Quest'opera è stata sostenuta da una sovvenzione della Comunità europea [progetto FP7-persone-2011-IAPP 285827 (EPIXCHANGE)].

Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal comitato etico di Ateneo per la sperimentazione animale e dal Ministero della salute. All'arrivo (Animal Research: Reporting In Vivo esperimenti11) sono state seguite le linee guida.
1. preparazione degli aghi di quarzo
<ol><li>Pulire e sterilizzare i capillari di quarzo (Vedi Tabella materiali) inserendoli per 5 min in acqua distillata, 5 min in etanolo al 99% e 5 min in etere etilico.</li>
	<li>Lasciare i capillari sotto il cofano per almeno 1 h per lasciarli asciugare completamente.</li>
	<li>Preparare gli aghi con l'estrattore laser secondo parametri che permettono la produzione di un ago sufficientemente lungo, sufficientemente sottile, a seconda delle esigenze individuali. Nota: Utilizziamo un estrattore di laser (Vedi Tabella materiali). Utilizzare un programma di due linee per la trazione. La prima riga utilizza ad alta potenza, la più grande lunghezza di scansione (corrispondente al valore di filamenti) e nessuna forza di trazione. Questa combinazione di parametri conduce alla fusione della parte più grande del capillare con la minima velocità di estensione, consentendo per la concretizzazione di un lungo ago con interno/esterno di grande dimensioni e ridotto la tibia. In questo modo, l'ago conserva un'elevata resistenza meccanica e diametro interno esteso che consente il passaggio di cellule staminali o particelle virali senza intasamenti. Velocità e il ritardo di questa linea di programma dovrebbe interrompere l'estensione capillare prima la punta diventa troppo piccola e lunga, manca la necessaria meccanica e caratteristiche di forma. La seconda riga del programma trazione viene eseguita automaticamente, una volta che il quarzo si raffredda (5 s). Parametri di potenza, filamento e forza di trazione sono funzionali per tagliare una punta con la minor lunghezza possibile suggerimento e gambo ripida, evitando la separazione tra i due aghi con una rottura della punta. Ordinariamente, con le nostre attrezzature utilizziamo i seguenti: (a) linea 1 = potenza 990, filamento 5, tirare di ritardo 130, velocità di 110, 0; (b) linea 2 = potenza 970, filamento 3, velocità 0, ritardo di 70, tirare 0.</li>
	<li>Mettere gli aghi in una capsula Petri precedentemente puliti con etanolo al 70%.<ol>
<li>Coprire il piatto con una pellicola di plastica paraffina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tagliare i capillari micro-dissettore.<ol>
<li>All'accensione, lasciate il laser eseguire un processo di calibrazione automatica per controllare la potenza e l'energia consegnata. Quindi impostare i parametri di taglio. Nota: Noi usiamo un micro-dissettore (Vedi Tabella materiali) e i seguenti parametri: energia di impulso di potere (63 µ j), diametro del raggio laser del 20% della massima apertura del laser (apertura massima: 1,0 µm) e velocità di taglio del 10% della velocità massimale (maximal velocità: 30 µm/s).</li>
		<li>Saldamente fissare l'ago sul tavolo microscopio e posizionare la punta al centro dello schermo del computer.</li>
		<li>Sulla barra dei menu, fare clic sull'icona della matita e utilizzarlo per disegnare un segno per il taglio laser dell'ago. Nota: Il taglio deve essere ad un angolo di circa 45 ° rispetto alla superficie dell'ago.</li>
		<li>La funzione di barra laterale, seleziona la bandiera che contiene il pulsante "START CUT" per consentire il laser tagliare il punto precedentemente marcato.</li>
		<li>Se necessario, tagliare il lato fori ripetendo le procedure descritte in 1.5.2-3; non c'è nessuna necessità di riposizionare l'ago (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Post-taglio di pulizia.<ol>
<li>Collegare l'ago ad una pompa di vuoto tramite un tubo di plastica.</li>
		<li>Accendere la pompa e impostare manualmente la portata avanti a velocità moderata (3 µ l/min).</li>
		<li>Aspirare l'etanolo al 99% prima e poi l'acqua distillata per rimuovere le impurità dovuta al taglio.</li>
		<li>Aspirare l'etanolo al 99% per facilitare l'asciugatura. Nota: Ogni passo dovrebbe durare per almeno 3 minuti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conservare gli aghi in una capsula Petri correttamente coperto fino al giorno della chirurgia.</li>
	<li>Gli aghi possono essere riutilizzati; alla fine dell'esperimento, pulire con la candeggina e l'etanolo per rimuovere la soluzione ed eventuali residui di tessuto. Per una pulizia più completa, mettere gli aghi in un vaso di stoccaggio micropipetta con la punta rivolta verso il basso, riempite il vaso con acqua distillata fino a quando le punte sono coperti, bollire per 1,5 minuti per rimuovere tutto il tessuto rimanente, poi lavare con etanolo.</li>
</ol>2. la procedura
<ol><li>Seguendo le istruzioni fornite dal manuale utente della pompa, selezionare il menu impostazioni per calibrare la pompa secondo il diametro/volume della siringa microiniezione e impostare la portata a 0,3 µ l/min.</li>
	<li>Riempire una siringa 10 mL (attrezzata con un ago smussato (ad es., Hamilton ago, 30g) e un tubo breve politetrafluoroetilene) con acqua sterile e si usa per riempire la siringa di Microiniezione (dopo aver tolto con molta cautela il pistone) e l'iniezione kit di parti di assemblaggio per la pompa manuale microiniezione (MMP). Nota: Il kit MMP è utilizzato per fissare l'ago nella cornice stereotassica (Figura 2). Il kit comprende: una tubazione del politetrafluoroetilene, luer-a-tubazione accoppiatore, supporto per pipette e guarnizioni per pipette con diversi diametri esterni.</li>
	<li>Collegare l'ago al kit MMP.<ol>
<li>Sciacquare più acqua in tutto il sistema tramite la siringa 10 mL e controllare se l'acqua esce l'ago. Nota: Assicurarsi di rimuovere qualsiasi bolla d'aria all'interno del sistema ripetendo la procedura di riempimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Staccare la siringa 10 mL dalla siringa microiniezione spingendo lentamente il pistone al fine di lasciare una goccia d'acqua nella parte superiore della siringa microiniezione. Inserire il pistone della siringa di microiniezione.</li>
	<li>Collegare la siringa di microiniezione alla pompa e impostare la velocità di flusso a 0,3 µ l/min. Nota: Attendere fino a quando c'è una goccia fuoriuscita dalla punta dell'ago e poi lasciarlo andare per un altro 3 min.</li>
	<li>Impostare il flusso a 0,1 µ l/min e avviare la procedura di chirurgia. La pompa deve essere in corso durante l'esecuzione dell'intervento. Nota: Per gli esperimenti riportati in questo articolo, usiamo i ratti maschii di Sprague Dawley 300g (3 mesi di età). Tuttavia, la procedura è applicabile ad altre specie, topi in particolare.</li>
	<li>Indurre l'anestesia generale usando un metodo approvato dai regolamenti locali. Nota: Usiamo un mix di iniezione intraperitoneale (i.p.) di 85 mg/kg xylazina ketamina e 8 mg/kg per 20-50 minuti di anestesia. È importante che pizzichi di coda e/o punta vengono utilizzati per garantire che l'animale è completamente sedato. Livello di anestesia e segni vitali di base vengono valutati prima di chirurgia comincia e monitorati ogni 10 min durante l'esecuzione dell'operazione. Temperatura corporea degli animali viene mantenuta costante prima, durante e dopo le procedure chirurgiche utilizzando un ricircolo di rilievo di riscaldamento di acqua. Gli animali vengono monitorati fino a quando completamente recuperato (per esempio sono in posizione verticale e ambulatoriale). Inoltre, gli animali ricevono analgesici (tramadol, 5 – 7 mg/kg i.p.) postoperatorio ogni 24 h per tre giorni.<ol>
<li>Radere la testa dell'animale e preparare adeguatamente il sito chirurgico per chirurgia asettica. Eseguire uno scrub bistadio con soluzione a base di iodio (Betadine) seguita da etanolo al 70%. Inoltre, per mantenere l'asepsi, avvolgere il sito chirurgico con un telo chirurgico (nel video è stato omesso a scopo dimostrativo).</li>
	</ol></li>
	<li>Posizionare il ratto nella cornice stereotassica su un acqua di ricircolo termocoperta. Per fornire ulteriore dolore, presso il sito della chirurgia applicare 0,5% lidocaina soluzione (non superare 7 mg/kg). Pre-sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici utilizzando una perlina sterilizzatore o liquido freddo di disinfezione di immergere l'attrezzatura in entrambi 2% glutaraldeide più 7,05% fenolo (Sporodicin o Cidex) seguita da risciacquo con acqua sterile o soluzione fisiologica. La disinfezione deve essere eseguita anche tra le procedure. Fare un taglio longitudinale sul cranio usando un bisturi sterilizzato. Sii gentile per evitare un eccessivo sanguinamento. Aprire il cuoio capelluto con una spatola piatta e applicare la clip chirurgiche dei lembi di pelle per mantenerla aperta. Molto delicatamente, staccare il periostio per esporre il bregma e la zona del cranio attraverso il quale verrà inserito l'ago.</li>
	<li>Montare il braccio sul telaio stereotassica (mentre il flusso è in corso) e spostare la punta dell'ago esattamente sulla cima di bregma, prestando attenzione a non rompere la sua punta. Annotare le coordinate antero-posteriore e medio-laterale del bregma e tradurre le coordinate desiderate. Guidati da uno stereomicroscopio, abbassare l'ago fino a quando la punta tocca quasi il cranio, marcare la foratura punto dopo alzando un po' il braccio stereotassica.</li>
	<li>Trapano (trapano punta Ø: 0,8 mm; velocità trapano: 1.000 giri/min) il cranio sul punto marcato. Deve prestare attenzione a non penetrare la dura madre durante le procedure di foratura. Durante la perforazione, goccia a goccia di soluzione salina sterile per evitare il danno osseo e necrosi.</li>
	<li>Tagliare un piccolo pezzo di pellicola di plastica paraffina e posizionarlo sul cranio. Utilizzando la pipetta da 10 µ l, fare una goccia della soluzione da iniettare sulla pellicola plastica paraffina. Fermare la pompa, leggermente recuperare il pestello della pompa e creare una piccola bolla d'aria nel capillare tirando delicatamente il pistone della siringa microiniezione.</li>
	<li>Abbassare il braccio di stereotactic fino a quando la punta dell'ago raggiunge la goccia. Prelevare il campione tirando (molto lentamente) il pistone della siringa microiniezione, evitando qualsiasi formazione di bolle. Sostituire il pestello della pompa a contatto con il pistone e accendere la pompa con una portata di 0,3 µ l/min attesa fino alla formazione di una goccia (pochi minuti) prima di procedere al passaggio successivo. Nota: Nel presente esperimento esempio, liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) è stata infusa nel corpo striato (AP: + 1.5, ML: ±2.7; DV: -5,0) e nell'ippocampo dorsale (AP: -3,5, ML: ±2.1; DV: -3,5; in mm da dura), 2 µ l/sito. Per facilitare il confronto tra i metodi di due iniezione, ogni area del cervello è stata infusa utilizzando un ago di quarzo in un emisfero e una punta smussata 26 G o un ago di acciaio inossidabile 30 G conici-punta in altra.</li>
	<li>Abbassare il flusso a 0,1 µ l/min, nick dura con un ago smusso-punta in acciaio inox e abbassare lentamente il braccio di stereotactic sull'asse dorso-ventrale, entrando il tessuto cerebrale. Quando viene raggiunta la posizione desiderata, andare giù altri 0,1 mm, fermare la pompa, sollevare il braccio stereotactic di 0,1 mm e avviare nuovamente la pompa a flusso a 0,3 µ l/min. Nota: Il motivo per mantenere un flusso lento mentre abbassando l'ago è quello di garantire una pressione positiva che evita la penetrazione di piccoli frammenti di tessuto nell'ago stesso. Tale evento ostacolerebbe la punta, alterando la consegna della soluzione. Poiché la portata è molto lenta, mentre abbassando l'ago e la velocità di abbassamento è di circa 10 s/mm, questo implica che la quantità di soluzione che rimanga lungo la pista dell'ago è trascurabile rispetto a quelli iniettati nel sito di destinazione. Questa precauzione può essere evitata quando si utilizzano aghi con fori laterali.</li>
	<li>Avviare il timer e attendere il tempo necessario a seconda del volume desiderato per iniettare (ad esempio, 6 min 40 s se l'iniezione 2 µ l). Monitorare il movimento di bolla durante l'iniezione. Alla fine, fermare la pompa e attendere 5 minuti prima di recuperare lentamente l'ago. Quando viene estratta completamente l'ago di quarzo, avviare nuovamente la pompa e controllare per la formazione di una goccia sulla punta dell'ago.</li>
	<li>Sigillare l'apertura nella superficie con cera dell'osso del cranio, rimuovere le clip emostatiche e suturare il cuoio capelluto, ricoprire la zona intorno alla ferita con una crema antibiotica (ad es., neosporin) e tornare l'animale dalla gabbia. Nota: Seguendo il protocollo di eutanasia approvato dal comitato etico istituzionale, per gli esperimenti descritti in questo articolo, gli animali erano profondamente anestetizzati con un'iniezione i.p. di 43 mg/kg ketamina e 7 mg/kg xylazina e decapitati. Cervelli sono stati rimossi, post-fissato in formalina per 48 h e paraffina. Sezioni coronali (8 µm) dei cervelli sono stati tagliati utilizzando un microtomo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kirik, D., Rosenblad, C., Bj&#246;rklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+behavioral+and+neurodegenerative+changes+following+partial+lesions+of+the+nigrostriatal+dopamine+system+induced+by+intrastriatal+6-hydroxydopamine+in+the+rat.">Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat.</a> Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).</li><li>Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eltoprazine+prevents+levodopa-induced+dyskinesias+by+reducing+striatal+glutamate+and+direct+pathway+activity.">Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity.</a> Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).</li><li>Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+pay+attention:+attentional+performance+time-stamped+prefrontal+cholinergic+activation,+diurnality,+and+performance.">Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance.</a> J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).</li><li>Shoichet, M. S., Winn, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+delivery+to+the+central+nervous+system.">Cell delivery to the central nervous system.</a> Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).</li><li>Simonato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+gene+therapy+for+neurological+disorders.">Progress in gene therapy for neurological disorders.</a> Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).</li><li>Bj&#246;rklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-and+Long-Term+Consequences+of+Intracranial+Injections+of+the+Excitotoxin,+Quinolinic+Acid,+as+Evidenced+by+GFA+Immunohistochemistry+of+Astrocytes.">Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes.</a> Brain Res. 317, 267-277 (1986).</li><li>Paradiso, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+delivery+of+fibroblast+growth+factor-2+and+brain-derived+neurotrophic+factor+reduces+spontaneous+seizures+in+an+epilepsy+model.">Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).</li><li>Falcicchia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+Status+Epilepticus-Induced+BDNF+Expression+with+Herpes+Simplex+Virus+Type-1+Based+Amplicon+Vectors.">Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors.</a> PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).</li><li>Munoz, J. L., Coles, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz+micropipettes+for+intracellular+voltage+microelectrodes+and+ion-selective+microelectrodes.">Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes.</a> J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+research:+reporting+in+vivo+experiments:+the+ARRIVE+guidelines.">Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).</li><li>Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+cell+therapies+to+the+clinic:+characteristics+of+cell+suspensions+in+large-diameter+injection+cannulae.">Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae.</a> Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La tecnica descritta in questo articolo soddisfa le esigenze descritte nell' Introduzione per l'ottimizzazione di microiniezioni che vengono eseguite per vari scopi12. Gli aghi descritti qui riducono i danni a un livello minimo, essenzialmente non rilevabili; alla varianza con aghi di vetro (che sono inclini a piegare), quarzo aghi sono rigidi e garantiscono un successo affidabile della regione cerebrale desiderata anche in profonde coordinate. Inoltre, il foro laterale assicura l...

Microiniezioni sono stati utilizzati per un lungo tempo per la consegna di composti farmacologicamente attivi di modulare l'attività neuronale in specifiche aree cerebrali. Inoltre, sono stati utilizzati per iniettare tossine vicino particolare popolazioni neuronali, per simulare eventi neurodegenerative caratteristici di alcune malattie, ad esempio 6-idrossi-dopamina nel sistema nigrostriatal della dopamina per imitare la malattia del Parkinson 1 , 2 o l'immunotossina 192 IgG saporin ha a lesione del sistema colinergico3. Più recentemente, procedure di microiniezione sono state utilizzate per trasportare gli innesti vettori o cellule virali per la terapia genica o delle cellule di cervello sperimentale disturbi4,5.
Il tipo classico di aghi impiegati in questi studi è fatto di acciaio inossidabile. Anche se facile e pratico da usare, aghi in acciaio hanno un numero di problemi6: essi sono relativamente grandi e può causare danni ai tessuti, con perdita della barriera sangue - cervello e attivazione degli astrociti; Inoltre, possono produrre carotaggio del tessuto cerebrale che ottiene nell'ago creando un ostacolo o persino completamente evitando il flusso della soluzione desiderata. Più recentemente, aghi di vetro preparati ad hoc dai vasi capillari sono stati introdotti in usano7,8. Questi non causano l'attivazione di danni né Astrocita significativa del tessuto, ma sono relativamente flessibili e possono piegarsi quando introdotto in strutture profonde, riducendo la precisione della localizzazione (osservazioni personali).
Esiste quindi la necessità di ridurre quanto più possibili danni (soprattutto durante gli esperimenti per curare i danni), aumentando la precisione e la riproducibilità (cioè, garantire che tutta la soluzione viene consegnata e garantire la corretta localizzazione). Inoltre, sarebbe auspicabile utilizzare disegni differenti dell'ago per assicurare una distribuzione ottimale della soluzione iniettata nelle aree del cervello con geometrie variabili. In questo articolo, descriviamo un protocollo per preparare e utilizzare il quarzo aghi per microiniezioni nel cervello del roditore. Dovuto l'alto punto di fusione, quarzo capillari non possono essere tirati su un estrattore convenzionale e pertanto, non sono stati utilizzati in passato per generare gli aghi. Quarzo, tuttavia, offre alcuni importanti vantaggi rispetto a vetro, in particolare ad alta rigidità e rottura resistenza9. A causa della loro rigidità, aghi di quarzo sono ideali per iniezioni nelle regioni ventrali del cervello. A causa della loro elevata resistenza alla rottura può essere modellate per includere più fori, ottenendo disegni che possono rivelarsi più efficaci anche quando la destinazione di regioni del cervello con geometrie complesse10.

<table><tbody><tr><td>Quartz capillaries</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA USA</td><td>Q100-50-10</td><td>Without filament</td></tr><tr><td>Puller</td><td>Sutter</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette storage jar</td><td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td><td>E210</td><td></td></tr><tr><td>Laser microdissector</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>LMD6500</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe</td><td>Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, St&amp;Yuml;tzerbach, Germany</td><td>19138-U</td><td></td></tr><tr><td>Microinfusion pump</td><td>Univentor, Zejtun, Malta</td><td>Model 864</td><td></td></tr><tr><td>Manual microinjection pump kit</td><td>WPI</td><td>Item#: MMP-KIT</td><td>Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame</td></tr><tr><td>Precision Drill</td><td>Proxxon</td><td>28510 MicroMot 50/E</td><td>Ball bearing drive shaft with variable speed</td></tr><tr><td>Artficial Cerebral Spinal Fluid</td><td>Tocris</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel</td><td>Hamilton</td><td>26 G Blunt: 19138-U&lt;br/&gt; 30 G Bevel: 20757</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica, Germany</td><td>LEICA RM212RT</td><td></td></tr></tbody></table>

personalized needles for microinjections in the rodent brain

Microiniezioni sono stati utilizzati per un lungo tempo per la consegna di farmaci o tossine all'interno di specifiche aree cerebrali e, più recentemente, sono stati utilizzati per fornire prodotti di terapia genica o cellulare. Purtroppo, le attuali tecniche di microiniezione utilizzano aghi in acciaio o vetro che sono non ottimali per molteplici ragioni: in particolare, aghi d'acciaio possono causare danni ai tessuti, e aghi di vetro possono piegarsi quando abbassato profondamente nel cervello, mancante della regione di destinazione. In questo articolo, descriviamo un protocollo per preparare e utilizzare aghi di quarzo che combinano una serie di funzioni utili. Questi aghi non producono danni rilevabili del tessuto e, essendo molto rigida, garantire la consegna affidabile nella regione del cervello desiderata anche quando si utilizza coordinate profonde. Inoltre, è possibile personalizzare il design dell'ago facendo più fori del diametro desiderato. Più fori di facilitano l'iniezione di grandi quantità di soluzione all'interno di un'area più ampia, mentre grandi fori facilitano l'iniezione delle cellule. Inoltre, questi aghi di quarzo possono essere puliti e riutilizzati, tale che la procedura diventa conveniente.

Abbiamo confrontato il danno indotto da microiniezione diretta nell'ippocampo dorsale del ratto e striato utilizzando un ago di quarzo (punta di diametro esterno 60 µM; foro laterale di uno 20 µM diametro; tipo C, Figura 1) rispetto ai due classici, estremità smussata 26 G e bordo smussato 30 G aghi in acciaio inox. A questo scopo, abbiamo iniettato 2 µ l di aCSF in destra e sinistra ippocampo dorsale e corpo striato utilizzando rispettivamente il quarzo ...

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Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Descriviamo qui un protocollo per il microinjection nel cervello del roditore che utilizza aghi di quarzo. Questi aghi non producono danni rilevabili del tessuto e garantire la consegna affidabile anche in regioni profonde. Inoltre, può essere adattati alle esigenze di ricerca di disegni personalizzati e può essere riutilizzati.

Personalizzato aghi per microiniezioni nel cervello del roditore

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

personalized-needles-for-microinjections-in-the-rodent-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K Views.  University of Ferrara. Descriviamo qui un protocollo per il microinjection nel cervello del roditore che utilizza aghi di quarzo. Questi aghi non producono danni rilevabili del tessuto e garantire la consegna affidabile anche in regioni profonde. Inoltre, può essere adattati alle esigenze di ricerca di disegni personalizzati e può essere riutilizzati.

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Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

Gli array scalabile fluidico Iniettore per Viral targeting di intatto 3-D circuiti cerebrali

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

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Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an injecting needle produces during its trajectory is a major concern especially in the mouse brain for not only the brain is small but also sometimes multiple injections are needed.  We show here a method to produce glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen which significantly reduces the brain damage and allows a precise targeting into the rodent brain. This method allows a delivery of small volumes (from 20 to 100 nl), reduces bleeding risks, and minimizes passive diffusion of drugs into the brain parenchyma. By using different size of capillary glass tubes, or changing the needle lumen, several types of substances and cells can be injected. Microinjections with a glass capillary tube represent a significant improvement in injection techniques and deep brain targeting with minimal collateral damage in small rodents.

In this article, we show a method to make glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen. This technique significantly reduces the brain damage, minimizes passive diffusion of drugs and allows a precise targeting into the rodent brain.

Targeting di strutture cerebrali profonde con microiniezioni di consegna dei farmaci, vettori virali, o trapianti di cellule

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.

Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.

Roditore cervello microiniezione di studio molecolare substrati di Motivato Behavior

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Comportamento

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing system was developed that allows for the injection of a drug while recording electrophysiological signals from the affected neuronal population. This method provides a simple and economical alternative to commercial solutions. A glass pipette was modified by combining it with a hypodermic needle and a silver filament. The injectrode is attached to commercial microsyringe pump for drug delivery. This results in a technique that provides real-time pharmacodynamics feedback through multi-unit extracellular signals originating from the site of drug delivery. As a proof of concept, we recorded neuronal activity from the superior colliculus elicited by flashes of light in rats, concomitantly with delivery of drugs through the injectrode. The injectrode recording capacity permits the functional characterization of the injection site favoring precise control over the localization of drug delivery. Application of this method also extends far beyond what is demonstrated here, as the choice of chemical substance loaded into the injectrode is vast, including tracing markers for anatomic experiments.

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

Registrazione simultanea elettrofisiologici e micro-iniezioni di agenti inibitori nel cervello del roditore

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal resolution from shallow and deep brain regions. Their use has been hindered, however, by mechanical and structural mismatches between the probes and brain tissue that commonly lead to micromotion and gliosis with resulting signal instability in chronic recording experiments. In contrast, following the implantation of ultraflexible mesh electronics via syringe injection, the mesh probes form a seamless, gliosis-free interface with the surrounding brain tissue that enables stable tracking of individual neurons on at least a year timescale. This protocol details the key steps in a typical mouse neural recording experiment using syringe-injectable mesh electronics, including the fabrication of mesh electronics in a standard photolithography-based process possible at many universities, loading mesh electronics into standard capillary needles, stereotaxic injection in vivo, connection of the mesh input/output to standard instrumentation interfaces, restrained or freely moving recording sessions, and histological sectioning of brain tissue containing mesh electronics. Representative neural recordings and histology data are presented. Investigators familiar with this protocol will have the knowledge necessary to incorporate mesh electronics into their own experiments and take advantage of the unique opportunities afforded by long-term stable neural interfacing, such as studies of aging processes, brain development, and the pathogenesis of brain disease.

Mesh electronics probes seamlessly integrate and provide stable, long-term, single-neuron level recording within the brain. This protocol uses mesh electronics for in vivo experiments, involving the fabrication of mesh electronics, loading into needles, stereotaxic injection, input/output interfacing, recording experiments, and histology of tissue containing mesh probes.

Siringa-iniettabili Mesh elettronica per elettrofisiologia roditore cronica stabile

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...

Bioingegneria

Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, manipulate, and follow single cells in the brain tissue with high resolution over time. This task is extremely challenging due to the complexity of tissues in the brain. We have recently developed a robot, that guide a microinjection needle into brain tissue upon utilizing images acquired from a microscope to deliver femtoliter volumes of solution into single cells. The robotic operation increases resulting an overall yield that is an order of magnitude greater than manual microinjection and allows for precise labeling and flexible manipulation of single cells in living tissue. With this, one can microinject hundreds of cells within a single organotypic slice. This article demonstrates the use of the microinjection robot for automated microinjection of neural progenitor cells and neurons in the brain tissue slices. More broadly, it can be used on any epithelial tissue featuring a surface that can be reached by the pipette. Once set up, the microinjection robot can execute 15 or more microinjections per minute. The microinjection robot because of its throughput and versality will make microinjection a broadly straightforward high-performance cell manipulation technique to be used in bioengineering, biotechnology, and biophysics for performing single-cell analyses in organotypic brain slices.

This protocol demonstrates the use of a robotic platform for microinjection into single neural stem cells and neurons in brain slices. This technique is versatile and offers a method of tracking cells in tissue with high spatial resolution.

Manipolazione di singole cellule staminali neurali e neuroni nelle fette cerebrali utilizzando la microiniezione robotica

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Consegna intra-arteriosa di cellule staminali neurali al cervello di ratto e topo: applicazione all'ischemia cerebrale

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Esecuzione di iniezioni intracerebroventricolari nei topi utilizzando un approccio a mano libera

Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice

The investigation of neuroendocrine systems often requires the delivery of drugs, viruses, or other experimental agents directly into the brains of mice. An intracerebroventricular (ICV) injection allows the widespread delivery of the experimental agent throughout the brain (particularly in the structures near the ventricles). Here, methods for making free-hand ICV injections in adult mice are described. By using visual and tactile landmarks on the heads of mice, injections into the lateral ventricles can be made rapidly and reliably. The injections are made with a glass syringe held in the experimenter&#39;s hand and placed at approximate distances from the landmarks. Thus, this technique does not require a stereotaxic frame. Furthermore, this technique requires only brief isoflurane anesthesia, which permits the subsequent assessment of mouse behavior and/or physiology in awake, freely behaving mice. Free-hand ICV injection is a powerful tool for the efficient delivery of experimental agents into the brains of living mice and can be combined with other techniques such as frequent blood sampling, neural circuit manipulation, or in vivo recording to investigate neuroendocrine processes.

Autore in primo piano: approfondimenti, innovazioni e strade future nel neurocontrollo riproduttivo 

Here, a simple and rapid approach for performing intracerebroventricular injections in mice using a free-hand approach (that is, without a stereotaxic device) is described.

Iniezioni intracerebroventricolari a mano libera nei topi

The investigation of neuroendocrine systems often requires the delivery of drugs, viruses, or other experimental agents directly into the brains of mice. ...

Personalizzato aghi per microiniezioni nel cervello del roditore

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Gli array scalabile fluidico Iniettore per Viral targeting di intatto 3-D circuiti cerebrali

Targeting di strutture cerebrali profonde con microiniezioni di consegna dei farmaci, vettori virali, o trapianti di cellule

Roditore cervello microiniezione di studio molecolare substrati di Motivato Behavior

Registrazione simultanea elettrofisiologici e micro-iniezioni di agenti inibitori nel cervello del roditore

Siringa-iniettabili Mesh elettronica per elettrofisiologia roditore cronica stabile

Manipolazione di singole cellule staminali neurali e neuroni nelle fette cerebrali utilizzando la microiniezione robotica

Consegna intra-arteriosa di cellule staminali neurali al cervello di ratto e topo: applicazione all'ischemia cerebrale

Iniezioni intracerebroventricolari a mano libera nei topi

Iniezioni intracerebroventricolari a mano libera nei topi

Iniezioni intracerebroventricolari a mano libera nei topi