Bu el yazması üzerine faydalı tartışmalar ve geribildirimler için Ivanov ve Anderson laboratuvarlarının üyelerine teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklendi [WP için GM111700 ve CA168872, PI için NS094918], Polonya Ulusal Bilim Merkezi [WS&#39;ye hibe UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054]. WS ayrıca, Polonya&#39;daki Bilim ve Yüksek Öğrenim Bakanlığı (Mobility Plus Programı) ve Lehçe-Amerikalı Fulbright Komisyonu&#39;nu ABD&#39;deki araştırmasına maddi destek verdiği için onayladı.

1. Hücre Hazırlama <ol><li> Şekil 1A&#39;da belirtildiği gibi otoklavlanmış lamelleri, 24 delikli bir plakanın 12 kuyucuğuna ekleyin; Bu, her lamelleri almak için bir vakuma tutturulmuş steril bir Pasteur pipeti kullanılarak yapılabilir. Lamerlerin kuyuya düşmesine izin vermek için emmeyi serbest bırakmak için nazikçe kuyunun kenarındaki lamelleri hafifçe vurun. </li><li> Plaka 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) osteosarkom hücreleri, 500 ul&#39;lik bir orta hacimde oyuk başına. Hücrelerin eşit olarak dağıldığından emin olmak için plakayı yana çevirin ve yukarı ve aşağı doğru birkaç kez hareket ettirin. </li><li> Lamelleri kuyunun en alt kısmında ve lamel altında kabarcıklar olmadığından emin olmak için nazikçe lamelleri aşağı doğru temiz bir P1000 ucu ile bastırın. </li></ol> 2. Stresli Hücreler <ol><li> Ertesi gün, hücrelerin lamellerin her tarafında eşit olarak dağılmış ve eşit şekilde birleştiğinden emin olmak için plakayı görsel olarak kontrol edin;Erkekler sonuçların tekrarlanabilirliğini olumsuz yönde etkileyebilir. Ters çevrilmiş doku kültürü mikroskopu üzerinde 10X&#39;lik bir hedef kullanın. </li><li> Ortamı 37 ° C&#39;ye ısıtın. Sırasıyla soğuk şok veya ısı şokuya neden olduğundan, hücrelere soğuk veya sıcak ortam uygulamanızdan kaçının. </li><li> İlacı önceden ısıtılmış ortamda seyreltin. Her bir farklı ilaç konsantrasyonu için, 500 uL ortam içeren 2 göz hazırlayın. Pipetleme yaparken kaybedilmesine izin vermek için ek 500 mcL hazırlayın. Alkol 4 tüp, her biri 1.5 mL içerir. <ol><li> Sodyum arsenit için: 500 uL içeren her oyuğa, 1.5 mcL 100 mM sodyum arsenit (nihai konsantrasyon: 100 uM) ekleyin veya 100 mM sodyum arsenit (son konsantrasyon: 50 uM) 0.75 μL ekleyin. </li><li> Vinorelbin için: 500 uL içeren her oyuğa 22.5 μL 10 mM vinorelbin (nihai konsantrasyon: 150 uM) ekleyin veya 18.75 μL 10 mM vinorelbin (nihai konsantrasyon: 100 uM) ekleyin. NOT: Sodyum arsenit<html> Iyi karakterize edilmiş ve sıkça kullanılan bir stres granül uyarıcısıdır ve bu nedenle klasik olarak pozitif bir kontrol olarak kullanılır. </li></ol></li><li> Ortamları B1 - 4 ve C1 - 4 kuyularından çıkarın ve atın. İlaçları medyaya ekleyin ve 60 dakika bekleyin (Şekil 1A). <ol><li> Kuyu B1 ve B2&#39;ye 100 uM sodyum arsenit ile 500 uL orta madde ekleyin. B3 ve B4 kuyularına 50 uM sodyum arsenit ile 500 uL orta madde ekleyin. </li><li> Kuyu C1 ve C2&#39;ye 150 uM vinorelbinli 500 uL orta madde ekleyin. Kuyu C3 ve C4&#39;e 125 uM vinorelbinli 500 uL orta madde ekleyin. </li></ol></li><li> Fiksasyondan 30 dakika önce kolon 2&#39;deki oyukları 5 μL sikloheksimid (1 mg / mL stok) ve kolon 4&#39;deki oyukları 2 uL puromisin (1.25 mg / mL stok) ile muamele edin. 37 ° C inkübatörde plakayı yerleştirmeden önce karıştırmak için plakayı hafifçe sallayın. </li></ol> 3. Hücre fiksasyonu ve immünofloresans Nt &quot;&gt; NOT: Deneyden önce metanolün -20 ° C&#39;ye soğutulduğundan emin olun Fosfatla tamponlanmış Tuzlu Su (PBS),% 5 Normal At Serumu (NHS) ve% 4 paraformaldehid (PFA ) PBS içinde. <ol><li> Ortamı atın ve lamelleri içeren kuyuları PBS ile yıkayın. Kullanılan ilaçlara bağlı olarak, ilaç içeren medyayı uygun bir şekilde atmak önemli olabilir; Belirli talimatlar için yerel çevre güvenlik ofisine başvurun. Etkin bir şekilde yıkamak için, sıkıştırılmış bir şişeyi PBS ile doldurun, sıkı bir akış olmadan nazik bir akış sağlamak için ucu kesin ve orijinal PBS&#39;yi aspire ettikten sonra her kuyuya PBS eklemek için kullanın. </li><li> Nazik ajitasyon altında oda sıcaklığında 15 dakika boyunca ~ 250 mcL% 4 PFA kullanarak hücreleri düzeltin. PFA ile lamelin üstünü tamamen örtün; 250 μL yeterli olmalı, ancak değilse daha fazla ekleyin. Bazı hücreler (veya hücrelerin stres tedavileri) bağlanmayı değiştirebileceğinden daima lamellerin üzerine doğrudan pipet koymaktan kaçının.Pipetleme gücü hücreleri uzaklaştırır. </li><li> PFA&#39;yı çıkarın ve doğru şekilde atın. Paraformaldehidi uygun bir şekilde nasıl atacağınız hakkında ayrıntılı bilgi için yerel çevre güvenlik ofisine başvurun. </li><li> ~ 250 μL metanol (-20 ° C) ekleyin ve nazik sallanan ortamda oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin; Bu her ikisi hücreleri permeabilize eder ve düzleştirir. </li><li> Metanolü çıkarıp atın ve 4 ° C&#39;de oda sıcaklığında 1 saat boyunca ~ 250 uL% 5 NHS uygulayarak hücreleri bloke edin. Metanolün uygun şekilde atılmasına ilişkin ayrıntılar için yerel çevre güvenlik ofisine başvurun. </li><li> Birincil antikorlar için, antikorları% 5 NHS&#39;de seyreltin. NOT: Gözlemlenen granüllerin iyi SG&#39;ler olup olmadığını teyit etmek için çoklu SG işaretlerinin kullanımı anahtardır. Kullanılabilecek SG işaretlerinin sayısı, mikroskopta bulunan filtrelere bağlıdır. Standart yeşil, kırmızı ve uzak kırmızı filtre setleri mevcutsa, 1/250 seyreltme ile G3BP1, eIF4G ve eIF3b&#39;yi kullanın. <ol><lI&gt; Bu deney için (250 ul&#39;lik lamelleri, her biri toplam: 3 mL,% 5 NHS), aşağıdakilerden her birinden 12 μL ekleyin: anti-G3BP1, anti-eIF3b ve anti-eIF4G. Birincil antikorları, 4 ° C&#39;de oda sıcaklığında veya O / N&#39;de en az 1 saat nazik ajitasyonla kuluçkalayın. </li></ol></li><li> Kuyucukları PBS ile 3 kez yıkayın ve her yıkamayı 5 dakika inkübe edin. </li><li> İkincil antikorlar için, tüm ikincil antikorları (1/250 seyreltme) ve Hoechst boyasını (1/1000 seyreltme)% 5 NHS&#39;de seyreltin. <ol><li> Bu deney için, her birinden 250 μL&#39;de lamelleri toplamı: 3 mL% 5 NHS), aşağıdakilerden her birinden 12 uL ekleyin: Cy2-Fare, Cy3-Tavşan ve Cy5-Keçi (her biri bir 1/250 seyreltme ) Ilave edin ve 3 μL Hoechst boyayı ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca lamelleri ikincil antikorlarla inkübe edin. Bu ve takip eden adımlar sırasında plakayı bir kutu ile örterek veya doku kültürü çanağının üstüne folyo koyarak örnekleri ışığa karşı koruyun. </li></ol></li><li> Biz yıkaHer biri 5 dakika PBS ile üç kez. </li><li> Etiket cam slaytlar üzerine montaj orta kullanarak lamelleri monte edin. Montaj ortamını, 37 ° C&#39;lik bir ısı bloğunda 10 dakika boyunca ısıtın; Bu viskozite azalır ve pipetlenmeyi kolaylaştırır. Kesilmiş bir P200 ucu ile, cam slayt üzerine lamel başına ortalama 25 μL pipetleme; 4-8 lamelleri, mikroskop aşamasının buna izin verdiklerini varsayarak bir cam slaydına sığabilir. İnce forseps kullanarak, lamelini kuyudan slayda aktarın, hücrenin yüzeyi ayağın altına yerleştirdiğinizden emin olun. Temiz bir P200 ucu kullanarak, lamel aşağı doğru bastırın. </li><li> Tüm lamelleri monte edildikten sonra, laboratuar dokusunu slayt üzerine sıkıca basarak aşırı montaj ortamını temizlemek için katlanan laboratuar dokularını kullanın. Fazla montaj ortamını boşaltmak için H 2 O içeren bir sıkıştırma şişesi kullanın ve sonra suyun alınması için katlanmış laboratuvar dokusu ile lekelenmeyi tekrarlayın. </li></ol> 4. Fluorescence In Situ &lt;/ Em&gt; Hibridizasyon (FISH) <ol><li> Bir kılavuz olarak 1 ve 2.1-4 adımlarını kullanarak hücreleri plaklayın ve tedavi edin; Aşağıdaki deneyde sadece 3 lamel batması gerektiği için, hücreleri 1 sütununa yerleştirmeniz yeterlidir. </li><li> Tüm tamponların hazırlandığından emin olun ( yani PBS içinde% 4 PFA, suda% 70 etanol, 2X Tuzlu Sodyum Sitrat (SSC) ve% 5 NHS), metanol -20 ° C&#39;ye soğutulur ve bu da Hibridizasyon fırını uygun sıcaklığa kadar ısıtılır. </li><li> Hücreleri yıkamak ve düzeltmek için 3.1-3.3 adımlarını uygulayın. </li><li> 10 dakika boyunca -20 ° C metanol ekleyerek hücreleri geçirir hale getirin. </li><li> Metanolü çıkarın ve lamelleri% 70 etanol içinde inkübe edin. Plakayı gece boyunca 4 ° C&#39;ye yerleştirin. Buharlaşmayı önlemek için parafilm kullanarak tabakayı mühürleyin. </li><li> Ertesi gün, etanolü çıkarın ve 500 μL 2x SSC ilave ederek hücreleri yeniden su haline getirin. Lamelleri, oda sıcaklığında nazik ajitasyonla 5 dakika inkübe edin. </li><li> 2x SSC&#39;yi çıkarın ve 500&#39;ü ekleyinΜL 2X SSC. Nazik ajitasyonda 5 dakika inkübe edin. </li><li> Hibridizasyon fırınının altına parafilm bir parça koyun. Her lamel için parafilm üzerine hibridizasyon tamponu pipet 25 mcL. (Bu noktada, lamelleri hücre tarafında olan) 24 yuvalı lamel kaldırın ve hibridleştirme tampon üzerinde lamel hücre tarafı aşağı yerleştirin. Bunu 42 ° C&#39;de veya isteğe bağlı olarak 65 ° C&#39;de 15 dakika boyunca yapın. NOT: Bu adımı 65 ° C&#39;de tamamlamak hücresel RNA&#39;ları denatürecektir; PolyA proteinlerle etkileşimler tarafından maskelenirse, bu sinyali artırabilir. </li><li> Hibridizasyon tamponu içinde Biotin-Oligo (dT) probunu (100 ng / μL) 2 ng / ml&#39;lik bir konsantrasyona kadar seyreltin; Lamel başına 25 μL yeterlidir. </li><li> Her lamel için, parafilm üzerine Biotin-Oligo (dT) içeren hibridizasyon tamponu pipetle 25 mcL. Forseps ile lamel Pick up ve yavaşça bir laboratuar dokusu üzerine lamel kenarına dokunmak aşırı kaldırmak içinHibridizasyon tamponu. Lamelini, Biotin-Oligo (dT) ile hibridizasyon tamponuna aktarın; Hücre tarafını aşağıya tutmayı unutmayınız. </li><li> Buharlaşmayı sınırlandırmak için lamelleri bir hibridizasyon kutusuna yerleştirin. Lamelleri Biotin-Oligo (dT) ile melezleme tamponu içinde 42 ° C&#39;de 60 dakika inkübe edin. </li><li> 42 ° C&#39;ye dengelenmesine izin vermek için melezleme fırınına 2x SSC yerleştirin. </li><li> 24-yuva çanağındaki çukurlara ~ 500 uL ısıtılan 2x SSC ilave edin ve lamelleri kuyuya aktarmak için forseps kullanın. 10 dakika inkübe edin. </li><li> Yukarıdaki yıkama adımını 42 ° C&#39;de iki kez ve oda sıcaklığında iki kez tekrarlayın. </li><li> Geleneksel bir antikor yerine Biotin-Oligo (dT) saptamak için bir streptavidin florokrom kullandığınızdan emin olun, 3.5-3.10 adımlarını tamamlayın. </li></ol> 5. Translasyonel Durumu Değerlendirmek için Ribopuromycylation Testi <ol><li> Adım 1&#39;de belirtildiği gibi lamelleri Üzerinde U2OS plakaları plaka, ancak koşul başına sadece bir lamel slayt (buOlgu, 3 lamelleri: tedavi edilmedi, 100 uM sodyum arsenit ve 150 uM vinorelbin) ( Şekil 1A). </li><li> 2. adımda protokolü kullanarak, adım 2.1-2.4&#39;i tamamlayan hücreleri stres haline getirin. </li><li> Fiksasyondan 5 dakika önce, 2 μL puromycin (stok: 1.25 mg / mL, 5 μg / mL&#39;lik bir nihai puromisin konsantrasyonu elde etmek için 500 μL&#39;de 2 μL seyreltin) ve 2.9 μL emetin (stok: 20 μg / mL; 2.9 uL, zaten puromisin içeren aynı çözeltiye) 0.5 mL içeren her kuyuya ilave edildi. </li><li> Puromisin tespit etmek için bir anti-puromisin antikor (1/1000 seyreltme) kullanarak, yukarıda belirtildiği gibi 3.1-3.10 adımlarını tamamlayın. İdeal olarak, kalan kanallarda iki SG işaretçisi kullanın. </li><li> Puromisin sinyalini nicelleştirirken, tüm görüntüleri aynı pozlamayı kullanarak alın. En parlak (çekilmemiş) örneği kullanarak ve doygunluk olmadan mümkün olduğunca parlak bir görüntü alarak bu pozlamayı seçin. NOT: Anti-puromycin floresan sinyalinin yoğunluğuBir amino asit yerine puromisin olduğu için devam eden çeviri, yeni proteine ​​dahil olur ve proteinin erken terminasyonunu zorlar. </li></ol> 6. Görüntü Edinimi ve Analizi <ol><li> Stres Granüllerinin Miktar Tayini <ol><li> SG&#39;leri ölçmek için 40X&#39;lik bir objektif kullanarak örnek başına 100&#39;den fazla hücre toplamı olan 3 - 5 görüntü elde edin. Alternatif olarak, diğer hedefleri kullanarak görüntüler elde edin, ancak&gt; 100 hücre lâtivite için sayılır ve büyütme granülleri net bir şekilde görselleştirmek için yeterince büyük olduğundan emin olun. Bunu lamelini beş kabaca eşit bölgelere bölerek ve her bölgeden rastgele bir alan seçerek yapın ( Şekil 1B ); Işaretçilerin birlikte yerelleştirilmesini değerlendirmek için aynı alanın görüntüleri tüm kanalları içermelidir. </li><li> Tüm görüntüler edinildikten sonra, kanalları birleştirin. Bazı kamera yazılımı bunu otomatik olarak yapar, diğerleri manuel birleştirmeyi gerektirir; Bu ile yapılabilirImageJ tüm görüntüleri açıp ardından [Resim | Renkli | Birleştirme Kanalları]. </li><li> Hoechst&#39;i çekirdek markörü olarak kullanarak, çekirdek sayısını sayarak toplam hücre sayısını elle sayın. Hücre başına ikiden fazla SG içeren hücrelerin sayısını manuel olarak hesaplayın. NOT: Örneğin, G3BP1 (yeşil), eIF4G (kırmızı) ve Hoechst (mavi) görüntüleyen birleştirilen bir üç kanallı görüntü kullanarak mavi kanalı kullanarak çekirdeği (veya hücre sayısını) sayın. Daha sonra, SG pozitif hücreleri hücre başına iki veya daha fazla sarı odak olan hücreler olarak sayın. Granüller, G3BP1&#39;den yeşil olarak, sarı renkte görünür ve eIF4G&#39;den gelen kırmızı, eğer birlikte yerelleştirilmişse sarı görünür. </li><li> 3-5 bağımsız bölgeden gelen verileri birleştirerek SG pozitif olan hücrelerin yüzdesini belirleyin ve hesaplayın: SG pozitif / çekirdek sayısı) * 100 = SG-pozitif hücrelerin yüzdesi </li></ol></li><li> Hat Yerinde Tarama Analiziyle Kolokalizasyonu Değerlendirme - Manuel Yöntem <ol><li> AçıkImageJ. () Adresinden ücretsiz indirebilirsiniz </li><li> ROI yöneticisini açın: [Analiz et | Araçlar | ROI yöneticisi ...]. </li><li> Birleştirilmiş görüntüyü ImageJ&#39;de açın: [File | Açık]. </li><li> ImageJ araç çubuğunda bulunan çizgi aracını kullanarak, SG&#39;den önce ve sonra eklediğinizden emin olarak bir SG&#39;den geçen bir satır ekleyin. ROI yöneticisi penceresinde [Ekle] öğesini tıklatarak bu satırı ROI yöneticisine ekleyin. </li><li> Her işaretçinin granüle lokalizasyonu değerlendirmek için birleştirilmiş görüntüyü ayrı kanallara bölün. [Image | Renkli | Bölünmüş Kanal]; Bu, birleştirilen görüntüyü üç siyah-beyaz görüntü haline bölecektir. </li><li> Siyah-beyaz görüntüde satırın seçili olduğundan emin olun; Çizgi resimde göründüğü takdirde seçilir. Değilse, ROI yöneticisi penceresinde paneldeki çizgiyi tıklayın; ROI yöneticisi penceresinde çizgi mavi renkte vurgulanır ve çizgiyi siyah-beyaz görüntüde görünür hale getirecektir. Hat hala görünmüyorsa, &quot;show all&quot; seçeneğinin ch olduğundan emin olunROI yöneticisinde ecked ve ardından resimdeki satırı tıklayın. </li><li> Satırın yoğunluğunu analiz edin: [Analiz et | Arsa Profili]; Bu, hat boyunca sinyalin yoğunluğunu gösteren &quot;Plot Profile&quot; penceresini ortaya çıkaracaktır. </li><li> &quot;Plot Profile&quot; penceresinde, [Listele] &#39;ye tıklayın; bu, grafikten ham verileri içeren bir pencere açar. Bu penceredeki tüm verileri kopyalayın ve bir elektronik tablo dosyasına yapıştırın. Bunu yapmak için, penceredeki tüm verileri seçin: [Düzenle | Hepsini seç]. Tarihi kopyalayın: [Düzenle | Kopya]. Bir elektronik tablo dosyasını açın ve verileri yapıştırın: [Düzenle | Yapıştırmak]. </li><li> Her bir kanal için 6.2.6 - 6.2.8 adımlarını tamamlayın. Değerlendirilen kanalı takip ettiğinizden emin olun. </li><li> Bir elektronik tabloda, sonuçların bir çizgi grafiği oluşturun. [Control] &#39;e basarak ve her sütunun üstündeki harfi tıklatarak veri içeren sütunları seçin. Ardından, çizgi grafiğini seçin: [Insert | Çizgi grafiği]. </li><li> Bu analizi mult için tekrarlayınÇoklu bağımsız deneyler boyunca granülleri zorlayın. </li></ol></li><li> Hat Tarama Analizi ile Kolokalizasyonu Değerlendirme - ImageJ Plugin <ol><li> RGB profil aracını ImageJ web sitesinden indirin ve yükleyin (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); Doğru takıldığında, kırmızı, yeşil ve mavi (RGB) çizgili simgeler araç çubuğunda görünmelidir. </li><li> ImageJ&#39;de görüntüyü ( örn. Tiff, JPG) açın: [File | Açık]. </li><li> ImageJ araç çubuğunda bulunan RGB simgesini tıklayın. </li><li> Bir SG aracılığıyla uzanan ve bitişik bölgeleri dahil etmeyi seçerek bir çizgi eklemek için tıklayın ve sürükleyin; Histogramın bir resmi bir pop-up pencerede görünür. </li><li> Verileri bir resim olarak kaydedin: [File | Farklı Kaydet | TIFF]. Alternatif olarak, verileri yukarıdaki 6.2.8 adımıyla başka bir grafik programında dışa aktarın ve grafiklerden çizin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Yamasaki, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+mRNA+translation+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reprogramming mRNA translation during stress.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).</li>
<li>Buchan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNP+granules%3A+Assembly%2C+function%2C+and+connections+with+disease%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease.</a> RNA Biol. 11 (8), (2014).</li>
<li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+ternary+complex+%28eIF2-GTP-tRNA%28i%29%28Met%29%29-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li>
<li>Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules+and+cell+signaling%3A+more+than+just+a+passing+phase%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase?</a> Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).</li>
<li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+shuttling+of+TIA-1+accompanies+the+recruitment+of+mRNA+to+mammalian+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 151 (6), 1257-1268 (2000).</li>
<li>Bley, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules+are+dispensable+for+mRNA+stabilization+during+cellular+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 43 (4), e26(2015).</li>
<li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G3BP-Caprin1-USP10+complexes+mediate+stress+granule+condensation+and+associate+with+40S+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits.</a> J Cell Biol. 212 (7), 845-860 (2016).</li>
<li>Panas, M. D., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+mammalian+stress+granule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into mammalian stress granule dynamics.</a> J Cell Biol. 215 (3), 313-323 (2016).</li>
<li>Anderson, P., Kedersha, N., Ivanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules%2C+P-bodies+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Stress granules, P-bodies and cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1849 (7), 861-870 (2015).</li>
<li>Aulas, A., Van de Velde,, C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+stress+granule+dynamics+driven+by+TDP-43+and+FUS%3A+a+link+to+pathological+inclusions+in+ALS%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS?</a> Front Cell Neurosci. 9, 423(2015).</li>
<li>Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+regulatory+networks+in+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional regulatory networks in immunity.</a> Immunol Rev. 253 (1), 253-272 (2013).</li>
<li>Wolozin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+protein+aggregation+run+amuck%3A+stress+granules+and+the+genesis+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Discov+Med%22%5BJournal%5D)">Physiological protein aggregation run amuck: stress granules and the genesis of neurodegenerative disease.</a> Discov Med. 17 (91), 47-52 (2014).</li>
<li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+stress+granules+and+P-bodies+during+RNA+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Regulation of stress granules and P-bodies during RNA virus infection.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (3), 317-331 (2013).</li>
<li>Somasekharan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YB-1+regulates+stress+granule+formation+and+tumor+progression+by+translationally+activating+G3BP1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1.</a> J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).</li>
<li>Adjibade, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorafenib%2C+a+multikinase+inhibitor%2C+induces+formation+of+stress+granules+in+hepatocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells.</a> Oncotarget. , (2015).</li>
<li>Fournier, M. J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell Int. 10, 12(2010).</li>
<li>Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J., Gallouzi, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+ubiquitin-proteasome+system+induces+stress+granule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the ubiquitin-proteasome system induces stress granule formation.</a> Mol Biol Cell. 18 (7), 2603-2618 (2007).</li>
<li>Moeller, B. J., Cao, Y., Li, C. Y., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+activates+HIF-1+to+regulate+vascular+radiosensitivity+in+tumors%3A+role+of+reoxygenation%2C+free+radicals%2C+and+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules.</a> Cancer Cell. 5 (5), 429-441 (2004).</li>
<li>Szaflarski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vinca+alkaloid+drugs+promote+stress-induced+translational+repression+and+stress+granule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation.</a> Oncotarget. 7 (21), 30307-30322 (2016).</li>
<li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li>
<li>Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+TIA-1+and+TIAR+link+the+phosphorylation+of+eIF-2+alpha+to+the+assembly+of+mammalian+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 147 (7), 1431-1442 (1999).</li>
<li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+stress+granules+and+processing+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).</li>
<li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).</li>
<li>Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+method+for+mapping+genes+on+Drosophila+polytene+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (14), 4381-4385 (1982).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> J Cell Biol. 197 (1), 45-57 (2012).</li>
<li>Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+characterization+of+stress+granules+in+virus+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells.</a> Methods. 90, 57-64 (2015).</li>
<li>David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emetine+optimally+facilitates+nascent+chain+puromycylation+and+potentiates+the+ribopuromycylation+method+%28RPM%29+applied+to+inert+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells.</a> Histochem Cell Biol. 139 (3), 501-504 (2013).</li>
<li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+visualization+and+dynamics+of+newly+synthesized+proteins+in+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons.</a> Nat Neurosci. 13 (7), 897-905 (2010).</li>
<li>Ruggieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+oscillation+of+translation+and+stress+granule+formation+mark+the+cellular+response+to+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 71-85 (2012).</li>
<li>Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules+contribute+to+alpha-globin+homeostasis+in+differentiating+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 420 (4), 768-774 (2012).</li>
<li>Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+RNAi+screen+links+O-GlcNAc+modification+of+ribosomal+proteins+to+stress+granule+and+processing+body+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly.</a> Nat Cell Biol. 10 (10), 1224-1231 (2008).</li>
<li>Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+pathways+regulated+by+arsenate+and+arsenite%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite.</a> Oncogene. 18 (54), 7794-7802 (1999).</li>
<li>Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenic+binding+to+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Arsenic binding to proteins.</a> Chem Rev. 113 (10), 7769-7792 (2013).</li>
<li>McDonald, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAR+DNA-binding+protein+43+%28TDP-43%29+regulates+stress+granule+dynamics+via+differential+regulation+of+G3BP+and+TIA-1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1.</a> Hum Mol Genet. 20 (7), 1400-1410 (2011).</li>
<li>Aulas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G3BP1+promotes+stress-induced+RNA+granule+interactions+to+preserve+polyadenylated+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA.</a> J Cell Biol. 209 (1), 73-84 (2015).</li>
<li>Martin, S., Tazi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+G3BP+stress+granules+dynamics+in+live+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li>
<li>Wippich, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+specificity+kinase+DYRK3+couples+stress+granule+condensation%2Fdissolution+to+mTORC1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling.</a> Cell. 152 (4), 791-805 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Birden fazla hastalıkta immünhistolojik çalışmalarla kanıtlandığı üzere, kronik stres, farklı hücre içi odakların oluşumuna yol açar. Örneğin, çoğu nörodejeneratif hastalıklar, çözünmeyen proteinlerin hücre içi agregaları ile karakterizedir. Bu agregalarda SG ile ilişkili proteinlerin bulunması, bu tür odakların SG&#39;ler olduğu sonucuna varmak için temel oluşturur. Yeni stres uyarıları ile tedavi edilen hücrelerde SG belirteç pozitif sitoplazmik odağı gözlendiğinde de benzer ...

Hücreler, strese tepki vermek için birçok mekanizma kullanmaktadır. Bazı tepkiler, transkripsiyon sonrası seviyede gerçekleşir ve mRNA translasyonunu ve / veya stabilitesini düzenleyen 1 , 2&#39;yi içerir . Stres modüle mRNA translasyonel durma ve bozulma, en sık karakterize Stress Granules (SGs) 3 , özel nonmembranöz hücresel odakların oluşumu ile ilişkilidir. SG&#39;ler, strese tepki veren translasyonel olarak tutuklanmış hücrelere ( örneğin, oksidasyon, ısı şoku, besin açlığı ve viral enfeksiyon) translasyon yapmayan mRNA&#39;ları konsantre eden sitoplazmik odaklardır 4 . Sıralanmamış mRNA&#39;lara ek olarak, SG&#39;ler translasyon başlatma faktörleri, RNA-bağlayıcı proteinler ve çeşitli sinyal proteinleri içerir 5 . SG&#39;ler, inhibe edilmiş protein translasyonu ve değiştirilmiş RNA metabolizmasının biyolojik belirteçleridir ve hücre sağkalımı ve apoptoz, sinyal yolağı ile ilişkilendirilmiştirS ve nükleer süreçler 5 . SG&#39;ler dinamik varlıklardır ve oluşumu hücresel çeviri durumu ile sıkı sıkıya bağlıdır 6 . Görünüşte sağlam görünmelerine rağmen, çoğu SG proteini bileşeni saniyede bir kalış süresi ile hızlı bir şekilde içeri ve dışarı götürülür. SG&#39;ler dakikalar ila saatler sürmesine rağmen, bileşenlerinin çoğu hızlı akış halindedir. Çeviri başlangıcının engellenmesi ve bunun sonucunda translasyon polisomlarının çözülmesi SG&#39;lerin oluşumunu teşvik eder; Dolayısıyla, SG&#39;ler polisomları tercüme etmekle dengelidir. Bu polisome / SG dengesi, iyi niyetli SG&#39;leri diğer stres kaynaklı odaklardan ayıran anahtartır 6 , 7 . Çevirinin başlatılmasının durdurulması, mRNA, çeviri başlatma faktörleri (eIF) ve 40S ribozomal altbirimleri (ler) i içeren, çeviri-yetkili ön başlatma komplekslerinin dönüşümünü gerektirir<html> O-ismi 48S kompleksleri), SG&#39;ler 4 , 6&#39;ya kaynaşabilen translasyonel olarak durmuş komplekslere (48S * kompleksleri) dönüştürür. SG&#39;ler, 48S kompleks oluşumunun akış aşağısındaki iki farklı adımda translasyonel durma ile desteklenir: kapak bağlayıcı eIF4F kompleksinin işlevleriyle ( örneğin eIF4A altbirimini hedef alan) müdahale veya translasyon başlatma faktörü eIF2&#39;nin α altbiriminin fosforilasyonu, bunların biri tarafından aracılık edilir Veya dört eIF2 kinazın daha fazlasını içerir. Stabil 48S komplekslerinin ( yani, 40S ribozomal altbirimler ve seçilen translasyon başlatma faktörleri) varlığı SG 8 , 9&#39;un bir işaretidir. SG&#39;ler viral enfeksiyonlar, nörodejenerasyon, otoimmünite ve kanser gibi çeşitli patolojik durumlarla bağlantılı olmuştur 3 , 10 , 11 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 12 , 13 . Birkaç SG bileşeninin mutasyona uğramış formları , nöronların nöronal ölümde etkin rol oynayabilen hücre içi patolojik kapanımları sergilediği nörodejeneratif hastalıklarla ( örn. Amiyotropik lateral skleroz) ilişkilidir 13 . Bazı virüsler, SG oluşumunu engellemek ve viral replikasyonu artırmak için SG bileşenlerini kaçırır 14 . Son çalışmalar aynı zamanda SG&#39;leri kansere 15 ve kanserli hücre sağkalımına kemo- ve radyoterapi tedavileri 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 bağlar. Bu bulgular SG biyolojisine büyük ilgiyi uyandırırken, yayınlanan raporların birçoğu, iyi niyetli SG&#39;lerin oluşumunu diğer stres kaynaklı odaklardan ayırmak için önemli kontrollerden yoksundur. SG&#39;ler başlangıçta, T-hücresi ntra-hücresel antijen 1 (TIA-1) ve Poli-A-bağlayıcı Protein (PABP) de dahil olmak üzere seçilen mRNA-bağlayıcı Proteinler (RBP&#39;ler) oluşan doku dışı sitoplazmik odak olarak tanımlandı; Çeviri başlatma faktörleri; Poliadenile mRNA; Ve küçük ribozomal altbirimler 4 , 6 , 21 , 22 . Geleneksel olarak, bileşimleri immün boyama ve floresan etiketli proteinlerin ektopik ekspresyonu 23 , 24 gibi tekniklerle belirlenmiştir. Son derece dinamik doğalarından dolayı, SG proteinleri ve / veya mRNA&#39;ların immüno-yerelleştirilmesi , SG&#39;leri 23 , 24 tespit etmek için tanımlayıcı metodoloji olmaya devam etmektedir. Bugüne kadar, birçok RBP ve diğer proteinler (120&#39;den fazla farklı protein) SG bileşenleri 11 olarak tanımlanmaktadır. Birçok SG lokalize proteinler, hem strese bağlı hem de bağımsız bir şekilde lokalizasyonlarını değiştirir ve diğer hücre içi bölmelerde ve odaklarda birikebilir, doğru SG belirteçlerini seçmek ve SG&#39;leri diğer stres kaynaklı streslerden ayırmak için işlevsel kriterleri kullanmak önemlidir odak. İyi niyetli SG&#39;ler mRNA, çeviri başlatma faktörleri ve küçük ribozomal altbirimleri içerir ve translasyonla dinamik denge içindedir. Bu basit iş akışı, stres kaynaklı odakların iyi niyetli SG&#39;ler olup olmadığını belirlemek için tasarlanmıştır. Bu iş akışı, SG&#39;leri incelemek için yaygın olarak kullanılan hücreler olan U2OS hücrelerini kullanan birkaç deneysel yaklaşımı içerir. Bu hücreler, büyük bir sitoplazmaya sahip oldukları için nispeten düz oldukları için idealdirler ve cam lamellerine kuvvetle bağlanırlar. SG&#39;leri incelemek için başka hücre türleri de kullanılabilir, ancak zamanlama, ilaç konsantrasyonu ve SG-çekirdeklenme proteinlerinin bolluğu arasındaki farklılıkların kinetiği ve bileşimi değiştirebileceğinin farkında olmak önemlidirsition. Ek olarak, bazı hücreler, bazı SG markerlerinin noktasal lokalizasyonuna neden olan kabarık bir görünüm veren hücre yüzeyindeki blebleri oluşturarak paraformaldehit fiksasyonuna tepki verir; Dikkatli bir analiz yapılmaksızın bunlar SG olarak yanlış sınıflandırılabilir. Bu, stres kaynaklı odakların iyi niyetli SG&#39;ler olarak tanımlanması için gerekli tüm ölçütlerin değerlendirilmesinin gerekliliğini vurgulamaktadır. SG 20&#39;yi teşvik eden bir kanser terapisi olan Vinorelbin (VRB) ve sağlam ve iyi karakterize edilmiş bir SG indüktörü olan Sodyum Arsenit (SA) bu protokoldeki deneyler için stres olarak kullanılır. Kanonik SG&#39;ler, sitoplazmik odaklarda kolokalize olan çoklu SG işaretçileri (hem proteinler hem de mRNA&#39;lar) içerir. Bu protokol sırasıyla protein markerlerinin ve poliadenile mRNA 22&#39;nin lokalizasyonunu saptamak için hem immünofloresans hem de floresan yerinde hibridizasyon (FISH) kullanır. Kısaca, dolaylı immünofloresan antikorları ( yani,e. Birincil antikorlar) belirli bir proteine ​​özeldir. Daha sonra, florokromlara bağlanan ikincil antikorlar (genellikle türe özgü) birincil antikoru tanır ve hedef protein lokalizasyonunu ortaya çıkarır. Floresan mikroskopi, hücre içindeki lokalize sinyali saptamak için kullanılır. Farklı türlerde üretilen antikorların kullanılması ve bunları farklı renkte sekonder antikorlar ile bulgulanması, çoklu antikorların kolokalizasyo- nunu saptamayı sağlar ve protein hedeflerinin aynı yerde bulunduğu- nu gösterir 23 . İyi niyetli SG&#39;lerde yerelleştirilmek üzere doğrulanmış belirteçleri seçmek önemlidir. BALIK, belirli bir RNA veya DNA sekansı 25 ile baz çiftleşen etiketli bir prob kullanır. MRNA&#39;yı tespit etmek için, bu protokol, mRNA&#39;nın poliA kuyruğuna melezleşen (veya baz çiftleri) biyotinlenmiş bir oligo (dT) 40 probu kullanır ( yani, poliA FISH). Streptavidin, biyotin için yüksek bir afiniteye sahip olduğu için, biyotinlenmiş prob, flüoresanla konjüge edilmiş streptavidin kullanılarak tespit edilir. SG&#39;leri değerlendirirken, iyi niyetli SG&#39;lerde olduğu gibi poliA FISH ile bir immünofloresansın bir SG işaretleyicisi tespit etmesi önemlidir, iki sinyal de aynı yerde bulunur. Bu protokolü kullanarak, kolokalizasyonu birden fazla yolla değerlendirilir. Çok kanallı ( yani RGB: kırmızı, yeşil ve mavi) görüntüde, kolokalizasyon, örtüşen sinyalin rengini değiştirecektir ( örn., Birleştirilmiş kırmızı ve yeşil sarı görünür) 23 . Ek olarak, kolokalizasyon, çizgi tarama analizi kullanılarak grafiksel olarak nicelenir ve burada her bir renk yoğunluğu verilen bir çizgi 8 , 20&#39;de ölçülür. Bu protokol, ImageJ 26 kullanan iki satır tarama analiz yöntemlerini tanımlamaktadır. Bir prosedür elle yapılmış ve tüm süreç boyunca devam etmektedir.Le, diğeri makroyu veya manuel adımları otomatikleştiren basit bir programı kullanır. Makro prosedürü anlamak için manuel programı incelemek önemlidir. SG&#39;ler, translasyonun bastırıldığı hücrelerde oluşur; Bu nedenle, SG&#39;li hücreler, tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla azalmış küresel translasyon seviyeleri göstermelidir. Deneysel olarak ribopuromisilasyon kullanılır. Puromisin, fiksasyondan önce kısa bir süre boyunca hücrelere eklenir ve puromisin aktif olarak şekillenen polipeptidlere dahil olur ve böylece sonlanma 27 , 28 olur . Yeniden başlatmayı önlemek için emetine uygulanması gerekir 29 . Puromisin daha sonra anti-puromisin antikoru kullanılarak tespit edilebilmekte ve aktif translasyonun anlık görüntüsü verilmektedir. Bu yöntem hızlı olduğu için, belirli bir amino asitten yoksun (ve potansiyel olarak hücreleri ön gerilimine sokan) bir besiyeri ile öncesi aç bırakmayı gerektirmeyen veProtein translasyonunun subselüler lokalizasyonu. SG&#39;leri içeren hücrelerin komşu hücrelere 31 kıyasla çok daha düşük translasyon sergilediğini göstermek için &quot;tıklama-it&quot; kimyası 30 ile birleştirilmiş metionin analog L-azidohomoalain (AHA) gibi tadil edilmiş amino asit analoglarını kullanan diğer yöntemler kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu teknik metionin açlığın- dan sonra 15-30 dakika süreyle nabız etiketlemesi gerektirir. Metilin açlığı ilave bir stres oluştururken, uzun etiketleme zamanı ( yani 15-30 dakika), devam etmekte olan tercümenin kümülatif olarak ölçülmesine ve aynı zamanda yeni sentezlenmiş proteinlerin sentez alanlarından son hedeflerine hücre. Buna karşılık, ribopuromisilasyon çok daha hızlıdır ve glikoz açlığı ile SG&#39;leri indüklemek için kullanılan glikozsuz ortam gibi herhangi bir ortamla uyumludur. Kanonik SG&#39;ler dinamik dengedeAktif olarak polisomları çevirirken. Bu deneysel olarak polisomları stabilize eden veya bozucu ilaçlarla örneklerle tedavi ederek değerlendirilebilir, böylece SG&#39;ler ile polisomlar arasındaki dengeyi de yükseltir 23 . Sikloheksimid (veya benzer şekilde davranan emetin) ribozomları mRNA üzerine &quot;dondurarak&quot; uzamayı engeller, böylece SG&#39;leri oluşturabilen mevcut polisomal olmayan mRNP&#39;lerin havuzunu düşürür. Deneysel olarak, bu iki şekilde kullanılabilir: SG oluşumunu önlemek için stres öncesi sikloheksimid (veya emetin) ekleyerek veya SG&#39;ler oluştuktan sonra sikloheksimit (veya emetin) ekleyerek, gerilme maddesini çıkarmadan, SG&#39;nin bozulmasına neden olan durmuş gibi Preinitiasyon kompleksleri yavaş yavaş polisom fraksiyonuna kabul edilir. Buna karşılık, puromisin, prematüre terminasyona neden olur ve polisome ayrışmasını teşvik eder ve SG&#39;lere montaj yapabilen başlatıcı mRNA&#39;ların havuzunu arttırır. Deneysel olarak, puromisin tedavisi, SG sayısını arttırır veya thresholü düşürürD olarak derecelendirilmiş stres veya ilaç dozajına tepki olarak form verdiklerini göstermektedir. Puromisin&#39;in etkisini değerlendirirken, puromisin&#39;in ilacın etkisini arttırması ve SG&#39;leri gösteren hücrelerin yüzdesini arttırması beklendiğinden ilâçın maksimal bir alt seviyesinin kullanılması önemlidir; ilaç görülmezse bu gerçekleşemez / Stres başlangıçta hücrelerin% 100&#39;ünde SG oluşturur. Bu, SG&#39;leri parçalara ayıran ve hücrelerin ~% 95&#39;inde başlangıçta SG&#39;leri görüntülediğinde, mümkün olan en büyük düşüşün gözlenebileceği ve doğru şekilde nicelleştirilebileceği siklooksit tedavisi ile çelişir. Bu protokol memelilerdeki SG&#39;leri incelemek için bir çerçeve sağlar. Yöntemler şunları içerir: (1) varsayılan SG&#39;lerdeki klasik SG ile ilişkili belirteçler eIF4G, eIF3b ve Ras GTPaz aktive edici protein bağlama proteini 1 (G3BP1) arasındaki kolokalizasyonu değerlendirmek için immünofloresan boyama ve ImageJ analizi; (2) oligo (dT) floresan in situ hibridizasyon (polyA FISH) poliadenile mRNA tespit etmek için; (3) stres kaynaklı odakların polisomlarla dinamik denge içerisinde olup olmadığını belirlemek için sikloheksid ve puromisin tedavisi; Ve (4) varsayılan SG&#39;leri içeren hücrelerin translasyonel durumunu değerlendirmek için ribopuromisilasyon. Birlikte, bu tahliller, stres kaynaklı odakların iyi niyetli SG&#39;ler olarak sınıflandırılabileceğini belirleyebilir.

<table><tbody><tr><td>U-2 OS</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;reg;HTB-96&amp;trade;</td><td>Commonly written &quot;U2OS&quot;&lt;br/&gt; Culture at 37 &amp;deg;C under 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; in 10% FBS/DMEM</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>Contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red&lt;br/&gt; Supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin&lt;br/&gt; Prewarm prior drug(s) dilution</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442-500ml</td><td>Used to supplement media</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td>Used to supplement media</td></tr><tr><td>penicilline streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ml</td><td>Used to supplement media</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>lab tissues (kimwipes)</td><td>KIMTECH SCIENCE</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Coverglass for Growth Cover Glasses</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>Autoclaved before use&lt;br/&gt; Keep sterile in the tissue culture hood</td></tr><tr><td>Sodium (meta)arsenite &amp;ge;90% (SA)</td><td>Sigma</td><td>S7400-100G</td><td>Dissolve in water to 1 M concentration, then dilute to 100 &amp;micro;M as a working stock</td></tr><tr><td>Vinorelbine (VRB)</td><td>TSZ CHEM</td><td>RS055</td><td>Dissolve in water to 10 mM</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma</td><td>P9620</td><td>Used to assess translation level (ribopuromycylation)&lt;br/&gt; -Used to assess SG connection with active translation&lt;br/&gt; Dilute in water to 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Emetine dihydrochloride hydrate</td><td>Sigma</td><td>E2375</td><td>Used in combination with puromycin to assess general translation level&lt;br/&gt; Used to assess SG connection with active translation&lt;br/&gt; -Dilute in water to 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Cycloheximide (CHX)</td><td>Sigma</td><td>C4859</td><td>Used to assess SG connection with active translation&lt;br/&gt; Dilute in water to 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Lonza / VWR</td><td>95042-486</td><td>Wash buffer for immunofluorescence</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved&lt;br/&gt; Aliquots can be stored at -20 &amp;deg;C for several months&lt;br/&gt; Hazardous, use ventilation&lt;br/&gt; Discard in special waste</td></tr><tr><td>Methanol, ACS</td><td>BDH / VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td>Prechill to -20 &amp;deg;C before use&lt;br/&gt; Discard in special waste</td></tr><tr><td>Normal Horse Serum (NHS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31874</td><td>Dilute to 5% in PBS&lt;br/&gt; Add sodium azide for storage at 4 &amp;deg;C&lt;br/&gt; Blocking solution for immunofluorescence</td></tr><tr><td>Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC</td><td>Decon Labs / VWR</td><td>89125-188</td><td>Dilute to 70% with water</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-81940</td><td>Store at 4 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/100 dilution</td></tr><tr><td>rabbit anti eIF4G antibody (H-300)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-11373</td><td>Store at 4 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/250 dilution</td></tr><tr><td>goat anti eIF3&amp;eta; (N-20) antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-16377</td><td>eIF3&amp;eta; is also known as eIF3b&lt;br/&gt; Store at 4 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/250 dilution</td></tr><tr><td>mouse anti puromycin 12D10 antibody</td><td>Millipore</td><td>MABE343</td><td>Store at 4 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/1,000 dilution</td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-225-150</td><td>Reconstitute in water per manufacturer&amp;rsquo;s instructions then store at 4 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/250 dilution</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-165-152</td><td>Reconstitute in water as per manufacturer&amp;rsquo;s instructions then store at 4&amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/2,500 dilution</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>705-175-147</td><td>Reconstitute in water as per manufacturer&amp;rsquo;s instructions then store at 4&amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/250 dilution</td></tr><tr><td>Hoechst 33258 solution</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>Incubate with secondary antibodies&lt;br/&gt; Stock solution 0.5 mg/mL in dH&lt;sub&gt;2&lt;sub&gt;0, protect from light&lt;br/&gt; -Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Cy3 Streptavidin</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>016-160-084</td><td>Reconstitute in water per manufacturer&amp;rsquo;s instructions, then store at 4 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 1/250 dilution</td></tr><tr><td>oligo-(dT)&lt;sub&gt;40x&lt;/sub&gt; probe biotinilated</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>/</td><td>Reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20 &amp;deg;C&lt;br/&gt; Dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use&lt;br/&gt; Custom order</td></tr><tr><td>hybridation box</td><td>/</td><td>/</td><td>Make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom&lt;br/&gt; - prewarm the box prior use</td></tr><tr><td>20x SSC buffer</td><td>Thermo fisher Ambion</td><td>AM9763</td><td>Dilute to 2x SSC using RNase Free water (DEPC treated)&lt;br/&gt; Store at RT&lt;br/&gt; Wash buffer for FISH</td></tr><tr><td>PerfectHybPlus Hybridization Buffer</td><td>Sigma</td><td>H7033-50ml</td><td>Block and probe incubation buffer for FISH</td></tr><tr><td>slide mounting media</td><td>home made</td><td>/</td><td>Mix 5 g of &amp;ldquo;cold-soluble&amp;rdquo; poly(vinyl alcohol) in 20 mL of PBS&lt;br/&gt; Mix by sonication, followed by stirring O/N at RT&lt;br/&gt; Add 5 mL of glycerol and 0.2 mL of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT&lt;br/&gt; Centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet&lt;br/&gt; Aliquot viscous liquid, long-term storage at -20 &amp;deg;C, 1 week at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Parafilm &quot;M&quot;</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Poly(vinyl alcohol)</td><td>Sigma</td><td>P-8136-250G</td><td>Reagent to make vinol</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516-100ML</td><td>Reagent to make vinol</td></tr><tr><td>sodium azide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2002-5G</td><td>Preservative agent for blocking solution and vinol&lt;br/&gt; Make a 20% dilution in water</td></tr></tbody></table>

methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules

Hücrelere genellikle ani çevresel değişikliklerle meydan okunur. Stres koşullarına maruz kalan hücrelerde oluşan stres granülleri (SG), hücre içi metabolizma ve sağkalımın çeşitli yönleriyle ilişkilendirilir. SG&#39;ler, hücresel sinyal yollarını, transkripsiyon sonrası gen ifadesini ve stres tepki programlarını modüle eder. Bu mRNA içeren granüllerin oluşumu doğrudan hücresel translasyona bağlıdır. SG birleşimi, inhibe edilen translasyon başlatma tarafından tetiklenir ve SG ayrılması, translasyon aktivasyonu veya inhibe edilmiş translasyon uzamayla desteklenir. Bu ilişki SG kompozisyonu ile daha da vurgulanır. Çekirdek SG bileşenleri, başlatma öncesi kompleksler, mRNA ve seçilen RNA bağlayıcı Proteinler (RBP&#39;ler) durdu. SG montajının amacı, translasyonel olarak duran oda temizleme mRNA&#39;larını saptayarak hücresel enerjiyi muhafaza etmek ve strese duyarlı proteinlerin geliştirilmiş translasyonuna izin vermektir. Additi&#39;deDurgun çeviri preinitiation kompleksleri gibi temel bileşenlere, SG&#39;ler diğer proteinlerin ve sinyal moleküllerinin bolluğunu içerir. SG oluşumundaki bozukluklar hücresel stres uyarlamasını bozabilir ve böylece hücre ölümünü hızlandırabilir. SG&#39;ler ve benzeri RNA içeren granüller nörodejeneratif bozukluklar ve kanser dahil bir dizi insan hastalığına bağlıdır ve son zamanlarda RNA granül alt tiplerinin sınıflandırılmasına ve tanımlanmasına ilgi uyandırmaktadır. Bu protokol, memeli SG&#39;leri karakterize etmek ve ölçmek için yapılan tahlilleri açıklamaktadır.

Stres kaynaklı odaklanma alanları mutlaka SG değildir. SG&#39;ler, mRNA&#39;lar, translasyon başlatma faktörleri ve RNA-bağlayıcı proteinleri içeren sitoplazmik odaklar olarak sınıflandırılır ve aktif translasyon ile denge halindedir. Yukarıdaki protokol, belirli bir stresin iyi niyetli SG&#39;ler oluşturup oluşturmadığını karakterize etmek için bir kalıp olarak kullanılabilir. SG&#39;ler, hem ...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules at JoVE.com

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Stres Granülleri (SG), çeşitli streslere maruz kalan hücrelerde oluşan doku dışı yapısal sitoplazmik yapılardır. SG&#39;ler mRNA&#39;lar, RNA-bağlayıcı proteinler, küçük ribozomal altbirimler, translasyona bağlı faktörler ve çeşitli hücre sinyal proteinlerini içerir. Bu protokol, iyi niyetli SG&#39;leri tespit etmek, karakterize etmek ve ölçmek için çeşitli deneysel yaklaşımlar kullanan bir iş akışını tanımlamaktadır.

Sitoplazmik Odakları Memeli Stres Granülleri Olarak Sınıflandırma Yöntemleri

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

methods-to-classify-cytoplasmic-foci-as-mammalian-stress-granules

Research

JoVE Journal

Biology

14.5K Görüntüleme.  Brigham and Women's Hospital.  Stres Granülleri (SG), çeşitli streslere maruz kalan hücrelerde oluşan doku dışı yapısal sitoplazmik yapılardır. SG'ler mRNA'lar, RNA-bağlayıcı proteinler, küçük ribozomal altbirimler, translasyona bağlı faktörler ve çeşitli hücre sinyal proteinlerini içerir. Bu protokol, iyi niyetli SG'leri tespit etmek, karakterize etmek ve ölçmek için çeşitli deneysel yaklaşımlar kullanan bir iş akışını tanımlamaktadır. 

Video: Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Memeli Hücreleri Trypsinizing ve alt kültüre

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Biyoloji

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Doku Örnekleri γH2AX Foci kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

Memeli Hücrelerinin Bakteri Mücadelesinden Sonra Stres Granül Oluşumunun İmmünofloresan Analizi

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Sitokrom Sitoplazmik Mikroenjeksiyon Apoptoz aktivasyonu C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Alt Yapı Analizörü: Floresan Mikroskopi Görüntülerinde HücreCisimlerinin Hızlı Araştırılması ve Doğru Analizi için Kullanıcı Dostu İş Akışı

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Biyomühendislik

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Tek hücreli Yara Şifa sırasında Sitoplazmik Akışı görselleştirme<em&gt; Stentor coeruleus</em

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

Polizom profilleme Stres Durumlardaki Çeviri başlatılması Analizi

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

Canlı İlköğretim Hücrelerde G3BP Stres Granül Dinamiği Görselleştirme

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

An Immunofluorescence Assay to Characterize and Quantify Mammalian Stress Granules

Source: Aulas, A. et al., <a href="https://app.jove.com/v/55656">Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates an assay for characterizing and quantifying mammalian stress granules, which consist of mRNAs, RNA-binding proteins (RBPs), and various other proteins.

Memeli Stres Granüllerini Karakterize Etmek ve Ölçmek için Bir İmmünofloresan Testi

1. Cell Preparation

	Add autoclaved coverslips to 12 wells of a 24-well plate, as indicated in&#160;Figure 1A; this can be done using a sterile Pasteur ...

Sitoplazmik Odakları Memeli Stres Granülleri Olarak Sınıflandırma Yöntemleri

Özet

Daha Fazla Video Keşfet