Este trabalho tem sido apoiado por uma subvenção da Comunidade Europeia [projecto FP7-pessoas-2011-IAPP 285827 (EPIXCHANGE)].

Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comité de ética da Universidade de Ferrara para a experimentação Animal e pelo Ministério da saúde italiano. A chegada (pesquisa Animal: Reporting em experimentos Vivo11) orientações foram seguidas.
1. preparação de agulhas de quartzo
<ol><li>Limpar e esterilizar os capilares de quartzo (ver Tabela de materiais), colocando-os por 5 min em água destilada, 5 min em 99% de etanol e 5 min em éter dietílico.</li>
	<li>Deixe os capilares sob o capô pelo menos 1 h para deixá-los secar completamente.</li>
	<li>Prepare as agulhas usando um extrator de laser de acordo com os parâmetros que permitem a produção de uma agulha suficientemente longo, suficientemente fina, dependendo das necessidades individuais. Nota: Nós usamos um puxador de laser (veja a Tabela de materiais). Use um programa de duas linhas para puxar. A primeira linha usa alta potência, o maior comprimento de digitalização (correspondente ao valor de filamentos) e não há força puxando. Esta combinação de parâmetros leva ao derretimento da porção maior do capilar com a menor velocidade de extensão, permitindo a formação de uma agulha longa com grande tamanho interno/externo e reduzida da haste. Desta forma, a agulha preserva uma alta resistência mecânica e diâmetro largo interno que permite a passagem de células-tronco ou partículas virais sem obstrução. Velocidade e atraso desta linha do programa devem parar a extensão capilar antes que a ponta se torna demasiado pequena e longa, perdendo as características de forma e mecânica necessária. A segunda linha do programa puxar é executada automaticamente, uma vez que o quartzo esfria para baixo (5 s). Parâmetros do poder, filamento e força de tracção são funcionais, cortar uma ponta com o menor comprimento possível ponta e íngreme da haste, evitando a separação das duas agulhas com uma ruptura de ponta. Rotineiramente, com o nosso equipamento, usamos o seguinte: 1 (uma) linha = potência 990, filamento 5, velocidade de 130, atraso 110, puxar 0; (b) linha 2 = poder 970, filamento 3, velocidade 0, demora 70, puxar o 0.</li>
	<li>Colocar as agulhas em um prato de Petri previamente limpado com álcool 70%.<ol>
<li>Cubra o prato com um filme plástico de parafina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Corte os capilares do micro-Dissecador.<ol>
<li>O start-up, deixe-o laser executar um processo de magazines para verificar a potência e a energia entregado. Em seguida, defina os parâmetros de corte. Nota: Nós usamos um micro-Dissecador (ver Tabela de materiais) e os seguintes parâmetros: energia de pulso de energia (63 µ j), diâmetro do feixe do laser de 20% da máxima abertura a laser (abertura máxima: 1,0 µm) e velocidade de corte de 10% da velocidade máxima (maximal velocidade: 30 µm/s).</li>
		<li>Firmemente fixar a agulha sobre a mesa do microscópio e posicione sua ponta no centro da tela do computador.</li>
		<li>Na barra de menus, clique no ícone do lápis e usá-lo para desenhar uma marca para o corte a laser da agulha. Nota: O corte deve ser em um ângulo de aproximadamente 45 ° em relação à superfície da agulha.</li>
		<li>A função de barra lateral, selecione a bandeira que contém o botão "Começar a cortar" para permitir que o laser cortar o local previamente marcado.</li>
		<li>Se necessário, cortar o furo do lado, repetindo os procedimentos descritos em 1.5.2-3; Não há nenhuma necessidade de reposicionar a agulha (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pós-corte de limpeza.<ol>
<li>Conecte a agulha a uma bomba de vazia através de um tubo de plástico.</li>
		<li>Ligue a bomba e definir manualmente a taxa de fluxo para a frente a uma velocidade moderada (3 µ l/min).</li>
		<li>Aspire o 99% etanol primeiro e depois a água destilada para remover impurezas devido ao corte.</li>
		<li>Aspire o 99% etanol novamente para facilitar a secagem. Nota: Cada etapa deve durar pelo menos de 3 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Armazene as agulhas em um prato de Petri devidamente coberto até o dia da cirurgia.</li>
	<li>Agulhas podem ser re-utilizadas; no final do experimento, limpe com água sanitária e álcool para remover a solução e possíveis resíduos de tecido. Para uma limpeza mais completa, colocar as agulhas em um frasco de armazenamento micropipeta com a ponta apontando para baixo, encha a jarra com água destilada até que as pontas estão cobertas, ferva por 1,5 min remover todo o tecido restante e, em seguida, lave com etanol.</li>
</ol>2. o procedimento
<ol><li>Seguindo as instruções fornecidas pelo manual do usuário da bomba, selecione o menu de configurações para calibrar a bomba de acordo com o diâmetro/volume da seringa microinjeção e definir a taxa de fluxo em 0,3 µ l/min.</li>
	<li>Encher uma seringa de 10 mL (equipada com uma agulha (por exemplo, agulha de Hamilton, 30 G) e um tubo curto de politetrafluoroetileno) com água estéril e usá-lo para encher a seringa de microinjeção (após ter muito cautelosamente retirado o pistão) e a injeção kit de peças de montagem para a bomba manual microinjeção (MMP). Nota: O kit MMP é usado para montar com firmeza a agulha na armação estereotáxica (Figura 2). O kit inclui: um tubo de politetrafluoroetileno, acoplador de luer-para-tubulação, titular da pipeta e gaxetas para pipetas com diferentes diâmetros externos.</li>
	<li>Conecte a agulha para o kit MMP.<ol>
<li>Liberar mais água através do sistema através da seringa de 10 mL e verificar se a água sai a agulha. Nota: Certifique-se de remover quaisquer bolhas de ar dentro do sistema, repetindo as etapas de enchimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Desconecte a seringa de 10 mL seringa microinjeção enquanto lentamente empurra o pistão para sair uma gota de água na parte superior da seringa microinjeção. Insira o êmbolo na seringa microinjeção.</li>
	<li>Conecte a seringa de microinjeção de bomba e definir a taxa de fluxo em 0,3 µ l/min. Nota: Aguarde até que haja uma gota vazando da ponta da agulha e deixaram cair por mais 3 minutos.</li>
	<li>Definir o fluxo em 0,1 µ l/min e iniciar o procedimento de cirurgia. A bomba deve ser contínua durante a execução da operação. Nota: Para os experimentos relatados neste artigo, nós usamos ratos Sprague Dawley masculinos, de 300g (3 meses de idade). No entanto, o procedimento é aplicável a outras espécies, os ratos em particular.</li>
	<li>Induzi a anestesia geral, utilizando um método aprovado pela legislação local. Nota: Nós usamos uma mistura de injeção intraperitoneal (i.p.) de 85 mg/kg quetamina e 8 mg/kg de xilazina para 20-50 min de anestesia. É importante que pitadas de cauda e/ou dos pés são usadas para garantir que o animal está totalmente sedado. Nível de anestesia e sinais vitais básicos são avaliados antes de cirurgia começa e monitorado a cada 10 minutos durante a realização da cirurgia. A temperatura do corpo animal é mantida constante antes, durante e após procedimentos cirúrgicos, usando um re-circulação almofada de aquecimento de água. Os animais são monitorados até totalmente recuperado (por exemplo, eles são eretas e ambulatório). Além disso, animais recebem analgésicos (tramadol, 5-7 mg/kg, i.p.) no período pós-operatório a cada 24 horas durante três dias.<ol>
<li>Raspar a cabeça do animal e preparar adequadamente o local cirúrgico para cirurgia asséptica. Realize uma esfoliação de dois estágios com solução à base de iodo (Betadine), seguida por 70% de etanol. Além disso, para manter a assepsia, enrole o local cirúrgico com um pano cirúrgico (no vídeo foi omitido para fins de demonstração).</li>
	</ol></li>
	<li>Posicione o rato no quadro estereotáxica sobre uma água de re-circulação cobertor térmico. Para proporcionar alívio da dor adicional, no local da cirurgia, aplicar solução de lidocaína 0,5% (não exceder 7 mg/kg). Pre-esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos usar uma grânulo esterilizador ou líquido fria desinfecção por imersão o equipamento em qualquer 2% glutaraldeído mais 7,05% de fenol (Sporodicin ou Cidex) seguido de enxágue com água estéril ou soro fisiológico. A desinfecção deve ser realizada até mesmo entre os procedimentos. Fazer um corte longitudinal sobre o crânio, usando um bisturi esterilizado. Cuidado para evitar sangramento excessivo. Abra o couro cabeludo utilizando uma espátula plana e aplicar grampos cirúrgicos sobre os retalhos de pele para mantê-lo aberto. Muito suavemente, desanexe o periósteo para expor o bregma e a área do crânio através do qual será inserida a agulha.</li>
	<li>Montar o braço na armação estereotáxica (enquanto o fluxo está em curso) e mova a ponta da agulha exatamente em cima de bregma, prestando atenção para não quebrar sua ponta. Anotar as coordenadas antero-posterior e medio-lateral do bregma e traduzir para as coordenadas desejadas. Guiado por um estereomicroscópio, abaixe a agulha até sua ponta quase toca o crânio, marca a perfuração local depois de levantar um pouco o braço estereotáxica.</li>
	<li>Broca (broca ponta Ø: 0,8 mm; velocidade de broca: 1.000 rpm) o crânio no local marcado. Deve ter cuidado para não penetrar a dura-máter durante os procedimentos de perfuração. Durante a perfuração, pinga soro fisiológico estéril, para evitar dano ósseo e necrose.</li>
	<li>Cortar um pequeno pedaço de filme plástico da parafina e coloque-o sobre o crânio. Usando a pipeta µ l 10, faça uma gota da solução a injetar no filme plástico de parafina. Parar a bomba, ligeiramente recuperar o empurrador da bomba e criar uma pequena bolha de ar no capilar, puxando suavemente o êmbolo da seringa microinjeção.</li>
	<li>Abaixe o braço estereotáxico até a ponta da agulha atinge a queda. Desenhe a amostra, (muito lentamente) puxando o êmbolo da seringa microinjeção, evitando qualquer formação de bolha. Substituir o empurrador de bomba em contacto com o pistão e ligue a bomba com um caudal de 0,3 µ l/min. espere até a formação de uma gota (poucos min) antes de prosseguir para a próxima etapa. Nota: No presente experimento exemplo, líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) foi infundido no striatum (AP: + 1,5, ML: ±2.7; DV:-5.0) e no hipocampo dorsal (AP: -3,5, ML: ±2.1; DV: -3,5; em mm da dura-máter), 2 µ l/site. Para facilitar a comparação entre os métodos de injeção de dois, cada área do cérebro foi infundida usando uma agulha de quartzo em um hemisfério e uma ponta romba de 26 G ou uma agulha de aço inoxidável de ponta em bisel 30 G no outro.</li>
	<li>Reduzir o fluxo de 0,1 µ l/min, nick a dura-máter com uma agulha de bisel-ponta de aço inoxidável e abaixe lentamente o braço estereotáxico no dorso-ventral Machado, entrando no tecido cerebral. Quando a posição desejada é atingida, vai para baixo um adicional 0,1 mm, parar a bomba, levante o braço estereotáxico de 0,1 mm e começar novamente a bomba com o caudal a 0,3 µ l/min. Nota: A razão para manter um fluxo lento reduzindo a agulha é garantir uma pressão positiva que evita a penetração de pequenos fragmentos de tecido com a agulha em si. Tal evento obstruiria a ponta, prejudicando a entrega da solução. Desde que a taxa de fluxo é muito lenta, enquanto abaixando a agulha e a velocidade de redução é de cerca de 10 s/mm, isto implica que a quantidade de solução que permanecem ao longo da trilha de agulha é insignificante em comparação com aqueles injetado no local de destino. Esta precaução pode ser evitada quando usando agulhas com orifícios laterais.</li>
	<li>Iniciar o temporizador... e esperar o tempo necessário, dependendo do volume desejado para injetar (por exemplo, 6 min 40 s se injetando 2 µ l). Monitore a movimentação de bolha enquanto injetando. No final, parar a bomba e espere 5 min antes de recuperar lentamente a agulha. Quando a agulha de quartzo é completamente extraída, verificar a formação de uma gota na ponta da agulha e recomeçar a bomba.</li>
	<li>Selar a abertura na superfície com cera para osso do crânio, remover os clipes hemostáticos e suturar o couro cabeludo, revestir a área ao redor da ferida com um creme antibiótico (por exemplo, neosporin) e retornar o animal da gaiola em casa. Nota: Seguindo o protocolo de eutanásia aprovado pelo Comitê de ética institucional, para os experimentos descritos neste artigo, os animais foram profundamente anestesiados com uma injeção i.p. de 43 mg/kg de ketamina e xilazina 7 mg/kg e decapitados. Cérebros foram removidos, postfixed de modo em formol para 48 h e parafina incorporado. Coronais seções (8 µm) dos cérebros foram cortadas usando um micrótomo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kirik, D., Rosenblad, C., Bj&#246;rklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+behavioral+and+neurodegenerative+changes+following+partial+lesions+of+the+nigrostriatal+dopamine+system+induced+by+intrastriatal+6-hydroxydopamine+in+the+rat.">Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat.</a> Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).</li><li>Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eltoprazine+prevents+levodopa-induced+dyskinesias+by+reducing+striatal+glutamate+and+direct+pathway+activity.">Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity.</a> Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).</li><li>Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+pay+attention:+attentional+performance+time-stamped+prefrontal+cholinergic+activation,+diurnality,+and+performance.">Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance.</a> J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).</li><li>Shoichet, M. S., Winn, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+delivery+to+the+central+nervous+system.">Cell delivery to the central nervous system.</a> Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).</li><li>Simonato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+gene+therapy+for+neurological+disorders.">Progress in gene therapy for neurological disorders.</a> Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).</li><li>Bj&#246;rklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-and+Long-Term+Consequences+of+Intracranial+Injections+of+the+Excitotoxin,+Quinolinic+Acid,+as+Evidenced+by+GFA+Immunohistochemistry+of+Astrocytes.">Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes.</a> Brain Res. 317, 267-277 (1986).</li><li>Paradiso, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+delivery+of+fibroblast+growth+factor-2+and+brain-derived+neurotrophic+factor+reduces+spontaneous+seizures+in+an+epilepsy+model.">Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).</li><li>Falcicchia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+Status+Epilepticus-Induced+BDNF+Expression+with+Herpes+Simplex+Virus+Type-1+Based+Amplicon+Vectors.">Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors.</a> PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).</li><li>Munoz, J. L., Coles, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz+micropipettes+for+intracellular+voltage+microelectrodes+and+ion-selective+microelectrodes.">Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes.</a> J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+research:+reporting+in+vivo+experiments:+the+ARRIVE+guidelines.">Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).</li><li>Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+cell+therapies+to+the+clinic:+characteristics+of+cell+suspensions+in+large-diameter+injection+cannulae.">Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae.</a> Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A técnica descrita neste artigo cumpre as necessidades descritas na introdução para otimizar alevinos que são executados para vários fins12. As agulhas descritas aqui reduzem o dano a um nível mínimo, essencialmente não-detectável; a variância com agulhas de vidro (que são propensas a dobrar), agulhas de quartzo são rígidas e certifique-se de um hit confiável da região cerebral desejado mesmo em profundas coordenadas. Além disso, o furo lateral garante entrega da s...

Microinjeções têm sido utilizadas por um longo tempo para a entrega de compostos farmacologicamente ativos de modular a atividade neuronal em áreas específicas do cérebro. Além disso, eles têm sido usados para injetar toxinas perto de populações neuronais particulares, para imitar neurodegenerativas eventos característicos de determinadas doenças, por exemplo 6-hidroxi-dopamina no sistema de dopamina nigrostriatal para imitar a doença de Parkinson 1 , 2 ou o saporin de IgG immunotoxin 192 a lesão do sistema colinérgico3. Mais recentemente, procedimentos de microinjeção tem sido usados para entregar enxertos de vetores ou células virais para terapia de gene ou célula cerebral experimental transtornos4,5.
O tipo clássico de agulhas utilizadas nestes estudos é feito de aço inoxidável. Apesar de fácil e prático de usar, agulhas de aço têm um número de problemas6: eles são relativamente grandes e podem danificar o tecido, com vazamento da barreira hemato - encefálica e ativação de astrócitos; Além disso, eles podem produzir dielétrico de tecido cerebral que entra a agulha, criando um obstáculo, ou até mesmo completamente evitando o fluxo da solução desejada. Mais recentemente, agulhas de vidro preparado ad hoc dos capilares foram introduzidas no usam7,8. Estas não causam ativação de danos nem astrocyte significativa de tecido, mas são relativamente flexíveis e podem dobrar quando introduzida em estruturas profundas, reduzindo a precisão da localização (observações pessoais).
Portanto, há uma necessidade de reduzir, tanto quanto a possíveis danos (especialmente ao realizar experimentos para curar danos) aumentando a precisão e reprodutibilidade (i.e., certifique-se de que toda solução é entregue e assegurar a localização correta). Além disso, seria desejável usar projetos diferentes da agulha para garantir uma distribuição ideal da solução injetada em áreas do cérebro com diferentes geometrias. Neste artigo, descrevemos um protocolo para preparar e usar agulhas de quartzo para alevinos do cérebro de roedor. Devido ao alto ponto de fusão, capilares de quartzo não podem ser puxados em um extrator convencional e, portanto, tem não sido usados no passado para gerar agulhas. Quartzo, no entanto, oferece algumas vantagens importantes sobre o vidro, em particular de alta rigidez e quebra resistência9. Por causa da sua rigidez, agulhas de quartzo são ideais para injeções em regiões do cérebro ventral. Por causa de sua alta resistência à quebra, eles podem ser modelados para incluir vários furos, obtendo projetos que possam revelar-se mais eficazes mesmo quando segmentando regiões do cérebro com geometrias complexas10.

<table><tbody><tr><td>Quartz capillaries</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA USA</td><td>Q100-50-10</td><td>Without filament</td></tr><tr><td>Puller</td><td>Sutter</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette storage jar</td><td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td><td>E210</td><td></td></tr><tr><td>Laser microdissector</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>LMD6500</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe</td><td>Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, St&amp;Yuml;tzerbach, Germany</td><td>19138-U</td><td></td></tr><tr><td>Microinfusion pump</td><td>Univentor, Zejtun, Malta</td><td>Model 864</td><td></td></tr><tr><td>Manual microinjection pump kit</td><td>WPI</td><td>Item#: MMP-KIT</td><td>Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame</td></tr><tr><td>Precision Drill</td><td>Proxxon</td><td>28510 MicroMot 50/E</td><td>Ball bearing drive shaft with variable speed</td></tr><tr><td>Artficial Cerebral Spinal Fluid</td><td>Tocris</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel</td><td>Hamilton</td><td>26 G Blunt: 19138-U&lt;br/&gt; 30 G Bevel: 20757</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica, Germany</td><td>LEICA RM212RT</td><td></td></tr></tbody></table>

personalized needles for microinjections in the rodent brain

Microinjeções têm sido utilizadas por um longo tempo para a entrega de drogas ou toxinas dentro de áreas específicas do cérebro e, mais recentemente, eles têm sido utilizados para entregar produtos de terapia genética ou célula. Infelizmente, as técnicas de microinjeção atual usar agulhas de aço ou vidro, que são de qualidade inferior por várias razões: em particular, agulhas de aço podem causar danos nos tecidos e agulhas de vidro podem dobrar quando abaixado profundamente no cérebro, ausente da região de destino. Neste artigo, descrevemos um protocolo para preparar e usar agulhas de quartzo que combinam um número de características úteis. Estas agulhas não produzir dano tecidual detectável e, sendo muito rígida, garantir a entrega confiável na região desejada cérebro mesmo quando usando coordenadas profundas. Além disso, é possível personalizar o design da agulha, fazendo vários furos do diâmetro desejado. Vários furos facilitam a injeção de grandes quantidades de solução dentro de uma área maior, Considerando que grandes buracos facilitam a injeção de células. Além disso, estas agulhas de quartzo podem ser limpos e reutilizadas, tal que o procedimento se torna rentável.

Comparamos os danos induzidos por microinjeção direta no hipocampo dorsal de rato e striatum usando uma agulha de quartzo (ponta de diâmetro externo 60 µM; buraco de lado um 20 µM de diâmetro e tipo C, Figura 1), em comparação com dois clássico, fim brusco 26 G e borda chanfrada de 30 G agulhas de aço inoxidável. Para este objectivo, injetamos 2 µ l de aCSF na direita e deixou o hipocampo dorsal e striatum usando respectivamente o quartzo e a agul...

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Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Descrevemos aqui um protocolo para o microinjection do cérebro de roedores que usa agulhas de quartzo. Estas agulhas não produzir dano tecidual detectável e assegurar a entrega confiável, mesmo em regiões profundas. Além disso, eles podem ser adaptados às necessidades de pesquisa pelos projetos personalizados e podem ser reutilizados.

Agulhas personalizadas para alevinos do cérebro de roedor

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

personalized-needles-for-microinjections-in-the-rodent-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K visualizações.  University of Ferrara. Descrevemos aqui um protocolo para o microinjection do cérebro de roedores que usa agulhas de quartzo. Estas agulhas não produzir dano tecidual detectável e assegurar a entrega confiável, mesmo em regiões profundas. Além disso, eles podem ser adaptados às necessidades de pesquisa pelos projetos personalizados e podem ser reutilizados.

Vídeo: Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

Escalável Fluidic Arrays Injector para Viral Segmentação de Intact Circuitos 3-D do cérebro

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Neurociência

Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an injecting needle produces during its trajectory is a major concern especially in the mouse brain for not only the brain is small but also sometimes multiple injections are needed.  We show here a method to produce glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen which significantly reduces the brain damage and allows a precise targeting into the rodent brain. This method allows a delivery of small volumes (from 20 to 100 nl), reduces bleeding risks, and minimizes passive diffusion of drugs into the brain parenchyma. By using different size of capillary glass tubes, or changing the needle lumen, several types of substances and cells can be injected. Microinjections with a glass capillary tube represent a significant improvement in injection techniques and deep brain targeting with minimal collateral damage in small rodents.

In this article, we show a method to make glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen. This technique significantly reduces the brain damage, minimizes passive diffusion of drugs and allows a precise targeting into the rodent brain.

Segmentação de estruturas cerebrais profundas com Microinjeções para entrega de drogas, vetores virais, ou Transplantes de Células

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.

Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.

Roedor Cérebro microinjeção para estudar substratos moleculares do comportamento motivado

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Comportamento

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing system was developed that allows for the injection of a drug while recording electrophysiological signals from the affected neuronal population. This method provides a simple and economical alternative to commercial solutions. A glass pipette was modified by combining it with a hypodermic needle and a silver filament. The injectrode is attached to commercial microsyringe pump for drug delivery. This results in a technique that provides real-time pharmacodynamics feedback through multi-unit extracellular signals originating from the site of drug delivery. As a proof of concept, we recorded neuronal activity from the superior colliculus elicited by flashes of light in rats, concomitantly with delivery of drugs through the injectrode. The injectrode recording capacity permits the functional characterization of the injection site favoring precise control over the localization of drug delivery. Application of this method also extends far beyond what is demonstrated here, as the choice of chemical substance loaded into the injectrode is vast, including tracing markers for anatomic experiments.

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

Gravação simultânea eletrofisiológica e micro-injeções de agentes inibidores no cérebro do roedor

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal resolution from shallow and deep brain regions. Their use has been hindered, however, by mechanical and structural mismatches between the probes and brain tissue that commonly lead to micromotion and gliosis with resulting signal instability in chronic recording experiments. In contrast, following the implantation of ultraflexible mesh electronics via syringe injection, the mesh probes form a seamless, gliosis-free interface with the surrounding brain tissue that enables stable tracking of individual neurons on at least a year timescale. This protocol details the key steps in a typical mouse neural recording experiment using syringe-injectable mesh electronics, including the fabrication of mesh electronics in a standard photolithography-based process possible at many universities, loading mesh electronics into standard capillary needles, stereotaxic injection in vivo, connection of the mesh input/output to standard instrumentation interfaces, restrained or freely moving recording sessions, and histological sectioning of brain tissue containing mesh electronics. Representative neural recordings and histology data are presented. Investigators familiar with this protocol will have the knowledge necessary to incorporate mesh electronics into their own experiments and take advantage of the unique opportunities afforded by long-term stable neural interfacing, such as studies of aging processes, brain development, and the pathogenesis of brain disease.

Mesh electronics probes seamlessly integrate and provide stable, long-term, single-neuron level recording within the brain. This protocol uses mesh electronics for in vivo experiments, involving the fabrication of mesh electronics, loading into needles, stereotaxic injection, input/output interfacing, recording experiments, and histology of tissue containing mesh probes.

Malha de seringa injetável eletrônica para eletrofisiologia roedor crônica estável

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...

Bioengenharia

Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, manipulate, and follow single cells in the brain tissue with high resolution over time. This task is extremely challenging due to the complexity of tissues in the brain. We have recently developed a robot, that guide a microinjection needle into brain tissue upon utilizing images acquired from a microscope to deliver femtoliter volumes of solution into single cells. The robotic operation increases resulting an overall yield that is an order of magnitude greater than manual microinjection and allows for precise labeling and flexible manipulation of single cells in living tissue. With this, one can microinject hundreds of cells within a single organotypic slice. This article demonstrates the use of the microinjection robot for automated microinjection of neural progenitor cells and neurons in the brain tissue slices. More broadly, it can be used on any epithelial tissue featuring a surface that can be reached by the pipette. Once set up, the microinjection robot can execute 15 or more microinjections per minute. The microinjection robot because of its throughput and versality will make microinjection a broadly straightforward high-performance cell manipulation technique to be used in bioengineering, biotechnology, and biophysics for performing single-cell analyses in organotypic brain slices.

This protocol demonstrates the use of a robotic platform for microinjection into single neural stem cells and neurons in brain slices. This technique is versatile and offers a method of tracking cells in tissue with high spatial resolution.

Manipulação de células-tronco neurais únicas e neurônios em fatias cerebrais usando microinjeção robótica

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Entrega intra-arterial de células-tronco neurais ao cérebro de ratos e ratos: aplicação à isquemia cerebral

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Realização de injeção intracerebroventricular em camundongos usando uma abordagem à mão livre

Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice

The investigation of neuroendocrine systems often requires the delivery of drugs, viruses, or other experimental agents directly into the brains of mice. An intracerebroventricular (ICV) injection allows the widespread delivery of the experimental agent throughout the brain (particularly in the structures near the ventricles). Here, methods for making free-hand ICV injections in adult mice are described. By using visual and tactile landmarks on the heads of mice, injections into the lateral ventricles can be made rapidly and reliably. The injections are made with a glass syringe held in the experimenter&#39;s hand and placed at approximate distances from the landmarks. Thus, this technique does not require a stereotaxic frame. Furthermore, this technique requires only brief isoflurane anesthesia, which permits the subsequent assessment of mouse behavior and/or physiology in awake, freely behaving mice. Free-hand ICV injection is a powerful tool for the efficient delivery of experimental agents into the brains of living mice and can be combined with other techniques such as frequent blood sampling, neural circuit manipulation, or in vivo recording to investigate neuroendocrine processes.

Autor em destaque: insights, inovações e caminhos futuros no neurocontrole reprodutivo 

Here, a simple and rapid approach for performing intracerebroventricular injections in mice using a free-hand approach (that is, without a stereotaxic device) is described.

Injeções intracerebroventriculares à mão livre em camundongos

The investigation of neuroendocrine systems often requires the delivery of drugs, viruses, or other experimental agents directly into the brains of mice. ...

Agulhas personalizadas para alevinos do cérebro de roedor

Resumo

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Escalável Fluidic Arrays Injector para Viral Segmentação de Intact Circuitos 3-D do cérebro

Segmentação de estruturas cerebrais profundas com Microinjeções para entrega de drogas, vetores virais, ou Transplantes de Células

Roedor Cérebro microinjeção para estudar substratos moleculares do comportamento motivado

Gravação simultânea eletrofisiológica e micro-injeções de agentes inibidores no cérebro do roedor

Malha de seringa injetável eletrônica para eletrofisiologia roedor crônica estável

Manipulação de células-tronco neurais únicas e neurônios em fatias cerebrais usando microinjeção robótica

Entrega intra-arterial de células-tronco neurais ao cérebro de ratos e ratos: aplicação à isquemia cerebral

Injeções intracerebroventriculares à mão livre em camundongos

Injeções intracerebroventriculares à mão livre em camundongos

Injeções intracerebroventriculares à mão livre em camundongos