Bu teknik önemlidir, çünkü canlı Drosophila dokularındaki belirli hücrelerde glikoz alımını ölçebilir. FRET tabanlı sensör, hücre içi glikoz seviyelerindeki değişikliklerin doğrudan ölçüsünü sağlar. Bu teknik, araştırmacıların ALS modellerinden canlı motor nöronlar içinde kontrollere karşı glikoz seviyelerindeki değişiklikleri gerçek zamanlı olarak değerlendirmelerini sağlar.
Zorlu bir husus, tamponu değiştirdikten sonra aynı nöron kümesini görüntülemektir. Numuneyi mikroskopta bırakmak, VMC'nin mümkün olduğunca az hareket etmesine yardımcı olur. Diseksiyonlara başlamadan önce görüntüleme mikroskobu ve lazerleri açın.
Daha sonra dolaşan üçüncü bir instar larva toplayın, çift damıtılmış su ile durulayın ve daha önce hazırlanmış bir elastomer astarlı kabın üzerine bir damla HL3 tampona yerleştirin. Daha sonra bir diseksiyon mikroskobu altında, larvayı böcek pimleriyle uzunluk açısından dikkatlice gererek larvanın ön ve arka uçlarını, dorsal tarafı yukarı sabitlemek için bir çift ön uç kullanın. Açılı bir çift Iris makası kullanarak, arka pimin hemen üzerinde bir kesi yapın.
Daha sonra kesiden larvaların ön ucuna doğru dikey bir kesim yapın. Gerekirse birkaç damla HL3 tamponu ekledikten sonra, merkezi sinir sistemini bozmadan trakeayı ve yüzen organların geri kalanını çıkarın. Daha sonra kanatları sabitleyerek, nöromüsküler sistemi sağlam tutarken merkezi sinir sistemini ortaya çıkarmak için vücut duvarını gerin.
Görüntü alımı için 40 kat su daldırma lensi ile dik konfokal mikroskop kullanın. Ardından CFP'yi heyecanlandırmak için 405 nanometre lazeri seçin. Ardından, tarama hızı, ortalama, hedef, yakınlaştırma iğne deliği boyutu ve uzamsal çözünürlük gibi edinme parametrelerini optimize edin.
Kazancı, sinyalin en uygun dinamik aralıkta olması için ayarlayın ve tüm genotipler için aynı parametreleri kullanın. Motor nöronları ventral sinir kordonu içinde görüntülemek için, diseksiyonlu numuneye sahip silikon kabı lensin altına yerleştirin ve trehaloz sakkaroz HL3 tamponu ile temas etmesi için lensi küçümseyin. Lensin arabelleğe tamamen batırıldığından emin olun ve gerekirse daha fazla arabellek ekleyin. Önümüzdeki.
CFP ve FRET kanallarını kullanarak, ventral sinir kordonu orta çizgisi boyunca bulunan odaktaki en az altı motor nörondan oluşan bir optik seçimi manuel olarak seçin. Ardından 10 dakika boyunca her 10 saniyede bir görüntü alın. Bu görüntüler taban çizgisini temsil eder.
Glikoz stimülasyonu için Pasteur pipet kullanarak HL3 tamponu içeren trehaloz sakkarozunu çıkarın ve ventral sinir kordonunu hareket ettirmeden beş milimoler glikoz takviyeli HL3 tamponu ekleyin. Ardından 10 dakikada bir 10 dakikada bir görüntü alın. Bu görüntüler stimülasyon aşamasını temsil eder.
Görüntüleri CZI dosyaları veya görüntüleme yazılımı tarafından desteklenen herhangi bir dosya türü olarak tarih, genetik arka plan, deneysel durum ve kullanılan kanallar dahil olmak üzere bir dosya adıyla kaydedin. Tüm genotipleri görüntülemek için parametreleri yeniden kullanın. Görüntü işleme için Fiji-ImageJ görüntüleme yazılımını açın, ardından CZI dosyalarını açın, hiper yığınla görünüm yığınını seçin ve renk modunu gri ölçeğe ayarlayın ve kanalları ayrı pencerelere bölün. Önümüzdeki.
Drift düzeltme eklentileri, turbo reg ve stack reg kullanarak görüntüleri işleyin. Her kanal, eklentiler altında yığın reg'i seçip çeviriye dönüştürmeyi seçerek ayrı ayrı düzeltilir. Tüm zaman serisi boyunca odakta kalan tüm motor nöronları izleyerek ilgi alanlarını veya ROI'leri manuel olarak seçin.
Ardından, her motor nöron anahattını kaydetmek için yatırım getirisi yöneticisini kullanın. Her zaman noktasındaki her yatırım getirislerindeki ortalama gri değeri ölçmek için çok ölçüm işlevini kullanın. Ardından, ilk kanaldan izlenen ROI'leri, uyarım öncesi görüntü için ikinci kanala kopyalayın.
Veri analizi için, FRET ve CFP kanallarının ortalama gri değerlerini kullanarak FRET'i CFP oranına göre hesaplayın. FRET'te CFP oranlarına göre yapılan değişiklikler hücre içi glikoz konsantrasyonundaki değişiklikleri yansıtır. Ardından FRET'i her yatırım getirisi ve zaman noktası için cfp oranlarına göre çizin.
Motor nöronlarda glikoz alımını ölçmek için genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı bir glikoz sensörü kullanıldı. Glikoz sensöre bağlı olmadığında, CFP ekscitasyonu yalnızca CFP emisyonuna neden olur. Glikoz bağlandığında, CFP ve YFP arasında meydana gelen FRET nedeniyle YFP sinyali tespit edilebilir.
Burada gösterilenler, TDP-43 mutant nöronlarında temel ve stimülasyon koşullarında glikoz sensörü kontrollerinde FRET ve CFP sinyallerinin görüntüleridir. Her görüntüde yatırım getirisi örneği olarak temsili bir motor nöron özetlenmiştir. Glikoz stimülasyonu üzerine, glikoz sensörlerini ifade eden kontrol motor nöronları, Glikoz alımında küçük bir artış gösterirken, TDP-43'ü ifade eden nöronlar önemli ölçüde daha yüksek bir glikoz alımı gösterdi.
TDP-43 mutant motor nöronların CFP oranları ile daha fazla FRET, her zaman noktasında glikoz sensörü kontrollerine normalleştirildi. Temel koşullar altında, genotipler arasında bir fark yoktu. Bununla birlikte, glikoz stimülasyonu üzerine, TDP-43 mutantlarında kontrole kıyasla glikoz alımında hızlı ve önemli bir artış gözlenmiştir.
Bir çubuk grafik gösteriminde, glikoz sensörunu ifade eden nöronlardaki glikoz stimülasyonu, temele kıyasla FRET'te CFP oranına göre küçük ama önemli bir artış göstermiştir. Buna karşılık TDP-43'i ifade eden nöronlar, stimülasyona bağlı olarak taban çizgisine göre önemli bir oran artışı göstermiştir. TDP-43'ü ifade eden motor nöronlar ile glikoz sensörü arasındaki CFP oranları ile FRET'teki net fark%10,9 civarındadır Zaman yönetimi bu prosedür için kritik öneme sahiptir, böylece nöronlar görüntüleme sırasında ölmezler.
Bunu önlemek için diseksiyonları hemen takip etmek önemlidir. Bu teknik, nöronlarda glikoz metabolizmasının önemini vurgulamış ve grubumuzun glikolizin motor nöron yenilenmesindeki rolünü daha fazla araştırmasına yol açmıştır.
