This work was supported by Ministero degli Affari Esteri (MAE, DRPG, Unit&#224; per la cooperazione scientifica e tecnologica, Grant: PGR Italy-USA) and by MIUR, Progetti di Ricerca di Interesse Nazionale (Grant: 2010W2KM5L_006).

Malzeme, Nükleik Asitler ve Proteinler 1. Hazırlık <ol><li> Nükleik Asitler <ol><li> 1.5 ml tüpler Otoklav ve steril bir kap içinde depolamak. Kirletici maddeleri laboratuvar sarf gelen nükleazlar yani ortadan kaldırmak için steril filtre ipuçlarını kullanarak her adımı gerçekleştirin. </li><li> DEPC ile muamele edilmiş su içinde Tris-HCI, 10 mM tampon pH 7.5 hazırlamak ve bir 0.22 um gözenek boyutlu filtre içinden filtre edilirken çözelti filtre. </li><li> NOT: &quot;TAR&quot; olarak adlandırılan oligonükleotid kısa (29-mer) RNA dizisine karşılık 5&#39;-GGCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGCC-3 &#39;15 cTAR kendi DNA tamamlayıcı dizisi 5&#39;-GGCAGAGAGCTCCCAGGCTCAGATCTGCC-3 iken&#39;. <ol><li> Yukarıda belirtilen Tris tamponu TAR ve cTAR hem çözünür (1.1.2.) 100 mcM stok çözümleri yapmak. -20 ° C&#39;de saklayın cTAR stok çözeltisi (alikotları bu koşullarda ay depolanabilir). RNA uzun süreli depolama için, TAR 20 ul hacimde yapmakStok çözeltisi, bir vakum yoğunlaştırıcı santrifüj kullanılarak, her bir kısım kurutulur ve -80 ° C&#39;de saklayın. Taze, kullanımdan önce, 20 ul DEPC ile muamele edilmiş su içinde her bir TAR kısım tekrar süspansiyon. Not: Çalışma TAR alikotları, iki hafta boyunca -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol></li></ol></li><li> NC proteini ve (12-55) NC peptit <ol><li> Rapor edilen tam boyunda biraraya getiren NC proteini hazırlanır. 16 mağazası -20 ° C &#39;de parçalar halinde stok çözeltisi. 6410 M -1 cm-1, 280 nm &#39;de bir sönüm katsayısı kullanarak, bir UV-Vis ile tam protein konsantrasyonunu belirleyin. </li><li> Sentetik (12-55) Tris-HCI, 10 mM pH 7.5 içinde Carolina peptid yeniden süspanse edilir ve -20 ° C&#39;de parçalar halinde stok solüsyonu saklayın. 5,700 M, 280 nm &#39;de bir sönüm katsayısı kullanarak, bir UV-Vis doğru peptid konsantrasyonunu belirlemek 1 cm-1. Not: (12-55) NC Peptit HPLC saflaştırıldı ve liyofilize elde edildiÇinko klorür iki eşdeğer ihtiva eden bir çözelti üzerinden ilized. </li></ol></li><li> Bileşik 1 <ol><li> Bir analitik terazi kullanılarak liyofilize bileşik 1 yaklaşık 1 mg tartılır ve yüksek bir konsantrasyon (≈10 mM) stok çözeltisi elde etmek üzere,% 100 DMSO içinde 100 ul, vaktinde tartılır içinde çözülür. Onun sönüm katsayısı kullanılarak UV-Vis spektrofotometre üzerinde tam bileşik konsantrasyonunu belirlemek (354 nm: 11.387 M -1 cm -1). Kullanımdan önce -20 ° C&#39;de karanlıkta stok solüsyonu saklayın. </li></ol></li></ol> 2. Gel Gel cihaz ve Döküm kurma <ol><li> Kuru onlara izin,% 70 etanol ile (uzun diğeri kısa) iki tabak durulama, jel kurmak, ve sonra daha uzun plaka uzun kenarları boyunca iki 1 mm pulları yerleştirmek için; Kısa plaka ile örtün, ve altta iki tabak hizalamak için emin olun. </li><li> Jel dökme için, SUPP tarafından sağlanan yönergeleri izleyinlier (sandviç kelepçeler ve yığınlar her döküm aparatı tarafından sağlanan farklı tedarikçiler biraz farklı cihazı kullanın). Tüm durumlarda, kelepçeler, yığınlar ve contalar temiz olduğundan emin olun, önceki kullanıcılar tarafından sol akrilamid izlerini kaldırmak. </li><li> Döküm standı monte jel sandviç yerleştirin ve tedarikçi tarafından özel talimatları uygulayın. NOT: Genellikle döküm yuvasının altındaki temiz bir silikon conta iyi bir sızdırmazlık sağlar ve jel dökerken sızıntıları önlemek için yardımcı olur. </li><li> Cam plakalar arasında bir pipet kullanarak damıtılmış su dökün, kaçakları kontrol etmek. Sandviç doldurmak ve hiçbir sızıntıları emin olmak için birkaç dakika bekleyin su ekleyin. Sandviç doğru monte edilirse, suyun ayrılması ve gözlük kurumaya iki gözlük arasındaki bir filtre kağıdı yerleştirin. Kağıdı çıkarın ve şimdi sandviç jel döküm için hazırdır. </li><li> Oda sıcaklığında (RT, 25 ° C) &#39;de jel dökün. Poliakrilamid derece nörotoksik olduğundan, eldiven giyin. Bizeolmayan denatüre (yerli) koşullarda e sürekli% 12 poliakrilamid jeller ADI tahlil gerçekleştirmek için. <ol><li> % 12 jel çözeltisi hazırlayın:% 40 akrilamid 12 ml karıştırın / bisakrilamid (19/1) çözümü, 4 ml TBE 10x tampon (10x: Tris-HCl 890 mM, Borat 890 mM EDTA 20 mM) ve 24 ml MilliQ su . 400 ul APS ve kullanımdan hemen önce Temed 50 ul ekleyin. Çözüm karıştırın ve hızla cam plakalar arasındaki çözüm aşağı dökmek bir pipet kullanın. Kabarcıklar kaçınarak, cam plakalar arasındaki tarağı tanıtın. Tam sandviç doldurmak için jel solüsyonu ekleyin. </li></ol></li><li> Jel, 1 saat 45 dakika süreyle polimerize olsun. Hemen örnek yüklemeden önce, yavaş yavaş tarak çıkarın ve distile su ile iyice durulayın kuyu. </li><li> Polimerizasyon ve kuyular durulama adımlarından sonra, dikey jel elektroforezi için aparat jel sandviç yerleştirmek için tedarikçi tarafından özel talimatları uygulayın. Bir soğutma sistemi varsa, cor jel sistemini yerleştirmek için emin olunSoğutma çekirdeğin ru konumu. </li><li> Sistem birden fazla jel işlemek için tasarlanmış, ama sadece bir jel çalıştırmak zorundadır ise, tam üst tampon odasına oluşturmak üzere diğer tarafta soğutma çekirdek tampon baraj gibi bir jel sandviç takın. NOT: Baraj doğru yerleştirilir değilse, üst tampon jel çalıştırmak durdurma muhtemelen sızdırıyor. </li><li> (: Tris-HCl 89 mM, borat 89 mM, EDTA 2 mM 1x), iyonu giderilmiş su içinde çalışan tampon TBE 2.5 L hazırlayın. Üst tampon odası için TBE tamponu ayrı yaklaşık 500 ml Set ve alt tampon odasına geri kalanını dökün. Üst tampon odasına kalan 500 ml TBE tampon dökün. </li><li> Anot ve katot uygun pozisyonda böylece, alt tampon odasının üstüne kapağını yerleştirin. </li><li> Varsa hortumları kullanarak bir su musluğuna, soğutma çekirdek bağlayın. Elektroforez sırasında bir ısı alıcı olarak hareket ve musluk suyu seçecek sırasında çekirdek aracılığıyla dolaşıma izin verir musluk suyu ile çekirdek, Dolgurophoresis. </li></ol> 3. Nükieokapsit Tavlama aracılı Elektroforez (ADI) Deneyi <ol><li> Tamponlar hazırlanması <ol><li> TNMg tamponu hazırlayın (1x: Tris-HCI 10 mM, NaCI, 20 mM Mg (ClO 4) 2 1 mM, pH 7.5), DEPC ile muamele edilmiş su ve 0,22 um gözenek boyutlu filtre içinden filtre edilirken çözelti filtre. Not: TNMg tampon 7 güne kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. En iyi katlama ve tavlama sonuçları için, taze yapılmış tamponlar kullanılmasını tavsiye ederiz. </li><li> SDS ihtiva eden bir jel yükleme tamponu hazırlayın (glb SDS: Tris-HCl, 100 mM EDTA, 4 mM, 50% w / h gliserol,% 2 w / hac SDS,% 0.05 mavi h bromofenol / ağ), DEPC ile muamele edilmiş su içinde. NOT: GLB oligonükleotidler örnekleri jel sistemine çalışan ne kadar izlemek için yardımcı olur ve jel içine örnekleri batmaya sağlar. GLB için SDS eklenmesi ADI tahlil optimal başarısı için kritik bir adımdır. Bu adımı takip değilse, o ge nükleik asitler bant ayırt etmek mümkün değildirl sistemi (Şekil 2). </li></ol></li><li> Hazırlık Kontrolleri <ol><li> Seri oligonükleotidler stok çözümleri sulandırmak ve TAR 1 uM çözeltisinin 10 ul hazırlamak için taze yapılmış 10 mcM çözümler kullanabilirsiniz. Ayrı ayrı, aynı şekilde hazırlayın 1 uM cTAR 10 ul TNMg 1x tamponu içinde. 5 dakika boyunca 95 ° C&#39;ye kadar, her tüp ısıtılması ve daha sonra da kök çıkıntı-döngü yapılarını varsaymak TAR ve cTAR sırayla oda sıcaklığına soğumaya bırakın. </li><li> Kontrol olarak hibrid TAR / cTAR 1 uM çözeltisi hazırlayın. 10 ul bir toplam hacim içinde, TNMg 1x 10 uM cTAR 1 ul 10 uM TAR 1 ul karıştırın. 5 dakika boyunca 95 ° C&#39;ye değin ısıtılması ile oligonükleotitleri denatüre ve bırakmak TAR, tamamlayıcı dizi cTAR tavlanacak şekilde ve çift-şeritli hibrid katran / cTAR oluşturmak için sırayla oda sıcaklığına yavaş yavaş soğumaya bırakılmıştır. </li><li> Çözeltiler, oda sıcaklığına kadar soğutuldu, zaman, bir kısa-eğirme santrifüj uygulayın. GLB SDS 3 ul ekleyin, pipet EACh tüpü 3 kez içinde çözüm ve buz tüpü koymak. Yükleme adım kadar buz üzerinde sabit kontrol örnekleri tutun. </li></ol></li><li> Numuneler hazırlık NC protein ve (12-55) NC peptit aktivitesini analiz etmek <ol><li> Her bir numune için taze 4 uM oligonükleotid çözeltisi 2.5 ul kullanın. Her zaman pipetleme hataları önlemek için her çözümün biraz aşırı miktarda hazırlamak. Yukarıda belirtilen kontroller hazırlanması için bildirilen TNMg 1x tamponu içinde cTAR bölgesinin ayrı ayrı, TAR 4 mcM solüsyonu 32.5 ul katlayın ve (adım 3.2.1.). </li><li> MilliQ su ile 80 uM çözeltisine, her iki NC Stok protein çözeltisi ve (12-55) NC peptit seyreltin. </li><li> TAR, cTAR çözeltiler, oda sıcaklığına kadar soğutulur, her iki tüp kısa-eğirme santrifüj yapmak ve numuneler boruların hazırlanması başlar. </li><li> Tüpler otoklava 12 boş 0.5 ml hazırlayın. Laboratuar örnekleri için rafa 4 tüp 3 satır yerleştirin. Her satır th analiz sırasıyla örnekleri gösterire tam uzunlukta NC proteini, protein olmadan örnekleri ve numuneler (12-55) NC peptit aktivitesini analiz etmek. </li><li> Her zaman farklı reaktif kullanılan ipuçları değiştirin. </li><li> Her bir tüp haline TAR 2.5 ul ve katlanmış cTAR 2.5 ul ekleyin. NC ve (12-55) NC analizi için numuneler 4 ul DEPC arıtılmış su ekleyin. Diğer örnekler 5 ul DEPC arıtılmış su ekleyin. </li><li> Sırasıyla, Örneklerin 80 mcM NC 1 ul veya 80 uM (12-55) 1 ul NC ekle, NC veya (12-55) NC analizi. </li><li> Her boru 3 kez içinde solüsyonu pipetle, (Şekil 1 &#39;de &quot;0 olarak rapor) saat 0 dakika örnekleri glb SDS hemen 3 ul ekleyin ve son olarak buz üzerine tüp koydu. Tüm örnekler ve kontroller için bu adımı tekrarlayın. Yükleme adım kadar buz üzerinde sabit örnekleri tutun. </li><li> 15 dakika, 30 dakika ve oda sıcaklığında inkübasyondan 1 saat sonra, glb SDS 3 ul EAC içindeki çözeltisi pipeth tüpü 3 kez ve buz tüpü koymak. Sırasıyla tüm örnekler ve kontroller için bu adımı yineleyin ve yükleme aşamasına kadar buz üzerinde tutmak. </li><li> Jel cihazının kapağını çıkarın. Yük kuyulara her numunenin 13 ul daha önce iyi oluşturan tarak ile jel döküm tarif Oluşan. Şekil 1&#39;de bildirilen düzeni aşağıdaki örnekleri yükleyin. </li><li> Jel cihazının kapağını değiştirin. Güç kaynağına jel cihazının açar takın. Elektrotlar güç kaynağı doğru yuvalara takılı olduğundan emin olun. </li><li> Güç açma ve Renk verici madde jelin alt yukarıda 1.5 cm göç kadar, 2 saat boyunca karıştırılır ve 200 V sabit gerilimde, 30 dakika boyunca jel üzerinde çalıştırıldı. </li></ol></li><li> Numune hazırlama NC ve (12-55) NC üzerinde antrakinon etkinliğini analiz etmek <ol><li> Bileşik 1 stok solüsyonu sulandırmak. 500 uM, 10 ul, 250 uM, bileşik 50 uM, 5 uM seyreltme hazırlanması &lt;MiliQ suyu 1 strong&gt;. </li><li> Yukarıda belirtildiği gibi, kontrol örnekleri hazırlayın (paragraf 3.2.). </li><li> Her bir numune için taze 4 uM oligonükleotid çözeltisi 2.5 ul kullanın. Her zaman pipetleme hataları önlemek için her çözümün biraz aşırı miktarda hazırlamak. TNMg 1x tamponunda cTAR bölgesinin ayrı ayrı, TAR 4 mcM çözeltisi 27.5 ul katlayın ve yukarıdaki gibi (adım 3.2.1.) Sözü. </li><li> Su içinde 80 uM çözeltisine, her iki NC Stok protein çözeltisi ve (12-55) NC peptit seyreltin. </li><li> TAR ve cTAR çözümleri oda sıcaklığına soğutuldu zaman, her iki tüpler kısa spin santrifüj gerçekleştirmek ve numunelerin hazırlanması başlar. </li><li> Tüpler otoklava 20 boş 0.5 ml hazırlayın. Laboratuar örnekleri için rafa 10 tüplerin her biri 2 satır yerleştirin. </li><li> Her zaman farklı reaktif kullanılan ipuçları değiştirin. </li><li> Katlanmış TAR 2.5 ul ilk sıranın her tüp ekleyin. Katlanmış cTAR 2.5 ul ikinci sıranın her tüp ekleyin. </li><li&gt; Uygun bileşik 2 ul ekleyin 1 seyreltme TAR ve cTAR (500 uM seyreltme için 5 uM konsantrasyonu artar). Bileşiğin olmaması durumunda NC analizi ve (12-55) NC örneklerde, bileşiğin su ile değiştirin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 15 dakika inkübasyondan sonra, muhabir TAR örneklerinde (birinci sıranın tüpleri) ile cTAR örnekleri (ikinci sıranın tüpler) karıştırın. </li><li> Sırasıyla, NC veya (12-55) NC analizi için numuneler 80 mcM NC 1 ul veya 80 uM (12-55) 1 ul NC ekleyin. </li><li> 15 dakika inkübasyondan sonra, GLB SDS 3 ul eklediğiniz her tüpü 3 kez pipet ve buz tüpü koymak. NC ve (12-55) NC analizi için numuneler kullanılarak, sırasıyla, bu adımı tekrarlayın. Yükleme adım kadar buz üzerinde sabit örnekleri tutun. </li><li> Jel cihazının kapağını çıkarın. Kuyulara her numunenin 13 ul yükleyin. Şekil bildirilen sırayla aşağıdaki örnekleri yükleyinure 3B. </li><li> Jel cihazının kapağını değiştirin. Güç kaynağına jel cihazının açar takın. Elektrotlar güç kaynağı doğru yuvalara takılı olduğundan emin olun. </li><li> Güç açma ve Renk verici madde jelin alt yukarıda 1.5 cm göç kadar, 2 saat boyunca karıştırılır ve 200 V sabit gerilimde, 30 dakika boyunca jel üzerinde çalıştırıldı. </li></ol></li><li> Numune hazırlama: NC-preinkübasyon modu vs Oligo-preinkübasyon modu <ol><li> Bileşik seyreltin 1 stok solüsyonu. 500 uM, 10 ul, 250 uM, 50 uM, MiliQ suyu içinde bileşik 1 5 uM seyreltme hazırlayın. </li><li> Yukarıda belirtildiği gibi, kontrol örnekleri hazırlayın (paragraf 3.2.). </li><li> Her bir örnek için 4 uM oligonükleotid çözeltisi 2.5 ul kullanın. Her zaman pipetleme hataları önlemek için her çözümün biraz aşırı miktarda hazırlamak. Yukarıda belirtildiği gibi TNMg 1x tamponu içinde cTAR bölgesinin ayrı ayrı, TAR 4 mcM çözeltisi 27.5 ul katlayın ve (adım 3.20,1.). </li><li> Su içinde 80 uM çözeltisine, her iki NC Stok protein çözeltisi ve (12-55) NC peptit seyreltin. </li><li> TAR ve cTAR çözümleri oda sıcaklığına soğutuldu zaman, her iki tüpler kısa spin santrifüj gerçekleştirmek ve numunelerin hazırlanması başlar. </li><li> Her zaman, her zaman reaktifler değiştirilir ipuçları değiştirmek veya reaksiyon tüpünde bulunan diğer herhangi bir sıvı veya çözelti dokunulursa. </li><li> Bu aşamada açıkça etiket ve iki farklı ön-kuluçka prosedürleri için örnekleri ayırmak için emin olun. <ol><li> Oligo preinkübasyon modu <ol><li> Tüpler otoklava 10 boş 0.5 ml hazırlayın. Laboratuar örnekleri için rafa 5 tüplerin 2 satır yerleştirin. </li><li> Katlanmış TAR ilk satırı 2.5 ul her tüp ekleyin. Katlanmış cTAR ikinci sıra 2.5 ul her tüp ekleyin. </li><li> Uygun bileşik 2 ul ekle 1 seyreltme TAR ve cTAR (500 uM seyreltme için 5 uM konsantrasyonu artar).Bileşiğin olmaması durumunda NC analizi için numune su ile bileşik değiştirin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 15 dakika inkübasyondan sonra, cTAR örnekleri (ikinci sıra) almak ve muhabir TAR örneklerinde (ilk satır) ile koyun. </li><li> Her bir numune için 80 uM NC 1 ul ilave edin ve oda sıcaklığında 15 dakika için örnek inkübe edin. </li><li> 15 dakika inkübasyondan sonra, GLB SDS 3 ul eklediğiniz her tüpü 3 kez pipet ve buz tüpü koymak. Yükleme adım kadar buz üzerinde sabit örnekleri tutun. </li></ol></li><li> NC-preinkübasyon modu <ol><li> 5 boş 0.5 mL otoklava tüpleri hazırlayın ve laboratuar örnekleri için rafa koyun. </li><li> Uygun bileşik 1 seyreltme her tüp 4 ul ekle (500 uM seyreltme için 5 uM konsantrasyonu artar). Bileşiğin olmaması durumunda NC analizi için numune su ile bileşik değiştirin. </li><li> 80 μ her bir tüp içinde ekleme 1 ulM, Kuzey Carolina, oda sıcaklığında 15 dakika için örnek inkübasyon ve. </li><li> Bir tüp haline cTAR 15 ul katlanmış TAR 15 ul karıştırın ve bir sonraki aşamada bu TAR + cTAR solüsyonu kullanın. </li><li> 15 dakika inkübasyondan sonra, TAR + cTAR karışımı çözeltisi her bir örnek, 5 ul ekle ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca numune inkübe edin. </li><li> 15 dakika inkübasyondan sonra, GLB SDS 3 ul eklediğiniz her tüpü 3 kez pipet ve buz tüpü koymak. Yükleme adım kadar buz üzerinde sabit örnekleri tutun. NOT: aşama ile ilgili 3.5.8 yapılan analizler tüm örneklerde (3.5.7 den devam) ile yapılabilir. </li></ol></li></ol></li><li> Jel cihazının kapağını çıkarın. Kuyulara her numunenin 13 ul yükleyin. Şekil 4 bildirilen düzeni aşağıdaki örnekleri yükleyin. </li><li> Jel cihazının kapağını değiştirin. Güç kaynağına jel cihazının açar takın. Elektrotlar güç Özel Sayı doğru yuvalara takılı olduğundan emin oluny. </li><li> Güç açma ve Renk verici madde jelin alt yukarıda 1.5 cm göç kadar, 2 saat boyunca karıştırılır ve 200 V sabit gerilimde, 30 dakika boyunca jel üzerinde çalıştırıldı. </li></ol></li></ol> 4. Jel ve Jel Boyama Çıkarma <ol><li> Elektroforez sonrasında, güç kaynağını kapatın ve elektrik kablolarını sökün. Soğutma sisteminin su musluğunu kapatın ve çekirdek hortumları ayırın. </li><li> Sistem soğutuldu eğer, soğutma çekirdek kaldırmak ve her iki odalarından tampon kapalı dökün, kapağını kaldırın ve. </li><li> Yavaşça cihazdan jel sandviç sökmeye ve cam plakalar tüm kelepçeleri çıkartın. , Plakalardan jel kaldırmak plakaların yan dışarı aralama birini itmek ve yukarı çekin ve uzak üst cam levha için yavaşça çevirin. Jel iki köşe kavrayın ve camdan çıkarmak için hafifçe kaldırın. </li><li> Için arzu edilen nükleik asitler, boyama çözeltisi ile uygun bir kapta jel yerleştirinKarıştırılarak 30-45 dk. </li><li> Boyama işleminden sonra jel sisteminde nükleik asitler, floresan sinyalini tespit etmek için bir transilluminator&#39;de görüntüleme sisteminde jel koydu. </li></ol>

<ol>
	<li>Druillennec, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mimic+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+impairs+reverse+transcription+and+displays+antiviral+activity.">A mimic of HIV-1 nucleocapsid protein impairs reverse transcription and displays antiviral activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4886-4891 (1999).</li><li>Darlix, J. L., Garrido, J. L., Morellet, N., Mely, Y., de Rocquigny, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+functions,+and+drug+targeting+of+the+multifunctional+nucleocapsid+protein+of+the+human+immunodeficiency+virus.">Properties, functions, and drug targeting of the multifunctional nucleocapsid protein of the human immunodeficiency virus.</a> Adv Pharmacol. 55, 299-346 (2007).</li><li>Thomas, J. A., Gorelick, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocapsid+protein+function+in+early+infection+processes.">Nucleocapsid protein function in early infection processes.</a> Virus Res. 134, 39-63 (2008).</li><li>Mirambeau, G., Lyonnais, S., Gorelick, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features,+processing+states,+and+heterologous+protein+interactions+in+the+modulation+of+the+retroviral+nucleocapsid+protein+function.">Features, processing states, and heterologous protein interactions in the modulation of the retroviral nucleocapsid protein function.</a> RNA Biol. 7, 724-734 (2010).</li><li>Zeng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nucleation,+reverse+annealing,+and+chaperone+function+along+the+reaction+path+of+HIV-1+single-strand+transfer.">Probing nucleation, reverse annealing, and chaperone function along the reaction path of HIV-1 single-strand transfer.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 12651-12656 (2007).</li><li>Basu, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strand+transfer+events+during+HIV-1+reverse+transcription.">Strand transfer events during HIV-1 reverse transcription.</a> Virus Res. 134, 19-38 (2008).</li><li>Guo, J., Henderson, L. E., Bess, J., Kane, B., Levin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+nucleocapsid+protein+promotes+efficient+strand+transfer+and+specific+viral+DNA+synthesis+by+inhibiting+TAR-dependent+self-priming+from+minus-strand+strong-stop+DNA.">Human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid protein promotes efficient strand transfer and specific viral DNA synthesis by inhibiting TAR-dependent self-priming from minus-strand strong-stop DNA.</a> J Virol. 71, 5178-5188 (1997).</li><li>Godet, J., Mely, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+studies+of+the+nucleic+acid+chaperone+properties+of+the+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Biophysical studies of the nucleic acid chaperone properties of the HIV-1 nucleocapsid protein.</a> RNA Biol. 7, 687-699 (2010).</li><li>Darlix, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+nature+and+specific+functions+of+the+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Flexible nature and specific functions of the HIV-1 nucleocapsid protein.</a> J Mol Biol. 410, 565-581 (2011).</li><li>Lapadat-Tapolsky, M., Pernelle, C., Borie, C., Darlix, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+nucleic+acid+annealing+activities+of+nucleocapsid+protein+from+HIV-1.">Analysis of the nucleic acid annealing activities of nucleocapsid protein from HIV-1.</a> Nucleic Acids Res. 23, 2434-2441 (1995).</li><li>Vo, M. -. N., Barany, G., Rouzina, I., Musier-Forsyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+studies+of+mini-TAR+RNA/DNA+annealing+in+the+absence+and+presence+of+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Mechanistic studies of mini-TAR RNA/DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein.</a> J Mol Biol. 363, 244-261 (2006).</li><li>Beltz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+HIV-1+nucleocapsid+protein+for+cTAR+DNA+binding+and+destabilization,+and+correlation+with+inhibition+of+self-primed+DNA+synthesis.">Structural determinants of HIV-1 nucleocapsid protein for cTAR DNA binding and destabilization, and correlation with inhibition of self-primed DNA synthesis.</a> J Mol Biol. 348, 1113-1126 (2005).</li><li>Mori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleocapsid+Protein:+a+Desirable+Target+for+Future+Therapies+against+HIV-1.">Nucleocapsid Protein: a Desirable Target for Future Therapies against HIV-1.</a> Curr Top Microbiol Immunol. , .</li><li>Sosic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+synthesis+and+biological+evaluation+of+TAR+and+cTAR+binders+as+HIV-1+nucleocapsid+inhibitors.">Design, synthesis and biological evaluation of TAR and cTAR binders as HIV-1 nucleocapsid inhibitors.</a> MedChemComm. 4, 1388-1393 (2013).</li><li>Tabarrini, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+Anti-HIV+Transcription+Inhibitor+Quinolones:+Identification+of+Potent+N1-Vinyl+Derivatives.">Studies of Anti-HIV Transcription Inhibitor Quinolones: Identification of Potent N1-Vinyl Derivatives.</a> Chemmedchem. 5, 1880-1892 (2010).</li><li>Hagan, N., Fabris, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+mass+spectrometric+determination+of+the+stoichiometry+and+binding+affinity+of+the+complexes+between+nucleocapsid+protein+and+RNA+stem-loop+hairpins+of+the+HIV-1+Psi-recognition+element.">Direct mass spectrometric determination of the stoichiometry and binding affinity of the complexes between nucleocapsid protein and RNA stem-loop hairpins of the HIV-1 Psi-recognition element.</a> Biochemistry. 42, 10736-10745 (2003).</li><li>Ivanyi-Nagy, R., Davidovic, L., Khandjian, E. W., Darlix, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disordered+RNA+chaperone+proteins:+from+functions+to+disease.">Disordered RNA chaperone proteins: from functions to disease.</a> Cell Mol Life Sciences: CMLS. 62, 1409-1417 (2005).</li><li>Zagotto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+G-quadruplex+vs+double-stranded+DNA+recognition+in+regioisomeric+lysyl-peptidyl-anthraquinone+conjugates.">Tuning G-quadruplex vs double-stranded DNA recognition in regioisomeric lysyl-peptidyl-anthraquinone conjugates.</a> Bioconjug Chem. 22, 2126-2135 (2011).</li><li>Carlson, C. B., Vuyisich, M., Gooch, B. D., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferred+RNA+binding+sites+for+a+threading+intercalator+revealed+by+in+vitro+evolution.">Preferred RNA binding sites for a threading intercalator revealed by in vitro evolution.</a> Chem Biol. 10, 663-672 (2003).</li><li>Gooch, B. D., Beal, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+duplex+RNA+by+helix-threading+peptides.">Recognition of duplex RNA by helix-threading peptides.</a> J Am Chem Soc. 126, 10603-10610 (2004).</li><li>Kanevsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+TAR+RNA-DNA+annealing+in+the+absence+and+presence+of+HIV-1+nucleocapsid+protein.">Structural determinants of TAR RNA-DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein.</a> Nucleic Acids Res. 39, 8148-8162 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

ADI hızla HIV-1, yeni anti-HIV ilaçlarının arayışında olan bir ilginç hedef nükleokapsid protein şaperon aktivitesinin inhibisyonunu değerlendirmek için izin veren bir deneydir. NC hızlı ve kararlı olan katlama aksi dikkatli tavlama ardından yüksek sıcaklıkta termal denatürasyon gerektirecek oda sıcaklığı nükleik asitler de tavlanan. Deney iki tam uzunlukta NC ya da kesik (12-55) NC ile gerçekleştirilebilir: her iki durumda da, iki nükleik asitler (RNA ve onun tamamlayıcı DNA kopyası) hızlı bir şekilde tavlanır. Bu tepe bölümü kesik Kuzey Carolina peptidi ile literatür gözlemiyle tutarlıdır tavlama TAR apikal döngünün tamamlayıcı dizisi ile, zayıf bir Kuzey Carolina bağlanma yeri onun tamamlayıcı apikal döngünün ilişkiler üzerinde cTAR gövdesinin etkin bir şekilde eritme ile başlatılır, genişletilmiş tavlı hibrid birkaç kararsız ara ürünler ile biten. 21 NC çok kararlı bir prot olduğunuein ve birkaç sorun performans ADI oluşabilir ise. Bu sağlanamadığı takdirde, jel doğru pozisyonlarda nükleik asit bantları göstermez: Ancak Tampon reaksiyonu durdurmak için kullanılan Jel Yükleniyor taze yapılmış SDS eklemek için çok önemlidir. Bu proteini doğru bir şekilde denatüre ve nükleik asit ile sıkı kompleks serbest bırakmak için bir jel yükleme tamponu içinde mevcut olması gerekir jel elektroforezi SDS katran / cTAR heterodubleksin görselleştirmek için çok Aslında, Kuzey Carolina, bir nükleik asit bağlayıcı bir proteindir. Bu da jel çalışması sırasında kaymıştır bantların oluşumu, yani deney olası bir sorun giderme, olduğunu. Bu etki tam uzunluktaki NC Şekil 2&#39;deki gibi, kullanılan zaman özellikle belirgin olup, nükleik asitlerin üzerinde güçlü bir etkiye sahip olan agregasyon, yüksek oranda bazik N-terminal ucunun varlığına bağlıdır. Terminal temel kuyruk varlığı gösterisi olarak, tavlama reaksiyonu daha zor inhibe yaparn Şekil 3 kullanılarak bileşik 1, bir temsilci diş ara katkı, TAR ve cTAR kök-döngü yapılarını stabilize özellikle verimli, yani bir ara katkı olarak. Aslında, nükleik asitler ile bu etkileşim çıkıntı ve döngüler baz çifti şeklindeki kütleli ikame daha kolay bir iş parçacığı sağlayan, çift sarmal sürekliliğinin kesintiye zaman tercih edilir. Bu nükleik asit bağlayıcı ile TAR ve cTAR stabilizasyonu daha önceleri, iki oligonükleotid erime sıcaklığı artış belirlenmesi ile analiz edilmiştir. 14 Ayrıca, erime sıcaklığı artışı, HIV-1 NC tarafından katalize edilen tavlama inhibisyonu ile bağlantılı olmasına karşın, hetero katran / cTAR oluşumunun yol ve diş ara katkılar örneğin TAR elemanı olarak RNA dinamik yapılar için bağlayıcıların ilginç bir sınıfı olduğuna işaret etmektedir. 14. Etki mekanizması, bu kaçakları için çağrılırŞekil 4&#39;te gösterildiği gibi unds Ayrıca, farklı alternatif biçimlerde ADI tahlili yapılarak geçerli olabilir: araya durumunda tavlanmış heterodubleksin inhibisyonu geliştirilmiş ilaç katlanmış iki oligo ile inkübe edildiği zaman. Böyle NC proteinin doğrudan bağlayıcı olarak farklı etki mekanizması ile hareket eden bileşikler, farklı preinkübasyon modu daha az etkilenen olacaktır. ADI tahlil bu nedenle, Kuzey Carolina inhibitörlerinin belirlenmesi için bileşiklerin kütüphaneleri taramak için kullanılabilir iki yöntem uygulanır, ve NC hedefleyen anti-HIV ilaçlarının ararken pozitif isabet etki farazi mekanizmanın belirlenmesi. Açıktır ki, tespit Kuzey Carolina inhibitörlerinin spesifik bir eylem mekanizması için iddia tek başına bu tekniklerin kullanımı yeterli değildir ve başka uygun deneyler, biyokimyasal çalışma hipotezi sürdürmek için ihtiyaç vardır. 14 Son olarak, bu ADI yüksek kullandığı vurguladı gerekirTest edilen bileşimler NC &quot;in vitro&quot; engellenmesi değerli bilgi veren yeniden birleştirici ya da sentetik ya da saflaştırılmış enzimler. Bu &quot;güç ve zayıflık&quot; testinin ise: ADI iyi sanal tarama tamamlayabilir ve moleküler modelleme hızla yapı-aktivite ilişkileri kurmak ve analiz sağlayan ve sonunda sentez ve ilaç tasarımı yönlendirerek, ilaç keşif programlarının ön adımlarla yaklaşır. Diğer biyokimyasal analizler HIV ilaç geliştirme projelerinde kullanılan Ancak, ADI virüs ile enfekte hücrelerde varsayılan inhibitörlerinin etkileri hakkında bilgi vermez.

insan bağışıklık eksikliği virüsü tip 1 (HIV-1) nükleokapsid protein NCp7 (NC) ters transkripsiyon sırasında bir kofaktör olarak virüs çoğalmasında önemli bir rol oynuyor sıkıca olgun bulaşıcı virüsün genomik RNA ile ilişkili olan, küçük, bazik protein, bir genom tanıma ve ambalaj. 1-3 NC istikrarlı nükleik asit yapılarının istikrarsızlaştırma ve tamamlayıcı dizilerin tavlanmasını katalize bir nükleik asit hastabakıcı olarak görev yapar. Çift yönlü destabilize edici aktivitesi çinko parmak yapıları (12-55 peptid) eşlenmiş ise onun nükleik asit toplayıcı aktivitesi 11 amino asit temel olarak N-terminal bulunur. 4, pozitif yüklü bir protein bağlanma reaksiyonunun elektrostatik bariyer düşürür ve İki ayrı tamamlayıcı dizileri bir araya gelip hızını artırır. Kararlı bir şekle katlanmış nükleik asitler facilitat için NC hastabakıcı faaliyetlerini gerektirirE bunların tavlama 5 Bu NC şerit aktarma olayları çok önemlidir ters transkripsiyon, özellikle önemlidir:. eksi ip aktarımı giderildi, eksi ip durdurma DNA gibi retrotranscribed R bölgesinde, bir tamamlayıcı diziye aktarılan ve tavlanmış olmalıdır termodinamik olarak tercih edilen olmakla birlikte, RNA genomunun 3 &#39;ucunda şablonu. 6, bu reaksiyon sonucu R bölgelerinde trans-aktivasyon duyarlı bölgesi (TAR), RNA ve kararlı bir yapının varlığı NC yokluğunda geniş bir oluşmaz bu da, DNA kopyası (cTAR DNA). karakteristik sap-halka yapısındaki 7 cTAR ve TAR, aslında, yüksek düzeyde yapılanmış olan bölgeler ile ilişkili olmalıdır. Kuzey Carolina proteini, bu toka denatüre, ve tamamlayıcı nükleik asit iplikçikleri arasındaki moleküller arası tavlama hızını arttırarak eksi-kordonlu transferini teşvik eder. TAR ve cTAR NC tavlama mekanizması iyice incelenmiş ve de olmuşturçeşitli araştırma kağıtları TAR tavlama deneyi olarak tarif ve önerilen şema mükemmel değerlendirmeleri tasvir edilir. 8-11 Özetleme, NC, böyle TAR-RNA gibi kararlı RNA ikincil yapısını destabilizes onun tamamlayıcı dizisi, cTAR-DNA ikincil yapısını destabilizes ve bir sonucu olarak tavlama katran / cTAR hetero oluşumuna yol açan bir RNA / DNA tepki. 10,11 teşvik, HIV replikasyonu esnasında şerit transfer adımı tercih edilir. 12 NC doğru küçük moleküllerin neden olduğu olası parazit tehlikeye NC aktivitesinin bir sonucu olarak, viral genomun ters transkripsiyon bir azalma ile sonuçlanır çünkü yeni antiviral ajanların geliştirilmesi için çekici bir hedeftir. 2,13 Bu yaklaşım olabilir sonuçta başarılı bir anti-HIV maddelerinin geliştirilmesine yol açar. NC için bir tarama sırasında biz de bilinen özelliklerine dayanarak bir tahlil geliştirdi 14 inhibitörleriverimli istikrarsızlaştırmak için nükleokapsit ve tavlama tamamlayıcı oligonükleotidlerden. 10,11 Biz N A nnealing- M E lectrophoresis (ADI) deneyi ediated ucleocapsid çağırdı. ADI deney hibrid katran / cTAR heterodubleksin vermek üzere, tamamlayıcı DNA dizisinin (cTAR) ile TAR RNA sekansının üst kısmı karşılık gelen oligonükleotid bizim durumumuzda, tamamlayıcı nükleik asitlerin stabil bir şekilde yapılandırılmış kopyalar arasında tavlama aracılık NC kullanır . NC mevcudiyetinde katran / cTAR bağlanma reaksiyonu analizi yerli poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile araştırılabilir. Bu protokol, hızla stabil saç tokası yapıları katlanmış oda sıcaklığı oligonükleotidlerle de tavlanmasına için ADI tahlil gerçekleştirmek için nasıl gösterir, nasıl deney reaksiyonu ve olası arıza sonucu analiz etmek. Nükleik asidin Radyoaktif etiketleme talep ve duyurma değiloligonükleotid bantlarının konvansiyonel boyama yöntemleri ile yapılabilir. rekombinant tam uzunluktaki protein veya NC kesik bir sentetik versiyonu ya da kullanan deney, NC, RNA ve DNA ile kuvvetli bir bağlanma ile ilişkili olduğu gösterilmiştir bir inhibe edici aktiviteye diş ara katkılar belirlenmesini sağlar. 14.

<table><tbody><tr><td>cTAR, 29-mer DNA oligo. Desalted. HPLC purified.</td><td>Metabion International AG</td><td></td><td>Store the stock&amp;nbsp; solution at -20 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TAR, 29-mer RNA oligo. Desalted. HPLC purified.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Metabion International AG</td><td></td><td>Store the stock aliquot at -80 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>(12-55)NC peptide</td><td>EspiKem srl</td><td></td><td>Store the stock solution at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>1.5 ml tubes</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120 086</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>0.5 ml tubes</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121 023</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Biosphere Filter Tips 0.1-10 &amp;micro;l</td><td>Sarstedt</td><td>701,130,210</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere Filter Tips 2-20 &amp;micro;l</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere Filter Tips 200&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Filter 0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>Biosigma srl</td><td>51,798</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carlo Erba</td><td>414631</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71725-50G</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-1L</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Perchlorate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>222283-100G</td><td>Store the 1&amp;nbsp;M solution at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49770-1L</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1329-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N,N&amp;prime;,N&amp;prime;&lt;/em&gt;-Tetramethylethylenediamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7460-500G</td><td>Prepare the 10% solution freshly before use</td></tr><tr><td>Acrylamide-bis ready-to-use solution 40% (19:1)</td><td>Merck Millipore</td><td>1006401000</td><td>Polyacrylamide is highly neurotoxic: wear gloves during the gel casting</td></tr><tr><td>Tris ultrapure</td><td>Applichem</td><td>A1086,1000</td><td></td></tr><tr><td>DEPC-treated water</td><td>Ambion</td><td>AM9922</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5415R</td><td>Eppendorf</td><td>22,621,408</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS spectrometer Lambda 20</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protean II xi Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-1803</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>SybrGreen II RNA Gel Staining</td><td>Lonza</td><td>50523</td><td>Make the 1/10,000 dilution in TBE 1x. Store it in the dark at 4&amp;nbsp;&amp;deg;C for two weeks.</td></tr><tr><td>Geliance 600 Imaging System</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nucleocapsid annealing-mediated electrophoresis (name) assay allows the rapid identification of hiv-1 nucleocapsid inhibitors

RNA ya da kararlı üç boyutlu katlanmasına katlanmış bir DNA antitümör ya da antiviral ilaçların geliştirilmesinde ilginç hedeflerdir. HIV-1 durumunda, virüs aktivitesinin düzenlenmesinde rol oynayan viral proteinler birçok nükleik asitleri tanır. nükleokapsid protein NCp7 (NC) virüs replikasyonu sırasında birkaç süreçleri düzenleyen önemli bir proteindir. NC aslında RNA ve DNA ve tavlama kolaylaştırılması ikincil yapıları istikrarsızlaştırıcı bir şaperonudur. NC inaktivasyonu yeni bir yaklaşım, anti-HIV tedavisi için bir ilgi çekici bir hedeftir. K bir nnealing- M D lectrophoresis ediated ucleocapsid (ADI) deneyi ile, örneğin TAR saç tokası yapıları ve HIV cTAR elemanları olarak termodinamik olarak kararlı üç boyutlu konformasyon katlanmış RNA ve DNA erime ve tavlama önleyebilen moleküller tanımlamak amacıyla geliştirilmiştir HIV-1 nükleokapsid protein. Yeni tahlil yeniden ya istihdamönceki etiketleme gerek kalmadan birleşmesini veya sentetik protein, ve oligonükleotitler. Sonuçların analizi konvansiyonel nükleik asit boyaması ile standart poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile elde edilir. Bu çalışmada rapor edilen protokol nükleik yetkin hem asit şaperonlar tam uzunluktaki bir protein ya da bazik N-terminal eksik olan kesilmiş sürümüyle ADI analizini gerçekleştirmek için ve nasıl NC şaperon aktivitesinin inhibisyonunu değerlendirmek için açıklamaktadır enterkalatörün parçacığı. Ayrıca, AD teşhis Kuzey Carolina inhibitörlerinin etki mekanizması, farazi ilgili bilgiler elde etmek için, iki farklı yararlı gerçekleştirilebilir.

Şekil 1, tam uzunluktaki rekombinant protein, ile) yapılır, Nükieokapsit Tavlama Aracılı Elektroforez (ADI) deneyi temsil eden bir sonucunu göstermektedir ii) cTAR + TAR karıştırılması ve oda sıcaklığında 1 saat kadar kuluçkalanması, yani protein, ve iii olmadan ) (12-55) NC, N-terminal alanının 11 amino asit eksiği olan bir sentetik peptid ile gerçekleştirilen aynı deney. Şekil 1 &#39;de daha önceden katlanmış TAR, cTAR karıştırılmış ve tavlanmış hetero TAR oluşumu / cTAR proteininin yokluğunda (Şekil 1&#39; in sol şerit) tam boyunda biraraya getiren NC mevcudiyetinde gözlenmiş (merkezi kuşak ) ve Şekil 1 &#39;de kesik (12-55) NC peptit (sağ şerit varlığında). Kontroller vardır: onların yavaş annealin ardından cTAR için TAR stabil katlanmış yapıların termal denatürasyon yoluyla elde edilen, cTAR katlanmış TAR katlanmış ve hibrit (TAR / cTAR) tavıörn. 14 uzatılmış hetero sarmal içinde iki sabit nükleik asit dizilerini denatüre etmek için NC kabiliyeti net bir şekilde belirgindir: tam uzunlukta NC proteini katran / cTAR hibridin oluşturulmasına hemen yol açar: 0 &#39;NC ilave arasından geçen en az bir zaman işaret örnekler ve reaksiyon durur jel yükleme tamponu eklenmesi; Tam oluşumunun başladığı 15 &#39;inkübasyon süresi sonunda elde edilir. tavlanmış heterodubleksin yoğunluğundaki artış katlanmış cTAR ve TAR oligonükleotidlerin yoğunluğundaki azalma ile paralellik göstermektedir. hetero oluşumu, tepe bölümü kesik bir halinin varlığı altında da elde sentetik peptidin biyolojik aktivitesini teyit (12-55) NC yani edilir. Protein ya da hetero oluşumu gözlenmez peptidin, katran ve cTAR oligonükleotid yokluğunda heterodubleksin içine oda sıcaklığında (Şekil 1) bağlandığı bir olmaz. IçindeTüm deneyler, kararsız ara ürünler zamanla azalır (Şekil 1 &quot;ara kompleksleri&quot;) hızlı oluşumu sürekli doğru nükleik asitler katlama kadar cTAR ve TOKALAR ve TAR yoluyla iplik değişimi önerilen mekanizma ile, görülmektedir. 17 Deney olası bir sorun Jel Yükleme Tamponu SDS eksikliğidir. GLB SDS yokluğunda reaksiyon sonucu, Şekil 2&#39;de gösterilen ve glb + SDS ile sonuç ile karşılaştırılır. Katlanmış TAR, cTAR karıştırılır ve oda sıcaklığında 3 saat süreyle inkübe edildi ve yeniden birleştirici tam uzunlukta NC proteini ile 37 ° C de 3 saat karıştırıldı. SDS (GLB olmadan) bir yarım jel yükleme tampon maddesi ile, diğer yarısına glb SDS (glb SDS) ile ise, ilave edildi: Kuluçkadan sonra, örnekler iki ayrılmıştır. Örnekler jel üzerine yüklendi ve nükleik asitler, bantların konumu tarafından işletilen jel sonra görselleştirilmiştirboya boyama. Bu beklenen ve protein ve nükleik asitler arasında güçlü bir bağlanma gösterir: NC mevcut ama örnekler GLB yüklü edildiğinde, tüm nükleik asitler bantları kadar kaymıştır. glb SDS ile sonuçlar jel aşırı sağ gösterilmiştir: SDS ilavesi, kontroller ile karşılaştırma yapılmasına olanak tanıyan, protein denatüre ve protein ile kararlı bir kompleks nükleik asitleri serbest bırakmaktadır. ADI deney dinamik nükleik asit yapılarını dengelemek ve NC şaperon aktivitesini inhibe arasında ara diş kabiliyetini değerlendirmek için kullanılır. 14 Diş ara katkılar örneğin antrakinon gibi halka sisteminin karşıt bölgelerde yer alan büyük yan zincirler ile ikame edilmiş düzlemsel aromatik moleküllerdir Şekil 3A&#39;da gösterilen. 18 Bu ara katkılar nükleik asitlerin çift sarmal aracılığıyla iplik mümkün, son olarak çift her oluğa yan zincirleri yerinisarmaldan oluşur. 19,20 Şekil 3B, tam uzunlukta NC mevcudiyetinde ya da tepe bölümü kesik peptit 1 numaralı bileşik ile, bilinen bir diş ara katkı, 18 mevcudiyetinde ADI tahlilinin sonuçlarını göstermektedir. Her iki durumda da, NC tarafından katran / cTAR hibrid oluşumu sırasında, aynı zamanda, serbest TAR ve cTAR miktarı artar interkalatörünün konsantrasyonunun arttırılması ile azaltılır. N-terminal kuyruğu (12-55NC) eksik proteininin tepesi kesik bir şekli onun etkinliğinin engellenmesi için daha duyarlıdır: bu fark kadar test edilen bütün bileşikler ile doğrulandı. ADI deneyi, ya da katlanmış bir nükleik asit alt-tabakalar ile, 15 dakika boyunca test bileşiği ön enkübasyona tabi tutulması ile iki yolla, ya da katlanmış oligonükleotidlerin (NC-preinkübasyon modu) ilave edildi NC ile test bileşiği, önceden inkübe edilerek yapılabilir , NC ilavesi ve 15 dakika (oligo PR için bir başka inkübasyon takipeincubation modu). Genel inkübasyon süresi iki farklı modlarda aynı olmasına rağmen, NC eklenmesinden önce katlanmış oligonükleotitlerle preinkübasyon katlanmış nükleik asidin içine enterkalatörleri bir parçacığı için daha fazla zaman sağlar. Bu dinamik yapılarının güçlü istikrar ve NC hastabakıcı faaliyetlerinin daha kolay bir inhibisyonu içine sonuçlanır. Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, iki modda ADI deneyinin analizi, bu nedenle, Kuzey Carolina inhibitörlerinin etki mekanizması farklılıkları geliştirir: bileşik 1 oligo preinkübasyon modunda NAME ile analiz edildiğinde (Şekil 4, sol şerit) çok daha düşük inhibisyon NC-preinkübasyon modunda görülmektedir oysa, NC-aracılı tavlama güçlü engellenmesini göstermektedir (Şekil 4, sağda şerit). Bu deneyde ve bu koşullarda, her deney içinde ilgili bileşikler arasından kümelerini tarama sırasında inhibe edici konsantrasyonlarının belirlenmesi için lütfen unutmayınment, üçlü (özellikle IC50 değeri civarında), yakın aralıklı konsantrasyonu kullanılarak en azından gerçekleştirilmelidir. 14 <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52474/52474fig1highres.jpg" /> Şekil 1:. Tam uzunlukta NC ve kesilmiş (12-55) NC Kırımlı TAR ve cTAR, her 1 mcM ile ADI tahlil, rekombinant NC ile ya da inkübe edildi (12-55) NC (oligolar / NC = 1 / 8) 0 dakika, 15 dakika, 30 dakika ve 1 saat karıştırıldı. Protein (0 dakika, 15 dakika, 30 dakika ve 1 saat) yokluğunda inkübe TAR, cTAR negatif kontrol olarak kullanılmıştır. Katlanmış TAR katlanmış cTAR ve hibrid katran / cTAR in vitro bağlanma kontrol olarak kullanıldı ve ardından ısı denatürasyonundan sonra elde edilmiştir. reaksiyonlar sonra GLB SDS kullanılarak durduruldu. Numuneler TBE 1x% 12 poliakrilamid jel üzerinde çözüldü; jeli üzerinde elektroforez nükleik asitler sonra lekeli bir transilluminator&#39;de ile tespit edildi. <html><img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52474/52474fig2highres.jpg" /> Şekil 2:. TAR analiz ederken, jel yükleme tampon maddesi SDS Etkisi (glb) / TNMg 1x önceden katlanmış Carolina TAR ve cTAR, tarafından cTAR tavlama tam boyunda biraraya getiren NC (oligo / NC = 1/8) 3 ile kuluçkaya yatırılmıştır Oda sıcaklığında veya 37 ° C &#39;de sa. Glb veya glb SDS sonra NC ile kuluçkalanmış numunelere ilave edildi. Kontroller: TAR, cTAR ve tavlanmış hibrid TAR / cTAR (her biri 1 uM). Elektroforez TBE 1x% 12 poliakrilamid jel kullanılarak yapıldı; jeli üzerinde elektroforez nükleik asitler sonra lekeli bir transilluminator&#39;de ile tespit edildi. Bu şekil, Şekil S4 modifiye edilmiştir:. Sosic, A. ve diğerleri tasarımı, sentezi ve HIV-1 nükleokapsid inhibitörleri olarak TAR ve cTAR bağlayıcı biyolojik değerlendirmesi MedChemComm 4, 1388-1393, DOI:. / C3md00212h (2013) 10,1039 . &quot;&gt; <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52474/52474fig3highres.jpg" /> Şekil 3: ADI testi ile değerlendirildi enterkalatörün 1 diş ve diş ara katkı 1. (B) (A) Kimyasal yapısı Etkisi. TAR ve cTAR, her biri 1 uM Katlanmış, her biri 8 uM tam uzunlukta NC ya da (12-55) NC ile bileşik 1 belirtilmiş konsantrasyonlarının varlığında inkübe edildi. CTAR ve genişletilmiş hetero TAR katlanmış Katlanmış TAR / cTAR kontroller olarak kullanılmıştır. reaksiyonlar sonra GLB SDS kullanılarak durduruldu. Numuneler TBE 1x% 12 poliakrilamid jel üzerinde çözüldü; jeli üzerinde elektroforez nükleik asitler sonra lekeli bir transilluminator&#39;de ile tespit edildi. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52474/52474fig4highres.jpg" /> Şekil 4: NC-preinkübasyon modları Oligo-preinkübasyon: ADI tahlil üzerindeki etkileri Oligo-preinkübasyon mod.E:., katlanmış TAR, cTAR katlanmış her biri 1 uM, tam uzunlukta NC (8 uM), NC-kuluçka öncesi mevcudiyetinde 15 dakika daha sonra, 15 dakika boyunca diş enterkalatörün 1 belirtilen konsantrasyonları ile önceden inkübe edildi ve modu: diş enterkalatörün 1, belirtilen konsantrasyonlar, 15 dakika boyunca tam uzunlukta NC (8 uM) ile ön inkübasyona tabi ve daha sonra ilave 15 dakika boyunca katlanmış TAR mevcudiyetinde ve cTAR, her biri 1 uM katlanmış. CTAR ve genişletilmiş hetero TAR katlanmış Katlanmış TAR / cTAR kontroller olarak kullanılmıştır. Tüm reaksiyonlar sonunda GLB SDS kullanılarak durduruldu. Numuneler TBE 1x% 12 poliakrilamid jel üzerinde çözüldü; jeli üzerinde elektroforez nükleik asitler sonra lekeli bir transilluminator&#39;de ile tespit edildi.

Watch this Scientific Journal Video about Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors at JoVE.com

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucleocapsid Tavlama Dolayımlı Elektroforez (ADI) Testi HIV-1 Nükieokapsit inhibitörlerinin Hızlı tanımlanması sağlar

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

nucleocapsid-annealing-mediated-electrophoresis-name-assay-allows

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

8.9K Görüntüleme.  University of Padova. This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Video: Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage (Tropism) by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA. 
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. 
The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients' needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL&lt;1000 copies/&mu;l roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video: 
1. Collection of a blood sample 
 2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells 
 3. Amplification of the env region 
 4. Amplification of the V3 region 
 5. Sequence reaction of the V3 amplicon 
 6. Purification of the sequencing samples 
 7. Sequencing the purified samples 
 8. Sequence editing 
 9. Sequencing data interpretation and tropism prediction

Prediction of HIV-1 Coreceptor Usage Tropism by Sequence Analysis using a Genotypic Approach

The prediction of the coreceptor usage of HIV-1 is required for the administration of a new class of antiretroviral drugs, i.e. coreceptor antagonists. It can be performed by sequence analysis of the env gene and subsequent interpretation through an internet based interpretation system (geno2pheno[coreceptor]).

Bir Genotipik Yöntemi&#39;ne Dizi Analizi ile HIV-1 coreceptor Kullanımı (tropizm) Tahmin

Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

HIV-1 Çekirdek in vitro Uncoating

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and host cell proteins on viral DNA synthesis. Here we address the lack of a cell-based, high-coverage, and high-resolution assay that is capable of defining retroviral reverse transcription intermediates within the physiological context of virus infection. The described method captures the 3'-termini of nascent complementary DNA (cDNA) molecules within HIV-1 infected cells at single nucleotide resolution. The protocol involves harvesting of whole cell DNA, targeted enrichment of viral DNA via hybrid capture, adaptor ligation, size fractionation by gel purification, PCR amplification, deep sequencing, and data analysis. A key step is the efficient and unbiased ligation of adaptor molecules to open 3'-DNA termini. Application of the described method determines the abundance of reverse transcripts of each particular length in a given sample. It also provides information about the (internal) sequence variation in reverse transcripts and thereby any potential mutations. In general, the assay is suitable for any questions relating to DNA 3'-extension, provided that the template sequence is known.

Here we present a deep sequencing approach that provides an unbiased determination of nascent 3&#39;-termini as well as mutational profiles of single-stranded DNA molecules. The main application is the characterization of nascent retroviral complementary DNAs (cDNAs), the intermediates generated during the process of retroviral reverse transcription.

Ters transkripsiyon enfekte hücreleri içinde belirleyici 3'-Termini ve HIV-1 sırasında doğmakta olan tek iplikçikli Viral DNA moleküllerinin dizileri

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Genetik

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

HIV ters transkriptaz ve integraz inhibitörleri hızlı taranması

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in sub-Saharan Africa continue to expand, individuals on ART should be closely monitored for the emergence of drug resistance. Surveillance of transmitted drug resistance to track transmission of viral strains already resistant to ART is also critical. Unfortunately, drug resistance testing is still not readily accessible in resource limited settings, because genotyping is expensive and requires sophisticated laboratory and data management infrastructure. An open access genotypic drug resistance monitoring method to manage individuals and assess transmitted drug resistance is described. The method uses free open source software for the interpretation of drug resistance patterns and the generation of individual patient reports. The genotyping protocol has an amplification rate of greater than 95% for plasma samples with a viral load &#62;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The sensitivity decreases significantly for viral loads &#60;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The method described here was validated against a method of HIV-1 drug resistance testing approved by the United States Food and Drug Administration (FDA), the Viroseq genotyping method. Limitations of the method described here include the fact that it is not automated and that it also failed to amplify the circulating recombinant form CRF02_AG from a validation panel of samples, although it amplified subtypes A and B from the same panel.

Drug resistance testing for HIV-1 infected individuals failing antiretroviral therapy (ART) can guide future therapies and improve treatment outcomes. Optimizing individual and population health outcomes in high HIV prevalence but resource-limited settings will ultimately require affordable and accessible drug resistance genotyping and interpretation methods.

Kaynak Sınırlı Ayarlar için uygun bir HIV-1 İlaç Direnci İzleme Yöntemi

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

Tıp

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

İnsan İmmün Yetmezlik Virüs çoğaltma Fitness belirlenmesi için İkili Büyüme Rekabet Analizi

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

Teşhis edilmesi için kullanılan ilişkili Viral ve hücresel proteinler Viral DNA'ın arıtma

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine detection of the virus. The current detection and quantification techniques, which rely primarily on nucleic acid amplification, do not discriminate infectious from non-infectious viral particles. The purpose of this article is to present specific details on recent advances in techniques used together in order to acquire further information on the infectivity status of viral particles. One technique involves assessing binding of a norovirus ssDNA aptamer to capsids. Aptamers have the advantage of being easily synthesized and modified, and are inexpensive and stable. Another technique, dynamic light scattering (DLS), has the advantage of observing capsid behavior in solution. Electron microscopy allows for visualization of the structural integrity of the viral capsids. Although promising, there are some drawbacks to each technique, such as non-specific aptamer binding to positively-charged molecules from sample matrices, requirement of purified capsid for DLS, and poor sensitivity for electron microscopy. Nonetheless, when these techniques are used in combination, the body of data produced provides more comprehensive information on norovirus capsid integrity that can be used to infer infectivity, information which is essential for accurate evaluation of inactivation methods or interpretation of virus detection. This article provides protocols for using these methods to discriminate infectious human norovirus particles.

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Routine detection methods utilizing viral genome amplification are limited by their inability to discriminate infectious from non-infectious particles. The purpose of this article is to provide detailed protocols for alternative methods to aid in discrimination of infectious norovirus particles using aptamer binding, dynamic light scattering, and transmission electron microscopy.

Viral kapsid yapısal bütünlük belirlenmesi için alternatif Vitro yöntemleri

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious cycle further requires the formation of viral/host protein complexes with HIV-1 RNA to regulate the splicing and enable nucleocytoplasmic transport. The HIV-1 Rev protein accomplishes the nuclear export of HIV-1 mRNAs through multimerization with intronic cis-acting targets - the Rev response element (RRE). A nucleolar localization signal (NoLS) exists within the COOH-terminus of the Rev arginine-rich motif (ARM), allowing the accumulation of Rev/RRE complexes in the nucleolus. Nucleolar factors are speculated to support the HIV-1 infectious cycle through various other functions in addition to mediating mRNA-independent nuclear export and splicing. We describe an immunoprecipitation method of wild-type (WT) Rev in comparison to Rev nucleolar mutations (deletion and single-point Rev-NoLS mutations) in the presence of HIV-1 replication for mass spectrometry. Nucleolar factors implicated in the nucleocytoplasmic transport (nucleophosmin B23 and nucleolin C23), as well as cellular splicing factors, lose interaction with Rev in the presence of Rev-NoLS mutations. Various other nucleolar factors, such as snoRNA C/D box 58, are identified to lose interaction with Rev mutations, yet their function in the HIV-1 replication cycle remain unknown. The results presented here demonstrate the use of this approach for the identification of viral/host nucleolar factors that maintain the HIV-1 infectious cycle. The concepts used in this approach are applicable to other viral and disease models requiring the characterization of understudied pathways.

Here we describe Rev immunoprecipitation in the presence of HIV-1 replication for mass spectrometry. The methods described can be used for the identification of nucleolar factors involved in the HIV-1 infectious cycle and are applicable to other disease models for the characterization of understudied pathways.

HıV-1 çoğaltma sırasında devir Immünoplikasyon ve kütle spektrometresi yoluyla Nüklenolar faktörleri tanımlaması

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious ...

High-throughput Antiviral Assays to Screen for Inhibitors of Zika Virus Replication

Antiviral drug discovery requires the development of reliable biochemical and cellular assays that can be performed in high-throughput screening (HTS) formats. The flavivirus non-structural (NS) proteins are thought to co-translationally assemble on the endoplasmic reticulum (ER) membranes, forming the replication complex (RC). The NS3 and NS5 are the most studied enzymes of the RC and constitute the main targets for drug development due to their crucial roles in viral genome replication. NS3 protease domain, which requires NS2B as its cofactor, is responsible for the cleavage of the immature viral polyprotein into the mature NS proteins, whereas NS5 RdRp domain is responsible for the RNA replication. Herein, we describe in detail the protocols used in replicon-based screenings and enzymatic assays to test large compound libraries for inhibitors of the Zika virus (ZIKV) replication. Replicons are self-replicating subgenomic systems expressed in mammalian cells, in which the viral structural genes are replaced by a reporter gene. The inhibitory effects of compounds on viral RNA replication can be easily evaluated by measuring the reduction in the reporter protein activity. The replicon-based screenings were performed using a BHK-21 ZIKV replicon cell line expressing Renilla luciferase as a reporter gene. To characterize the specific targets of identified compounds, we established in-vitro fluorescence-based assays for recombinantly expressed NS3 protease and NS5 RdRp. The proteolytic activity of the viral protease was measured by using the fluorogenic peptide substrate Bz-nKRR-AMC, while the NS5 RdRp elongation activity was directly detected by the increase of the fluorescent signal of SYBR Green I during RNA elongation, using the synthetic biotinylated self-priming template 3&#8242;UTR-U30 (5&#39;-biotin-U30-ACUGGAGAUCGAUCUCCAGU-3&#39;).

In this work, we describe the protocols used in replicon-based and viral enzyme-based assays to screen for inhibitors of Zika virus replication in a high-throughput screening format.

Zika Virüs Replikasyonunun inhibitörlerini taramak için yüksek verimli Antiviral Tahliller

Antiviral drug discovery requires the development of reliable biochemical and cellular assays that can be performed in high-throughput screening (HTS) ...