Bu eser Avrupa Topluluğu [FP7-insanlar-2011-IAPP proje 285827 (EPIXCHANGE)] bir hibe tarafından desteklenmiştir.

Tüm deneysel protokoller Ferrara Üniversitesi etik kurul için hayvan deney ve İtalyanca Sağlık Bakanlığı tarafından kabul edildi. VARIŞ (hayvan araştırma: Raporlama In Vivo deneyler11) yönergeleri takip etti.
1. kuvars iğneler hazırlanması
<ol><li>Temiz ve distile suda 5 dk, 5 dk etanol % 99 ve 5 dakika içinde Dietil eter yerleştirerek ( Tablo malzemelerigörmek) kuvars kılcal sterilize.</li>
	<li>Kılcal koyup tamamen kuruyuncaya kadar bırakın en az 1 h için başlık altında bırakın.</li>
	<li>Bir lazer çektirmenin bireysel ihtiyaçlarına bağlı olarak yeterince uzun, yeterince ince bir iğne imalatı izin parametrelere göre kullanarak iğneler hazır olun. Not: Biz bir lazer çektirmenin kullanın (bkz. Tablo malzeme). Bir iki satır program çekmek için kullanın. Yüksek güç, en büyük tarama uzunluğu (FİLAMENTLER DEĞERİNE karşılık gelen) ve çekerek güç kullanmaya ilk satırını kullanır. Bu parametreler birleşimi kılcal büyük iç/dış boyutu uzun bir iğneyle şekillendirme için izin en düşük uzantısı hızı ile en büyük bölümü erime yol açar ve şaft düşük. Bu şekilde, bir yüksek mekanik direnci ve tıkanma olmadan kök hücre veya viral parçacıkların geçişini sağlayan geni iç çapı iğne korur. Ucu çok küçük ve uzun, gerekli mekanik ve şekil özellikleri eksik olmadan önce hız ve gecikme bu program satırının kapiller uzantısı durdurmanız gerekir. Kuvars soğuduktan sonra çekerek programının ikinci satır otomatik olarak çalıştırılmasına (5 s). Güç, filaman ve kuvvet çekme bir ucu kısa olası ipucu uzunluğu ve bir ipucu kopma iki iğnelerle ayrılması kaçınarak dik shank ile kesmek için fonksiyonel parametreleridir. Düzenli olarak, bizim ekipman ile aşağıdakileri kullanın: (a) Line 1 = güç 990, filaman 5, hız 130, gecikme 110, çekme 0; (b) satır 2 = güç 970, gecikme 70, filament 3, hız 0 0 çekin.</li>
	<li>İğneler daha önce % 70 etanol ile temizlenmiş Petri kabına koyun.<ol>
<li>Bir plastik parafin film ile çanak kapağı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kılcal mikro-tetkik kes.<ol>
<li>Başlangıç lazer güç doğrulamak için bir hazneler süreç çalıştırmak ve teslim enerji ver. Sonra kesme parametreleri ayarlayın. Not: Biz bir mikro-tetkik kullanın (bkz. Tablo reçetesi) ve aşağıdaki parametreleri: lazer güç darbe enerji (63 µJ), lazer ışın çapı maksimum diyafram % 20 (maksimum diyafram: 1.0 µm) ve kesme hızı maksimum hız (maksimum % 10 hız: 30 µm/s).</li>
		<li>Sıkıca iğne mikroskop tablosunu düzeltmek ve ucu bilgisayar ekranın ortasına konumlandırın.</li>
		<li>Menü çubuğunda kalem simgesine tıklayın ve bir işareti iğne lazer kesme için çizmek için kullanın. Not: Cut iğne yüzeyi ile ilgili yaklaşık 45 ° açılı olması gerekir.</li>
		<li>Yan çubuğu işlevi önceden işaretlenmiş nokta kesmek lazer izin vermek için "kesin Başlat" düğmesini içeren bayrağı seçin.</li>
		<li>Gerekirse, yan hole(s) 1.5.2-3 içinde açıklanan yordamları yineleyerek kesilmiş; iğne (şekil 1) yeniden konumlandırmak için gerek yoktur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Temizlik sonrası kesti.<ol>
<li>İğne geçersiz bir pompa ile bir plastik tüp takın.</li>
		<li>Pompa açmak ve el ile ılımlı bir hızda (3 µL/dak) ileriye doğru akış oranını ayarlamak.</li>
		<li>% 99 etanol Aspire kesme nedeniyle kirleri çıkarmak için ilk ve daha sonra distile su.</li>
		<li>Tekrar kurutma kolaylaştırmak için % 99 etanol Aspire edin. Not: Her adım en az 3 dakika sürmelidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İğneler düzgün kapalı kabında cerrahi güne kadar saklayın.</li>
	<li>İğne yeniden kullanılabilir; deney sonunda, temiz çamaşır suyu ve etanol çözüm ve olası doku artıklarını çıkarın. Bir daha eksiksiz, iğne ucunu aşağı doğru işaret eden bir micropipette depolama kavanoza koyup temizlik için ipuçları kaplıdır kadar kavanoz distile su ile doldurun, kalan herhangi bir doku kaldırın, sonra etanol ile yıkamak için 1,5 dakika kaynatın.</li>
</ol>2. yordam
<ol><li>Pompa kullanım kılavuzu tarafından sağlanan yönergeleri izleyerek, pompa çapı/hacim mikroenjeksiyon şırınganın göre kalibre ve 0.3 µL/dak akış hızı ayarlamak için Ayarlar menüsünü seçin.</li>
	<li>((Örneğin, Hamilton iğne, 30 G) künt bir iğne ve kısa politetrafloroetilen tüp ile donatılmış) bir 10 mL şırınga steril su ile doldurun ve mikroenjeksiyon şırınga (sonra çok dikkatli piston çıkarmak) ve enjeksiyon doldurmak için kullanın Montaj parçaları kiti için el ile mikroenjeksiyon pompa (MMP). Not: MMP kit stereotaksik çerçeve (Şekil 2) iğnede güvenli bir şekilde bağlamak için kullanılır. Kiti içerir: politetrafloroetilen boru, radarı boru coupler, pipet tutucu ve contalar Pipetler farklı dış çapı için.</li>
	<li>İğne MMP teçhizat-e doğru bağlamak.<ol>
<li>Daha fazla su sistemi genelinde 10 mL şırınga temizler ve su dışında iğne gelir olup olmadığını kontrol edin. Not: doldurma adımları tekrar uygulayarak sistem içinde herhangi bir hava kabarcığı kaldırdığınızdan emin olun.</li>
	</ol></li>
	<li>10 mL şırınga yavaş yavaş piston bir damla su mikroenjeksiyon şırınga üstündeki bırakmak için bastırıyor ise mikroenjeksiyon şırıngadan çıkarın. Piston mikroenjeksiyon şırıngada yerleştirin.</li>
	<li>Mikroenjeksiyon şırınga pompa bağlanmak ve 0.3 µL/dak akış hızı ayarlayın. Not: bir damla iğneyi ucundan sızıntı tamamlanana kadar bekleyin ve sonra başka bir 3 dakikadır gidelim.</li>
	<li>Akış 0.1 µL/dk az ayarlayın ve cerrahisi prosedürü başlatın. Pompa ameliyat yaparken sürekli olması gerekir. Not: Bu makalesinde bildirilen deneyler için biz erkek Sprague Dawley Rat 300 g (3 ay-in yaş) kullanın. Ancak, yordamı özellikle fareler diğer türler için geçerlidir.</li>
	<li>Genel anestezi yerel düzenlemelere tarafından onaylanmış bir yöntemi kullanarak neden. Not: Anestezi için 20-50 dk 85 mg/kg ketamin ve 8 mg/kg xylazine mayi enjeksiyon (IP) bir karışımı kullanın. Kuyruk ve/veya ayak Pinch hayvan tamamen uyuşturulmuş emin olmak için kullanılır önemlidir. Anestezi ve temel hayati önce ameliyat başlar ve ameliyat yaparken her 10 min izlenen değerlendirildi. Hayvan vücut ısısı sırasında ve sonrasında cerrahi işlemler yeniden Isıtma yastığını dolaşan bir su kullanarak daha önce sabit tutulur. Hayvanlar kadar tamamen iyileşti izlenir (örneğin dik ve Ambulatuvar vardır). Ayrıca, hayvanlar üç gün boyunca post-operatively her 24 h analjezikler (tramadol, 5-7 mg/kg ı.p.) alırsınız.<ol>
<li>Hayvanın kafasını tıraş ve yeterince için aseptik cerrahi cerrahi site hazırlamak. Bir iki aşamalı bodur iyot tabanlı çözüm (betadin) % 70 etanol tarafından takip ile gerçekleştirin. Ayrıca, asepsis korumak için cerrahi sitesi cerrahi örtüsü ile sarın (video gösterim amacıyla çıkarılmıştır).</li>
	</ol></li>
	<li>Fareyi stereotaksik çerçevede yeniden Isıtma battaniye dolaşan bir su üzerinde konumlandırın. Ek ağrı sağlamak için % 0.5 lidokain çözüm ameliyat yerinde geçerli (7 mg/kg fazla olamaz). Önceden tüm cerrahi aletler sterilize de %2 oxazolidin artı %7.05 fenol (Sporodicin veya Cidex) aletleri immerging tarafından bir boncuk Sterilizatör veya sıvı soğuk dezenfeksiyon kullanarak durulama steril su veya serum fizyolojik ile izledi. Dezenfeksiyon prosedürleri arasında bile gerçekleştirilmelidir. Bir boyuna kesim kafatası üzerinde steril neşter kullanarak yapmak. Aşırı kanama önlemek için nazik ol. Düz bir spatula kullanarak kafa derisi açın ve cerrahi klipleri onu açık tutmak için cilt kapakları üzerinde uygulayın. Çok yavaşça bregma ve hangi aracılığıyla iğne eklenir kafatası alan duyurmak kapaklarini bağlantısını kesin.</li>
	<li>(Akış devam eden ise) stereotaksik karede kol mount ve tam olarak bregma, ucu kırmamaya dikkat üzerine iğne ucu taşıyın. Bregma antero-posterior ve medio-lateral koordinatlarını açıklama ekleyin ve istediğiniz koordinatları tercüme. Bir stereomicroscope tarafından yönlendirilen, iğne ucu neredeyse kafatası dokunuyor kadar düşük, sondaj spot mark biraz stereotaksik kol yükseltme sonra.</li>
	<li>Matkap (matkap ucu Ø: 0.8 mm; matkap hızı: 1000 devir/dakika) işaretli nokta kafatasında. Beyin zarı Delme işlemler sırasında nüfuz değil bakım alınması gerekir. Delme sırasında kemik hasarı ve nekroz önlemek için steril serum fizyolojik damla.</li>
	<li>Plastik parafin film küçük bir parça keser ve kafatasında yerleştirir. 10 µL damlalıklı kullanarak, plastik parafin filmde enjekte için çözüm teslimatı yap. Pompa kes, biraz itici pompa almak ve mikroenjeksiyon şırınga piston hafifçe çekerek kılcal içinde küçük bir hava kabarcığı oluşturun.</li>
	<li>İğne ucu damla ulaşıncaya kadar stereotaksik kolu indir. Örnek (çok yavaş) herhangi bir kabarcık oluşumu kaçınarak mikroenjeksiyon şırınga piston çekerek çizin. Pompa itici piston ile temas halinde eski yerine koymak ve pompanın debisi 0,3 µL/dak bekle, bir sonraki adıma devam etmeden önce bir damla (bir kaç dk) oluşumu kadar açın. Not: mevcut örnek deneyde, yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) içinde striatum infüzyon (AP: +1.5, ML: ±2.7; DV:-5.0) ve dorsal hippocampus (AP:-3.5, ML: ±2.1; DV:-3.5; dura üzerinden mm), 2 µL/site. İki enjeksiyon yöntemleri arasında karşılaştırma kolaylaştırmak için her beyin alan bir Yarımküre ve 26 G künt bahşiş kuvars iğne veya diğer 30 G eğim-tip paslanmaz çelik iğne kullanarak infüzyon.</li>
	<li>Daha düşük akış 0.1 µL/dk, dura bir paslanmaz çelik eğim uçlu iğneyle nick ve beyin dokusu girerek dorso-ventral balta stereotaksik kolunda yavaşça indirin. İstediğiniz konuma geldiğinde, bir ek 0,1 mm pompa durdurmak, stereotaktik kol tarafından 0,1 mm yükseltmek ve 0.3 µL/dk akış istasyonlarında baştan gidin. Not: iğne düşürürken bir yavaş akış sağlamak için neden küçük parçaları iğne kendisi doku penetrasyonu önler bir pozitif basınç sağlamaktır. Böyle bir durumda çözüm teslimini bozulması uç, engel. İğne ve düşürücü hızını düşürerek yaklaşık 10 s/mm ise akış hızı çok yavaş olduğu için bu iğne parça kalır çözüm miktarda bu hedef sitede enjekte karşılaştırıldığında yok denecek kadar azdır anlamına gelir. Bu önlem iğneler ile yan delik kullanırken gerek kalmayabilir.</li>
	<li>Sayacı başlatmak ve enjekte etmek için istenen birimde bağlı olarak ihtiyaç duyduğu zaman (2 µL enjekte Eğer örneğin, 6 dk 40 sn) bekleyin. Kabarcık hareketi enjekte ederken izlemek. Sonunda, pompa durdurun ve yavaş yavaş iğne almadan önce 5 dakika bekleyin. Kuvars iğne tamamen ayıklandığında, pompa yeniden başlatın ve iğne ucunda bir damla oluşumu için kontrol edin.</li>
	<li>Kafatası yüzey kemik balmumu ile açılış mühür, Kan durdurucu sargı küçük resimleri kaldırmak ve kafa derisi dikiş, yara bir antibiyotik krem (örneğin, neosporin) ile çevresini kat ve hayvan ev kafese döndürür. Not: Bu makalede açıklanan deneyler için kurumsal etik kurul tarafından onaylanmış ötenazi Protokolü hayvanlar derin 43 mg/kg ketamin ve 7 mg/kg xylazine bir ı.p. enjeksiyon ile anestezi ve kesti. 48 h ve parafin gömülü için formalin postfixed beyin çıkarıldı. Koronal bölümler (8 µm) beyin bir microtome kullanarak dilimlenmiş.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kirik, D., Rosenblad, C., Bj&#246;rklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+behavioral+and+neurodegenerative+changes+following+partial+lesions+of+the+nigrostriatal+dopamine+system+induced+by+intrastriatal+6-hydroxydopamine+in+the+rat.">Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat.</a> Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).</li><li>Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eltoprazine+prevents+levodopa-induced+dyskinesias+by+reducing+striatal+glutamate+and+direct+pathway+activity.">Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity.</a> Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).</li><li>Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+pay+attention:+attentional+performance+time-stamped+prefrontal+cholinergic+activation,+diurnality,+and+performance.">Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance.</a> J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).</li><li>Shoichet, M. S., Winn, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+delivery+to+the+central+nervous+system.">Cell delivery to the central nervous system.</a> Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).</li><li>Simonato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+gene+therapy+for+neurological+disorders.">Progress in gene therapy for neurological disorders.</a> Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).</li><li>Bj&#246;rklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-and+Long-Term+Consequences+of+Intracranial+Injections+of+the+Excitotoxin,+Quinolinic+Acid,+as+Evidenced+by+GFA+Immunohistochemistry+of+Astrocytes.">Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes.</a> Brain Res. 317, 267-277 (1986).</li><li>Paradiso, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+delivery+of+fibroblast+growth+factor-2+and+brain-derived+neurotrophic+factor+reduces+spontaneous+seizures+in+an+epilepsy+model.">Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).</li><li>Falcicchia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+Status+Epilepticus-Induced+BDNF+Expression+with+Herpes+Simplex+Virus+Type-1+Based+Amplicon+Vectors.">Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors.</a> PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).</li><li>Munoz, J. L., Coles, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz+micropipettes+for+intracellular+voltage+microelectrodes+and+ion-selective+microelectrodes.">Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes.</a> J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+research:+reporting+in+vivo+experiments:+the+ARRIVE+guidelines.">Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).</li><li>Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+cell+therapies+to+the+clinic:+characteristics+of+cell+suspensions+in+large-diameter+injection+cannulae.">Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae.</a> Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu makalede açıklanan tekniği için çeşitli amaçlar12gerçekleştirilen microinjections optimize etmek için giriş bölümünde özetlenen ihtiyaçlarını yerine getirir. Burada açıklanan iğneler zarar en az, aslında algılanabilir seviyeye azaltmak; varyans (viraj eğilimli olduğunu) cam iğneler ile kuvars iğneler sert ve derin koordinatlarındaki bile istenen beyin bölgesi güvenilir bir doz emin olun. Ayrıca, ucu delik beyin dokusu içinde ekleme sırasında t?...

Microinjections farmakolojik aktif bileşikler teslim etmek için uzun bir süre için belirli beyin alanlarda nöronal aktivite modüle için kullanılmıştır. Buna ek olarak, toksinler nörodejeneratif olaylar karakteristik bazı hastalıkların, örneğin 6-hidroksi-Parkinson hastalığı taklit etmek için nigrostriatal dopamin sisteminde dopamin taklit etmek için belirli nöron popülasyonları yakınındaki enjekte kullanılmıştır 1 , 2 veya anma 192 IgG saporin lezyon kolinerjik sistemi3için. Daha yakın zamanlarda, mikroenjeksiyon işlemleri viral vektörler veya hücreleri Greftler deneysel beyin bozuklukları4,5gen veya hücre tedavisi için teslim etmek için kullanılmaktadır.
Bu çalışmalarda kullanılan iğneler klasik tip paslanmaz çelikten imal edilmiştir. Ne kadar kolay ve pratik kullanmak, bir dizi sorunları6çelik iğneler var: onlar nispeten büyük ve doku hasarı, kan - beyin bariyerini kaçağı ve astrocytes; aktivasyonu ile neden Ayrıca, onlar bir engel oluşturmak veya hatta tamamen kaçınmak istediğiniz çözüm akışının iğne alır beyin dokusunun Asitleme üretebilir. Daha yakın zamanlarda, hazırlanan özel kılcal damarlar üzerinden tanıtıldı içinde cam iğne7,8kullanın. Bunlar önemli doku hasarı ne de astrocyte harekete geçirmek, neden olmaz ama nispeten esnek ve yerelleştirme (kişisel gözlemler) doğruluğunu azaltarak derin yapılarını tanıttığında viraj.
Bu nedenle olası hasar olduğu kadar hassasiyet ve tekrarlanabilirlik artırırken (özellikle hasar iyileşir deneyler yaparken) azaltmak için bir ihtiyaç olduğunu (Yani, tüm çözüm iletilmesini sağlamak ve doğru yerelleştirme emin olun). Ayrıca, en iyi beyin alanlarda değişen geometrileri ile enjekte çözüm dağıtımını sağlamak için farklı iğne tasarımları kullanmak arzu olacaktır. Bu makalede, biz hazırlamak ve kuvars iğneler microinjections kemirgen beyin için kullanmak için bir iletişim kuralı tanımlamak. Yüksek erime noktası nedeniyle kuvars kılcal bir geleneksel çektirmenin çekti ve bu nedenle, geçmişte iğneler oluşturmak için kullanılmamış. Kuvars, ancak, cam, özellikle yüksek sertlik ve ara direnç9bazı önemli avantaj sunar. Onların sertlik nedeniyle kuvars iğneler ideal enjeksiyonları ventral beyin bölgeleri için uygundur. Onların kırılma direnci nedeniyle onlar bile karmaşık geometriler10ile beyin bölgeleri hedefleme en etkili kanıtlayabilir tasarımlar elde birden fazla delik eklemek modellenebilir.

<table><tbody><tr><td>Quartz capillaries</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA USA</td><td>Q100-50-10</td><td>Without filament</td></tr><tr><td>Puller</td><td>Sutter</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette storage jar</td><td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td><td>E210</td><td></td></tr><tr><td>Laser microdissector</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>LMD6500</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe</td><td>Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, St&amp;Yuml;tzerbach, Germany</td><td>19138-U</td><td></td></tr><tr><td>Microinfusion pump</td><td>Univentor, Zejtun, Malta</td><td>Model 864</td><td></td></tr><tr><td>Manual microinjection pump kit</td><td>WPI</td><td>Item#: MMP-KIT</td><td>Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame</td></tr><tr><td>Precision Drill</td><td>Proxxon</td><td>28510 MicroMot 50/E</td><td>Ball bearing drive shaft with variable speed</td></tr><tr><td>Artficial Cerebral Spinal Fluid</td><td>Tocris</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel</td><td>Hamilton</td><td>26 G Blunt: 19138-U&lt;br/&gt; 30 G Bevel: 20757</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica, Germany</td><td>LEICA RM212RT</td><td></td></tr></tbody></table>

personalized needles for microinjections in the rodent brain

Microinjections uyuşturucu ya da toksinlerin belirli beyin bölgeleri içinde teslim etmek için uzun süre kullanılmıştır ve daha yakın zamanlarda, bunlar gen veya hücre terapi ürünleri teslim etmek için kullanılmıştır. Ne yazık ki, şu anki mikroenjeksiyon teknikleri için birden çok nedeni suboptimal çelik veya cam iğne kullanın: özellikle, çelik iğneler doku hasarına neden olabilir ve cam iğne eğmek derinden hedef bölge eksik beyin düşürdü. Bu makalede, biz hazırlamak ve yararlı özellikleri birleştirmek kuvars iğne kullanmak için bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu iğneler tespit doku hasarı üretmek değildir ve çok sert olmak, güvenilir teslim istenen beyin bölgesinde derin koordinatları kullanırken bile olun. Ayrıca, birden fazla delik istenilen çap yaparak iğne tasarımını kişiselleştirmek mümkündür. Enjeksiyon hücrelerinin büyük delikler kolaylaştırmak, ancak birden fazla delik çözüm daha büyük bir alan içinde büyük miktarda enjeksiyon kolaylaştırmak. Buna ek olarak, bu kuvars iğneler temizlenmesi ve kullanılan, yeniden öyle ki yordamı maliyet-etkin hale gelir.

Biz fare dorsal Hipokampus ve striatum iki klasik, 26 G künt end ve 30 G eğimli kenar ile karşılaştırıldığında bir kuvars iğne (60 µM dış çapı uç; bir 20 µM çapı yan delik; tip C, şekil 1) kullanarak doğrudan mikroenjeksiyon tarafından indüklenen zarar göre Paslanmaz çelik iğneler. Bu amaç için aCSF sağ 2 µL enjekte ve dorsal Hipokampus ve sırasıyla kuvars ve çelik iğne ve, 48 saat sonra enjeksiyon kullanarak striatum yaptı...

Watch this Scientific Journal Video about Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain at JoVE.com

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Biz burada mikroenjeksiyon kuvars iğneleri kullanan kemirgen beyin için bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu iğneler değil algılanabilir doku hasarı üretmek ve derin bölgelerde bile güvenilir teslim edilmesini sağlamak. Ayrıca, araştırma ihtiyaçlarına tarafından kişiselleştirilmiş tasarımlar adapte edilebilir ve yeniden kullanılabilir.

Microinjections kemirgen beyin için kişiselleştirilmiş iğneler

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

personalized-needles-for-microinjections-in-the-rodent-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K Görüntüleme.  University of Ferrara. Biz burada mikroenjeksiyon kuvars iğneleri kullanan kemirgen beyin için bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu iğneler değil algılanabilir doku hasarı üretmek ve derin bölgelerde bile güvenilir teslim edilmesini sağlamak. Ayrıca, araştırma ihtiyaçlarına tarafından kişiselleştirilmiş tasarımlar adapte edilebilir ve yeniden kullanılabilir.

Video: Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

Bozulmamış 3-D Beyin Devrelerin Hedefleme Viral için Ölçeklenebilir akışkan Enjektör Diziler

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Nörobilim

Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an injecting needle produces during its trajectory is a major concern especially in the mouse brain for not only the brain is small but also sometimes multiple injections are needed.  We show here a method to produce glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen which significantly reduces the brain damage and allows a precise targeting into the rodent brain. This method allows a delivery of small volumes (from 20 to 100 nl), reduces bleeding risks, and minimizes passive diffusion of drugs into the brain parenchyma. By using different size of capillary glass tubes, or changing the needle lumen, several types of substances and cells can be injected. Microinjections with a glass capillary tube represent a significant improvement in injection techniques and deep brain targeting with minimal collateral damage in small rodents.

In this article, we show a method to make glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen. This technique significantly reduces the brain damage, minimizes passive diffusion of drugs and allows a precise targeting into the rodent brain.

İlaçlar, Viral Vektörler, veya Hücre Transplantasyon teslimi için Microinjections Derin Beyin Yapıları Hedefleme

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.

Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.

Kemirgen Beyin Mikroenjeksiyon Moleküler Alt Tabakalar Motive Davranış Eğitim için

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Davranış

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing system was developed that allows for the injection of a drug while recording electrophysiological signals from the affected neuronal population. This method provides a simple and economical alternative to commercial solutions. A glass pipette was modified by combining it with a hypodermic needle and a silver filament. The injectrode is attached to commercial microsyringe pump for drug delivery. This results in a technique that provides real-time pharmacodynamics feedback through multi-unit extracellular signals originating from the site of drug delivery. As a proof of concept, we recorded neuronal activity from the superior colliculus elicited by flashes of light in rats, concomitantly with delivery of drugs through the injectrode. The injectrode recording capacity permits the functional characterization of the injection site favoring precise control over the localization of drug delivery. Application of this method also extends far beyond what is demonstrated here, as the choice of chemical substance loaded into the injectrode is vast, including tracing markers for anatomic experiments.

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve kemirgen Beyindeki inhibitör Ajanların Mikro-enjeksiyon

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal resolution from shallow and deep brain regions. Their use has been hindered, however, by mechanical and structural mismatches between the probes and brain tissue that commonly lead to micromotion and gliosis with resulting signal instability in chronic recording experiments. In contrast, following the implantation of ultraflexible mesh electronics via syringe injection, the mesh probes form a seamless, gliosis-free interface with the surrounding brain tissue that enables stable tracking of individual neurons on at least a year timescale. This protocol details the key steps in a typical mouse neural recording experiment using syringe-injectable mesh electronics, including the fabrication of mesh electronics in a standard photolithography-based process possible at many universities, loading mesh electronics into standard capillary needles, stereotaxic injection in vivo, connection of the mesh input/output to standard instrumentation interfaces, restrained or freely moving recording sessions, and histological sectioning of brain tissue containing mesh electronics. Representative neural recordings and histology data are presented. Investigators familiar with this protocol will have the knowledge necessary to incorporate mesh electronics into their own experiments and take advantage of the unique opportunities afforded by long-term stable neural interfacing, such as studies of aging processes, brain development, and the pathogenesis of brain disease.

Mesh electronics probes seamlessly integrate and provide stable, long-term, single-neuron level recording within the brain. This protocol uses mesh electronics for in vivo experiments, involving the fabrication of mesh electronics, loading into needles, stereotaxic injection, input/output interfacing, recording experiments, and histology of tissue containing mesh probes.

Stabil Kronik kemirgen Elektrofizyoloji için şırınga enjekte edilebilir Mesh elektronik

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...

Biyomühendislik

Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, manipulate, and follow single cells in the brain tissue with high resolution over time. This task is extremely challenging due to the complexity of tissues in the brain. We have recently developed a robot, that guide a microinjection needle into brain tissue upon utilizing images acquired from a microscope to deliver femtoliter volumes of solution into single cells. The robotic operation increases resulting an overall yield that is an order of magnitude greater than manual microinjection and allows for precise labeling and flexible manipulation of single cells in living tissue. With this, one can microinject hundreds of cells within a single organotypic slice. This article demonstrates the use of the microinjection robot for automated microinjection of neural progenitor cells and neurons in the brain tissue slices. More broadly, it can be used on any epithelial tissue featuring a surface that can be reached by the pipette. Once set up, the microinjection robot can execute 15 or more microinjections per minute. The microinjection robot because of its throughput and versality will make microinjection a broadly straightforward high-performance cell manipulation technique to be used in bioengineering, biotechnology, and biophysics for performing single-cell analyses in organotypic brain slices.

This protocol demonstrates the use of a robotic platform for microinjection into single neural stem cells and neurons in brain slices. This technique is versatile and offers a method of tracking cells in tissue with high spatial resolution.

Robotik Mikroenjeksiyon Kullanarak Beyin Dilimlerinde Tek Nöral Kök Hücre ve Nöronların Manipülasyonu

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Nöral Kök Hücrelerin Sıçan ve Fare Beynine İntra-Arteriyel Teslimatı: Serebral İskemiye Uygulama

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Farelerde Serbest El Yaklaşımı Kullanılarak İntraserebrovülriküler Enjeksiyon Yapılması

Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice

The investigation of neuroendocrine systems often requires the delivery of drugs, viruses, or other experimental agents directly into the brains of mice. An intracerebroventricular (ICV) injection allows the widespread delivery of the experimental agent throughout the brain (particularly in the structures near the ventricles). Here, methods for making free-hand ICV injections in adult mice are described. By using visual and tactile landmarks on the heads of mice, injections into the lateral ventricles can be made rapidly and reliably. The injections are made with a glass syringe held in the experimenter&#39;s hand and placed at approximate distances from the landmarks. Thus, this technique does not require a stereotaxic frame. Furthermore, this technique requires only brief isoflurane anesthesia, which permits the subsequent assessment of mouse behavior and/or physiology in awake, freely behaving mice. Free-hand ICV injection is a powerful tool for the efficient delivery of experimental agents into the brains of living mice and can be combined with other techniques such as frequent blood sampling, neural circuit manipulation, or in vivo recording to investigate neuroendocrine processes.

Yazar Spotlight: Üreme Nörokontrolünde İçgörüler, Yenilikler ve Gelecekteki Yollar 

Here, a simple and rapid approach for performing intracerebroventricular injections in mice using a free-hand approach (that is, without a stereotaxic device) is described.

Farelerde Serbest El İntraserebroventriküler Enjeksiyonlar

The investigation of neuroendocrine systems often requires the delivery of drugs, viruses, or other experimental agents directly into the brains of mice. ...

Microinjections kemirgen beyin için kişiselleştirilmiş iğneler

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bozulmamış 3-D Beyin Devrelerin Hedefleme Viral için Ölçeklenebilir akışkan Enjektör Diziler

İlaçlar, Viral Vektörler, veya Hücre Transplantasyon teslimi için Microinjections Derin Beyin Yapıları Hedefleme

Kemirgen Beyin Mikroenjeksiyon Moleküler Alt Tabakalar Motive Davranış Eğitim için

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve kemirgen Beyindeki inhibitör Ajanların Mikro-enjeksiyon

Stabil Kronik kemirgen Elektrofizyoloji için şırınga enjekte edilebilir Mesh elektronik

Robotik Mikroenjeksiyon Kullanarak Beyin Dilimlerinde Tek Nöral Kök Hücre ve Nöronların Manipülasyonu

Nöral Kök Hücrelerin Sıçan ve Fare Beynine İntra-Arteriyel Teslimatı: Serebral İskemiye Uygulama

Farelerde Serbest El İntraserebroventriküler Enjeksiyonlar

Farelerde Serbest El İntraserebroventriküler Enjeksiyonlar

Farelerde Serbest El İntraserebroventriküler Enjeksiyonlar