Bu yöntem epigenetik ve TET2 aracılı 5-Metiyatozin demetilasyon alanında normal ve klinik TET2 mutasyonlarının aktivitesinin analizigibi anahtar soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı yerli TET2'nin tek bir adımda saflaştırılaması ve faaliyetinin her üç ürünün oluşumu açısından analiz edilebilmektedir. Birkaç lisansüstü öğrenci prosedürü gösterecektir.

Protein arınması Chayan Bhattacharya, Aninda Sundary Dey'nin TET2 tahlilleri ve Navid Ayon'un LC-MS/MS analizi ile gerçekleştirilecektir. Bakteriyel dönüşüm için, 1.7 mililitrelik bir tüpte kimyasal olarak yetkin 100 mikrolitre E.coli BL21 DE3 hücresine etiketsiz insan TET2 dioksijenaz içeren bir mikrolitre rekombinant pDEST 14 hedef ekspresyonu vektörü ekleyin. En az 15 dakika buz üzerinde kuluçka sonra, ısı bir su banyosunda 30 saniye boyunca 42 santigrat derece karışımı şok.

Isı şokundan hemen sonra, hücreleri en az iki dakika buza geri yerleştirin. Bunu takiben, hücrelere katabolit baskı ile süper optimal suyu 250 mikrolitre ekleyin. Bir shaker içinde 37 santigrat derece bir saat için bakteri hücreleri kuluçka.

Kuluçkadan sonra, tüpü 9,000 kat yerçekimini bir dakika lığına santrifüj ederek hücreleri aşağı çevirin. Pipetleme ile supernatant% 70 atın ve kalan ortamda pelet eritin. Mililitre ampisilin başına 100 mikrogram içeren lirua suyu agar plaka üzerinde hücre süspansiyon yayıldı.

Plakayı 16 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. İzole edilmiş bir koloni seçin ve 10 mililitre LB ampisilin ortama dönüştürün. Tüpü bir gecede 37 derecede bir çalkalayıcıyla kuluçkaya yatırın.

Bunu takiben, birincil kültür olarak 100 mililitre LB ampisilin media'yı aşılamak için 100 mikrolitre bakteri kültürü kullanın. Tüpü bir gecede 37 derecede bir çalkalayıcıyla kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, her biri 600 mililitre LB ampisilin medya içeren ve şişe başına altı mililitre birincil kültür içeren 15 şişeyi inoküle edin.

Şişeleri 180 RPM'de bir çalkalayıcıyla 37 derecede kuluçkaya yatırın. Bakteri kültürünün yoğunluğunu kontrol etmek için optik yoğunluğunu 600 nanometre veya OD600 olarak spektrofotometre kullanarak ölçün. Kültür OD600'de 0.8 yoğunluğa ulaştıktan sonra, her şişede bir azı iptg 300 mikrolitre ile TET2 proteinekspresaneden ve 17 santigrat derece ek bir 16 saat için kültür büyümek.

Kuluçkadan sonra bakteri kültürünü santrifüj şişelerine aktarın. TET2 enzimini 5, 250 kat yerçekiminde ifade eden bakteri kültürünü 45 dakika santrifüj edin. TET2 arıtma için bakteriyel pelet kullanın.

Buz üzerinde ya da dört santigrat derecede çalışarak, 50 milimolar MES tampon, pH altı 100 mililitre bakteriyel pelet yeniden askıya. Sonra hücre süspansiyon beş mililitre almak ve tampon ile 45 mililitre getirmek. 60 saniyelik soğutma aralıklarıyla süspansiyonu güç 20'de beş kez 30 saniye sonicate edin.

Lysate'yi 5,250 kez 45 dakika boyunca çevirin. Çözünür TET2 enzimini içeren süpernatant'ı toplayın ve bir FPLC sistemine yüklemeden önce 0,45 mikron filtreden geçirin. Bir FPLC sütununa 30 mililitre güçlü katyon değişimi reçinesini paketle.

FPLC sistemi kullanarak kolonu dakikada 0,3 mililitre sabit akış hızında 10 yatak hacmi ile dengeleyin. Açıklığa kavuşturulmuş lisate'yi önceden dengelenmiş kolona yükleyin ve akış netleşene kadar yaklaşık 10 yatak hacmi nde yıkama tamponu ile yıkayın. Elute TET2, yıkama tamponundan 15 yatak hacminde elüsyon tamponuna sıfır ila %10 degrade kullanarak, ardından iki yatak hacmi için %10 elüsyon tamponu tutar.

Kolon yüklemesinden önce ve sonra 100 mikrolitre likit örneği, tüm elüsyon fraksiyonları ile birlikte toplayın ve SDS-PAGE jelini %10 oranında analiz edin. TET2 proteini içeren fraksiyonları havuza alın ve proteini dondurun-kurulayın. Sonra enzimi 10 mililitre suda çözün ve eksi 80 derecede saklayın.

Üç mikrogram substrat ile triplicate tüm demetilasyon reaksiyonları gerçekleştirin. Toplam reaksiyon tampon50 mikrolitre saflaştırılmış TET2 enzimi 100 mikrogram ekleyin. 37 derecede bir saatlik kuluçkadan sonra, TET2 katalize edilmiş oksidasyon reaksiyonlarını 500 milimolar EDTA'lık beş mikrolitre ile söndürün.

Analiz için numune hazırlamak için, DNA'yı TET2 reaksiyon karışımından ilk olarak 55 mikrolitre sönme reaksiyonuna 100 mikrolitre Oligo bağlayıcı tampon ekleyerek ayırın. Bunu takiben, karışıma% 100 etanol 400 mikrolitre ekleyin. Bu karışımı oligo bağlayıcı sütunundan geçirin.

Ciltli DNA'yı 750 mikrolitre yıkama tamponuyla yıkadıktan sonra, 20 mikrolitre sudaki DNA'yı eleyin. Şimdi, izole edilmiş DNA'yı iki ünite DNase I ve 60 ünite S1 nükleazını 37 derecede 12 saat boyunca tek tek nükleozit monofosfatlar üretelim. Sindirimden sonra, örneklere iki ünite baldır bağırsak alkalen fosfataz ekleyin.

37 santigrat derecede 12 saat ek olarak çekirdekofosfatlardan terminal fosfat gruplarını çıkarın ve nükleozitleri elde edin. LC-MS/MS yönteminin geliştirilmesi için tüm modifiye sitozin nükleozitlerinin 100 mikromolar stok çözeltisini ve HPLC sınıfı sudaki normal DNA bazlarını hazırlayın. Gelişmiş MS tetkik modunda dakikada 10 mikrolitre akış hızında stok çözümlerini kütle spektrometresinde birer aşılayarak nükleozite bağımlı MS/MS parametrelerini optimize edin.

Her DNA nükleoziti için yazılımın otomatik kantitatif optimizasyon özelliği kullanılarak çeşitli parametreler optimize edilebilir. Bu noktada, akış enjeksiyon analizi modunda yazılımın manuel kantitatif optimizasyon özelliğini kullanarak her DNA nükleoziti için kalan parametreleri optimize edin. Şimdi, dakikada 0,3 mililitre akış hızında %25 çözücü B ile bir degrade kullanarak 10 mikrolitre stok çözeltisi enjekte ederek kaynağa bağımlı MS/MS parametrelerini optimize edin.

Sekiz DNA nükleozitini ayırmak için, C18 sütunundaki metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi sıvı kromatografisi yapın. Son olarak, standart eğrilerde LC-MS/MS yöntemini kullanarak tüm nükleozitleri tespit edin ve ölçün. TET2'nin katalitik etki alanı, çoğu yerli E.coli proteini ile karşılaştırıldığında nispeten yüksek izoelektrik bir noktaya sahip olduğundan, katyon değişimi kromatografisi kullanan verimli bir arıtma süreci geliştirilmiştir.

Bu saflaştırma tek bir adımda %90'dan fazla saf TET2 enzimi elde etti. TeT2 enzimatik reaksiyonu sonrasında farklı deoksisitin türevlerini ve dört doğal DNA tabanını ayırmak ve ölçmek için hassas bir LC-MS/MS bazlı test optimize edildi. Standart eğriler, tüm nükleozitleri içeren bir karışımın seri seyreltmeleri kullanılarak çizilmiştir.

Sıvı kromatografims/MS yönteminin sonuçları burada gösterilmiştir. Yöntem, dört normal DNA bazlarının ve dört modifiye sitozin tabanının ayrılmasına ve ölçülmesine olanak sağlar. Bu deneysel prosedürde, e-Coli'de bir hedef vektörde, siteye özgü rekombinasyon tekniği ve yeterli bir ifade kullanılarak etiketsiz insan TET2 dioksinase katalitik etki alanının klonlanması anlatMaktadır.

Tek bir adımda %90 saflıktan daha fazla saflık elde etmek için katyon değişimi kromatografisini kullanan etiketsiz TET2 enzimini verimli bir şekilde saflaştırdık. Ayrıca, dört normal DNA bazını ve dört modifiye sitozin tabanını ayırmak için yeni bir sıvı kromatografi yöntemi geliştirdik. TET2 katalize reaksiyonlarından sekiz nükleoziti ölçmek için geliştirilmiş sıvı kromatografi yöntemimizi tandem kütle spektrometresi ile birleştirdik.

Daha sonra rekombinant etiketsiz insan TET2 enziminin aktivitesini belirlemek için hassas LC-MS/MS teşelesi kullanıldı. Burada açıklanan yaklaşım büyük ölçüde yabani tip ve mutant TET2 dioksijenaz değerleme artıracaktır.