Yazarlar, Radiobiyoloji servisindeki (Lyon-Sud hastanesi) Anne Charrié&#39;yi ve maddi desteklerinden dolayı Fond National Suisse&#39;yi (FNS) onaylarlar.

1. Hücre Kültürü Ortamlarının ve Çözümlerinin Hazırlanması <ol><li> Kültür ortamının hazırlanması <ol><li> Ham&#39;in F-10 ortamını glutamin (2 mM), penisilin / streptomisin (5 μg / mL final),% 2 Fetal Buzağı Serumu (FCS) ve% 2 serum replasmanı ile takviye ederek çoğalma ortamı hazırlayın. </li><li> Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) glutamin (2 mM), penisilin / streptomisin (5 μg / mL son) ve% 2 FCS ile takviye ederek farklılaşma ortamı (DM) hazırlayın. </li></ol></li><li> Glikoz alım çözümlerinin hazırlanması Dikkat: Radyoaktif maddenin taşınmasına yalnızca sınırlı ve kontrollü bir alanda yetkili personel tarafından izin verilmektedir. Malzeme ve atıklar, uygun prosedürlere, kılavuzlara ve yerel mevzuata uygun olarak ele alınmalıdır. <ol><li> X-Dulbecco fosfat tamponlu salin (X-DPBS) hazırlamak için,% 0.2 (w / v) (son konsantrasyon) sığır serumu alb içeren bir DPBS solüsyonu hazırlayınUmin (BSA). Çözeltiyi 0.2 um&#39;lik bir filtreden geçirin. 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Soğuk 2-deoksi-D-glikoz (2dG) solüsyonu hazırlamak için 16.4 mg 2dG&#39;yi tartın ve 10 mM&#39;lik bir çözelti elde etmek için 10 mL damıtılmış suda çözünürleştirin. 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Radyoaktif olarak işaretlenmiş 2dG (2dG *) çözeltiyi elde etmek için 600 μL soğuk 2dG ve 6 μL radyoaktif işaretlenmiş [3H] 2dG&#39;yi 5400 μL X-DPBS&#39;ye ekleyin. NOT: Nihai konsantrasyon 1 mM 2dG&#39;dir ve etiketleme 1 mcC / mL&#39;dir. <ol><li> Radyoaktif olarak işaretlenmiş 2dG * solüsyonundan 20 μL&#39;lik bir alikot (TC20) ayırın. </li></ol></li></ol></li><li> Kuluçka karışımlarının hazırlanması <ol><li> Sitokalasin B karışımı için, 2 mL radiolabeled 2dG * solüsyonuna 2 mcL 20 mM sitokalazin B ilave edin. NOT: Sitokalasin B stok solüsyonu dimetil sülfoksid (DMSO) içinde 10 mg / mL&#39;dir. </li><li> DMSO karışımı için kalan 4 mL radyoaktif işaretlenmiş 2dG * çözeltisine 4 uL DMSO ekleyin. </li></ol&gt; </li></ol> 2. İnsan Primer Kas Hücrelerinin Kültürü <ol><li> İnsan kaslı uydu hücreleriyle 6 oyuklu plakaların tohumlanması NOT: Dondurulmuş bir flakondan (250.000 hücre içeren) ticari olarak temin edilebilen insan kaslı uydu hücrelerini şirket içinde kullanın (bkz. Referans 24 ). Tek bir durumda glikoz alımının ölçümü için gerekli olan bir 6 kuyulu plaka elde etmek için aşağıdaki prosedür 250,000 hücre için verilmiştir. <ol><li> İçinde 24 bulunan donmuş flakonları veya önceden hazırlanmış ılık suda (37 ° C) insan kas uydu hücrelerinin ticari preparatlarını flakona sadece küçük bir buz bloğu kalana kadar hızla çözdürür. </li><li> Doğrudan 10 mL önceden ısıtılmış (37 ° C) PM içeren 50 mL&#39;lik bir plastik tüp içine dökün. </li><li> 500 xg&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı atın. </li><li> Hücre pelletini, önceden ısıtılmış PM&#39;nin 18 mL&#39;si ile hafifçe tekrar süspanse edin (her biri 42.000 hücre elde etmek için3 mL orta). 6 oyuklu bir plakanın (9.6 cm2) her oyuğuna 3 mL dağıtın. NOT: Bir plakanın altı ayrı oyuğu, pasif nakil inhibisyonu (kuyucuk 1 ve 2), bazal hız (kuyu 3 ve 4) ve insülinle uyarılan hız (kuyular 5 ve 6). Farklı tedavilere ihtiyaç duyulduğundan altı kuyucuklu plakaları tekrarlayın. </li><li> Hücreler% 90 konfluansa erişene kadar standart kültür koşullarında (37 ° C,% 5 CO2) inkübe edin. NOT: Bu adım, hücre partisine bağlı olarak 48 - 72 saat arasında sürer. Bu adımda orta maddeyi değiştirmeyin. </li></ol></li><li> Kas hücrelerinin farklılaşması <ol><li> PM&#39;yi alın (48-72 saat sonra) ve önceden ısıtılmış DM (kuyucuk başına 3 mL) ile değiştirin. 37 ° C&#39;de,% 5 C02&#39;de inkübe edin. NOT: Farklılaşma, hücrelerin hizalanması ve polinükleer hale getirildiği istikrarlı bir duruma erişmek için beş gün sürer. Tipik olarak birincilMiyotüpler, 1 g / L glikoz ortamında kültürlenir. Bu nedenle, kültür esnasında şeker tükenmesini önlemek için, yeterli glikoz substratının her zaman hücreler için mevcut olduğundan emin olmak için plakayı 3 mL ortam ile doldurun. </li><li> DM ortamını iki günde bir değiştirin. NOT: Bu noktadan itibaren, miyotüpler önemli bir değişiklik olmaksızın 7 gün boyunca kararlıdır ve glikoz alım ölçümleri her an yapılabilir. </li></ol></li><li> Kas hücresi tedavisi (opsiyonel) NOT: Birincil miyotürler, insülin uyarımı ve glikoz alım ölçümlerinden önce modifikasyon (uyuşturucu testi, sinyal yolunun inhibitörleri / aktivatörleri vs. ) uyandırmak için birkaç gün tedavi edilebilir. Kas hücreleri insülin hassasiyetini etkileyebilecek her tedaviye tabi tutulabilir ve glikoz alım ölçümleri bu etkiyi nicelleştirir. Örneğin, kas hücrelerinin doymuş yağlı asit palmitat ile kuluçkalanması insülin direncini arttırır ve hücreler azaltılmış iNsulin, glikoz alımını uyarmıştır. <ol><li> % 10 BSA (yağ asidi içermeyen) ve 0.5 mL palmitat (PALM) ile desteklenmiş 12 mL DM hazırlayın. Sadece% 10 BSA (yağ asidi içermeyen) ile desteklenmiş 12 mL DM hazırlayın. </li><li> İnsan primer miyotları ile iki 6 oyuklu levha hazırlayın ve bölümler 2.1 ve 2.2&#39;de (5 günlük farklılaşma ile) açıklandığı gibi kültürleyin. </li><li> 5. günde, her oyuğu 2 mL PBS ile yıkayın. Bir tabağa, PALM içeren 2 mL DM ekleyin. Diğer plakaya yalnızca DM içeren 2 mL BSA ilave edin. </li><li> 48 saat boyunca 37 ° C&#39;de,% 5 C02&#39;de inkübe edin. </li></ol></li></ol> 3. İnsülin Uyarımı <ol><li> Farklılaşmış kas hücrelerini iki kez 2 mL PBS ile yıkayın. </li><li> PBS&#39;yi dikkatlice çıkarın ve serum tükenmesi için 3 saat boyunca (37 ° C,% 5 CO 2 ) FCS içermeyen 3 mL DM ile inkübe edin. </li><li> Tüm kuyularda bulunan ortamları FCS içermeyen 3 mL DM ile değiştirin. Kuyu 5 ve 6&#39;ya 100 nM insülin ekleyin. </li><li> Için insan miyotüp kültürü kuluçkalayın1 saat (37 ° C,% 5 C02). </li></ol> 4. Glikoz Alımı <ol><li> 1 saatlik insülin stimülasyonundan sonra, oyukları X-DPBS ile yıkayın (yıkama başına 1 mL). </li><li> 1 mL sitokalazin B karışımı kuyu 1 ve 2&#39;ye ve 1 mL DMSO karışımı çukurlara 3 - 6 ekleyin. 15 dakika inkübe edin (37 ° C,% 5 CO 2 ). Kuluçka işleminin sonunda, plakayı derhal buzda bekletin. </li></ol> 5. Hücre Lizizi <ol><li> Hücreleri 1 mL buz soğukluğundaki PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> Hücreleri, 600 uL 50 mM NaOH ile her oyukta Lyse. 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve yavaş yavaş yörünge dönüşü ile karıştırın. NOT: Lizat çok yapışkan ise, 1.5 mL NaOH ile seyreltin. </li><li> Bir pipet kullanarak, tekrar askıda bırakın ve hücre lizatını toplamayın. </li></ol> 6. Radyolabellenmiş Glikoz Tayini <ol><li> Bir sıvı sintilasyon sayma flakonda her bir hücre lizatı 400 mcL koyun. 400 ile negatif kontrol flakonu hazırlayın50 mM NaOH&#39;nin 50 uL&#39;si ve 20 uL TC20 ile pozitif bir kontrol şişesi (basamak 1.2.3.1&#39;den). </li><li> Her flakona 4 mL sıvı sintilasyon solüsyonu ilave edin. Kapağı kapatın ve her şişeyi iyice karıştırın (1-2 s). </li><li> Her şişeyi bir sıvı sintilasyon sayacına yerleştirin ve üreticinin talimatlarına göre radyoaktiviteyi ölçün. Her sintilasyon flakonu için 10 dk için dakika başına rekor (BGBM) kaydedin. NOT: CPM = &quot;dakika başına parçalanma&quot; x &quot;sayım verimliliği&quot;. </li></ol> 7. Glikoz Alım Oranı <ol><li> Kalan lizatı (200 uL, adım 5.2&#39;den itibaren) protein konsantrasyonunu ölçmek için kullanın. Her hücre lizatının protein konsantrasyonunu Bradford 25 veya eşdeğer bir yöntem kullanarak belirleyin. Her kuyu için toplam protein miktarını (Q) mg cinsinden hesaplayın. </li><li> TC1 (1 μL radyoaktif işaretli 2dG * değeri) elde etmek için, TC20&#39;nin BGBM değerini 20&#39;ye bölün. </li><li> Her şişe için tGlikoz alımı oranı şu şekildedir: <img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/55743/55743eq1.jpg" /> NOT: R, pmol / mg / dak olarak ölçülür. Kuyular 1 - 2 için R ortalaması, pasif nakliye oranını, R p&#39;yi verir . 3-4 kuyu için R ortalaması, bazal toplam nakliye oranını, Rbt&#39;yi verir . Kuyular 5-6 için R değeri, insülinle uyarılan toplam nakil oranını verir, R it . <ol><li> Bazal aktif nakil oranını (R ba ) aşağıdaki gibi hesaplayın: <img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/55743/55743eq2.jpg" /></li><li> İnsülin ile uyarılan aktif aktarım hızını ( Rıa ) aşağıdaki gibi hesaplayın: <img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/55743/55743eq3.jpg" /> NOT: Miyotüpler gibi insüline duyarlı hücrelerde, glikoz alım hızı genellikle üç değerle temsil edilir: R ba , Rıa ve kat insülin uyarımı Rıa / R ba olarak . </li></ol></li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Glukoz alımı, hücre kültürü üzerindeki aktivatörleri veya inhibitörleri test etmek için önemli biyolojik bir ölçümdür ve glikoz kullanımını nasıl etkilediği ve hücrenin insüline cevap verme yeteneği. Burada açıklanan yöntemin hızlı ve güvenilir olduğu gösterilmiştir ve sağlıklı kişilerden ve / veya metabolik olarak etkilenen hastalardan alınan primer miyotları kullanan birçok çalışmada yaygın olarak kullanılmaktadır 6,7,10,12,21,26,27,36,37. Sadece bir 6 kuyucuklu plaka ile, ...

İskelet kası, memelilerdeki en büyük glikoz mevduat ve büyük ölçüde glikoz homeostazına katkıda bulunur. Bu insülin yanıt veren doku, insülin stimülasyonu 1 tarafından tetiklenen glikoz alımının birincil bölgesidir. Tip 2 diyabette, iskelet kası da dahil olmak üzere çeşitli dokularda insülin direnci gözlenir ve normal kan şekeri konsantrasyonunun üstünde seyreder. Bu nedenle, bir öznedeki bir kusurun karakterize edilmesine mi yoksa iyileştirmek isteyen bir tedavinin verimliliğini değerlendirmeye mi götürmesi gerektiği gibi, bu dokunun ve hücrelerinin insülin duyarlılığının seviyesinin belirlenmesi büyük önem taşır. Insan ya da hayvan konularda, insülin duyarlılığını değerlendirmek için altın standart tekniği, hiperinsülinemik-öglisemik klipstir. DeFronzo tarafından 1979 2&#39;de tanıtıldı ve 3 , 4&#39;den sonra değiştirildi, yöntem tüm vücudu a veDokular insülin tepkisi, normal kan şekeri konsantrasyonunu korumak için insülin uyarımı altında perfüze edilecek glikoz oranı olarak ölçülmüştür. İnsülin duyarlılığı araştırması, in vitro kas modelleri kullanılarak hücre seviyesinde de yapılabilir ve glikoz alım oranlarının ölçümü, hücrenin insülin stimülasyonuna biyolojik tepkisini ölçmek için etkin ve güvenilir bir araç olarak kalır 5 , 6 , 7 . Aslında, glikoz alım ölçümleri, insülin reseptörüne bağlanmasından, GLUT4 zenginleştirilmiş vezikülleri translokasyonuna kadar ve hücre içi sinyalizasyon ve fosforilasyon kaskadları dahil olmak üzere, insülin stimülasyonuna verilen hücre biyolojik tepkisini niceleştirir. Farklılaşmış miyotlar, verici fenotipin metabolik özellikleri de dahil olmak üzere pek çok özelliğini muhafaza ettiği için insan numuneleri ile büyük ilgi görüyor.Hastalarda görülen bozukluklar ve bozukluklar 9 , 10 , 11 , 12 . Miyotüpler, glikoz taşıyıcıları 15 ve hücresel insülin sinyalleme makineleri 16&#39;nın ekspresyonu dahil olmak üzere iskelet kasına 13 , 14 yapısal, metabolik ve fenotipik benzerlikler gösterir. Bu nedenle, primer miyotlarda glikoz alımı ölçümü, bir donörün kas fenotipinin karakterize edilmesi veya bir müdahalenin (ilaç, beslenme veya fiziksel aktivite) kas hücresindeki insülin duyarlılığı üzerindeki etkisinin araştırılması ile ilgilidir. Kültürlenmiş miyotlarda glikoz alımı ölçümü, insülin duyarlılığını değiştiren deneyler yaparken güvenilir bir araçtır17,18. In vitro </Em&gt; modeli, insülin yanıt vermeyi iyileştirebilen veya edinilen veya indüklenen insülin direncini 19 , 20 , 21 , 22 , 23 engelleyebilen veya tersine döndürebilen herhangi bir bileşiğin testi için uygundur. Burada insan miyotlarını kültürlemek ve ayırmak ve hücre glikoz alım hızlarını ölçmek için ayrıntılı bir protokolü açıklıyoruz. Bu yöntem, laboratuvar ortamındaki preparatlardan, işbirliğinden ya da piyasada bulunan tedarikçilerden gelmiş olmasına rağmen, insan kas öncül hücrelerinin herhangi bir kaynağına uygulanabilir. Fare ve sıçan kökenli sırasıyla C2C12 ve L6 gibi ölümsüzleştirilmiş kas hücre çizgileri, bu protokolle glikoz alım ölçümleri için de kullanılabilir 7 . Radyoaktif işaretli [ 3 H] 2dG&#39;yi kullanarak bazal ve insülinle uyarılmış haldeki oranları ölçmek için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. TEtiketli bir glikoz analoğunun kullanılması, birincil hücrelerle çalışıldığında ortak bir koşul olan indirgenmiş başlangıç ​​materyali ile glikoz girişinin doğru bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Modifiye glikoz molekülü, metabolik yollara giremiyor ve böylece hücre içinde birikiyor ve toplam hücre radyoaktivitesi aracılığıyla güvenilir bir şekilde ölçülebiliyor. Deneysel koşullar arasında bir glikoz transport inhibitörü (sitokalasin B) kullanımı yer alır ve ölçümler insülin ile veya insülinsiz yapılır. Bu kombinasyon, glukoz aktif giriş hızlarının belirlenmesine ve insülin tepki indeksi için kat değişikliğinin hesaplanmasına izin verir. Yöntem tek bir kuluçka süresi boyunca bir doz insülin ile sunulur, ancak protokol doz yanıtı ya da zaman dersi deneyleri için kolayca modifiye edilebilir 12 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="868">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:180px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:257px;">If not available, use commercial source</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">Promocell</td>
			<td>C-12530</td>
			<td style="width:257px;">Should be cultured with associated media C23060 and C23061</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">6-well plate</td>
			<td style="width:171px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">356400</td>
			<td style="width:257px;">BioCoat Collagen I Multiwell Plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0145-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Glutamine</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">X0551-100</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">penicilin/streptomycin 100x</td>
			<td style="width:171px;">Thermo fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15140122</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Serum substitute UltroserG</td>
			<td style="width:171px;">Pall France</td>
			<td style="width:180px;">15950.017</td>
			<td style="width:257px;">serum substitute in text</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DMEM low glucose</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0064-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td style="width:171px;">Eurobio</td>
			<td style="width:180px;">CVFSVF00-01</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0625-500</td>
			<td style="width:257px;">Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Insulin solution human</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">I9278</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">2-deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">D6134</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Albumin bovine</td>
			<td style="width:171px;">euromedex</td>
			<td style="width:180px;">04-100-812-E</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">fatty acid-free BSA</td>
			<td style="width:171px;">Roche</td>
			<td style="width:180px;">10,775,835,001</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">palmitate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">P0500</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">NET328A001MC</td>
			<td style="width:257px;">Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">c2743</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PICO PRIAS VIAL 6ml</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">6000192</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ultima gold MW CA&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td>6013159</td>
			<td style="width:257px;">scintillation liquid</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">b&#234;ta counter&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">2900TR</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glucose uptake measurement and response to insulin stimulation in in vitro cultured human primary myotubes

İskelet kası, memelilerdeki en büyük glikoz mevduat ve büyük ölçüde glikoz homeostazına katkıda bulunur. Kas glikoz metabolizmasını araştırmaya ve metabolik değişiklikleri karakterize etme amaçlı tüm çalışmalar için kas hücrelerinin insülin duyarlılığının değerlendirilmesi büyük önem taşımaktadır. Kas hücrelerinde, glukoz taşıyıcı tip 4 (GLUT4) proteinleri, insüline tepki olarak plazma membranına translokasyon yapar, böylece hücrenin içine glükoz girmesini sağlar. Kas hücrelerinin glikoz alım oranını arttırarak insüline cevap verme yeteneği, insüline karşı kas hücrelerinin duyarlılığını ölçmek için standart okumalardan biridir. İnsan primer miyotları, in vitro model olarak uygundur, çünkü hücreler insülin duyarlılığı da dahil olmak üzere verici fenotipin birçok özelliğini korurlar. Bu in vitro model de insülin yanıt vermeyi etkileyebilecek herhangi bir bileşiğin testi için uygundur. Farklı miyotlarda glikoz alım hızı ölçümleriInsülin duyarlılığı. Bu yöntemde insan primer kas hücreleri, in vitro kültürlenerek farklılaşmış miyotlar elde edilir ve insülin stimülasyonu olan ve olmayan glikoz alım hızı ölçülür. Radyoaktif işaretli [3H] 2-deoksi-D-Glukoz ([3H] 2dG) kullanılarak pasif ve aktif glikoz taşınım oranlarını belirlemek için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. Hesaplama yöntemleri, aktif bazal ve insülin tarafından uyarılan hızların yanı sıra stimülasyon katının miktarını belirlemek için sağlanır.

3. günde miyoblastlar konfluansa ulaşır ( Şekil 1A ). Bu aşamadaki miyoblastlar tipik olarak mononükleotiddir. Ortam değiştirildi ve 8. günde farklılaşma tamamlandı ( Şekil 1B ) (protokol bölümü 2). 5 gün farklılaştıktan sonra, miyotlar hizalanır ve tipik olarak polinükleere edilir. İnsan primer miyotları, glikoz alım hızı ölçümünden önce bir palmitat veya bir BSA&#39;ya uygulanmıştır. Hücrele...

Watch this Scientific Journal Video about Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes at JoVE.com

İn Vitro Kültürlü İnsan Birincil Miyotüplerinde Glikoz Alımı Ölçümü ve İnsülin Stimülasyonuna Yanıt | Biyoloji | Video

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Bu yöntemde insan primer kas hücreleri, in vitro kültürlenerek farklı miyotüpler elde edilir ve glikoz alım hızı ölçülür. Radyoaktif işaretli [ 3 H] 2-deoksi-D-Glikoz kullanarak bazal ve insülinle uyarılmış haldeki oranları ölçmek için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz.

Glikoz Alımı Ölçümü ve İnsülin Uyarıcısına Yanıt<em&gt; In vitro</em&gt; Kültürlü İnsan Primer Miyotları

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

glucose-uptake-measurement-response-to-insulin-stimulation-in-vitro

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Cellular Processes

Metabolism

SCIENTISTS IN ACTION

19.7K Görüntüleme.  University of Lyon.  Bu yöntemde insan primer kas hücreleri, in vitro kültürlenerek farklı miyotüpler elde edilir ve glikoz alım hızı ölçülür. Radyoaktif işaretli [ 3 H] 2-deoksi-D-Glikoz kullanarak bazal ve insülinle uyarılmış haldeki oranları ölçmek için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. 

Video: Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Biyoloji

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

İnsülin Enjeksiyon ve Yetişkin İnsülin Hassasiyet Tedbir hemolimf Ekstraksiyon Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Sıçan Karaciğer Hücreleri İzolasyon ve İlköğretim Kültür

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

Kültürlü organel Ulaşım<em&gt; Drosophila</em&gt; Hücreler: S2 Hücre Hattı ve İlköğretim Nöronlar.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

Sitoplazmik DNA Algılama Pathways uyarılması<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Hydra Glutatyon kaynaklı Besleme Tepki Ölçüm

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the large size of the human BRCA2 protein (approximately 390 kDa). We report modifications of standard siRNA transfection and immunoblotting protocols to silence human BRCA2 and detect endogenous BRCA2 protein, respectively, in human epithelial cell lines. Key steps include a high siRNA to transfection reagent ratio and two subsequent rounds of siRNA transfection within the same experiment. Using these and other modifications to the standard protocol we consistently achieve more than 70% silencing of the human BRCA2 gene as judged by immunoblotting analysis with anti-BRCA2 antibodies. In addition, denaturation of the cell lysates at 55 &#176;C instead of the conventional 70-100 &#176;C and other technical optimizations of the immunoblotting procedure allow detection of intact BRCA2 protein even when very low amounts of starting material are available or when BRCA2 protein expression levels are very low. Efficient silencing of BRCA2 in human cells offers a valuable strategy to disrupt BRCA2 function in cells with intact BRCA2, including tumor cells, to examine new molecular pathways and cellular functions that may be affected by pathogenic BRCA2 mutations in tumors. Adaptation of this protocol for efficient silencing and analysis of other &#39;large&#39; proteins like BRCA2 should be readily achievable.

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

Susturulması<em&gt; BRCA2</em&gt; Kültür İnsan hücrelerinde Roman BRCA2 düzenlenmiş Biyolojik Fonksiyonları Belirlemek İçin

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Gap Junctional Hücreler arası iletişim: Doğal Ürünler Toksikantların ve Toksinler Yan Etkileri değerlendirmek için Fonksiyonel Biyomarker ve Sağlık Faydaları

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

Dictyostelium discoideum yanıt-e doğru akut mekanik stimülasyon değerlendirilmesi

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...