmuşturçeşitli araştırma kağıtları TAR tavlama deneyi olarak tarif ve önerilen şema mükemmel değerlendirmeleri tasvir edilir. 8-11 Özetleme, NC, böyle TAR-RNA gibi kararlı RNA ikincil yapısını destabilizes onun tamamlayıcı dizisi, cTAR-DNA ikincil yapısını destabilizes ve bir sonucu olarak tavlama katran / cTAR hetero oluşumuna yol açan bir RNA / DNA tepki. 10,11 teşvik, HIV replikasyonu esnasında şerit transfer adımı tercih edilir. 12 NC doğru küçük moleküllerin neden olduğu olası parazit tehlikeye NC aktivitesinin bir sonucu olarak, viral genomun ters transkripsiyon bir azalma ile sonuçlanır çünkü yeni antiviral ajanların geliştirilmesi için çekici bir hedeftir. 2,13 Bu yaklaşım olabilir sonuçta başarılı bir anti-HIV maddelerinin geliştirilmesine yol açar. NC için bir tarama sırasında biz de bilinen özelliklerine dayanarak bir tahlil geliştirdi 14 inhibitörleriverimli istikrarsızlaştırmak için nükleokapsit ve tavlama tamamlayıcı oligonükleotidlerden. 10,11 Biz N A nnealing- M E lectrophoresis (ADI) deneyi ediated ucleocapsid çağırdı. ADI deney hibrid katran / cTAR heterodubleksin vermek üzere, tamamlayıcı DNA dizisinin (cTAR) ile TAR RNA sekansının üst kısmı karşılık gelen oligonükleotid bizim durumumuzda, tamamlayıcı nükleik asitlerin stabil bir şekilde yapılandırılmış kopyalar arasında tavlama aracılık NC kullanır . NC mevcudiyetinde katran / cTAR bağlanma reaksiyonu analizi yerli poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile araştırılabilir. Bu protokol, hızla stabil saç tokası yapıları katlanmış oda sıcaklığı oligonükleotidlerle de tavlanmasına için ADI tahlil gerçekleştirmek için nasıl gösterir, nasıl deney reaksiyonu ve olası arıza sonucu analiz etmek. Nükleik asidin Radyoaktif etiketleme talep ve duyurma değiloligonükleotid bantlarının konvansiyonel boyama yöntemleri ile yapılabilir. rekombinant tam uzunluktaki protein veya NC kesik bir sentetik versiyonu ya da kullanan deney, NC, RNA ve DNA ile kuvvetli bir bağlanma ile ilişkili olduğu gösterilmiştir bir inhibe edici aktiviteye diş ara katkılar belirlenmesini sağlar. 14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="631">
	<tbody>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:192px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:140px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:155px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">cTAR, 29-mer DNA oligo. Desalted. HPLC purified.</td>
			<td style="width:140px;">Metabion International AG</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;">Store the stock&#160; solution at -20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">TAR, 29-mer RNA oligo. Desalted. HPLC purified.&#160;&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Metabion International AG</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;">Store the stock aliquot at -80 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">(12-55)NC peptide</td>
			<td style="width:140px;">EspiKem srl</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;">Store the stock solution at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:145px;">0030 120 086</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">0.5 mL tubes</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:145px;">0030 121 023</td>
			<td>Autoclave before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">Biosphere Filter Tips 0.1-10 &#181;L</td>
			<td style="width:140px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:145px;">701,130,210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Biosphere Filter Tips 2-20 &#181;L</td>
			<td style="width:140px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:145px;">70,760,213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Biosphere Filter Tips 200 &#181;L</td>
			<td style="width:140px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:145px;">70,760,213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Syringe Filter 0,22 &#181;m</td>
			<td style="width:140px;">Biosigma srl</td>
			<td style="width:145px;">51,798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Ethanol</td>
			<td style="width:140px;">Carlo Erba</td>
			<td style="width:145px;">414631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">71725-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">D8418-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">71376-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Boric Acid</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">B0252-2.5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">Ethylenediaminetetraacetic Acid</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">E5134-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">Magnesium Perchlorate</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">222283-100G</td>
			<td style="width:155px;">Store the 1M solution at&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Glycerol</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">49770-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">Bromophenol Blue</td>
			<td style="width:140px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:145px;">17-1329-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:192px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">T9281-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:192px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">A7460-500G</td>
			<td style="width:155px;">Prepare the 10% solution freshly before use</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:192px;">Acrylamide-bis ready-to-use solution 40% (19:1)</td>
			<td style="width:140px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:145px;">1006401000</td>
			<td style="width:155px;">Polyacrylamide is highly neurotoxic: wear gloves during the gel casting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Tris ultrapure</td>
			<td style="width:140px;">Applichem</td>
			<td style="width:145px;">A1086,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">DEPC-treated water</td>
			<td style="width:140px;">Ambion</td>
			<td style="width:145px;">AM9922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Centrifuge 5415R</td>
			<td style="width:140px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:145px;">22,621,408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">NanoDrop 1000 spectrometer</td>
			<td style="width:140px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">UV-VIS spectrometer Lambda 20</td>
			<td style="width:140px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Protean II xi Cell</td>
			<td style="width:140px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:145px;">165-1803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:192px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td style="width:140px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:145px;">164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:192px;">SybrGreen II RNA Gel Staining</td>
			<td style="width:140px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">50523</td>
			<td style="width:155px;">Make the 1/10000 dilution in TBE 1X. Store it in the dark at 4&#176;C for two weeks&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:192px;">Geliance 600 Imaging System</td>
			<td style="width:140px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nucleocapsid annealing-mediated electrophoresis (name) assay allows the rapid identification of hiv-1 nucleocapsid inhibitors

RNA ya da kararlı üç boyutlu katlanmasına katlanmış bir DNA antitümör ya da antiviral ilaçların geliştirilmesinde ilginç hedeflerdir. HIV-1 durumunda, virüs aktivitesinin düzenlenmesinde rol oynayan viral proteinler birçok nükleik asitleri tanır. nükleokapsid protein NCp7 (NC) virüs replikasyonu sırasında birkaç süreçleri düzenleyen önemli bir proteindir. NC aslında RNA ve DNA ve tavlama kolaylaştırılması ikincil yapıları istikrarsızlaştırıcı bir şaperonudur. NC inaktivasyonu yeni bir yaklaşım, anti-HIV tedavisi için bir ilgi çekici bir hedeftir. K bir nnealing- M D lectrophoresis ediated ucleocapsid (ADI) deneyi ile, örneğin TAR saç tokası yapıları ve HIV cTAR elemanları olarak termodinamik olarak kararlı üç boyutlu konformasyon katlanmış RNA ve DNA erime ve tavlama önleyebilen moleküller tanımlamak amacıyla geliştirilmiştir HIV-1 nükleokapsid protein. Yeni tahlil yeniden ya istihdamönceki etiketleme gerek kalmadan birleşmesini veya sentetik protein, ve oligonükleotitler. Sonuçların analizi konvansiyonel nükleik asit boyaması ile standart poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile elde edilir. Bu çalışmada rapor edilen protokol nükleik yetkin hem asit şaperonlar tam uzunluktaki bir protein ya da bazik N-terminal eksik olan kesilmiş sürümüyle ADI analizini gerçekleştirmek için ve nasıl NC şaperon aktivitesinin inhibisyonunu değerlendirmek için açıklamaktadır enterkalatörün parçacığı. Ayrıca, AD teşhis Kuzey Carolina inhibitörlerinin etki mekanizması, farazi ilgili bilgiler elde etmek için, iki farklı yararlı gerçekleştirilebilir.

Şekil 1, tam uzunluktaki rekombinant protein, ile) yapılır, Nükieokapsit Tavlama Aracılı Elektroforez (ADI) deneyi temsil eden bir sonucunu göstermektedir ii) cTAR + TAR karıştırılması ve oda sıcaklığında 1 saat kadar kuluçkalanması, yani protein, ve iii olmadan ) (12-55) NC, N-terminal alanının 11 amino asit eksiği olan bir sentetik peptid ile gerçekleştirilen aynı deney. Şekil 1 &#39;de daha önceden katlanmış TAR, cTAR karıştırılmış ve tavlanmış hetero TAR oluşumu / cTAR proteininin yokluğunda (Şekil 1&#39; in sol şerit) tam boyunda biraraya getiren NC mevcudiyetinde gözlenmiş (merkezi kuşak ) ve Şekil 1 &#39;de kesik (12-55) NC peptit (sağ şerit varlığında). Kontroller vardır: onların yavaş annealin ardından cTAR için TAR stabil katlanmış yapıların termal denatürasyon yoluyla elde edilen, cTAR katlanmış TAR katlanmış ve hibrit (TAR / cTAR) tavıörn. 14 uzatılmış hetero sarmal içinde iki sabit nükleik asit dizilerini denatüre etmek için NC kabiliyeti net bir şekilde belirgindir: tam uzunlukta NC proteini katran / cTAR hibridin oluşturulmasına hemen yol açar: 0 &#39;NC ilave arasından geçen en az bir zaman işaret örnekler ve reaksiyon durur jel yükleme tamponu eklenmesi; Tam oluşumunun başladığı 15 &#39;inkübasyon süresi sonunda elde edilir. tavlanmış heterodubleksin yoğunluğundaki artış katlanmış cTAR ve TAR oligonükleotidlerin yoğunluğundaki azalma ile paralellik göstermektedir. hetero oluşumu, tepe bölümü kesik bir halinin varlığı altında da elde sentetik peptidin biyolojik aktivitesini teyit (12-55) NC yani edilir. Protein ya da hetero oluşumu gözlenmez peptidin, katran ve cTAR oligonükleotid yokluğunda heterodubleksin içine oda sıcaklığında (Şekil 1) bağlandığı bir olmaz. IçindeTüm deneyler, kararsız ara ürünler zamanla azalır (Şekil 1 &quot;ara kompleksleri&quot;) hızlı oluşumu sürekli doğru nükleik asitler katlama kadar cTAR ve TOKALAR ve TAR yoluyla iplik değişimi önerilen mekanizma ile, görülmektedir. 17 Deney olası bir sorun Jel Yükleme Tamponu SDS eksikliğidir. GLB SDS yokluğunda reaksiyon sonucu, Şekil 2&#39;de gösterilen ve glb + SDS ile sonuç ile karşılaştırılır. Katlanmış TAR, cTAR karıştırılır ve oda sıcaklığında 3 saat süreyle inkübe edildi ve yeniden birleştirici tam uzunlukta NC proteini ile 37 ° C de 3 saat karıştırıldı. SDS (GLB olmadan) bir yarım jel yükleme tampon maddesi ile, diğer yarısına glb SDS (glb SDS) ile ise, ilave edildi: Kuluçkadan sonra, örnekler iki ayrılmıştır. Örnekler jel üzerine yüklendi ve nükleik asitler, bantların konumu tarafından işletilen jel sonra görselleştirilmiştirboya boyama. Bu beklenen ve protein ve nükleik asitler arasında güçlü bir bağlanma gösterir: NC mevcut ama örnekler GLB yüklü edildiğinde, tüm nükleik asitler bantları kadar kaymıştır. glb SDS ile sonuçlar jel aşırı sağ gösterilmiştir: SDS ilavesi, kontroller ile karşılaştırma yapılmasına olanak tanıyan, protein denatüre ve protein ile kararlı bir kompleks nükleik asitleri serbest bırakmaktadır. ADI deney dinamik nükleik asit yapılarını dengelemek ve NC şaperon aktivitesini inhibe arasında ara diş kabiliyetini değerlendirmek için kullanılır. 14 Diş ara katkılar örneğin antrakinon gibi halka sisteminin karşıt bölgelerde yer alan büyük yan zincirler ile ikame edilmiş düzlemsel aromatik moleküllerdir Şekil 3A&#39;da gösterilen. 18 Bu ara katkılar nükleik asitlerin çift sarmal aracılığıyla iplik mümkün, son olarak çift her oluğa yan zincirleri yerinisarmaldan oluşur. 19,20 Şekil 3B, tam uzunlukta NC mevcudiyetinde ya da tepe bölümü kesik peptit 1 numaralı bileşik ile, bilinen bir diş ara katkı, 18 mevcudiyetinde ADI tahlilinin sonuçlarını göstermektedir. Her iki durumda da, NC tarafından katran / cTAR hibrid oluşumu sırasında, aynı zamanda, serbest TAR ve cTAR miktarı artar interkalatörünün konsantrasyonunun arttırılması ile azaltılır. N-terminal kuyruğu (12-55NC) eksik proteininin tepesi kesik bir şekli onun etkinliğinin engellenmesi için daha duyarlıdır: bu fark kadar test edilen bütün bileşikler ile doğrulandı. ADI deneyi, ya da katlanmış bir nükleik asit alt-tabakalar ile, 15 dakika boyunca test bileşiği ön enkübasyona tabi tutulması ile iki yolla, ya da katlanmış oligonükleotidlerin (NC-preinkübasyon modu) ilave edildi NC ile test bileşiği, önceden inkübe edilerek yapılabilir , NC ilavesi ve 15 dakika (oligo PR için bir başka inkübasyon takipeincubation modu). Genel inkübasyon süresi iki farklı modlarda aynı olmasına rağmen, NC eklenmesinden önce katlanmış oligonükleotitlerle preinkübasyon katlanmış nükleik asidin içine enterkalatörleri bir parçacığı için daha fazla zaman sağlar. Bu dinamik yapılarının güçlü istikrar ve NC hastabakıcı faaliyetlerinin daha kolay bir inhibisyonu içine sonuçlanır. Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, iki modda ADI deneyinin analizi, bu nedenle, Kuzey Carolina inhibitörlerinin etki mekanizması farklılıkları geliştirir: bileşik 1 oligo preinkübasyon modunda NAME ile analiz edildiğinde (Şekil 4, sol şerit) çok daha düşük inhibisyon NC-preinkübasyon modunda görülmektedir oysa, NC-aracılı tavlama güçlü engellenmesini göstermektedir (Şekil 4, sağda şerit). Bu deneyde ve bu koşullarda, her deney içinde ilgili bileşikler arasından kümelerini tarama sırasında inhibe edici konsantrasyonlarının belirlenmesi için lütfen unutmayınment, üçlü (özellikle IC50 değeri civarında), yakın aralıklı konsantrasyonu kullanılarak en azından gerçekleştirilmelidir. 14 <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52474/52474fig1highres.jpg" /> Şekil 1:. Tam uzunlukta NC ve kesilmiş (12-55) NC Kırımlı TAR ve cTAR, her 1 mcM ile ADI tahlil, rekombinant NC ile ya da inkübe edildi (12-55) NC (oligolar / NC = 1 / 8) 0 dakika, 15 dakika, 30 dakika ve 1 saat karıştırıldı. Protein (0 dakika, 15 dakika, 30 dakika ve 1 saat) yokluğunda inkübe TAR, cTAR negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Katlanmış TAR katlanmış cTAR ve hibrid katran / cTAR in vitro bağlanma kontrol olarak kullanıldı ve ardından ısı denatürasyonundan sonra elde edilmiştir. reaksiyonlar sonra GLB SDS kullanılarak durduruldu. Numuneler TBE 1x% 12 poliakrilamid jel üzerinde çözüldü; jeli üzerinde elektroforez nükleik asitler sonra lekeli bir transilluminator&#39;de ile tespit edildi. <html><img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52474/52474fig2highres.jpg" /> Şekil 2:. TAR analiz ederken, jel yükleme tampon maddesi SDS Etkisi (glb) / TNMg 1x önceden katlanmış Carolina TAR ve cTAR, tarafından cTAR tavlama tam boyunda biraraya getiren NC (oligo / NC = 1/8) 3 ile kuluçkaya yatırılmıştır Oda sıcaklığında veya 37 ° C &#39;de sa. Glb veya glb SDS sonra NC ile kuluçkalanmış numunelere ilave edildi. Kontroller: TAR, cTAR ve tavlanmış hibrid TAR / cTAR (her biri 1 uM). Elektroforez TBE 1x% 12 poliakrilamid jel kullanılarak yapıldı; jeli üzerinde elektroforez nükleik asitler sonra lekeli bir transilluminator&#39;de ile tespit edildi. Bu şekil, Şekil S4 modifiye edilmiştir:. Sosic, A. ve diğerleri tasarımı, sentezi ve HIV-1 nükleokapsid inhibitörleri olarak TAR ve cTAR bağlayıcı biyolojik değerlendirmesi MedChemComm 4, 1388-1393, DOI:. / C3md00212h (2013) 10,1039 . &quot;&gt; <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52474/52474fig3highres.jpg" /> Şekil 3: ADI testi ile değerlendirildi enterkalatörün 1 diş ve diş ara katkı 1. (B) (A) Kimyasal yapısı Etkisi. TAR ve cTAR, her biri 1 uM Katlanmış, her biri 8 uM tam uzunlukta NC ya da (12-55) NC ile bileşik 1 belirtilmiş konsantrasyonlarının varlığında inkübe edildi. CTAR ve genişletilmiş hetero TAR katlanmış Katlanmış TAR / cTAR kontroller olarak kullanılmıştır. reaksiyonlar sonra GLB SDS kullanılarak durduruldu. Numuneler TBE 1x% 12 poliakrilamid jel üzerinde çözüldü; jeli üzerinde elektroforez nükleik asitler sonra lekeli bir transilluminator&#39;de ile tespit edildi. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52474/52474fig4highres.jpg" /> Şekil 4: NC-preinkübasyon modları Oligo-preinkübasyon: ADI tahlil üzerindeki etkileri Oligo-preinkübasyon mod.E:., katlanmış TAR, cTAR katlanmış her biri 1 uM, tam uzunlukta NC (8 uM), NC-kuluçka öncesi mevcudiyetinde 15 dakika daha sonra, 15 dakika boyunca diş enterkalatörün 1 belirtilen konsantrasyonları ile önceden inkübe edildi ve modu: diş enterkalatörün 1, belirtilen konsantrasyonlar, 15 dakika boyunca tam uzunlukta NC (8 uM) ile ön inkübasyona tabi ve daha sonra ilave 15 dakika boyunca katlanmış TAR mevcudiyetinde ve cTAR, her biri 1 uM katlanmış. CTAR ve genişletilmiş hetero TAR katlanmış Katlanmış TAR / cTAR kontroller olarak kullanılmıştır. Tüm reaksiyonlar sonunda GLB SDS kullanılarak durduruldu. Numuneler TBE 1x% 12 poliakrilamid jel üzerinde çözüldü; jeli üzerinde elektroforez nükleik asitler sonra lekeli bir transilluminator&#39;de ile tespit edildi.

Watch this Scientific Journal Video about Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors at JoVE.com

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucleocapsid Tavlama Dolayımlı Elektroforez (ADI) Testi HIV-1 Nükieokapsit inhibitörlerinin Hızlı tanımlanması sağlar

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

nucleocapsid-annealing-mediated-electrophoresis-name-assay-allows

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

8.8K Görüntüleme.  University of Padova. This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Video: Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Bir Genotipik Yöntemi&#39;ne Dizi Analizi ile HIV-1 coreceptor Kullanımı (tropizm) Tahmin

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

HIV-1 Çekirdek in vitro Uncoating

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

Yeni Araçlar HIV-1 ile enfekte bireyler gelen Düzenleyici T hücreleri büyütmek için

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

HIV ters transkriptaz ve integraz inhibitörleri hızlı taranması

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Bir Hücre temelli bir ELISA testi kullanarak, HIV-1 zarf trimerik Glikoproteinler konformasyonel Değerlendirilmesi

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1 pozitif Bireylerin Plazma eksozomlann izolasyonu

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an essential step for virus particle formation, since a defect in Gag membrane binding results in severe impairment of viral particle production. To gain mechanistic details of Gag-lipid membrane interactions, in vitro methods based on NMR, protein footprinting, surface plasmon resonance, liposome flotation centrifugation, or fluorescence lipid bead binding have been developed thus far. However, each of these in vitro methods has its limitations. To overcome some of these limitations and provide a complementary approach to the previously established methods, we developed an in vitro assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes take place in a &#34;cell-like&#34; environment. In this assay, Gag binding to lipid membranes is visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. Here we describe the background and the protocols to obtain myristoylated full-length Gag proteins and GUV membranes necessary for the assay and to detect Gag-GUV binding by microscopy.

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

Dev ünilamellar vesikül (GUV) membranlanna bağlanan, HIV-1 Gag Görselleştirme

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, HIV-1 üretim yapan RNA&#39;lar etkinlik ve toksisite Değerlendirilmesi

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Ölçümü<em&gt; İn Vitro</em&gt; HIV-1 Preintegration Kompleksleri Entegrasyon Etkinliği

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Here, we describe a quantitative proteomics method using the technique of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) to analyze the effects of HIV-1 infection on host exosomal proteomes. This protocol can be easily adapted to cells under different stress or infection conditions.