Damos las gracias a los miembros de los laboratorios Ivanov y Anderson por su útil discusión y comentarios sobre este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud [GM111700 y CA168872 a PA, NS094918 a PI], el Centro Nacional de Ciencias en Polonia [otorgar UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 a WS]. WS también reconoce al Ministerio de Ciencia y Educación Superior en Polonia (Programa Mobility Plus) ya la Comisión Fulbright Polaco-Americana por el apoyo financiero de su investigación en los Estados Unidos.

1. Preparación de células <ol><li> Añadir cubreobjetos autoclavados a 12 pocillos de una placa de 24 pocillos, como se indica en la Figura 1A ; Esto se puede hacer usando una pipeta Pasteur estéril unida a un vacío para recoger cada cubreobjetos. Golpee suavemente la cubreobjetos en el lado del pozo para liberar la succión, permitiendo que la cubreobjetos caiga en el pozo. </li><li> Placa 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) células de osteosarcoma por pocillo a un volumen final de 500 μl de medio. Mueva la placa de lado a lado y arriba y abajo varias veces para asegurarse de que las células están distribuidas uniformemente. </li><li> Presione suavemente los cubreobjetos con una punta P1000 limpia para asegurarse de que el cubreobjetos está en la parte inferior del pozo y que no hay burbujas debajo de la cubreobjetos. </li></ol> 2. Subrayando las células <ol><li> Al día siguiente, revise visualmente la placa para asegurarse de que las células están uniformemente dispersas y uniformemente confluentes a través de la cubreobjetos, ya que las variaciones entre saLos modelos pueden afectar negativamente a la reproducibilidad de los resultados. Utilice un objetivo de 10X en un microscopio invertido de cultivo de tejidos. </li><li> Precaliente el medio a 37 ° C. Evite aplicar medios fríos o calientes a las células, ya que éstas causan choque en frío o choque térmico, respectivamente. </li><li> Diluir los medicamentos en medios precalentados. Para cada concentración de fármaco diferente, preparar 2 pocillos que contienen 500 μl de medio. Prepare 500 μl adicionales para permitir la pérdida mientras se pipetea. Alícuota 4 tubos, cada uno conteniendo 1,5 mL. <ol><li> Para el arsenito de sodio: a cada pocillo que contenga 500 μl, añadir 1,5 μl de arsenito sódico 100 mM (concentración final: 100 μM) o añadir 0,75 μl de arsenito sódico 100 mM (concentración final: 50 μM). </li><li> Para la vinorelbina: a cada pocillo que contiene 500 μl, añadir 22,5 μl de vinorelbina 10 mM (concentración final: 150 μM) o añadir 18,75 μL de vinorelbina 10 mM (concentración final: 100 μM). NOTA: Arsenito de sodio<html> Es un inductor de gránulos de esfuerzo bien caracterizado y comúnmente utilizado y, por lo tanto, se utiliza clásicamente como control positivo. </li></ol></li><li> Retire y deseche el medio de los pocillos B1 - 4 y C1 - 4. Agregue el medio con medicamentos y espere 60 min (Figura 1A). <ol><li> Añadir 500 μl de medio con arsenito sódico 100 μM a los pocillos B1 y B2. Añadir 500 μl de medio con 50 μM de arsenito de sodio a los pocillos B3 y B4. </li><li> Añadir 500 μl de medio con 150 μM de vinorelbina a los pozos C1 y C2. Añadir 500 μl de medio con 125 μM de vinorelbina a los pozos C3 y C4. </li></ol></li><li> 30 min antes de la fijación, tratar los pocillos en la columna 2 con 5 μl de cicloheximida (1 mg / ml de stock) y los pocillos en la columna 4 con 2 μl de puromicina (1,25 mg / ml de stock). Rocíe suavemente la placa para que se mezcle antes de colocar la placa en la incubadora a 37 ° C. </li></ol> 3. Fijación Celular e Inmunofluorescencia Nt &quot;&gt; NOTA: antes del experimento, asegúrese de que el metanol se enfría a -20 ° C. Hacer tampones, incluyendo solución salina tamponada con fosfato (PBS), 5% de suero de caballo normal (NHS) en PBS y 4% de paraformaldehído ) En PBS. <ol><li> Deseche el medio y lave los pocillos que contengan cubreobjetos con PBS. Dependiendo de los fármacos utilizados, puede ser importante descartar adecuadamente los medios que contienen drogas; Póngase en contacto con la oficina de seguridad ambiental local para obtener instrucciones específicas. Para lavar de manera eficiente, llenar una botella de compresión con PBS, cortar la punta para permitir un flujo suave en lugar de una corriente apretada, y utilizar esto para agregar PBS a cada pozo después de aspirar el PBS original. </li><li> Fijar las células utilizando ~ 250 μ l de 4% PFA durante 15 min a RT bajo agitación suave. Cubra completamente la parte superior del cubreobjetos con PFA; 250 μL debe ser suficiente, pero si no, agregue más. Siempre evite pipetear directamente sobre los cubreobjetos, ya que algunas células (o tratamientos de estrés de las células) pueden alterar el apego, y tLa fuerza de la pipeta puede desalojar las células. </li><li> Retire el PFA y deséchelo correctamente. Póngase en contacto con la oficina local de seguridad ambiental para obtener detalles sobre cómo desechar adecuadamente el paraformaldehído. </li><li> A~nadir ~ 250 μl de metanol (-20 ◦ C) e incubar durante 5 min a TA bajo agitación suave; Esto permeabiliza y aplana las células. </li><li> Retirar y descartar el metanol y bloquear las células mediante la aplicación de ~ 250 μ l de NHS al 5% durante 1 h a RT O / N a 4 ° C. Póngase en contacto con la oficina local de seguridad ambiental para obtener más información sobre cómo desechar adecuadamente el metanol. </li><li> Para los anticuerpos primarios, diluir los anticuerpos en NHS al 5%. NOTA: El uso de múltiples marcadores SG es clave para confirmar si los gránulos observados son SGs de buena fe . El número de marcadores SG que se pueden utilizar depende de los filtros disponibles en el microscopio. Si se dispone de juegos de filtros estándar verde, rojo y rojo distante, utilice G3BP1, eIF4G y eIF3b a una dilución de 1/250. <ol><lI&gt; Para este experimento (12 cubreobjetos a 250 μL cada uno-Total: 3 ml de NHS al 5%), añada 12 μl de cada uno de los siguientes: anti-G3BP1, anti-eIF3b y anti-eIF4G. Incubar los anticuerpos primarios utilizando agitación suave durante al menos 1 h a RT o O / N a 4 ° C. </li></ol></li><li> Lavar los pocillos 3x con PBS, e incubar cada lavado durante 5 min. </li><li> Para anticuerpos secundarios, diluir todos los anticuerpos secundarios (dilución 1/250) y colorante Hoechst (dilución 1/1000) en NHS al 5%. <ol><li> Para este experimento (12 cubreobjetos a 250 μL cada uno-Total: 3 ml de NHS al 5%), añada 12 μl de cada uno de los siguientes: Cy2-Ratón, Cy3-Conejo y Cy5-Cabra (una dilución 1/250 de cada uno ) Y añadir 3 μl de colorante Hoechst. </li><li> Incubar los cubreobjetos con los anticuerpos secundarios durante 1 h a RT. Durante este y los pasos siguientes, proteja las muestras de la luz cubriendo la placa con una caja o colocando la hoja sobre la tapa de la placa de la cultura de tejido. </li></ol></li><li> Lava elLls tres veces con PBS durante 5 min cada uno. </li><li> Coloque los cubreobjetos en portaobjetos de vidrio etiquetados utilizando el soporte de montaje. Calentar el medio de montaje en un bloque de calor a 37 ° C durante 10 min; Esto disminuye la viscosidad y facilita la pipeta. Con una punta de corte P200, pipetee 25 μl de medio de montaje por cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio; 4-8 cubreobjetos pueden caber en una diapositiva de cristal, suponiendo que la etapa de microscopio permite esto. Usando fórceps finos, transfiera el cubreobjeto del pozo a la diapositiva, asegurándose de colocar el lado de la celda hacia abajo en el soporte de montaje. Utilizando una punta P200 limpia, presione el cubreobjetos hacia abajo. </li><li> Una vez que todos los cubreobjetos han sido montados, use tejido de laboratorio doblado para limpiar el exceso de medio de montaje presionando el tejido de laboratorio muy firmemente sobre la diapositiva. Utilice una botella de compresión que contenga H2O para eliminar el exceso de medio de montaje y luego repetir la transferencia con el tejido doblado de laboratorio para eliminar el agua. </li></ol> 4. Fluorescencia In Situ &lt;/ Em&gt; Hibridación (FISH) <ol><li> Plato y tratar las células, utilizando los pasos 1 y 2.1-4 como una guía; Sólo es necesario chapar las células en la columna 1, ya que sólo 3 cubreobjetos son necesarios en el siguiente experimento. </li><li> Asegúrese de que todos los tampones están preparados ( es decir, PFA al 4% en PBS, etanol al 70% en agua, 2x Citrato de Sodio Salino (SSC) y NHS al 5%), que el metanol se enfríe a -20ºC y que El horno de hibridación se calienta hasta la temperatura apropiada. </li><li> Lleve a cabo los pasos 3.1-3.3 para lavar y fijar las células. </li><li> Permeabilizar las células mediante la adición de -20 ° C de metanol durante 10 min. </li><li> Retire el metanol e incube los cubreobjetos en etanol al 70%. Colocar la placa a 4 ° C durante la noche. Selle la placa usando parafilm para evitar la evaporación. </li><li> Al día siguiente, eliminar el etanol y rehidratar las células mediante la adición de 500 μ l de 2x SSC. Incubar los cubreobjetos durante 5 min con agitación suave a RT. </li><li> Quite el SSC 2x y añada 500Μl de SSC 2X. Incubar durante 5 min bajo agitación suave. </li><li> Coloque un pedazo de parafilm plano en la parte inferior del horno de hibridación. Pipetear 25 μL de tampón de hibridación sobre el parafilm para cada cubreobjetos. Retire el cubreobjetos del plato de 24 pocillos (en este punto, los cubreobjetos están al lado de la celda hacia arriba) y coloque el cubreobjetos hacia abajo sobre el tampón de hibridación. Hacer esto a 42 ° C o opcionalmente a 65 ° C durante 15 min. NOTA: Completar este paso a 65 ° C desnaturalizará los RNAs celulares; Esto puede mejorar la señal si el poliA está enmascarado por las interacciones con las proteínas. </li><li> Diluir la sonda Biotin-Oligo (dT) (100 ng / μl) en tampón de hibridación a una concentración de 2 ng / μl; 25 μL por cubreobjetos es suficiente. </li><li> Para cada cubreobjetos, pipetee 25 μL de tampón de hibridación que contiene Biotin-Oligo (dT) sobre el parafilm. Recoja el cubreobjetos con una pinza y toque suavemente el borde del cubreobjetos en un tejido de laboratorio para eliminar el excesoTampón de hibridación. Transferir el cubreobjetos al tampón de hibridación con Biotin-Oligo (dT); Recuerde mantener el lado de la celda hacia abajo. </li><li> Coloque los cubreobjetos en una caja de hibridación para limitar la evaporación. Incubar los cubreobjetos con Biotin-Oligo (dT) en tampón de hibridación durante 60 min a 42 ° C. </li><li> Colocar 2 x SSC en el horno de hibridación para permitir que se equilibre a 42 ° C. </li><li> Añadir ~ 500 μl de 2X SSC calentado a los pocillos en el plato de 24 pocillos y usar fórceps para transferir los cubreobjetos al pocillo. Incubar durante 10 min. </li><li> Repetir el paso de lavado anterior dos veces a 42 ° C y después dos veces a TA. </li><li> Complete los pasos 3.5-3.10, asegurándose de usar un fluorocromo de estreptavidina para detectar el Biotin-Oligo (dT) en lugar de un anticuerpo convencional. </li></ol> 5. Ensayo de ribopuromicilación para evaluar el estado translacional <ol><li> Las células U2OS de la placa en cubreobjetos, como se indica en el paso 1, pero sólo la placa un cubreobjetos por condición (en esteCaso, 3 cubreobjetos: no tratado, arsenito de sodio 100 μM y vinorelbina 150 μM) ( Figura 1 A). </li><li> Células de estrés utilizando el protocolo en el paso 2, completando los pasos 2.1-2.4. </li><li> 5 minutos antes de la fijación, añadir 2 μl de puromicina (stock: 1,25 mg / ml, diluir 2 μL en 500 μl para obtener una concentración final de puromicina de 5 μg / ml) y 2,9 μl de emetina (stock: 20 μg / ml; 2,9 μL a la misma solución que ya contiene la puromicina) a cada pocillo que contiene 0,5 ml. </li><li> Completar los pasos 3.1-3.10 como se indicó anteriormente, utilizando un anticuerpo anti-puromicina (dilución 1/1000) para detectar puromicina. Idealmente, use otros dos marcadores SG en los canales restantes. </li><li> Al cuantificar la señal de puromicina, tome todas las imágenes usando la misma exposición. Elija esta exposición utilizando la muestra más brillante (sin tensión) y obtenga una imagen lo más brillante posible sin saturación. NOTA: La intensidad de la señal fluorescente anti-puromicina represMientras que la puromicina sustituye a un aminoácido, se incorpora a la proteína naciente y hace cumplir la terminación prematura de la proteína. </li></ol> 6. Adquisición y análisis de imágenes <ol><li> Cuantificación de Gránulos de Estrés <ol><li> Para cuantificar SGs, adquiera de 3 a 5 imágenes con un total de&gt; 100 células por muestra utilizando un objetivo de 40X. Alternativamente, adquiera imágenes utilizando otros objetivos, pero asegúrese de que se cuenten&gt; 100 células por cubreobjetos y que la ampliación sea lo suficientemente grande para visualizar claramente los gránulos. Hacer esto dividiendo el cubreobjetos en cinco regiones aproximadamente iguales y seleccionando aleatoriamente un campo de cada región ( Figura 1B ); Las imágenes del mismo campo deben incluir todos los canales para evaluar la colocalización de los marcadores. </li><li> Una vez que se hayan adquirido todas las imágenes, combine los canales. Algún software de la cámara hará automáticamente esto, mientras que otros requieren la fusión manual; Esto se puede hacer conImageJ abriendo todas las imágenes y seleccionando [Image | Color | Combinar canales]. </li><li> Contar manualmente el número total de células contando el número de núcleos, utilizando Hoechst como el marcador de núcleos. Contar manualmente el número de celdas que contienen más de dos SG por celda. NOTA: Por ejemplo, usando una imagen de tres canales combinada que muestra G3BP1 (verde), eIF4G (rojo) y Hoechst (azul), cuente los núcleos (o el número de celdas) usando el canal azul. A continuación, cuente las células SG-positivas como aquellas con dos o más focos amarillos por célula. Los gránulos aparecerán de color amarillo, como el verde de G3BP1 y el rojo de eIF4G aparecen en color amarillo si están colocalizados. </li><li> Determine el porcentaje de células que son SG positivo combinando los datos de las 3-5 regiones independientes y luego calcule: Número de SG positivo / número de núcleos) * 100 = porcentaje de células SG-positivas </li></ol></li><li> Evaluación de la Colocalización por Análisis de Análisis de Línea - Método Manual <ol><li> AbiertoImageJ. Descargalo de forma gratuita desde () </li><li> Abra el gestor de ROI: [Analyze | Herramientas | Gerente de ROI ...]. </li><li> Abra la imagen fusionada en ImageJ: [File | Abierto]. </li><li> Utilizando la herramienta de línea situada en la barra de herramientas ImageJ, añada una línea que pasa por un SG, asegurándose de incluir antes y después del SG. Agregue esta línea al gestor de ROI haciendo clic en [Agregar] en la ventana del gestor de ROI. </li><li> Dividir la imagen fusionada en canales separados para evaluar la localización de cada marcador en el gránulo: [Image | Color | Split Channel]; Esto dividirá la imagen fusionada en tres imágenes en blanco y negro. </li><li> En la imagen en blanco y negro, asegúrese de que la línea está seleccionada; La línea se selecciona si aparece en la imagen. Si no, en la ventana del administrador de ROI, haga clic en la línea en el panel; Esto resaltará la línea en azul en la ventana del gestor de ROI y hará que la línea sea visible en la imagen en blanco y negro. Si la línea todavía no aparece, asegúrese de que &quot;mostrar todo&quot; es chEcked en el gestor de ROI y luego haga clic en la línea en la imagen. </li><li> Analizar la intensidad de la línea: [Analizar | Perfil de trazado]; Esto mostrará la ventana &quot;Perfil de trazado&quot;, que traza la intensidad de la señal a través de la línea. </li><li> En la ventana &quot;Perfil de trazado&quot;, haga clic en [Lista], que abre una ventana que contiene los datos sin procesar del gráfico. Copie todos los datos de esta ventana y péguelos en un archivo de hoja de cálculo. Para ello, seleccione todos los datos de la ventana: [Editar | Seleccionar todo]. Copie la fecha: [Editar | Dupdo]. Abra un archivo de hoja de cálculo y pegue los datos: [Editar | Pegar]. </li><li> Complete los pasos 6.2.6 a 6.2.8 para cada canal por separado. Asegúrese de realizar un seguimiento del canal que se está evaluando. </li><li> En una hoja de cálculo, genere un gráfico de líneas de los resultados. Seleccione las columnas que incluyen datos pulsando [control] y haciendo clic en la letra en la parte superior de cada columna. A continuación, seleccione el gráfico de líneas: [Insertar | Gráfico de líneas]. </li><li> Repita este análisis para multLos gránulos de estrés a través de múltiples experimentos independientes. </li></ol></li><li> Evaluación de la colocalización por análisis de barrido de línea - Plugin de ImageJ <ol><li> Descargue e instale la herramienta de perfil RGB del sitio web de ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); Cuando esté correctamente instalado, aparecerá un icono rojo, verde y azul (RGB) en la barra de herramientas. </li><li> Abra la imagen ( por ejemplo, Tiff, JPG) en ImageJ: [Archivo | Abierto]. </li><li> Haga clic en el icono RGB situado en la barra de herramientas de ImageJ. </li><li> Haga clic y arrastre para agregar una línea que se extienda a través de un SG, asegurándose de incluir regiones adyacentes; Una imagen del histograma aparecerá en una ventana emergente. </li><li> Guardar los datos como una imagen: [Archivo | Guardar como | Pelea]. Alternativamente, exporte y luego grafique los datos en otro programa gráfico usando el paso 6.2.8 desde arriba. </li></ol></li></ol>

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L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+TIA-1+and+TIAR+link+the+phosphorylation+of+eIF-2+alpha+to+the+assembly+of+mammalian+stress+granules.">RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 147 (7), 1431-1442 (1999).</li><li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).</li><li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).</li><li>Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+method+for+mapping+genes+on+Drosophila+polytene+chromosomes.">Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (14), 4381-4385 (1982).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> J Cell Biol. 197 (1), 45-57 (2012).</li><li>Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+characterization+of+stress+granules+in+virus+infected+cells.">Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells.</a> Methods. 90, 57-64 (2015).</li><li>David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emetine+optimally+facilitates+nascent+chain+puromycylation+and+potentiates+the+ribopuromycylation+method+(RPM)+applied+to+inert+cells.">Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells.</a> Histochem Cell Biol. 139 (3), 501-504 (2013).</li><li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+visualization+and+dynamics+of+newly+synthesized+proteins+in+rat+hippocampal+neurons.">In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons.</a> Nat Neurosci. 13 (7), 897-905 (2010).</li><li>Ruggieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+oscillation+of+translation+and+stress+granule+formation+mark+the+cellular+response+to+virus+infection.">Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 71-85 (2012).</li><li>Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+contribute+to+alpha-globin+homeostasis+in+differentiating+erythroid+cells.">Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 420 (4), 768-774 (2012).</li><li>Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+RNAi+screen+links+O-GlcNAc+modification+of+ribosomal+proteins+to+stress+granule+and+processing+body+assembly.">A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly.</a> Nat Cell Biol. 10 (10), 1224-1231 (2008).</li><li>Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+pathways+regulated+by+arsenate+and+arsenite.">Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite.</a> Oncogene. 18 (54), 7794-7802 (1999).</li><li>Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic+binding+to+proteins.">Arsenic binding to proteins.</a> Chem Rev. 113 (10), 7769-7792 (2013).</li><li>McDonald, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+(TDP-43)+regulates+stress+granule+dynamics+via+differential+regulation+of+G3BP+and+TIA-1.">TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1.</a> Hum Mol Genet. 20 (7), 1400-1410 (2011).</li><li>Aulas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G3BP1+promotes+stress-induced+RNA+granule+interactions+to+preserve+polyadenylated+mRNA.">G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA.</a> J Cell Biol. 209 (1), 73-84 (2015).</li><li>Martin, S., Tazi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+G3BP+stress+granules+dynamics+in+live+primary+cells.">Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li><li>Wippich, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+specificity+kinase+DYRK3+couples+stress+granule+condensation/dissolution+to+mTORC1+signaling.">Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling.</a> Cell. 152 (4), 791-805 (2013).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Como evidenciado por estudios inmunohistológicos en múltiples enfermedades, el estrés crónico conduce a la formación de diferentes focos intracelulares. Por ejemplo, la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por agregados intracelulares de proteínas insolubles. La presencia de SG-proteínas asociadas en tales agregados es a menudo la base para concluir que tales focos son SGs. Una conclusión similar se deduce también cuando se observan focos citoplasmáticos con marcador positivo en cél...

Las células emplean muchos mecanismos para responder al estrés. Algunas respuestas se producen a nivel post-transcripcional e implican la regulación de la traducción y / o la estabilidad del mRNA 1 , 2 . La detención y degradación de la ARNm de mRNA modulada por estrés se asocian con la formación de focos celulares no membranosos específicos, siendo los más bien caracterizados los Stress Granules (SGs) 3 . Las SGs son focos citoplasmáticos que concentran mRNPs no traducientes en células detenidas en translación que responden al estrés ( por ejemplo, oxidación, choque térmico, inanición de nutrientes e infección viral) 4 . Además de no traducir mRNAs, SGs contienen factores de iniciación de la traducción, RNA-proteínas de unión, y varias proteínas de señalización [ 5] . SGs son biomarcadores de la traducción de proteínas inhibidas y el metabolismo del ARN alterado y se han relacionado con la supervivencia celular y la apoptosis, vía de señalizaciónS, y los procesos nucleares 5 . SGs son entidades dinámicas, y su formación está estrechamente conectado con el estado de la traducción celular [ 6] . A pesar de su aspecto aparentemente sólido, la mayoría de los componentes de la proteína SG transitan rápidamente dentro y fuera, con un tiempo de residencia de segundos. Mientras SGs persistir durante minutos a horas, la mayoría de sus componentes están en rápido flujo. La inhibición de la iniciación de la traducción y el consiguiente desmontaje de los polisomas de translación promueven la formación de SGs; Por lo tanto, SGs están en equilibrio con la traducción de polisomas. Este equilibrio polysome / SG es clave para distinguir los SGs de buena fe de otros focos inducidos por el estrés 6 , 7 . La detención de la iniciación de la traducción implica la conversión de complejos de preiniciación competentes para la traducción que contienen mRNA, factores de iniciación de la traducción (eIF) y subunidades ribosómicas 40S<html> O-llamados 48S complejos) en complejos traslacionalmente estancado (lo que se llama 48S * complejos) que pueden coalescer en SGs 4 , 6 . SGs son promovidos por detención traslacional en dos etapas diferentes antes de la formación del complejo 48S: interferencia con las funciones del complejo eIF4F de unión a la capa ( por ejemplo, dirigida a su subunidad eIF4A) o fosforilación de la subunidad α del factor de iniciación de la traducción eIF2, mediada por una O más de las cuatro quinasas eIF2. La presencia de complejos 48S bloqueados ( es decir subunidades ribosómicas 40S y factores de iniciación de la traducción seleccionados) es un sello distintivo de las SG 8 , 9 . Las SG se han relacionado con varios estados patológicos, como infecciones virales, neurodegeneración, autoinmunidad y cáncer 3 , 10 , 11 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 12 , 13 . Las formas mutadas de varios componentes de SG están asociadas con enfermedades neurodegenerativas ( por ejemplo, esclerosis lateral amiotrófica) en las que las neuronas presentan inclusiones patológicas intracelulares que pueden desempeñar papeles activos en la muerte neuronal 13 . Algunos virus secuestrar componentes SG para inhibir la formación de SG y para mejorar la replicación viral [ 14] . Estudios recientes también vinculan SGs al cáncer 15 ya la supervivencia de las células cancerígenas en tratamientos de quimioterapia y radioterapia 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Si bien estos hallazgos han estimulado un gran interés en la biología de SG, muchos de los informes publicados carecen de controles importantes para distinguir la formación de SGs de buena fe de otros focos inducidos por el estrés. Las SG se describieron inicialmente como focos citoplasmáticos no membranosos compuestos de proteínas de unión a mRNA seleccionadas (RBP), incluyendo el antígeno ntracelular de células T 1 (TIA-1) y la proteína de unión a PolyA (PABP); Factores de iniciación de la traducción; MARN poliadenilado; Y pequeñas subunidades ribosómicas 4 , 6 , 21 , 22 . Tradicionalmente, su composición ha sido determinada por técnicas como la inmunotinción y la expresión ectópica de las proteínas marcadas con fluorescencia 23 , 24 . Debido a su naturaleza altamente dinámica, la inmunolocalización de las proteínas SG y / o ARNm sigue siendo la metodología que define la detección de SGs 23 , 24 . Hasta la fecha, muchas RBP y otras proteínas (más de 120 proteínas distintas) se describen como SG componentes [ 11] . TantasLas proteínas G-localizadas cambian su localización tanto de una manera dependiente del estrés como de una manera independiente y pueden acumularse en otros compartimentos y focos intracelulares, es importante elegir marcadores SG correctos y emplear criterios funcionales para distinguir SG de otros tipos de estrés inducido Focos Bona fide SGs contienen mRNA, factores de iniciación de la traducción, y pequeñas subunidades ribosómicas y están en equilibrio dinámico con la traducción. Este simple flujo de trabajo está diseñado para determinar si los focos inducidos por el estrés son SGs de buena fe . Este flujo de trabajo incluye varios enfoques experimentales utilizando células U2OS, células comúnmente utilizadas para estudiar SGs. Estas células son ideales, ya que tienen un citoplasma grande, son relativamente plana, y se adhieren fuertemente a cubreobjetos de vidrio. Otros tipos de células se pueden utilizar para estudiar SGs, pero es importante tener en cuenta que las diferencias en el tiempo, la concentración de fármacos, y la abundancia de SG-nucleating proteínas pueden alterar la cinética y compoSión. Además, algunas células responden a la fijación de paraformaldehído formando vesículas superficiales de las células, dando entonces un aspecto rizado que causa la localización puntiforme de algunos marcadores SG; Sin un análisis cuidadoso, estos pueden ser clasificados erróneamente como SGs. Esto pone de relieve la necesidad de evaluar todos los criterios necesarios para identificar los focos inducidos por el estrés como SG de buena fe . Vinorelbina (VRB), un cáncer terapéutico que promueve SGs 20 , así como Sodium Arsenite (SA), un robusto y bien caracterizado SG inductor, se utilizan como las tensiones para los experimentos en este protocolo. Canonical SGs contienen múltiples marcadores SG (proteínas y mRNAs) que colocalize en focos citoplasmáticos. Este protocolo utiliza tanto la inmunofluorescencia como la hibridación in situ fluorescente (FISH) para detectar la localización de los marcadores de proteínas y el ARNm poliadenilado 22 , respectivamente. Brevemente, la inmunofluorescencia indirecta utiliza anticuerpos ( i.mi. Anticuerpos primarios) específicos para una proteína dada para detectarla dentro de la célula. Entonces, los anticuerpos secundarios (generalmente específicos de la especie) unidos a los fluorocromos reconocen el anticuerpo primario y revelan la localización de la proteína diana. La microscopía fluorescente se utiliza para detectar la señal localizada dentro de la célula. El uso de anticuerpos producidos en diferentes especies y su detección con anticuerpos secundarios de color diferente permite la detección de la colocalización de múltiples anticuerpos, lo que indica que sus objetivos de proteínas se encuentran en el mismo lugar [ 23] . Es importante seleccionar marcadores que han sido verificados para colocalizar en SGs de buena fe . FISH utiliza una sonda marcada que pares de bases a un ARN o secuencia de ADN específicos [ 25] . Para detectar ARNm, este protocolo utiliza una sonda de oligo (dT) 40 biotinilada que hibrida (o pares de bases) a la cola poliA de mRNA ( es decir, poliA FISH). La sonda biotinilada se detecta entonces utilizando estreptavidina conjugada con fluorescencia, ya que la estreptavidina tiene una alta afinidad por la biotina. Al evaluar SGs, es importante acoplar el poliA FISH con la inmunofluorescencia detectando un marcador SG, como en SGs de buena fe , las dos señales deben colocalize. Usando este protocolo, la colocalización se evalúa de múltiples maneras. En una imagen multicanal ( es decir, RGB: rojo, verde y azul), la colocalización alterará el color de la señal superpuesta ( p. Ej . Color rojo compartido y verde aparecen en color amarillo) 23 . Además, la colocalización se cuantifica gráficamente mediante análisis de barrido lineal, donde la intensidad de cada color se mide a través de una línea dada 8 , 20 . Este protocolo describe dos procedimientos de análisis de exploración de línea utilizando ImageJ 26 . Un procedimiento es manual y pasa por todo el proceso,El otro utiliza una macro, o un programa simple que automatiza los pasos manuales. Es importante pasar por el programa manual para entender el procedimiento macro. Las SG se forman en las celdas donde se reprime la traducción; Por lo tanto, las células con SGs deben mostrar niveles disminuidos de traducción global en comparación con las células no tratadas. Experimentalmente, se usa ribopuromicilación. Puromicina y emetina se añaden a las células durante un breve período de tiempo antes de la fijación, permitiendo que la puromicina se incorpore en polipéptidos que forman activamente, causando la terminación 27 , 28 . El tratamiento con emetina es necesario para evitar la reiniciación 29 . La puromicina puede entonces detectarse usando anticuerpos anti-puromicina, dando una instantánea de la traducción activa. Este método se utiliza porque es rápido, no requiere pre-hambre con un medio que carece de un aminoácido particular (y potencialmente el pretensado de las células), y revela laLocalización subcelular de la traducción de proteínas. Se han utilizado otros métodos, especialmente el uso de análogos de aminoácidos modificados, tales como el análogo de metionina L-azidohomoalaína (AHA), junto con la química &quot;click-it&quot; 30 , para mostrar que las células que contienen SG presentan una traducción mucho menor que las células vecinas 31 . Sin embargo, esta técnica requiere inanición de metionina seguido de marcaje por pulso durante 15-30 min. El hambre por metionina constituye un estrés adicional, mientras que el largo tiempo de etiquetado ( es decir, 15-30 minutos) da como resultado la medición de la traducción acumulativa en lugar de la continua y también permite que las proteínas recién sintetizadas se muevan desde su sitio de síntesis hasta su destino final dentro del celda. Por el contrario, la ribopuromicilación es mucho más rápida y es compatible con cualquier medio, tal como el medio libre de glucosa utilizado para inducir SG a través de la ingesta de glucosa. Los SGs canónicos están en equilibrio dinámicoCon traducción activa de polisomas. Esto puede evaluarse experimentalmente mediante el tratamiento de las muestras con los fármacos que estabilizan o desestabilizar polisomas, por lo tanto, el equilibrio entre la inclinación SGs y polisomas [ 23] . La cicloheximida (o emetina, que se comporta de manera similar) bloquea el alargamiento mediante la &quot;congelación&quot; de los ribosomas en el ARNm, disminuyendo así el grupo de mRNP no polisómicos disponibles capaces de formar SGs. Experimentalmente, esto puede ser utilizado de dos maneras: añadiendo cicloheximida (o emetina) antes del estrés para prevenir la formación de SG o añadiendo cicloheximida (o emetina) después de que se hayan formado los SG, incluso sin eliminar el agente tensor, causando el desmontaje SG, Los complejos de preinitiación se introducen lentamente en la fracción de polisoma. Por el contrario, la puromicina provoca la terminación prematura y promueve el desensamblaje del polisoma, aumentando el grupo de ARNm iniciadores capaces de ensamblarse en SGs. Experimentalmente, el tratamiento con puromicina aumenta el número de SG o disminuye el umbralD en la que se forman en respuesta al estrés graduado oa la dosis de fármaco. Cuando se evalúa el efecto de la puromicina, es importante usar un nivel sub-máximo del fármaco de interés, ya que se espera que la puromicina aumente el efecto del fármaco y aumente el porcentaje de células que presentan SGs - esto no puede ocurrir si el fármaco / Estrés provoca SGs en el 100% de las células inicialmente. Esto contrasta con el tratamiento con cicloheximida, que desensambla SGs y funciona mejor cuando ~ 95% de las células inicialmente muestran SGs de modo que se puede observar y cuantificar con precisión la mayor disminución posible. Este protocolo proporciona un marco para estudiar SGs en células de mamíferos. Los métodos incluyen: (1) tinción inmunofluorescente y análisis ImageJ para evaluar la colocalización de los marcadores clásicos SG asociados eIF4G, eIF3b, y Ras GTPasa-proteína activadora de la proteína de unión 1 (G3BP1) en putativo SGs; (2) hibridación in situ de fluorescencia de oligo (dT) (poliA FISH) para detectar ARNm poliadenilado; (3) tratamiento con cicloheximida y puromicina para determinar si los focos inducidos por el estrés están en equilibrio dinámico con polisomas; Y (4) ribopuromicilación para evaluar el estado de traslación de células que contienen SGs putativas. Juntos, estos ensayos pueden determinar si los focos inducidos por el estrés pueden clasificarse como SGs de buena fe .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>U-2 OS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174;HTB-96&#8482;</td>
			<td>- commonly written as &#34;U2OS&#34; 
			- culture at 37 &#176;C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>- abbreviated DMEM 
			- contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red 
			- supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin 
			- prewarm prior drug(s) dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td>- abbreviated FBS 
			- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline streptomycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ml</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tissues</td>
			<td>KIMTECH SCIENCE</td>
			<td>34120</td>
			<td>- commonly called &#34;kimwipes&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td>- autoclaved before used 
			- keep sterile in the tissue culture hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium (meta)arsenite &#8805;90%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7400-100G</td>
			<td>- commonly called sodium arsenite and abbreviated SA 
			- dissolution in water at 1 M concentration, then dilute to 100 &#181;M as a working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>TSZ CHEM</td>
			<td>RS055</td>
			<td>- abbreviated VRB 
			- dissolve in water to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9620</td>
			<td>- used to assess translation level (ribopuromycylation) 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emetine dihydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2375</td>
			<td>- used in combination with puro to assess general translation level 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4859</td>
			<td>- abbreviated CHX 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Lonza / VWR</td>
			<td>95042-486</td>
			<td>- abbreviated PBS 
			- wash buffer for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>- make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved 
			- aliquots can be stored at - 20 &#176;C for several months 
			- hazardous, use ventilation 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, ACS</td>
			<td>BDH / VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td>- pre-chilled to -20&#176;C before use 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td>- abbreviated NHS 
			- dilute to 5% in PBS 
			- add sodium azide for storage at 4&#176;C 
			- blocking solution for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC</td>
			<td>Decon Labs / VWR</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>- dilute to 70% with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-81940</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- use at 1/100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti eIF4G antibody (H-300)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-11373</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti eIF3&#951; (N-20) antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-16377</td>
			<td>- eIF3&#951; is also known as eIF3b 
			- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti puromycin 12D10 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE343</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-225-150</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/2500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td>- incubate with secondary antibodies 
			-stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light 
			- Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>016-160-084</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions, then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo-(dT)40x probe biotinilated</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td>/</td>
			<td>- reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20&#176;C 
			- dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use 
			- custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridation box</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>- make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom 
			- prewarm the box prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 x SSC buffer</td>
			<td>Thermo fisher Ambion</td>
			<td>AM9763</td>
			<td>- dilute to 2X SSC using RNase Free water (DEPC treated) 
			- store at room temperature 
			- wash buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfectHybPlus Hybridization Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7033-50ml</td>
			<td>- block and probe incubation buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide mounting media</td>
			<td>home made</td>
			<td>/</td>
			<td>- mix 5 g of &#8220;cold-soluble&#8221; poly(vinyl alcohol) in 20 ml of PBS 
			- mix by sonication, followed by stirring overnight at RT 
			- Add 5 ml of glycerol and 0.2 ml of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT 
			- centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet 
			- aliquot viscous liquid, long-term storage at -20&#176;C, 1 week at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>- usually referred as &#34;parafilm&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-8136-250G</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-100ML</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td>- preservative agent for blocking solution and vinol 
			- make a 20 % dilution in water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules

Las células son a menudo desafiadas por cambios ambientales repentinos. Los Gránulos de Estrés (SG), complejos de ribonucleoproteínas citoplasmáticas que se forman en células expuestas a condiciones de estrés, están implicados en diversos aspectos del metabolismo celular y la supervivencia. Las SG modulan las vías de señalización celular, la expresión génica post-transcripcional y los programas de respuesta al estrés. La formación de estos gránulos que contienen mRNA está directamente conectada a la traducción celular. SG se desencadena por la iniciación de la traducción inhibida, y el desmontaje SG se promueve por activación de la traducción o por elongación de la traducción inhibida. Esta relación se pone más de relieve por la composición SG. Los componentes de núcleo SG son complejos de preiniciación de traducción estancados, mRNA, y proteínas RNA-binding (RBPs) seleccionadas. El propósito de la asamblea de SG es conservar la energía celular secuestrando los mRNAs de mantenimiento doméstico traducionalmente estancados, permitiendo la traducción mejorada de proteínas que responden al estrés. En additiSobre los constituyentes del núcleo, tales como complejos de preiniciación de traducción estancada, SGs contienen una plétora de otras proteínas y moléculas de señalización. Los defectos en la formación de SG pueden alterar la adaptación celular al estrés y, por lo tanto, pueden favorecer la muerte celular. Las SG y los gránulos similares que contienen ARN se han ligado a una serie de enfermedades humanas, incluyendo trastornos neurodegenerativos y cáncer, dando lugar al reciente interés en clasificar y definir subtipos de gránulos de ARN. Este protocolo describe ensayos para caracterizar y cuantificar SGs de mamíferos.

Los focos inducidos por el estrés no son necesariamente SGs. Las SG se clasifican como focos citoplásmicos que contienen mRNAs, factores de iniciación de la traducción y proteínas de unión al ARN y están en equilibrio con la traducción activa. El protocolo anterior puede usarse como una plantilla para caracterizar si un esfuerzo dado induce SGs de buena fe . Las SG se colocalizan con otros marcadores SG conoci...

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Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Los Gránulos de Estrés (SG) son estructuras citoplasmáticas no membranosas que se forman en células expuestas a una variedad de tensiones. SGs contienen mRNAs, proteínas de unión a ARN, pequeñas subunidades ribosómicas, factores relacionados con la traducción, y diversas proteínas de señalización celular. Este protocolo describe un flujo de trabajo que utiliza varios enfoques experimentales para detectar, caracterizar y cuantificar SGs de buena fe .

Métodos para clasificar los focos citoplasmáticos como gránulos de estrés de mamíferos

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

methods-to-classify-cytoplasmic-foci-as-mammalian-stress-granules

Research

JoVE Journal

Biology

14.5K vistas.  Brigham and Women's Hospital.  Los Gránulos de Estrés (SG) son estructuras citoplasmáticas no membranosas que se forman en células expuestas a una variedad de tensiones. SGs contienen mRNAs, proteínas de unión a ARN, pequeñas subunidades ribosómicas, factores relacionados con la traducción, y diversas proteínas de señalización celular. Este protocolo describe un flujo de trabajo que utiliza varios enfoques experimentales para detectar, caracterizar y cuantificar SGs de buena fe . ...

Video: Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing Siembra y células de mamífero

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Investigación

Biología

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

La cuantificación de γH2AX focos en respuesta a la radiación ionizante

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

La cuantificación de γH2AX focos en muestras de tejido

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

La activación de la apoptosis mediante microinyección citoplasmática del citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

Visualización de G3BP estrés gránulos Dinámica en Pilas en directo

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

La estimulación de citoplasmáticos de ADN Sensing Pathways<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Métodos para evaluar subcelulares compartimentos de músculo en<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis como modelo para identificar Traducción Deterioro

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

Ensayo Cometa como una medida indirecta de estrés oxidativo sistémico

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...