Agradecemos aos membros dos laboratórios Ivanov e Anderson por sua útil discussão e feedback sobre este manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde [GM111700 e CA168872 para PA, NS094918 para PI], o National Science Centre na Polônia [concessão UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 para WS]. WS também reconhece o Ministério da Ciência e Educação Superior na Polônia (Programa Mobility Plus) ea Comissão Fulbright polonesa-americana por seu apoio financeiro de sua pesquisa nos EUA.

1. Preparação da Célula <ol><li> Adicionar lamínulas autoclavadas a 12 poços de uma placa de 24 poços, como indicado na Figura 1A ; Isso pode ser feito usando uma pipeta estéril Pasteur anexado a um vácuo para pegar cada lamínula. Toque suavemente a lamela no lado do poço para liberar a sucção, permitindo que a lamela para cair no poço. </li><li> Placa 1 x 10 5 células de osteosarcoma U-2 OS (U2OS) por poço a um volume final de 500 μL de meio. Mova a placa lado a lado e para cima e para baixo várias vezes para garantir que as células são distribuídas uniformemente. </li><li> Suavemente pressione os lamínulas para baixo com uma ponta P1000 limpa para garantir que a lamela está no fundo do poço e que não há bolhas sob a lamela. </li></ol> 2. Estressando as Células <ol><li> No dia seguinte, verifique visualmente a placa para assegurar que as células estejam uniformemente dispersas e uniformemente confluentes através da lamela, uma vez que variações entre saPodem afetar adversamente a reprodutibilidade dos resultados. Use um objetivo 10X em um microscópio de cultura de tecido invertido. </li><li> Pré-aqueça o meio a 37 ° C. Evite aplicar meios frios ou quentes nas células, pois estas causam choque frio ou choque térmico, respectivamente. </li><li> Diluir drogas em meios pré-aquecidos. Para cada concentração de fármaco diferente, preparar 2 poços contendo 500 μL de meio. Prepare um adicional de 500 μL para permitir a perda durante a pipetagem. Alíquota 4 tubos, contendo cada um 1,5 mL. <ol><li> Para o arsenito de sódio: para cada poço contendo 500 μL, adicionar 1,5 μL de arsenito de sódio 100 mM (concentração final: 100 μM) ou adicionar 0,75 μL de arsenito de sódio 100 mM (concentração final: 50 μM). </li><li> Para vinorelbina: a cada poço contendo 500 μL, adicionar 22,5 μL de vinorelbina 10 mM (concentração final: 150 μM) ou adicionar 18,75 μL de vinorelbina 10 mM (concentração final: 100 μM). NOTA: Arsenito de sódio<html> É um indutor de grânulos de stress bem caracterizado e vulgarmente utilizado e é portanto classicamente utilizado como controlo positivo. </li></ol></li><li> Remova e descarte a mídia dos poços B1 - 4 e C1 - 4. Adicione o meio com drogas e espere 60 min (Figura 1A). <ol><li> Adicionar 500 μL de meio com 100 μM de arsenito de sódio aos poços B1 e B2. Adicionar 500 μL de meio com 50 μM de arsenito de sódio aos poços B3 e B4. </li><li> Adicionar 500 μL de meio com 150 μM de vinorelbina aos poços C1 e C2. Adicionar 500 μL de meio com 125 μM de vinorelbina aos poços C3 e C4. </li></ol></li><li> 30 min antes da fixaï¿½o, tratar os poï¿½s na coluna 2 com 5 ï¿½ de cicloheximida (1 mg / mL de stock) e os poï¿½s na coluna 4 com 2 ï¿½ de puromicina (pasta de 1,25 mg / mL). Agite suavemente a placa para misturar antes de colocar a placa de volta na incubadora a 37 ° C. </li></ol> 3. Fixação Celular e Imunofluorescência Nt &quot;&gt; NOTA: Antes do experimento, assegure-se de que o metanol é arrefecido até -20 ° C. Faça buffers, incluindo solução salina tamponada com fosfato (PBS), 5% de soro de cavalo normal (NHS) em PBS e paraformaldeído a 4% ) Em PBS. <ol><li> Descarte a mídia e lave os poços contendo lamínulas com PBS. Dependendo dos fármacos utilizados, pode ser importante descartar adequadamente os meios contendo drogas; Entre em contato com o escritório local de segurança ambiental para obter instruções específicas. Para lavar eficientemente, encha uma garrafa de espremer com PBS, corte a ponta de modo a permitir um fluxo suave ao invés de um fluxo apertado e use isso para adicionar PBS a cada poço após a aspiração do PBS original. </li><li> Fixar as células utilizando ~ 250 μL de PFA a 4% durante 15 min à RT sob agitação suave. Cubra completamente a parte superior da lamela com PFA; 250 μL deve ser suficiente, mas se não, adicione mais. Sempre evite pipetar diretamente nos lamínulas, pois algumas células (ou tratamentos de tensão de células) podem alterar o apego, e tA força de pipetagem pode desalojar as células. </li><li> Remova o PFA e descarte adequadamente. Entre em contato com o escritório local de segurança ambiental para obter detalhes sobre como descartar adequadamente paraformaldeído. </li><li> Adicionar ~ 250 μL de metanol (-20 ° C) e incubar durante 5 min à RT sob agitação suave; Isto permeabiliza e aplana as células. </li><li> Remover e descartar o metanol e bloquear as células, aplicando ~ 250 μL de NHS a 5% durante 1 h a RT O / N a 4 ° C. Entre em contato com o escritório de segurança ambiental local para obter detalhes sobre como descartar adequadamente metanol. </li><li> Para anticorpos primários, diluir os anticorpos em NHS a 5%. NOTA: A utilização de múltiplos marcadores SG é fundamental para confirmar se os grânulos observados são SGs de boa-fé . O número de marcadores SG que podem ser usados ​​depende dos filtros disponíveis no microscópio. Se estiverem disponíveis conjuntos de filtros verde, vermelho e far-vermelho padrão, utilize G3BP1, eIF4G e eIF3b a uma diluição de 1/250. <ol><lI&gt; Para esta experiência (12 lamelas a 250 μL de cada-Total: 3 mL de NHS a 5%), adicionar 12 μL de cada um dos seguintes: anti-G3BP1, anti-eIF3b e anti-eIF4G. Incubar os anticorpos primários utilizando agitação suave durante pelo menos 1 h à RT ou O / N a 4 ° C. </li></ol></li><li> Lavar os poços 3x com PBS, e incubar cada lavagem durante 5 min. </li><li> Para anticorpos secundários, diluir todos os anticorpos secundários (diluição 1/250) e corante Hoechst (diluição 1/1000) em NHS a 5%. <ol><li> Para esta experiência (12 lamelas a 250 μL de cada um - Total: 3 mL de NHS a 5%), adicionar 12 μL de cada um dos seguintes: Cy2-Mouse, Cy3-Rabbit e Cy5-Goat (uma diluição 1/250 de cada ) E adicionar 3 μL de corante Hoechst. </li><li> Incubar os lamínulas com os anticorpos secundários durante 1 h à RT. Durante este e os seguintes passos, proteger as amostras de luz, cobrindo a placa com uma caixa ou colocando folha sobre o topo do prato de cultura de tecidos. </li></ol></li><li> Lave oLls três vezes com PBS durante 5 min cada. </li><li> Monte os lamínulas em lâminas de vidro etiquetado usando meio de montagem. Aquecer o meio de montagem num bloco de calor a 37 ° C durante 10 min; Isto diminui a viscosidade e facilita a pipetagem. Com uma ponta de corte P200, pipetar 25 μL de meio de montagem por lamela em uma lâmina de vidro; 4-8 lamínulas podem caber em uma lâmina de vidro, assumindo que o estágio do microscópio permite isso. Usando fórceps finos, transferir a lamela do poço para o slide, certificando-se de colocar o lado da célula para baixo sobre o meio de montagem. Usando uma ponta P200 limpa, pressione o lamínula para baixo. </li><li> Uma vez que todos os lamínulas foram montados, use tecido de laboratório dobrado para limpar o excesso de mídia de montagem, pressionando o tecido de laboratório muito firmemente sobre o slide. Use um frasco de compressão contendo H 2 O para enxaguar o excesso de meio de montagem e, em seguida, repita o blotting com tecido de laboratório dobrado para remover a água. </li></ol> 4. Fluorescência In Situ &lt;/ Em&gt; Hybridization (FISH) <ol><li> Placa e tratar as células, usando os passos 1 e 2.1-4 como um guia; Só é necessário plaquear as células na coluna 1, uma vez que são necessários apenas 3 lamelas na experiência seguinte. </li><li> Certifique-se de que todos os tampões são preparados ( isto é, PFA a 4% em PBS, etanol a 70% em água, 2x Citrato de sódio salino (SSC) e NHS a 5%), que o metanol seja arrefecido até -20 ° C e que O forno de hibridação é aquecido até à temperatura apropriada. </li><li> Execute os passos 3.1-3.3 para lavar e fixar as células. </li><li> Permeabilizar as células por adição de -20 ° C de metanol durante 10 min. </li><li> Remover o metanol e incubar as lamelas em etanol a 70%. Colocar a placa a 4 ° C durante a noite. Selar a placa usando parafilme para evitar a evaporação. </li><li> No dia seguinte, remover o etanol e re-hidratar as células adicionando 500 μL de SSC 2x. Incubar os lamínulas durante 5 min com agitação suave à temperatura ambiente. </li><li> Remova o SSC 2x e adicione 500ΜL de SSC 2X. Incubar durante 5 minutos sob agitação suave. </li><li> Coloque um pedaço de parafilme na parte de baixo do forno de hibridação. Pipetar 25 μL de tampão de hibridização sobre o parafilme para cada lamínula. Remova a lamela do prato de 24 poços (neste ponto, os lamínulas estão lado da célula para cima) e coloque a lamela lado da célula para baixo sobre o buffer de hibridização. Faça-o a 42 ° C ou opcionalmente a 65 ° C durante 15 min. NOTA: Completar esta etapa a 65 ° C desnaturalizará RNAs celulares; Isto pode melhorar o sinal se o poliA é mascarado por interações com proteínas. </li><li> Diluir a sonda de Biotina-Oligo (dT) (100 ng / μL) em tampão de hibridação para uma concentração de 2 ng / μL; 25 μL por lamínula é suficiente. </li><li> Para cada lamela, pipetar 25 μL de tampão de hibridação contendo Biotina-Oligo (dT) sobre o parafilme. Pegue a lamela com fórceps e toque suavemente a borda da lamela em um tecido de laboratório para remover o excessoTampão de hibridação. Transferir a lamela para o tampão de hibridação com Biotin-Oligo (dT); Lembre-se de manter o lado da célula para baixo. </li><li> Coloque os lamínulas em uma caixa de hibridização para limitar a evaporação. Incubar os lamínulas com Biotina-Oligo (dT) em tampão de hibridação por 60 min a 42 ° C. </li><li> Colocar 2x SSC no forno de hibridação para permitir que ele se equilibre a 42 ° C. </li><li> Adicionar ~ 500 μL de 2 x SSC aquecido para os poços na placa de 24 poços e usar pinças para transferir os lamínulas para o poço. Incubar durante 10 min. </li><li> Repetir o passo de lavagem acima duas vezes a 42 ° C e depois duas vezes à TA. </li><li> Complete os passos 3.5-3.10, certificando-se de usar um fluorocromo de estreptavidina para detectar o Biotin-Oligo (dT) em vez de um anticorpo convencional. </li></ol> 5. Ensaio de ribopuromicilação para avaliar o estado translacional <ol><li> Placa de células U2OS em lamínulas, como indicado no passo 1, mas apenas chapa um lamínula por condição (nesteCaso, 3 lamínulas: não tratadas, arsenito de sódio 100 μM e vinorelbina 150 μM) ( Figura 1 A). </li><li> Células de estresse usando o protocolo na etapa 2, completando as etapas 2.1-2.4. </li><li> 5 min antes da fixação, adicionar 2 μL de puromicina (estoque: 1,25 mg / mL, diluir 2 μL em 500 μL para obter uma concentração final de puromicina de 5 μg / mL) e 2,9 μL de emetina (estoque: 20 μg / mL; 2,9 μL à mesma solução contendo já a puromicina) para cada poço contendo 0,5 mL. </li><li> Completar os passos 3.1-3.10 como indicado acima, utilizando um anticorpo anti-puromicina (diluição 1/1000) para detectar puromicina. Idealmente, use outros dois marcadores SG nos canais restantes. </li><li> Ao quantificar o sinal de puromicina, tome todas as imagens usando a mesma exposição. Escolha esta exposição usando a amostra mais brilhante (sem tensão) e tirando uma imagem tão brilhante quanto possível sem saturação. NOTA: A intensidade do sinal fluorescente anti-puromicina represA tradução contínua, como substitutos de puromicina para um aminoácido, incorpora na proteína nascente, e impõe a terminação prematura da proteína. </li></ol> 6. Aquisição e Análise de Imagens <ol><li> Quantificação de grânulos de estresse <ol><li> Para quantificar SGs, adquira 3 - 5 imagens totalizando&gt; 100 células por amostra usando um objetivo 40X. Em alternativa, adquira imagens utilizando outros objectivos, mas certifique-se de que&gt; 100 células são contadas por lamínula e que a ampliação é suficientemente grande para visualizar claramente os grânulos. Faça isso dividindo a lamela em cinco regiões aproximadamente iguais e selecionando aleatoriamente um campo de cada região ( Figura 1B ); Imagens do mesmo campo devem incluir todos os canais para avaliar a colocalização de marcadores. </li><li> Uma vez que todas as imagens foram adquiridas, mesclar os canais. Algum software da câmera fará automaticamente isto, enquanto outros requerem a fusão manual; Isso pode ser feito comImageJ abrindo todas as imagens e selecionando [Image | Cor | Mesclar Canais]. </li><li> Contagem manual do número total de células, contando o número de núcleos, usando Hoechst como o marcador de núcleos. Contagem manualmente o número de células que contêm mais de dois SGs por célula. NOTA: Por exemplo, usando uma imagem de três canais combinada exibindo G3BP1 (verde), eIF4G (vermelho) e Hoechst (azul), conte os núcleos (ou número de células) usando o canal azul. Em seguida, considere as células SG-positivas como aquelas com dois ou mais focos amarelos por célula. Os grânulos aparecerão amarelos, como verde de G3BP1 e vermelho de eIF4G aparecem amarelos se colocalized. </li><li> Determine a percentagem de células que são SG positivo, combinando os dados das 3-5 regiões independentes e, em seguida, calcular: Número de SG positivo / número de núcleos) * 100 = percentagem de células SG-positivas </li></ol></li><li> Avaliação da Colocalização por Análise de Varredura de Linha - Método Manual <ol><li> AbertoImageJ. Faça o download gratuitamente de () </li><li> Abra o gerenciador de ROI: [Analisar | Ferramentas | Gerente de ROI ...]. </li><li> Abra a imagem mesclada no ImageJ: [File | Aberto]. </li><li> Usando a ferramenta de linha localizada na barra de ferramentas ImageJ, adicione uma linha que passa por um SG, certificando-se de incluir antes e depois do SG. Adicione esta linha ao gerenciador de ROI clicando em [Adicionar] na janela do gerenciador de ROI. </li><li> Dividir a imagem mesclada em canais separados para avaliar a localização de cada marcador para o grânulo: [Image | Cor | Split Channel]; Isso dividirá a imagem mesclada em três imagens em preto e branco. </li><li> Na imagem em preto-e-branco, certifique-se de que a linha está selecionada; A linha é selecionada se aparecer na imagem. Caso contrário, na janela do gestor de ROI, clique na linha no painel; Isto irá realçar a linha em azul na janela do gestor de ROI e tornará a linha visível na imagem em preto e branco. Se a linha ainda não aparecer, certifique-se de que &quot;mostrar tudo&quot; é chEcked no gerente de ROI e, em seguida, clique na linha na imagem. </li><li> Analisar a intensidade da linha: [Analisar | Plot Profile]; Isto irá abrir a janela &quot;Plot Profile&quot;, que traça a intensidade do sinal através da linha. </li><li> Na janela &quot;Plot Profile&quot;, clique em [List], que abre uma janela contendo os dados brutos do gráfico. Copie todos os dados nesta janela e cole-os em um arquivo de planilha. Para fazer isso, selecione todos os dados na janela: [Editar | Selecionar tudo]. Copie a data: [Editar | Cópia de]. Abra um arquivo de planilha e cole os dados: [Editar | Colar]. </li><li> Complete os passos 6.2.6 a 6.2.8 para cada canal separadamente. Certifique-se de acompanhar o canal que está sendo avaliado. </li><li> Em uma planilha, gere um gráfico de linha dos resultados. Selecione as colunas que incluem dados pressionando [controle] e clicando na letra na parte superior de cada coluna. Em seguida, selecione o gráfico de linha: [Inserir | Gráfico de linha]. </li><li> Repita essa análise para multGranulados de estresse em várias experiências independentes. </li></ol></li><li> Avaliando Colocalização por Análise de Varredura de Linha - Plugin ImageJ <ol><li> Faça o download e instale a ferramenta de perfil RGB no site da ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); Quando instalado corretamente, um ícone vermelho, verde e azul (RGB) -lineado deve aparecer na barra de ferramentas. </li><li> Abra a imagem ( por exemplo, Tiff, JPG) em ImageJ: [File | Aberto]. </li><li> Clique no ícone RGB localizado na barra de ferramentas ImageJ. </li><li> Clique e arraste para adicionar uma linha que se estende através de um SG, certificando-se de incluir regiões adjacentes; Uma imagem do histograma aparecerá em uma janela pop-up. </li><li> Salvar os dados como uma imagem: [Arquivo | Guardar como | Tiff]. Como alternativa, exporte e, em seguida, grafique os dados em outro programa gráfico usando a etapa 6.2.8 acima. </li></ol></li></ol>

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L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+TIA-1+and+TIAR+link+the+phosphorylation+of+eIF-2+alpha+to+the+assembly+of+mammalian+stress+granules.">RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 147 (7), 1431-1442 (1999).</li><li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).</li><li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).</li><li>Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+method+for+mapping+genes+on+Drosophila+polytene+chromosomes.">Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (14), 4381-4385 (1982).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> J Cell Biol. 197 (1), 45-57 (2012).</li><li>Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+characterization+of+stress+granules+in+virus+infected+cells.">Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells.</a> Methods. 90, 57-64 (2015).</li><li>David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emetine+optimally+facilitates+nascent+chain+puromycylation+and+potentiates+the+ribopuromycylation+method+(RPM)+applied+to+inert+cells.">Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells.</a> Histochem Cell Biol. 139 (3), 501-504 (2013).</li><li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+visualization+and+dynamics+of+newly+synthesized+proteins+in+rat+hippocampal+neurons.">In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons.</a> Nat Neurosci. 13 (7), 897-905 (2010).</li><li>Ruggieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+oscillation+of+translation+and+stress+granule+formation+mark+the+cellular+response+to+virus+infection.">Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 71-85 (2012).</li><li>Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+contribute+to+alpha-globin+homeostasis+in+differentiating+erythroid+cells.">Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 420 (4), 768-774 (2012).</li><li>Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+RNAi+screen+links+O-GlcNAc+modification+of+ribosomal+proteins+to+stress+granule+and+processing+body+assembly.">A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly.</a> Nat Cell Biol. 10 (10), 1224-1231 (2008).</li><li>Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+pathways+regulated+by+arsenate+and+arsenite.">Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite.</a> Oncogene. 18 (54), 7794-7802 (1999).</li><li>Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic+binding+to+proteins.">Arsenic binding to proteins.</a> Chem Rev. 113 (10), 7769-7792 (2013).</li><li>McDonald, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+(TDP-43)+regulates+stress+granule+dynamics+via+differential+regulation+of+G3BP+and+TIA-1.">TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1.</a> Hum Mol Genet. 20 (7), 1400-1410 (2011).</li><li>Aulas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G3BP1+promotes+stress-induced+RNA+granule+interactions+to+preserve+polyadenylated+mRNA.">G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA.</a> J Cell Biol. 209 (1), 73-84 (2015).</li><li>Martin, S., Tazi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+G3BP+stress+granules+dynamics+in+live+primary+cells.">Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li><li>Wippich, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+specificity+kinase+DYRK3+couples+stress+granule+condensation/dissolution+to+mTORC1+signaling.">Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling.</a> Cell. 152 (4), 791-805 (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Conforme evidenciado por estudos imuno-histológicos em múltiplas doenças, o estresse crônico leva à formação de diferentes focos intracelulares. Por exemplo, a maioria das doenças neurodegenerativas é caracterizada por agregados intracelulares de proteínas insolúveis. A presença de proteínas associadas a SG nesses agregados é frequentemente a base para concluir que tais focos são SGs. Uma conclusão semelhante é também tirada quando os focos citoplasmáticos positivos para o marcador SG são observados ...

As células empregam muitos mecanismos para responder ao estresse. Algumas respostas ocorrem no nível pós-transcricional e envolvem a regulação da tradução e / ou estabilidade do mRNA 1 , 2 . A detenção e degradação da tradução do mRNA modulado pelo estresse estão associados com a formação de focos celulares não-membranares específicos, sendo os mais bem caracterizados os Stress Granules (SGs) 3 . As SGs são focos citoplasmáticos que concentram mRNPs não-traduzidos em células arrancadas pela tradução que respondem ao estresse ( por exemplo, oxidação, choque térmico, inanição de nutrientes e infecção viral) 4 . Para além dos mRNAs não traduzidos, os SGs contêm factores de iniciação de tradução, proteínas de ligação a RNA e várias proteínas de sinalização 5 . As SGs são biomarcadores da tradução de proteínas inibidas e do metabolismo do ARN alterado e têm sido associadas à sobrevivência celular e à apoptose, via de sinalizaçãoS e processos nucleares 5 . SGs são entidades dinâmicas, e sua formação está firmemente conectado ao status de tradução celular 6 . Apesar da sua aparência aparentemente sólida, a maioria dos componentes da proteína SG transite rapidamente para dentro e para fora, com um tempo de residência de segundos. Enquanto SGs persistem por minutos a horas, a maioria dos seus componentes estão em fluxo rápido. A inibição da iniciação da tradução ea conseqüente desmontagem dos polissomos de translação promovem a formação de SGs; Assim, as SGs estão em equilíbrio com os polissomas de translação. Este equilíbrio polissômico / SG é fundamental para distinguir SGs bona fide de outros focos induzidos pelo estresse 6,7. A interrupção da iniciação da tradução implica a conversão de complexos de pré-iniciação competentes para a tradução que contêm mRNA, factores de iniciação de tradução (eIF) e subunidades ribossómicas 40S<html> O-chamado 48S complexos) em translacionalmente stalled complexos (chamados 48S * complexos) que podem coalescer em SGs 4 , 6 . As SGs são promovidas por paragem translacional em dois passos diferentes a montante da formação do complexo 48S: interferência com as funções do complexo eIF4F de ligação de tampão ( por exemplo, direccionando a sua subunidade eIF4A) ou fosforilação da subunidade a do factor de iniciação da tradução eIF2, mediada por uma Ou mais das quatro cinases eIF2. A presença de complexos 48S bloqueados ( isto é, subunidades ribossómicas 40S e factores de iniciação de tradução seleccionados) é uma característica dos SG 8 , 9 . SGs foram ligados a vários estados patológicos, tais como infecções virais, neurodegeneração, auto-imunidade e câncer 3 , 10 , 11 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 12 , 13 . As formas mutadas de vários componentes SG estão associadas a doenças neurodegenerativas ( por exemplo, esclerose lateral amiotrófica) nas quais os neurônios exibem inclusões patológicas intracelulares que podem desempenhar papéis ativos na morte neuronal 13 . Alguns vírus sequestrar SG componentes para inibir SG formação e para reforçar a replicação viral [ 14] . Estudos recentes também ligam SGs ao cancro 15 e à sobrevivência das células cancerígenas nos tratamentos de quimioterapia e radioterapia 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Embora tais descobertas tenham estimulado grande interesse na biologia da SG, muitos dos relatórios publicados não têm controles importantes para distinguir a formação de SGs de boa-fé de outros focos induzidos pelo estresse. As SGs foram inicialmente descritas como focos citoplasmï¿½icos nï¿½ membranosos compostos de proteï¿½as de ligaï¿½o a mRNA seleccionadas (RBPs), incluindo o antigï¿½io ntracelular de cï¿½ulas T 1 (TIA-1) e Proteï¿½a de Ligaï¿½o a Poli-A (PABP); Factores de iniciação de tradução; MARN poliadenilado; E pequenas subunidades ribossómicas 4 , 6 , 21 , 22 . Tradicionalmente, a sua composição foi determinada por técnicas como a imunocoloração e a expressão ectópica de proteínas com marcação fluorescente 23 , 24 . Devido à sua natureza altamente dinâmica, a imunolocalização de proteínas SG e / ou mRNAs continua a ser a metodologia de definição para a detecção de SGs 23 , 24 . Até à data, muitas RBP e outras proteínas (mais de 120 proteínas distintas) são descritas como SG componentes [ 11] . QuantasAs proteínas G-localizadas alteram a sua localização tanto de uma forma dependente de stress como de uma forma independente e podem acumular-se em outros compartimentos intracelulares e focos, é importante escolher marcadores SG correctos e empregar critérios funcionais para distinguir SGs de outros tipos de stress induzido Focos Bona fide SGs contêm mRNA, fatores de iniciação de tradução e pequenas subunidades ribossômicas e estão em equilíbrio dinâmico com a tradução. Esse fluxo de trabalho simples é projetado para determinar se os focos induzidos pelo estresse são SGs de boa-fé . Este fluxo de trabalho inclui várias abordagens experimentais usando células U2OS, células comumente usadas para estudar SGs. Estas células são ideais, porque têm um citoplasma grande, são relativamente lisas, e atribuem fortemente aos lamínulas de vidro. Outros tipos de células podem ser usados ​​para estudar SGs, mas é importante estar ciente de que as diferenças no tempo, na concentração de fármacos e na abundância de proteínas nucleantes de SG podem alterar a cinética e a composiçãoPosição. Alï¿½ disso, algumas cï¿½ulas respondem ï¿½fixa de paraformaldeï¿½o formando vesï¿½ulas de superfï¿½ie celular, dando, entï¿½, uma aparï¿½cia abaulada que provoca a localizaï¿½o puncata de alguns marcadores SG; Sem uma análise cuidadosa, estes podem ser classificados erroneamente como SGs. Isso destaca a necessidade de avaliar todos os critérios necessários para identificar focos induzidos pelo estresse como SGs de boa-fé . Vinorelbina (VRB), um cancro terapêutico que promove SGs 20 , bem como Sodium Arsenite (SA), um robusto e bem caracterizado SG indutor, são utilizados como stress para as experiências neste protocolo. As SGs canônicas contêm múltiplos marcadores SG (proteínas e mRNAs) que se colocalizam em focos citoplasmáticos. Este protocolo utiliza tanto a imunofluorescência como a hibridização in situ fluorescente (FISH) para detectar a localização de marcadores de proteína e ARNm poliadenilado 22 , respectivamente. Resumidamente, a imunofluorescência indirecta utiliza anticorpos ( i.E. Anticorpos primï¿½ios) especï¿½icos para uma determinada proteï¿½a para a detectar dentro da cï¿½ula. Em seguida, os anticorpos secundários (geralmente específicos de espécies) ligados a fluorocromos reconhecem o anticorpo primário e revelam a localização da proteína alvo. A microscopia fluorescente é utilizada para detectar o sinal localizado dentro da célula. Utilizar anticorpos produzidos em diferentes espécies e detectá-los com anticorpos secundários de cor diferente permite a detecção da colocalização de múltiplos anticorpos, indicando que os alvos proteicos são encontrados no mesmo local 23 . É importante selecionar marcadores que foram verificados para co-localizar em SGs de boa-fé . FISH usa uma sonda marcada que base-pares para uma determinada RNA ou DNA seqüência [ 25] . Para detectar ARNm, este protocolo utiliza uma sonda de oligo (dT) 40 biotinilada que hibrida (ou pares de bases) com a cauda poliA de mRNA ( isto é, poliA FISH). A sonda biotinilada é então detectada utilizando estreptavidina conjugada com fluorescência, uma vez que a estreptavidina tem uma elevada afinidade para a biotina. Ao avaliar SGs, é importante acoplar poliA FISH com imunofluorescência detectando um marcador SG, como em SGs bona fide , os dois sinais devem colocalize. Usando este protocolo, colocalização é avaliada de várias maneiras. Em uma imagem multicanal ( ou seja, RGB: vermelho, verde e azul), a colocalização alterará a cor do sinal sobreposto ( por exemplo, colocalized vermelho e verde aparecem amarelo) 23 . Adicionalmente, a colocalização é quantificada graficamente usando análise de varredura de linha, onde a intensidade de cada cor é medida através de uma dada linha 8 , 20 . Este protocolo descreve dois procedimentos de análise de varredura de linha usando o ImageJ 26 . Um procedimento é manual e passa por todo o processo,O outro usa uma macro, ou um programa simples que automatiza as etapas manuais. É importante passar pelo programa manual para entender o procedimento macro. SGs formam-se em células onde a tradução é reprimida; Portanto, as células com SGs devem exibir níveis diminuídos de tradução global em comparação com células não tratadas. Experimentalmente, utiliza-se ribopuromicilação. A puromicina e a emetina são adicionadas às células durante um curto período de tempo antes da fixação, permitindo que a puromicina se incorpore aos polipéptidos que formam activamente, causando a terminação 27 , 28 . O tratamento com emetina é necessário para prevenir o re-início 29 . A puromicina pode então ser detectada utilizando anticorpo anti-puromicina, dando um instantâneo de tradução activa. Este método é usado porque é rápido, não requer pré-fome com um meio que não tem um aminoácido particular (e potencialmente pretensão das células), e revela aLocalização subcelular de tradução de proteínas. Outros mï¿½odos, nomeadamente utilizando anï¿½ogos de aminoï¿½idos modificados, tais como o anï¿½ogo de metionina L-azidohomoalaina (AHA), acoplados com a quï¿½ica &quot;click-it&quot; 30 , foram utilizados para mostrar que as cï¿½ulas contendo SG apresentam uma traduï¿½o muito mais baixa do que as cï¿½ulas vizinhas 31 . No entanto, esta técnica requer inanição de metionina seguida de marcação por impulsos durante 15-30 min. A privação de metionina constitui um estresse adicional, enquanto que o longo tempo de marcação ( isto é, 15-30 min) resulta na medição de tradução cumulativa em vez de contínua e também permite que as proteínas recém-sintetizadas se movam do seu local de síntese para o seu destino final dentro do célula. Em contraste, a ribopuromicilação é muito mais rápida e é compatível com qualquer meio, tal como o meio isento de glucose utilizado para induzir SGs através de inanição de glucose. As SGs canônicas estão em equilíbrio dinâmicoCom tradução activa de polissomas. Isto pode ser avaliado experimentalmente por tratamento de amostras com os fármacos que estabilizam ou desestabilizam polissomas, inclinando assim o equilíbrio entre SGs e polissomas 23 . A ciclo-heximida (ou emetina, que se comporta de modo semelhante) bloqueia o alongamento por &quot;congelamento&quot; de ribossomas no mRNA, diminuindo assim o conjunto de mRNPs não polissómicos disponíveis capazes de formar SGs. Experimentalmente, isto pode ser usado de duas maneiras: pela adição de cicloheximida (ou emetina) antes da tensão para prevenir a formação de SG ou pela adição de cicloheximida (ou emetina) após a formação das SGs, mesmo sem remover o agente estressante, causando a desmontagem da SG Os complexos de pré-iniciação são lentamente admitidos na fracção de polissomo. Em contraste, a puromicina provoca a terminação prematura e promove a desmontagem do polissomo, aumentando o conjunto de mRNAs iniciadores capazes de se reunirem em SGs. Experimentalmente, o tratamento com puromicina aumenta o número de SGs ou reduz oD em que se formam em resposta ao stress graduado ou dose de fármaco. Ao avaliar o efeito da puromicina, é importante utilizar um nível sub-máximo do fármaco de interesse, uma vez que se espera que a puromicina aumente o efeito do fármaco e aumente a percentagem de células apresentando SGs - isto não pode ocorrer se o fármaco / Estresse provoca SGs em 100% das células inicialmente. Isto contrasta com o tratamento com cicloheximida, que desmonta as SGs e funciona melhor quando ~ 95% das células inicialmente exibem SGs de modo que a maior diminuição possível pode ser observada e quantificada com precisão. Este protocolo proporciona uma estrutura para estudar SGs em células de mamíferos. Os métodos incluem: (1) coloraï¿½o imunofluorescente e anï¿½ise de ImageJ para avaliar a colocalizaï¿½o dos marcadores SG-associados eIF4G, eIF3b e proteï¿½a de ligaï¿½o de proteï¿½a 1 activadora de Ras GTPase (G3BP1) em SGs putativas; (2) hibridação in situ de fluorescência de oligo (dT) (poliA FISH) para detectar ARNm poliadenilado; (3) tratamento com ciclo-heximida e puromicina para determinar se os focos induzidos pelo estresse estão em equilíbrio dinâmico com polissomos; E (4) ribopuromicilação para avaliar o estado de translação de células contendo SGs putativas. Juntos, estes ensaios podem determinar se os focos induzidos pelo stress podem ser classificados como SGs de boa-fé .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>U-2 OS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174;HTB-96&#8482;</td>
			<td>- commonly written as &#34;U2OS&#34; 
			- culture at 37 &#176;C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>- abbreviated DMEM 
			- contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red 
			- supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin 
			- prewarm prior drug(s) dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td>- abbreviated FBS 
			- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline streptomycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ml</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tissues</td>
			<td>KIMTECH SCIENCE</td>
			<td>34120</td>
			<td>- commonly called &#34;kimwipes&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td>- autoclaved before used 
			- keep sterile in the tissue culture hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium (meta)arsenite &#8805;90%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7400-100G</td>
			<td>- commonly called sodium arsenite and abbreviated SA 
			- dissolution in water at 1 M concentration, then dilute to 100 &#181;M as a working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>TSZ CHEM</td>
			<td>RS055</td>
			<td>- abbreviated VRB 
			- dissolve in water to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9620</td>
			<td>- used to assess translation level (ribopuromycylation) 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emetine dihydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2375</td>
			<td>- used in combination with puro to assess general translation level 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4859</td>
			<td>- abbreviated CHX 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Lonza / VWR</td>
			<td>95042-486</td>
			<td>- abbreviated PBS 
			- wash buffer for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>- make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved 
			- aliquots can be stored at - 20 &#176;C for several months 
			- hazardous, use ventilation 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, ACS</td>
			<td>BDH / VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td>- pre-chilled to -20&#176;C before use 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td>- abbreviated NHS 
			- dilute to 5% in PBS 
			- add sodium azide for storage at 4&#176;C 
			- blocking solution for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC</td>
			<td>Decon Labs / VWR</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>- dilute to 70% with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-81940</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- use at 1/100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti eIF4G antibody (H-300)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-11373</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti eIF3&#951; (N-20) antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-16377</td>
			<td>- eIF3&#951; is also known as eIF3b 
			- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti puromycin 12D10 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE343</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-225-150</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/2500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td>- incubate with secondary antibodies 
			-stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light 
			- Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>016-160-084</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions, then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo-(dT)40x probe biotinilated</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td>/</td>
			<td>- reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20&#176;C 
			- dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use 
			- custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridation box</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>- make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom 
			- prewarm the box prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 x SSC buffer</td>
			<td>Thermo fisher Ambion</td>
			<td>AM9763</td>
			<td>- dilute to 2X SSC using RNase Free water (DEPC treated) 
			- store at room temperature 
			- wash buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfectHybPlus Hybridization Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7033-50ml</td>
			<td>- block and probe incubation buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide mounting media</td>
			<td>home made</td>
			<td>/</td>
			<td>- mix 5 g of &#8220;cold-soluble&#8221; poly(vinyl alcohol) in 20 ml of PBS 
			- mix by sonication, followed by stirring overnight at RT 
			- Add 5 ml of glycerol and 0.2 ml of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT 
			- centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet 
			- aliquot viscous liquid, long-term storage at -20&#176;C, 1 week at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>- usually referred as &#34;parafilm&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-8136-250G</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-100ML</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td>- preservative agent for blocking solution and vinol 
			- make a 20 % dilution in water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules

As células são muitas vezes desafiadas por mudanças ambientais súbitas. Os grï¿½ulos de stress (SGs), complexos de ribonucleoproteï¿½a citoplasmï¿½icos que se formam em cï¿½ulas expostas a condiï¿½es de stress, estï¿½ implicados em vï¿½ios aspectos do metabolismo celular e sobrevivï¿½cia. As SGs modulam as vias de sinalização celular, expressão de genes pós-transcricionais e programas de resposta ao estresse. A formação destes grânulos contendo mRNA está directamente ligada à tradução celular. SG é desencadeada por inibição da iniciação da tradução e a desmontagem SG é promovida por ativação da tradução ou por alongamento da tradução inibida. Esta relação é ainda mais realçada pela composição da SG. Os componentes Core SG são complexos de pré-iniciação de tradução paralisados, ARNm e proteínas de ligação a RNA seleccionadas (RBPs). A finalidade da montagem do SG é conservar a energia celular sequestrando mRNAs arranjados da manutenção da tradução, permitindo a tradução realçada de proteínas stress-responsivas. Em additiSobre os constituintes do núcleo, tais como complexos de pré-iniciação de tradução paralisada, as SGs contêm uma multiplicidade de outras proteínas e moléculas de sinalização. Defeitos na formação de SG podem prejudicar a adaptação celular ao estresse e, assim, podem promover a morte celular. SGs e grï¿½ulos contendo ARN semelhantes foram ligados a vï¿½ias doenï¿½s humanas, incluindo distï¿½bios neurodegenerativos e cancro, levando ao interesse recente na classificaï¿½o e definiï¿½o de subtipos de grï¿½ulos de ARN. Este protocolo descreve ensaios para caracterizar e quantificar SGs de mamíferos.

Os focos induzidos pelo estresse não são necessariamente SGs. As SGs são classificadas como focos citoplasmáticos que contêm mRNAs, factores de iniciação de tradução e proteínas de ligação ao ARN e estão em equilíbrio com a tradução activa. O protocolo acima pode ser usado como um modelo para caracterizar se um determinado estresse induz SGs bona fide . SGs colocalize com outros marcadores SG conhecido...

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Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Os grânulos de estresse (SGs) são estruturas citoplasmáticas não-membranosas que se formam em células expostas a uma variedade de tensões. As SGs contêm mRNAs, proteínas de ligação a RNA, subunidades ribossómicas pequenas, factores relacionados com a tradução e várias proteínas de sinalização celular. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho que utiliza várias abordagens experimentais para detectar, caracterizar e quantificar SGs de boa-fé .

Métodos para classificar os focos citoplasmáticos como grânulos de estresse de mamíferos

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

methods-to-classify-cytoplasmic-foci-as-mammalian-stress-granules

Research

JoVE Journal

Biology

14.5K visualizações.  Brigham and Women's Hospital.  Os grânulos de estresse (SGs) são estruturas citoplasmáticas não-membranosas que se formam em células expostas a uma variedade de tensões. As SGs contêm mRNAs, proteínas de ligação a RNA, subunidades ribossómicas pequenas, factores relacionados com a tradução e várias proteínas de sinalização celular. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho que utiliza várias abordagens experimentais para detectar, caracterizar e quantificar SGs de boa-fé...

Vídeo: Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing e Subcultura células de mamíferos

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Biologia

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Quantificação de γH2AX Focos em resposta à radiação ionizante

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Quantificação de γH2AX Focos em amostras de tecido

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Ativação da apoptose por microinjeção citoplasmática de citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

Visualização de G3BP Estresse grânulos Dynamics em pilhas ao vivo

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

Estimulação da Citoplasmáticas DNA Sensing Pathways<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Métodos para avaliar Subcelulares Compartimentos de músculo em<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis como um modelo para identificar Tradução Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

Ensaio Cometa como uma medida indireta do Systemic Estresse Oxidativo

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...