Wir danken den Mitgliedern der Iwanow- und Anderson-Labore für ihre hilfreiche Diskussion und Feedback zu diesem Manuskript. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health [GM111700 und CA168872 bis PA, NS094918 bis PI], dem National Science Center in Polen [gewährt UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 an WS] unterstützt. WS erkennt auch das Ministerium für Wissenschaft und Hochschulbildung in Polen (Mobility Plus-Programm) und die polnisch-amerikanische Fulbright-Kommission für ihre finanzielle Unterstützung seiner Forschung in den USA an.

1. Zellvorbereitung <ol><li> Fügen Sie autoklavierte Deckgläser zu 12 Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen hinzu, wie in Fig. 1A gezeigt ; Dies kann mit einer sterilen Pasteurpipette erfolgen, die an einem Vakuum befestigt ist, um jedes Deckglas aufzunehmen. Vorsichtig auf das Deckglas auf der Seite des Brunnens klopfen, um das Absaugen zu lösen, so dass das Deckglas in den Brunnen fallen kann. </li><li> Platte 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) Osteosarkomzellen pro Vertiefung bei einem Endvolumen von 500 μl Medium. Bewegen Sie die Platte seitlich und nach oben und unten mehrmals, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind. </li><li> Drücken Sie die Deckgläser vorsichtig mit einer sauberen P1000-Spitze nach unten, um sicherzustellen, dass sich das Deckglas auf der Unterseite des Brunnens befindet und dass es keine Blasen unter dem Deckglas gibt. </li></ol> 2. Stresszellen <ol><li> Am nächsten Tag kontrollieren Sie die Tafel visuell, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig verteilt und gleichmäßig über das Deckglas hinweg konfludern, da Variationen zwischen saMples kann die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse nachteilig beeinflussen. Verwenden Sie ein 10X-Ziel auf einem invertierten Gewebekulturmikroskop. </li><li> Das Medium auf 37 ° C vorheizen. Vermeiden Sie es, kalte oder heiße Medien auf die Zellen zu applizieren, da diese Kälte- oder Hitzeschock verursachen. </li><li> Medikamente in vorgeheizten Medien verdünnen Für jede unterschiedliche Arzneimittelkonzentration werden 2 Vertiefungen mit 500 μl Medium hergestellt. Bereiten Sie weitere 500 μl vor, um während des Pipettierens einen Verlust zu ermöglichen. Aliquot-4-Röhrchen mit jeweils 1,5 ml <ol><li> Für Natriumarsenit: Zu jeder Vertiefung, die 500 μl enthält, werden 1,5 μl 100 mM Natriumarsenit (Endkonzentration: 100 μM) zugegeben oder 0,75 μl 100 mM Natriumarsenit (Endkonzentration: 50 μM) zugegeben. </li><li> Für Vinorelbin: Zu jeder Vertiefung, die 500 μl enthält, werden 22,5 μl 10 mM Vinorelbin (Endkonzentration: 150 μM) zugegeben oder 18,75 μl 10 mM Vinorelbin (Endkonzentration: 100 μM) zugegeben. HINWEIS: Natriumarsenit<html> Ist ein gut charakterisierter und gängiger Stressgranulat-Induktor und wird daher klassisch als Positivkontrolle eingesetzt. </li></ol></li><li> Entfernen und entsorgen Sie das Medium aus den Brunnen B1 - 4 und C1 - 4. Fügen Sie das Medium mit Drogen hinzu und warten Sie 60 Minuten (Abbildung 1A). <ol><li> Füge 500 μl Medium mit 100 μM Natriumarsenit zu den Vertiefungen B1 und B2 hinzu. Füge 500 μl Medium mit 50 μM Natriumarsenit zu den Vertiefungen B3 und B4 hinzu. </li><li> Füge 500 μl Medium mit 150 μM Vinorelbin zu den Vertiefungen C1 und C2 hinzu. Füge 500 μl Medium mit 125 μM Vinorelbin zu den Vertiefungen C3 und C4 hinzu. </li></ol></li><li> 30 min vor der Fixierung die Vertiefungen in Spalte 2 mit 5 μl Cycloheximid (1 mg / mL Stamm) und den Vertiefungen in Spalte 4 mit 2 μl Puromycin (1,25 mg / mL Stamm) behandeln. Schlagen Sie die Platte vorsichtig vor, bevor Sie die Platte wieder in den 37 ° C-Inkubator stellen. </li></ol> 3. Zellfixierung und Immunfluoreszenz Nt &quot;&gt; HINWEIS: Vor dem Versuch sicherstellen, dass das Methanol auf -20 ° C abgekühlt wird. Puffer, einschließlich Phosphat-gepufferter Saline (PBS), 5% normales Pferdeserum (NHS) in PBS und 4% Paraformaldehyd (PFA ) In PBS. <ol><li> Verwerfen Sie die Medien und waschen Sie die Wells mit Deckgläschen mit PBS. Abhängig von den verwendeten Medikamenten könnte es wichtig sein, die Medien, die Drogen enthalten, ordnungsgemäß zu verwerfen; Wenden Sie sich an die örtliche Umweltschutzstelle für spezifische Anweisungen. Um effizient zu waschen, füllen Sie eine Squeeze-Flasche mit PBS, schneiden Sie die Spitze, um einen sanften Fluss zu ermöglichen, anstatt einen engen Strom, und verwenden Sie diese, um PBS zu jedem Brunnen nach dem Ansaugen der ursprünglichen PBS hinzuzufügen. </li><li> Fixieren Sie die Zellen mit ~ 250 μl 4% PFA für 15 min bei RT unter leichtem Rühren. Den Deckel komplett mit PFA bedecken; 250 μl sollte ausreichend sein, aber wenn nicht, fügen Sie mehr hinzu. Vermeiden Sie immer Pipettieren direkt auf die Deckgläser, da einige Zellen (oder Stressbehandlungen von Zellen) die Befestigung verändern können und tEr Kraft aus Pipettieren kann die Zellen zu vertreiben. </li><li> PFA entfernen und ordnungsgemäß ablegen. Wenden Sie sich an das örtliche Umweltschutzbüro, um Einzelheiten darüber zu erhalten, wie Sie Paraformaldehyd ordnungsgemäß verwerfen können. </li><li> Füge ~ 250 μl Methanol (-20 ° C) hinzu und inkubiere für 5 min bei RT unter leichtem Schütteln; Dies permeabilisiert und flacht die Zellen. </li><li> Entfernen und entsorgen Sie das Methanol und blockieren Sie die Zellen durch Anwendung von ~ 250 μl 5% NHS für 1 h bei RT O / N bei 4 ° C. Wenden Sie sich an das örtliche Umweltschutzbüro, um weitere Informationen darüber zu erhalten, wie Sie Methanol ordnungsgemäß entsorgen können. </li><li> Für primäre Antikörper verdünnen die Antikörper in 5% NHS. HINWEIS: Die Verwendung von mehreren SG-Markern ist der Schlüssel zur Bestätigung, ob die beobachteten Granulate bona fide SGs sind. Die Anzahl der SG-Marker, die verwendet werden können, hängt von den im Mikroskop verfügbaren Filtern ab. Wenn Standardgrün-, Rot- und Fernrot-Filter-Sets verfügbar sind, verwenden Sie G3BP1, eIF4G und eIF3b bei einer 1/250 Verdünnung. <ol><lI&gt; Für dieses Experiment (12 Deckgläser bei jeweils 250 μl - Gesamt: 3 ml 5% NHS), fügen Sie 12 μl von den folgenden: anti-G3BP1, anti-eIF3b und anti-eIF4G hinzu. Inkubieren der primären Antikörper unter leichtem Rühren für mindestens 1 h bei RT oder O / N bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Waschen Sie die Wells 3x mit PBS und inkubieren Sie jede Wäsche für 5 min. </li><li> Für sekundäre Antikörper verdünnen Sie alle sekundären Antikörper (1/250 Verdünnung) und Hoechst Farbstoff (1 / 1.000 Verdünnung) in 5% NHS. <ol><li> Für dieses Experiment (12 Deckgläser bei jeweils 250 &amp; mgr; l - Gesamt: 3 ml 5% NHS) wurden 12 &amp; mgr; l von jeweils folgend zugegeben: Cy2-Maus, Cy3-Kaninchen und Cy5-Ziege (jeweils 1/250 Verdünnung) ) Und fügen Sie 3 μl Hoechst Farbstoff hinzu. </li><li> Inkubieren Sie die Deckgläser mit den sekundären Antikörpern für 1 h bei RT. Während dieses und der folgenden Schritte, schützen Sie die Proben vor Licht, indem Sie die Platte mit einer Schachtel abdecken oder indem Sie Folie über die Oberseite der Gewebekulturschale legen. </li></ol></li><li> Waschen wir unsDreimal mit PBS für jeweils 5 min. </li><li> Montieren Sie die Deckgläser auf beschrifteten Glasschienen mit Montagemedium. Das Montagemedium in einem 37 ° C Heizblock für 10 min erhitzen; Dadurch verringert sich die Viskosität und erleichtert die Pipettierung. Mit einer geschnittenen P200-Spitze, pipettieren Sie 25 μl Montagemedium pro Deckglas auf eine Glasrutsche; 4-8 Deckgläschen können auf eine Glasrutsche passen, vorausgesetzt, dass die Mikroskopstufe dies zulässt. Mit feinen Pinzetten, übertragen Sie das Deckglas vom Brunnen zum Schieber und achten Sie darauf, die Zellseite auf das Montagemedium zu legen. Mit einem sauberen P200-Tip drücken Sie das Deckglas nach unten. </li><li> Sobald alle Deckgläser montiert sind, verwenden Sie gefaltetes Laborgewebe, um das übermäßige Montagemedium aufzuräumen, indem Sie das Laborgewebe sehr fest auf die Folie drücken. Verwenden Sie eine Quetschflasche, die H 2 O enthält, um das überschüssige Füllmedium abzuspülen und wiederholen Sie das Blotting mit gefaltetem Laborgewebe, um das Wasser zu entfernen. </li></ol> 4. Fluoreszenz in situ &lt;/ Em&gt; Hybridisierung (FISH) <ol><li> Platte und behandeln die Zellen, mit den Schritten 1 und 2.1-4 als Leitfaden; Es ist nur notwendig, die Zellen in Spalte 1 zu plattieren, da im folgenden Experiment nur 3 Decklippen benötigt werden. </li><li> Sicherstellen, dass alle Puffer vorbereitet sind ( dh 4% PFA in PBS, 70% Ethanol in Wasser, 2x Salin-Natrium-Citrat (SSC) und 5% NHS), dass das Methanol auf -20 ° C abgekühlt wird, und das Der Hybridisierungsofen wird auf die entsprechende Temperatur erwärmt. </li><li> Führen Sie die Schritte 3.1-3.3 aus, um die Zellen zu waschen und zu fixieren. </li><li> Permeabilisieren von Zellen durch Zugabe von -20 ° C Methanol für 10 min. </li><li> Das Methanol entfernen und die Deckgläser in 70% igem Ethanol inkubieren. Legen Sie die Platte bei 4 ° C über Nacht. Die Platte mit Parafilm abdichten, um Verdunstung zu vermeiden. </li><li> Am nächsten Tag entfernen Sie das Ethanol und rehydrieren die Zellen durch Zugabe von 500 μl 2x SSC. Inkubieren Sie die Deckgläser für 5 min mit sanfter Bewegung bei RT. </li><li> Entfernen Sie die 2x SSC und fügen Sie 500 hinzuΜL von 2X SSC. 5 min unter leichtem Rühren inkubieren. </li><li> Legen Sie ein Stück Parafilm flach auf den Boden des Hybridisierungsofens. 25 μl Hybridisierungspuffer auf das Parafilm für jedes Deckglas pipettieren. Entfernen Sie das Deckglas aus der 24-Well-Schale (an dieser Stelle sind die Deckgläser zellseitig nach oben) und legen Sie die Deckglas-Zelle auf den Hybridisierungspuffer. Tun Sie dies bei 42 ° C oder wahlweise bei 65 ° C für 15 min. ANMERKUNG: Wenn Sie diesen Schritt bei 65 ° C abschließen, werden zelluläre RNAs denaturiert; Dies kann das Signal verbessern, wenn das PolyA durch Wechselwirkungen mit Proteinen maskiert wird. </li><li> Verdünnen Sie die Biotin-Oligo (dT) -Sonde (100 ng / μL) im Hybridisierungspuffer auf eine Konzentration von 2 ng / μL; 25 μl pro Deckglas ist ausreichend. </li><li> Für jedes Deckglas pipettieren Sie 25 μl Hybridisierungspuffer, der Biotin-Oligo (dT) enthält, auf das Parafilm. Heben Sie das Deckglas mit Pinzette auf und berühren Sie die Kante des Deckglases vorsichtig auf ein Laborgewebe, um überschüssiges zu entfernenHybridisierungspuffer Übertragen Sie das Deckglas in den Hybridisierungspuffer mit Biotin-Oligo (dT); Denken Sie daran, die Zelle Seite nach unten zu halten. </li><li> Legen Sie die Deckgläser in eine Hybridisierungsbox, um die Verdunstung zu begrenzen. Inkubieren Sie die Deckgläser mit Biotin-Oligo (dT) in Hybridisierungspuffer für 60 min bei 42 ° C. </li><li> Legen Sie 2x SSC in den Hybridisierungsofen, damit er auf 42 ° C äquilibrieren kann. </li><li> Fügen Sie ~ 500 μl erwärmtes 2x SSC zu den Vertiefungen in der 24-Well-Schale hinzu und verwenden Sie Pinzette, um die Deckgläser in den Brunnen zu übertragen. 10 min inkubieren </li><li> Wiederholen Sie den obigen Waschschritt zweimal bei 42 ° C und dann zweimal bei RT. </li><li> Führen Sie die Schritte 3.5-3.10 aus und stellen Sie sicher, dass Sie ein Streptavidin-Fluorochrom verwenden, um das Biotin-Oligo (dT) anstelle eines herkömmlichen Antikörpers zu detektieren. </li></ol> 5. Ribopuromycylierungsassay zur Beurteilung des Translationsstatus <ol><li> Platte U2OS Zellen auf Deckgläschen, wie in Schritt 1 angegeben, aber nur Platte ein Deckglas pro Zustand (in diesemFall, 3 Deckgläser: nicht kontaminiert, 100 μM Natriumarsenit und 150 μM Vinorelbin) (Abbildung 1 A). </li><li> Stress-Zellen mit dem Protokoll in Schritt 2, Abschluss der Schritte 2.1-2.4. </li><li> 5 min vor der Fixierung 2 &amp; mgr; l Puromycin (Bestand: 1,25 mg / ml, 2 &amp; mgr; l in 500 &amp; mgr; l verdünnen, um eine endgültige Puromycinkonzentration von 5 &amp; mgr; g / ml zu erhalten) und 2,9 &amp; mgr; l Emetin (Bestand: 20 &amp; mgr; g / ml; 2,9 &amp; mgr; l zu der gleichen Lösung, die bereits das Puromycin enthält) zu jeder Vertiefung, die 0,5 ml enthält. </li><li> Führen Sie die Schritte 3.1-3.10 wie oben beschrieben, mit einem Anti-Puromycin-Antikörper (1/1000 Verdünnung), um Puromycin zu erkennen. Idealerweise verwenden Sie zwei weitere SG-Marker in den übrigen Kanälen. </li><li> Bei der Quantifizierung des Puromycin-Signals nehmen Sie alle Bilder mit der gleichen Belichtung. Wählen Sie diese Belichtung mit der hellsten (unbelasteten) Probe und nehmen Sie ein Bild so hell wie möglich ohne Sättigung. HINWEIS: Die Intensität des Anti-Puromycin-Fluoreszenzsignals repräsentiertDie laufende Übersetzung, da Puromycin eine Aminosäure substituiert, in das naszierende Protein einbringt und die vorzeitige Beendigung des Proteins erzwingt. </li></ol> 6. Bildaufnahme und -analyse <ol><li> Quantifizierung von Stressgranulaten <ol><li> Um SGs zu quantifizieren, erwerben Sie 3 - 5 Bilder mit&gt; 100 Zellen pro Probe mit einem 40X Ziel. Alternativ können Sie Bilder mit anderen Zielen erfassen, aber dafür sorgen, dass&gt; 100 Zellen pro Deckglas gezählt werden und dass die Vergrößerung groß genug ist, um die Granulate klar zu visualisieren. Tun Sie dies, indem Sie das Deckglas in fünf ungefähr gleiche Bereiche teilen und zufällig ein Feld aus jeder Region auswählen (Abbildung 1B ); Bilder des gleichen Feldes sollten alle Kanäle enthalten, um die Kolokalisierung von Markern zu beurteilen. </li><li> Sobald alle Bilder erworben wurden, fusionieren Sie die Kanäle. Einige Kamera-Software wird dies automatisch tun, während andere manuelle Verschmelzung erfordern; Dies kann mit gemacht werdenImageJ, indem du alle Bilder öffnest und dann [Bild | Farbe | Zusammenführen von Kanälen]. </li><li> Manuell die Gesamtzahl der Zellen durch Zählen der Anzahl der Kerne, mit Hoechst als die Kerne Marker zählen. Manuell die Anzahl der Zellen zählen, die mehr als zwei SGs pro Zelle enthalten. HINWEIS: Wenn Sie beispielsweise ein zusammengeführtes Drei-Kanal-Bild mit G3BP1 (grün), eIF4G (rot) und Hoechst (blau) verwenden, zählen Sie die Kerne (oder Anzahl der Zellen) mit dem blauen Kanal. Dann zählen SG-positive Zellen als solche mit zwei oder mehr gelben Foci pro Zelle. Die Granulate erscheinen gelb, da grün aus G3BP1 und rot von eIF4G gelb erscheinen, wenn kolokalisiert. </li><li> Bestimmen Sie den Prozentsatz der Zellen, die SG positiv sind, indem Sie die Daten aus den 3-5 unabhängigen Regionen kombinieren und dann berechnen: Anzahl der SG-positiven / Anzahl der Kerne) * 100 = Prozent der SG-positiven Zellen </li></ol></li><li> Assessing Colocalization durch Line Scan Analysis - Manuelle Methode <ol><li> ÖffnenBildJ. Laden Sie es kostenlos herunter () </li><li> Öffnen Sie den ROI-Manager: [Analysieren | Werkzeuge | ROI Manager ...]. </li><li> Öffnen Sie das zusammengeführte Bild in ImageJ: [Datei | Öffnen]. </li><li> Verwenden Sie das Zeilentool, das sich in der ImageJ-Symbolleiste befindet, fügen Sie eine Zeile hinzu, die durch einen SG geht, und achten Sie darauf, vor und nach dem SG einzuschließen. Fügen Sie diese Zeile zum ROI-Manager hinzu, indem Sie im ROI-Manager-Fenster auf [Hinzufügen] klicken. </li><li> Split das verschmolzene Bild in separate Kanäle, um die Lokalisierung der einzelnen Marker auf das Granulat zu beurteilen: [Bild | Farbe | Split Channel]; Dies wird das verschmolzene Bild in drei Schwarz-Weiß-Bilder aufteilen. </li><li> Stellen Sie im Schwarz-Weiß-Bild sicher, dass die Zeile ausgewählt ist. Die Zeile wird ausgewählt, wenn sie im Bild erscheint. Wenn nicht, klicken Sie im ROI-Manager-Fenster auf die Zeile im Panel; Dies markiert die Linie in blau im ROI-Manager-Fenster und macht die Linie sichtbar auf dem Schwarz-Weiß-Bild. Wenn die Zeile immer noch nicht erscheint, ist sicher, dass &quot;alles anzeigen&quot; istEckte im ROI-Manager und klicke dann auf die Zeile im Bild. </li><li> Analysieren Sie die Intensität der Linie: [Analysieren | Plot-Profil]; Dies wird das &quot;Plot Profile&quot; -Fenster, das die Intensität des Signals über die Linie zeichnet zu bringen. </li><li> Klicken Sie im Fenster &quot;Plot Profile&quot; auf [Liste], in dem ein Fenster mit den Rohdaten aus der Grafik aufgeführt wird. Kopiere alle Daten in diesem Fenster und füge sie in eine Tabellenkalkulation ein. Um dies zu tun, wählen Sie alle Daten im Fenster: [Bearbeiten | Alles auswählen]. Kopiere das Datum: [Bearbeiten | Kopieren]. Öffnen Sie eine Tabellenkalkulation und fügen Sie die Daten ein: [Bearbeiten | Paste]. </li><li> Komplette Schritte 6.2.6 - 6.2.8 für jeden Kanal separat. Sei sicher, den Kanal zu beurteilen, der beurteilt wird. </li><li> In einer Kalkulationstabelle einen Liniengraphen der Ergebnisse erzeugen. Wählen Sie die Spalten aus, die Daten enthalten, indem Sie [Steuerung] drücken und auf den Buchstaben oben in jeder Spalte klicken. Dann wählen Sie Liniendiagramm: [Einfügen | Liniendiagramm]. </li><li> Wiederholen Sie diese Analyse für multIple Stressgranulat über mehrere unabhängige Experimente hinweg. </li></ol></li><li> Assessing Colocalization durch Line Scan Analyse - ImageJ Plugin <ol><li> Downloaden und installieren Sie das RGB-Profil-Tool von der ImageJ-Website (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); Bei korrekter Installation sollte in der Symbolleiste ein rotes, grünes und blaues (RGB) -Symbol angezeigt werden. </li><li> Öffnen Sie das Bild ( zB Tiff, JPG) in ImageJ: [Datei | Öffnen]. </li><li> Klicken Sie auf das RGB-Symbol in der ImageJ-Symbolleiste. </li><li> Klicken Sie auf und ziehen Sie, um eine Zeile hinzuzufügen, die sich durch einen SG erstreckt. Ein Bild des Histogramms erscheint in einem Popup-Fenster. </li><li> Speichern Sie die Daten als Bild: [Datei | Speichern unter | Tiff]. Alternativ exportieren und grafisch die Daten in einem anderen Grafikprogramm mit Schritt 6.2.8 von oben. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Yamasaki, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+mRNA+translation+during+stress.">Reprogramming mRNA translation during stress.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).</li><li>Buchan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNP+granules:+Assembly,+function,+and+connections+with+disease.">mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease.</a> RNA Biol. 11 (8), (2014).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+ternary+complex+(eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules.">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li><li>Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+and+cell+signaling:+more+than+just+a+passing+phase?.">Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase?.</a> Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+shuttling+of+TIA-1+accompanies+the+recruitment+of+mRNA+to+mammalian+stress+granules.">Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 151 (6), 1257-1268 (2000).</li><li>Bley, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+are+dispensable+for+mRNA+stabilization+during+cellular+stress.">Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 43 (4), e26 (2015).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G3BP-Caprin1-USP10+complexes+mediate+stress+granule+condensation+and+associate+with+40S+subunits.">G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits.</a> J Cell Biol. 212 (7), 845-860 (2016).</li><li>Panas, M. D., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+mammalian+stress+granule+dynamics.">Mechanistic insights into mammalian stress granule dynamics.</a> J Cell Biol. 215 (3), 313-323 (2016).</li><li>Anderson, P., Kedersha, N., Ivanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules,+P-bodies+and+cancer.">Stress granules, P-bodies and cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1849 (7), 861-870 (2015).</li><li>Aulas, A., Van de Velde, ., C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+stress+granule+dynamics+driven+by+TDP-43+and+FUS:+a+link+to+pathological+inclusions+in+ALS?.">Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS?.</a> Front Cell Neurosci. 9, 423 (2015).</li><li>Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+regulatory+networks+in+immunity.">Post-transcriptional regulatory networks in immunity.</a> Immunol Rev. 253 (1), 253-272 (2013).</li><li>Wolozin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+protein+aggregation+run+amuck:+stress+granules+and+the+genesis+of+neurodegenerative+disease.">Physiological protein aggregation run amuck: stress granules and the genesis of neurodegenerative disease.</a> Discov Med. 17 (91), 47-52 (2014).</li><li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+stress+granules+and+P-bodies+during+RNA+virus+infection.">Regulation of stress granules and P-bodies during RNA virus infection.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (3), 317-331 (2013).</li><li>Somasekharan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YB-1+regulates+stress+granule+formation+and+tumor+progression+by+translationally+activating+G3BP1.">YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1.</a> J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).</li><li>Adjibade, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorafenib,+a+multikinase+inhibitor,+induces+formation+of+stress+granules+in+hepatocarcinoma+cells.">Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells.</a> Oncotarget. , (2015).</li><li>Fournier, M. J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules.">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell Int. 10, 12 (2010).</li><li>Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J., Gallouzi, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+ubiquitin-proteasome+system+induces+stress+granule+formation.">Inhibition of the ubiquitin-proteasome system induces stress granule formation.</a> Mol Biol Cell. 18 (7), 2603-2618 (2007).</li><li>Moeller, B. J., Cao, Y., Li, C. Y., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+activates+HIF-1+to+regulate+vascular+radiosensitivity+in+tumors:+role+of+reoxygenation,+free+radicals,+and+stress+granules.">Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules.</a> Cancer Cell. 5 (5), 429-441 (2004).</li><li>Szaflarski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vinca+alkaloid+drugs+promote+stress-induced+translational+repression+and+stress+granule+formation.">Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation.</a> Oncotarget. 7 (21), 30307-30322 (2016).</li><li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1.">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li><li>Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+TIA-1+and+TIAR+link+the+phosphorylation+of+eIF-2+alpha+to+the+assembly+of+mammalian+stress+granules.">RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 147 (7), 1431-1442 (1999).</li><li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).</li><li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).</li><li>Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+method+for+mapping+genes+on+Drosophila+polytene+chromosomes.">Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (14), 4381-4385 (1982).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> J Cell Biol. 197 (1), 45-57 (2012).</li><li>Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+characterization+of+stress+granules+in+virus+infected+cells.">Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells.</a> Methods. 90, 57-64 (2015).</li><li>David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emetine+optimally+facilitates+nascent+chain+puromycylation+and+potentiates+the+ribopuromycylation+method+(RPM)+applied+to+inert+cells.">Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells.</a> Histochem Cell Biol. 139 (3), 501-504 (2013).</li><li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+visualization+and+dynamics+of+newly+synthesized+proteins+in+rat+hippocampal+neurons.">In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons.</a> Nat Neurosci. 13 (7), 897-905 (2010).</li><li>Ruggieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+oscillation+of+translation+and+stress+granule+formation+mark+the+cellular+response+to+virus+infection.">Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 71-85 (2012).</li><li>Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+contribute+to+alpha-globin+homeostasis+in+differentiating+erythroid+cells.">Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 420 (4), 768-774 (2012).</li><li>Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+RNAi+screen+links+O-GlcNAc+modification+of+ribosomal+proteins+to+stress+granule+and+processing+body+assembly.">A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly.</a> Nat Cell Biol. 10 (10), 1224-1231 (2008).</li><li>Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+pathways+regulated+by+arsenate+and+arsenite.">Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite.</a> Oncogene. 18 (54), 7794-7802 (1999).</li><li>Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic+binding+to+proteins.">Arsenic binding to proteins.</a> Chem Rev. 113 (10), 7769-7792 (2013).</li><li>McDonald, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+(TDP-43)+regulates+stress+granule+dynamics+via+differential+regulation+of+G3BP+and+TIA-1.">TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1.</a> Hum Mol Genet. 20 (7), 1400-1410 (2011).</li><li>Aulas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G3BP1+promotes+stress-induced+RNA+granule+interactions+to+preserve+polyadenylated+mRNA.">G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA.</a> J Cell Biol. 209 (1), 73-84 (2015).</li><li>Martin, S., Tazi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+G3BP+stress+granules+dynamics+in+live+primary+cells.">Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li><li>Wippich, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+specificity+kinase+DYRK3+couples+stress+granule+condensation/dissolution+to+mTORC1+signaling.">Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling.</a> Cell. 152 (4), 791-805 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wie durch immunhistologische Studien bei multiplen Krankheiten belegt, führt chronischer Stress zur Bildung verschiedener intrazellulärer Herde. Zum Beispiel sind die meisten neurodegenerativen Erkrankungen durch intrazelluläre Aggregate von unlöslichen Proteinen gekennzeichnet. Die Anwesenheit von SG-assoziierten Proteinen in solchen Aggregaten ist oft die Grundlage für den Schluss, dass solche Herde SGs sind. Eine ähnliche Schlussfolgerung wird auch gezogen, wenn SG-Marker-positive zytoplasmatische Herde in Zell...

Zellen verwenden viele Mechanismen, um auf Stress zu reagieren. Einige Antworten treten auf der posttranskriptionellen Ebene auf und beinhalten die Regulierung der mRNA-Translation und / oder der Stabilität 1 , 2 . Stressmodulierte mRNA-Translationsstillstand und -abbau sind mit der Bildung spezifischer nichtmembranöser zellulärer Herde verbunden, wobei die am stärksten charakterisierten Stressgranulate (SGs) 3 sind . SGs sind zytoplasmatische Herde, die die Nicht-Translations von mRNPs in translatorisch verhafteten Zellen, die auf Stress reagieren ( z. B. Oxidation, Hitzeschock, Nährstoffhunger und Virusinfektion), konzentrieren. Zusätzlich zur Nicht-Translation von mRNAs enthalten SGs Translationsinitiierungsfaktoren, RNA-bindende Proteine ​​und verschiedene Signalproteine 5 . SGs sind Biomarker der gehemmten Protein-Translation und veränderten RNA-Metabolismus und wurden mit Zellüberleben und Apoptose, Signalweg verbundenS und nukleare Prozesse 5 . SGs sind dynamische Entitäten, und ihre Bildung ist eng mit dem Status der zellulären Übersetzung verbunden 6 . Trotz ihrer scheinbar soliden Erscheinung, die meisten SG-Protein-Komponenten schnell ein- und ausschalten, mit einer verweilzeit von Sekunden. Während SGs für Minuten bis Stunden bestehen bleiben, sind die meisten ihrer Komponenten im raschen Fluss. Die Hemmung der Translationsinitiierung und die daraus folgende Demontage von translatierenden Polysomen fördern die Bildung von SGs; So sind die SGs im Gleichgewicht mit der Übersetzung von Polysomen. Dieses Polysom ​​/ SG-Gleichgewicht ist der Schlüssel zur Unterscheidung bona fide SGs von anderen stressinduzierten Herden 6 , 7 . Die Veranlassung der Translationsinitiierung beinhaltet die Umwandlung von translation-kompetenten Prä-Initiierungskomplexen, die mRNA, Translationsinitiationsfaktoren (eIF) und 40S ribosomale Untereinheiten enthalten (s<html> O-genannt 48S-Komplexe) in translatorisch blockierte Komplexe (sogenannte 48S * -Komplexe), die sich in SGs 4 , 6 koaleszieren können. SGs werden durch Translationsstillstand an zwei verschiedenen Schritten stromaufwärts von 48S-Komplexbildung gefördert: Interferenz mit den Funktionen des cap-bindenden eIF4F-Komplexes ( zB Targeting auf seine eIF4A-Untereinheit) oder Phosphorylierung der α-Untereinheit des Translationsinitiationsfaktors eIF2, vermittelt durch eins Oder mehr der vier eIF2-Kinasen. Die Anwesenheit von blockierten 48S-Komplexen ( dh 40S ribosomale Untereinheiten und ausgewählte Translationsinitiierungsfaktoren) ist ein Kennzeichen der SGs 8 , 9 . SGs wurden mit verschiedenen pathologischen Zuständen wie Virusinfektionen, Neurodegeneration, Autoimmunität und Krebs 3 , 10 , 11 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 12 , 13 . Mutierte Formen von mehreren SG-Komponenten sind mit neurodegenerativen Erkrankungen ( zB amyotropher Lateralsklerose) assoziiert, bei denen Neuronen intrazelluläre pathologische Einschlüsse zeigen, die im neuronalen Tod aktive Rollen spielen können. Einige Viren entführen SG-Komponenten, um die SG-Bildung zu hemmen und die Virusreplikation zu verbessern 14 . Jüngste Studien verknüpfen auch SGs an Krebs 15 und an Krebszellüberleben unter Chemo- und Strahlentherapie-Behandlungen 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Während solche Erkenntnisse ein großes Interesse an der SG-Biologie geweckt haben, fehlen viele der veröffentlichten Berichte über wichtige Kontrollen, um die Bildung von bona fide SGs von anderen stressinduzierten Herden zu unterscheiden. SGs wurden anfänglich als nichtmembranöse zytoplasmatische Foci beschrieben, die aus ausgewählten mRNA-bindenden Proteinen (RBPs) zusammengesetzt waren, einschließlich T-Zell-ntrazelluläres Antigen 1 (TIA-1) und Poly-A-bindendes Protein (PABP); Übersetzungsinitiierungsfaktoren; Polyadenylierten mRNA; Und kleine ribosomale Untereinheiten 4 , 6 , 21 , 22 . Traditionell wurde ihre Zusammensetzung durch Techniken wie Immunfärbung und die ektopische Expression von fluoreszenzmarkierten Proteinen 23 , 24 bestimmt . Aufgrund ihrer hochdynamischen Natur bleibt die Immunolokalisierung von SG-Proteinen und / oder mRNAs die definierende Methode zur Detektion von SGs 23 , 24 . Bisher werden viele RBPs und andere Proteine ​​(über 120 verschiedene Proteine) als SG-Komponenten beschrieben 11 . So viele SG-lokalisierte Proteine ​​verändern ihre Lokalisation sowohl in einer stressabhängigen als auch in einer unabhängigen Weise und können sich an anderen intrazellulären Kompartimenten und Herden ansammeln. Es ist wichtig, korrekte SG-Marker zu wählen und funktionelle Kriterien zu verwenden, um SGs von anderen Arten von Stress-induzierten zu unterscheiden Foci Bona fide SGs enthalten mRNA, Translationsinitiationsfaktoren und kleine ribosomale Untereinheiten und befinden sich im dynamischen Gleichgewicht mit Translation. Dieser einfache Workflow ist darauf ausgelegt, festzustellen, ob Stress-induzierte Herde bona fide SGs sind. Dieser Workflow umfasst mehrere experimentelle Ansätze mit U2OS-Zellen, Zellen, die üblicherweise zur Untersuchung von SGs verwendet werden. Diese Zellen sind ideal, da sie ein großes Zytoplasma haben, sind relativ flach und haften stark an Glasdeckgläschen. Andere Zelltypen können verwendet werden, um SGs zu studieren, aber es ist wichtig, sich bewusst zu sein, dass Unterschiede in der Zeitmessung, der Arzneimittelkonzentration und der Fülle von SG-Nukleierungsproteinen die Kinetik und den Compo verändern könnenSition Zusätzlich reagieren einige Zellen auf die Paraformaldehyd-Fixierung, indem sie Zelloberflächen-Blasen bilden, was dann ein gerafftes Aussehen gibt, das die punktuelle Lokalisierung einiger SG-Marker verursacht; Ohne sorgfältige Analyse können diese als SGs falsch klassifiziert werden. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, alle Kriterien zu beurteilen, die erforderlich sind, um stressinduzierte Herde als bona fide SGs zu identifizieren. Vinorelbin (VRB), ein Krebs-Therapeutikum, das SGs 20 fördert, sowie Sodium Arsenite (SA), ein robuster und gut charakterisierter SG-Induktor, werden als Stress für die Experimente in diesem Protokoll verwendet. Kanonische SGs enthalten mehrere SG-Marker (sowohl Proteine ​​als auch mRNAs), die sich in zytoplasmatischen Herden kolokalisieren. Dieses Protokoll verwendet sowohl Immunfluoreszenz- als auch Fluoreszenz- in-situ- Hybridisierung (FISH), um die Lokalisierung von Proteinmarkern und polyadenylierten mRNA 22 zu detektieren. Kurz gesagt, indirekte Immunfluoreszenz verwendet Antikörper ( i.E. Primäre Antikörper), die für ein gegebenes Protein spezifisch sind, um es innerhalb der Zelle zu detektieren. Dann erkennen sekundäre Antikörper (meist speziespezifisch) an Fluorochrome den primären Antikörper und zeigen die Zielprotein-Lokalisation. Die Fluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um das lokalisierte Signal innerhalb der Zelle zu detektieren. Die Verwendung von in verschiedenen Spezies produzierten Antikörpern und deren Nachweis mit unterschiedlich gefärbten sekundären Antikörpern ermöglicht den Nachweis der Kolokalisation mehrerer Antikörper, was darauf hinweist, dass ihre Proteinziele an der gleichen Stelle 23 gefunden werden . Es ist wichtig, Marker auszuwählen, die bei der Korruption bei bona fide SGs überprüft wurden. FISH verwendet eine markierte Sonde, die Basenpaare zu einer spezifischen RNA oder DNA-Sequenz 25 bildet . Um mRNA zu detektieren, verwendet dieses Protokoll eine biotinylierte Oligo (dT) 40- Sonde, die (oder Basenpaare) an den PolyA-Schwanz von mRNA hybridisiert ( dh PolyA FISCH). Die biotinylierte Sonde wird dann unter Verwendung von fluoreszenzkonjugiertem Streptavidin nachgewiesen, da Streptavidin eine hohe Affinität für Biotin aufweist. Bei der Beurteilung von SGs ist es wichtig, PolyA FISH mit Immunfluoreszenz zu koppeln, die einen SG-Marker detektiert, wie bei bona fide SGs, die beiden Signale sollten kolokalisieren. Mit diesem Protokoll wird die Kolokalisierung auf mehrere Arten beurteilt. In einem mehrkanaligen ( dh RGB: rot, grün und blau) Bild wird die Kolokalisierung die Farbe des überlappenden Signals verändern ( z. B. kolokalisiert rot und grün gelb) 23 . Zusätzlich wird die Kolokalisierung graphisch unter Verwendung einer Linienabtastanalyse quantifiziert, wobei die Intensität jeder der Farben über eine gegebene Linie 8 , 20 gemessen wird . Dieses Protokoll beschreibt zwei Zeilen-Scan-Analyse-Verfahren mit ImageJ 26 . Ein Verfahren ist manuell und geht durch den gesamten Prozess, whiDer andere verwendet ein Makro oder ein einfaches Programm, das die manuellen Schritte automatisiert. Es ist wichtig, durch das manuelle Programm zu gehen, um das Makroverfahren zu verstehen. SGs bilden sich in Zellen, wo die Translation unterdrückt wird; Daher sollten Zellen mit SGs verringerte Werte der globalen Translation im Vergleich zu unbehandelten Zellen zeigen. Experimentell wird Ribopuromycylierung verwendet. Puromycin und Emetin werden den Zellen für eine kurze Dauer vor der Fixierung zugesetzt, so dass das Puromycin in die aktive Bildung von Polypeptiden einbinden kann, was die Beendigung 27 , 28 verursacht. Eine Behandlung mit Emetin ist erforderlich, um eine Wiederinitiierung zu verhindern 29 . Puromycin kann dann mit Anti-Puromycin-Antikörper nachgewiesen werden, was eine Momentaufnahme der aktiven Translation ergibt. Diese Methode wird verwendet, weil es schnell ist, erfordert nicht vorhungern mit einem Medium fehlt eine bestimmte Aminosäure (und potenziell Vorspannung der Zellen), und zeigt dieSubzelluläre Lokalisation der Proteinübersetzung Andere Verfahren, insbesondere modifizierte Aminosäureanaloga, wie das Methionin-Analog-L-Azidohomoalain (AHA), gekoppelt mit der &quot;Klick-it&quot; -Aryge 30 , wurden verwendet, um zu zeigen, dass Zellen, die SGs enthalten, eine viel geringere Translation aufweisen als die benachbarten Zellen 31 . Diese Technik erfordert jedoch einen Methionin-Hunger, gefolgt von einer Puls-Markierung für 15-30 min. Der Methionin-Hunger stellt einen zusätzlichen Stress dar, während die lange Etikettierzeit ( dh 15-30 min) zur Messung der kumulativen und nicht fortlaufenden Translation führt und es den neu synthetisierten Proteinen ermöglicht, sich von ihrem Syntheseort zu ihrem endgültigen Ziel innerhalb der Zelle. Im Gegensatz dazu ist die Ribopuromycylierung viel schneller und kompatibel mit jedem Medium, wie dem glucosefreien Medium, das verwendet wird, um SGs durch Glucoseverhungern zu induzieren. Die kanonischen SGs befinden sich im dynamischen GleichgewichtMit aktiv übersetzenden Polysomen. Dies kann experimentell beurteilt werden, indem man Proben mit den Medikamenten behandelt, die Polysomen stabilisieren oder destabilisieren, wodurch das Gleichgewicht zwischen SGs und Polysomen gekippt wird 23 . Cycloheximid (oder Emetin, das sich ähnlich verhält) blockiert die Dehnung durch &quot;Einfrieren&quot; von Ribosomen auf mRNA, wodurch der Pool der verfügbaren nicht-polysomalen mRNPs, die SGs bilden können, verringert. Experimentell kann dies auf zwei Arten verwendet werden: durch Zugabe von Cycloheximid (oder Emetin) vor Stress, um eine SG-Bildung zu verhindern, oder durch Zugabe von Cycloheximid (oder Emetin), nachdem die SGs gebildet worden sind, auch ohne das Stressmittel zu entfernen, was eine SG-Demontage verursacht, wie es blockiert ist Präinitiierungskomplexe werden langsam in die Polysomfraktion eingelassen. Im Gegensatz dazu verursacht Puromycin eine vorzeitige Beendigung und fördert die Polysom-Demontage, wodurch der Pool von initiierenden mRNAs erhöht wird, die in der Lage sind, in SGs zusammenzusetzen. Experimentell erhöht die Puromycin-Behandlung die Anzahl der SGs oder senkt den SchwellenwertD, bei denen sie sich als Reaktion auf abgestuften Stress oder Arzneimitteldosierung bilden. Bei der Beurteilung der Wirkung von Puromycin ist es wichtig, ein submaximales Niveau des Medikaments von Interesse zu verwenden, da Puromycin erwartet wird, die Wirkung des Arzneimittels zu erhöhen und den Prozentsatz der Zellen, die SGs zeigen, zu erhöhen - dies kann nicht auftreten, wenn das Medikament / Stress verursacht SGs in 100% der Zellen anfangs. Dies steht im Gegensatz zu der Cycloheximid-Behandlung, die SGs zerlegt und am besten funktioniert, wenn ~ 95% der Zellen anfänglich SGs zeigen, so dass die größtmögliche Abnahme beobachtet und genau quantifiziert werden kann. Dieses Protokoll bietet einen Rahmen für die Untersuchung von SGs in Säugetierzellen. Zu den Methoden gehören: (1) Immunfluoreszenzfärbung und ImageJ-Analyse zur Beurteilung der Kolokalisierung der klassischen SG-assoziierten Marker eIF4G, eIF3b und Ras GTPase-aktivierenden Proteinbindungsprotein 1 (G3BP1) in putativen SGs; (2) Oligo (dT) Fluoreszenz in situ Hybridisierung (PolyA FISH) zur Detektion polyadenylierter mRNA; (3) Cycloheximid- und Puromycin-Behandlung, um zu bestimmen, ob stressinduzierte Herde im dynamischen Gleichgewicht mit Polysomen sind; Und (4) Ribopuromycylierung zur Beurteilung des Translationsstatus von Zellen, die putative SGs enthalten. Zusammen können diese Assays bestimmen, ob Stress-induzierte Herde als bona fide SGs eingestuft werden können.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>U-2 OS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174;HTB-96&#8482;</td>
			<td>- commonly written as &#34;U2OS&#34; 
			- culture at 37 &#176;C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>- abbreviated DMEM 
			- contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red 
			- supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin 
			- prewarm prior drug(s) dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td>- abbreviated FBS 
			- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline streptomycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ml</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tissues</td>
			<td>KIMTECH SCIENCE</td>
			<td>34120</td>
			<td>- commonly called &#34;kimwipes&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td>- autoclaved before used 
			- keep sterile in the tissue culture hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium (meta)arsenite &#8805;90%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7400-100G</td>
			<td>- commonly called sodium arsenite and abbreviated SA 
			- dissolution in water at 1 M concentration, then dilute to 100 &#181;M as a working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>TSZ CHEM</td>
			<td>RS055</td>
			<td>- abbreviated VRB 
			- dissolve in water to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9620</td>
			<td>- used to assess translation level (ribopuromycylation) 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emetine dihydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2375</td>
			<td>- used in combination with puro to assess general translation level 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4859</td>
			<td>- abbreviated CHX 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Lonza / VWR</td>
			<td>95042-486</td>
			<td>- abbreviated PBS 
			- wash buffer for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>- make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved 
			- aliquots can be stored at - 20 &#176;C for several months 
			- hazardous, use ventilation 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, ACS</td>
			<td>BDH / VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td>- pre-chilled to -20&#176;C before use 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td>- abbreviated NHS 
			- dilute to 5% in PBS 
			- add sodium azide for storage at 4&#176;C 
			- blocking solution for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC</td>
			<td>Decon Labs / VWR</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>- dilute to 70% with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-81940</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- use at 1/100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti eIF4G antibody (H-300)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-11373</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti eIF3&#951; (N-20) antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-16377</td>
			<td>- eIF3&#951; is also known as eIF3b 
			- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti puromycin 12D10 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE343</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-225-150</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/2500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td>- incubate with secondary antibodies 
			-stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light 
			- Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>016-160-084</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions, then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo-(dT)40x probe biotinilated</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td>/</td>
			<td>- reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20&#176;C 
			- dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use 
			- custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridation box</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>- make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom 
			- prewarm the box prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 x SSC buffer</td>
			<td>Thermo fisher Ambion</td>
			<td>AM9763</td>
			<td>- dilute to 2X SSC using RNase Free water (DEPC treated) 
			- store at room temperature 
			- wash buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfectHybPlus Hybridization Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7033-50ml</td>
			<td>- block and probe incubation buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide mounting media</td>
			<td>home made</td>
			<td>/</td>
			<td>- mix 5 g of &#8220;cold-soluble&#8221; poly(vinyl alcohol) in 20 ml of PBS 
			- mix by sonication, followed by stirring overnight at RT 
			- Add 5 ml of glycerol and 0.2 ml of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT 
			- centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet 
			- aliquot viscous liquid, long-term storage at -20&#176;C, 1 week at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>- usually referred as &#34;parafilm&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-8136-250G</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-100ML</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td>- preservative agent for blocking solution and vinol 
			- make a 20 % dilution in water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules

Zellen werden oft durch plötzliche Umweltveränderungen herausgefordert. Stressgranulate (SGs), zytoplasmatische Ribonukleoproteinkomplexe, die sich in Zellen bilden, die Stressbedingungen ausgesetzt sind, sind in verschiedenen Aspekten des Zellstoffwechsels und des Überlebens verwickelt. SGs modulieren zelluläre Signalwege, post-transkriptionale Genexpression und Stress-Response-Programme. Die Bildung dieser mRNA-haltigen Granulate ist direkt mit der zellulären Translation verbunden. SG-Assembly wird durch gehemmte Translationsinitiation ausgelöst, und die SG-Demontage wird durch Translationsaktivierung oder durch gehemmte Translationsdehnung gefördert. Diese Beziehung wird durch SG-Komposition weiter hervorgehoben. Core-SG-Komponenten sind gestoppte Translationsvorinitiierungskomplexe, mRNA und ausgewählte RNA-bindende Proteine ​​(RBPs). Der Zweck der SG-Versammlung besteht darin, zelluläre Energie durch Sequestrierung von translatorisch blockierten Housekeeping-mRNAs zu erhalten, was die verbesserte Translation von stressempfindlichen Proteinen ermöglicht. In additivAuf die Kernbestandteile, wie z. B. gestoppte Translationsvorbereitungskomplexe, enthalten SGs eine Fülle von anderen Proteinen und Signalmolekülen. Defekte in der SG-Bildung können die zelluläre Anpassung an Stress beeinträchtigen und so den Zelltod fördern. SGs und ähnliche RNA-haltige Granulate wurden mit einer Reihe von menschlichen Krankheiten, einschließlich neurodegenerativen Erkrankungen und Krebs, verbunden, was zu dem jüngsten Interesse an der Klassifizierung und Definition von RNA-Granulat-Subtypen führte. Dieses Protokoll beschreibt Assays zur Charakterisierung und Quantifizierung von Säugetier-SGs.

Stress-induzierte Herde sind nicht unbedingt SGs. SGs werden als zytoplasmatische Foci klassifiziert, die mRNAs, Translationsinitiationsfaktoren und RNA-bindende Proteine ​​enthalten und im Gleichgewicht mit aktiver Translation stehen. Das obige Protokoll kann als Vorlage verwendet werden, um zu charakterisieren, ob eine gegebene Spannung bona fide SGs induziert. SGs kolokalisieren mit anderen bekannten SG-Markern...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules at JoVE.com

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Stressgranulate (SGs) sind nichtmembranöse zytoplasmatische Strukturen, die sich in Zellen bilden, die einer Vielzahl von Spannungen ausgesetzt sind. SGs enthalten mRNAs, RNA-bindende Proteine, kleine ribosomale Untereinheiten, Translations-bezogene Faktoren und verschiedene Zell-Signal-Proteine. Dieses Protokoll beschreibt einen Workflow, der mehrere experimentelle Ansätze verwendet, um bona fide SGs zu erkennen, zu charakterisieren und zu quantifizieren.

Methoden zur Klassifizierung von zytoplasmatischen Foci als Säugetier-Stressgranulat

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

methods-to-classify-cytoplasmic-foci-as-mammalian-stress-granules

Research

JoVE Journal

Biology

14.5K Aufrufe.  Brigham and Women's Hospital.  Stressgranulate (SGs) sind nichtmembranöse zytoplasmatische Strukturen, die sich in Zellen bilden, die einer Vielzahl von Spannungen ausgesetzt sind. SGs enthalten mRNAs, RNA-bindende Proteine, kleine ribosomale Untereinheiten, Translations-bezogene Faktoren und verschiedene Zell-Signal-Proteine. Dieses Protokoll beschreibt einen Workflow, der mehrere experimentelle Ansätze verwendet, um bona fide SGs zu erkennen, zu charakterisieren und zu quantifizieren. 

Serie: Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing und Subkultivierung Säugerzellen

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Forschung

Biologie

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Response to ionisierender Strahlung

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Die Quantifizierung der γH2AX Foci in Gewebeproben

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Die Aktivierung der Apoptose durch cytoplasmatische Mikroinjektion von Cytochrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

Visualisierung von G3BP Stress-Granulat Dynamics Live Primärzellen

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

Stimulation der DNA-Sensing Zytoplasmatische Pathways<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Methoden zur subzellulärer Kompartimente der Muskel in Beurteilen<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis als Modell zur Übersetzung Impairment Identifizieren

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

Comet Assay als ein indirektes Maß für Systemische Oxidativer Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...