この作品は、欧州共同体「FP7 の人々-2011 IAPP プロジェクト 285827 (EPIXCHANGE)」からの助成金によってサポートされていますいます。

すべて実験的プロトコルは、フェラーラ大学動物実験倫理委員会およびイタリアの保健省によって承認されました。到着 (動物資源研究領域: 生体実験の報告11) ガイドラインに続いています。
1. 水晶探針の作製
<ol><li>きれいにし、蒸留水で 5 分、エタノール 99% で 5 分、ジエチル エーテル 5 分を置くことによって (材料表参照) 石英毛細血管を滅菌します。</li>
	<li>完全に乾燥させる、少なくとも 1 時間のためのフードの下の毛細血管を残します。</li>
	<li>個々 のニーズに応じて、十分に長く、十分に細い針の生産を許可するパラメーターによるとレーザーの引き手を使用して針を準備します。 注: 我々 はレーザーの引き手を使用して (材料の表を参照してください)。引っ張るための 2 行のプログラムを使用します。最初の行は、高出力、(フィラメントの値に対応する) 最大スキャンの長さと引っ張る力を使用します。このパラメーターの組み合わせはスピードが低い拡張機能、内部/外部の大きさで長い針の形成を可能にする毛管の最大の部分の溶融につながり、シャンクを削減します。この方法では、針は、高機械的な抵抗と目詰まりせず幹細胞またはウイルス粒子の通過を可能にする広い内径を保持します。速度とこのプログラム ラインの遅延は、先端が小さすぎると、長い、不足している必要な機械および形態になる前に、毛細血管の拡張を中止すべき。水晶が冷却したら引くプログラムの 2 番目の行は、自動的に実行 (5 s)。電源、フィラメントと牽引力のパラメーターが最短の可能な先端の長さと破裂の先端 2 本の針の分離を避け、急なシャンクの先端をカットする機能。日常的に、当社設備で、我々 は次を使用: (a) 行 1 = 電源 990、フィラメント 5、速度 130、遅延 110、プル 0;(b) 2 行目 = 力 970, フィラメント 3、速度 0, 遅延 70、0 を引きます。</li>
	<li>エタノール 70% ときれいに以前ペトリ皿に針を置きます。<ol>
<li>プラスチック パラフィン フィルムで包みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マイクロ切開で毛細血管をカットします。<ol>
<li>起動時には、レーザー パワーを確認するための自動キャリブレーション プロセスを実行、提供されるエネルギーをしましょう。切削パラメーターを設定します。 注意: マイクロ凝固切開装置を使うこと (材料の表を参照)、次のパラメーター: パルス エネルギー (63 μ J)、最大絞り値の 20% のビーム径のレーザー (最大絞り: 1.0 μ m) と切削速度の最大速度 (最大 10%速度: 30 μ m/s)。</li>
		<li>しっかりと顕微鏡テーブルの上針を修正し、コンピューター画面の中央にその先端を配置します。</li>
		<li>メニュー バーで、鉛筆のアイコンをクリックし、針のレーザー切断のマークの描画に使用します。 注: カット針表面に対して約 45 ° の角度にする必要があります。</li>
		<li>サイド バー関数以前マークしたスポットをカットするレーザーを許可する「カットを開始」ボタンを含むフラグを選択します。</li>
		<li>必要な場合は、1.5.2-3; で説明した手順を繰り返すことによって側穴をカットします。(図 1) 針の位置を変更する必要はありません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>洗浄後カットします。<ol>
<li>針をプラスチック製のチューブを介してボイド ポンプに接続します。</li>
		<li>ポンプをオンにして適度な速度 (3 μ L/分) で前方の流量を手動で設定します。</li>
		<li>99% エタノールを吸引切断による不純物を除去するには、最初で、蒸留水。</li>
		<li>乾燥を容易にするためもう一度 99% エタノールを吸引します。 注: 各手順は、少なくとも 3 分を持続させるべき。</li>
	</ol>
</li>
	<li>手術の日まできちんとカバーされたペトリ皿に針を格納します。</li>
	<li>針は、再使用する可能性があります。実験の終わりには、漂白剤やソリューションと組織の残留物を除去し、エタノールできれい。針マイクロ ピペット ストレージ jar ファイルを入れて、下向きの先端とより完全なクリーニングのためのヒントが覆われるまで蒸留水の瓶を埋める、任意の残りの組織を除去し、エタノールで洗う 1.5 分煮る。</li>
</ol>2. 手続き
<ol><li>ポンプのユーザー マニュアルの指示に従って、マイクロインジェクション注射器の直径/量に応じたポンプを調整し、0.3 μ L/分の流量を設定するには、[設定] メニューを選択します。</li>
	<li>滅菌水で 10 mL 注射器 (例えばハミルトン針 (30 G) 鈍針と短いポリテトラフルオロ エチレン チューブを装備) を記入し、(後にピストンを非常に慎重に取り除いた) マイクロインジェクション注射器と注入を埋めるためにそれを使用手動インジェクション ポンプ (MMP) の組立部品キットです。 メモ: MMP キットは、定位脳手術フレーム (図 2) で針を安全にマウントに使用されます。キットが含まれています: ポリテトラフルオロ エチレン チューブ、ルア-チューブ カプラー、ピペット ホルダー、異なる外径ピペット用ガスケット。</li>
	<li>針を MMP キットに接続します。<ol>
<li>10 mL のシリンジをシステム全体でより多くの水をフラッシュし、水が、針が出てくるかどうかを確認します。 注: 充填の手順を繰り返して、システム内部の空気の泡を削除するを確認します。</li>
	</ol></li>
	<li>マイクロインジェクション注射器の上部に水を一滴を残すためにピストンをゆっくりと押しながら、マイクロインジェクション注射器から 10 mL 注射器を外します。マイクロインジェクション注射器のピストンを挿入します。</li>
	<li>ポンプにマイクロインジェクション シリンジを接続し、0.3 μ L/分の流量を設定します。 注: 待機まで針の先端から漏れドロップ、それが別の 3 分のために行くみましょう。</li>
	<li>0.1 μ L/分で流れを設定し、手術の手順を開始します。ポンプは、手術中継続的なする必要があります。 注: この記事で報告した実験用ラット 300 g (生後 3 か月) の男性スプレイグを使用します。ただし、手順は特に他の種、マウスに適用されます。</li>
	<li>地域の規制によって承認されたメソッドを使用して全身麻酔を誘導します。 注: 我々 は麻酔の 20-50 分の 85 mg/kg 8 mg/kg とケタミン ・ キシラジンの腹腔内注入 (i. p.) のミックスを使用します。尻尾やつま先のつまみを使用して、動物が完全に鎮静を確保が重要です。手術が始まり、手術を行っている間 10 分毎を監視する前に、麻酔と基本的なバイタルのレベルが評価されます。動物の体の温度は一定に前に中、や加熱パッドを再循環水を使用しての手術後。動物は、完全に回復するまで監視される (彼らは直立、歩行など)。さらに、動物は三日間 24 h に術後に鎮痛剤 (トラマドール、i. p. 5-7 mg/kg) を受け取る。<ol>
<li>動物の頭を剃るし、無菌手術の手術部位を適切に準備します。ヨウ素ベースのソリューション (Betadine) 70% エタノールに続いて 2 段スクラブを実行します。さらに、無菌状態を維持するために手術用覆布で手術部位をラップ (ビデオで省略されていますデモ用)。</li>
	</ol></li>
	<li>脳定位固定装置のフレームに毛布を再循環水にラットを置きます。その他の痛みの緩和を提供する手術のサイトで適用 0.5% リドカイン液 (7 mg/kg を超えないように)。すべて手術器具をあらかじめ滅菌滅菌水または生理食塩水ですすぎ 2% グルタルアルデヒド プラス 7.05% フェノール (Sporodicin または Cidex) いずれかの設備を immerging でビーズ滅菌器または液体のコールド消毒を使用して続きます。プロシージャ間でさえ、消毒を行う必要があります。頭蓋骨に滅菌メスを使用して縦方向のカットを行います。過度の出血を避けるために優しくすること。平らなヘラを使って頭皮を開き、開いたままに皮膚のフラップに外科用クリップを適用します。非常に優しく、前と、針が挿入される頭蓋骨の領域を公開する骨膜をデタッチします。</li>
	<li>脳定位固定装置のフレームのアームのマウント (流れは継続されている) し、前、その先端を割らないように注意を払って上正確に針の先端を移動します。前の前後とメディオ水平座標に注釈を付ける、目的の座標に変換します。顕微鏡に導かれ、その先端はほとんど頭蓋骨を触れるまで針を下げ、マーク少し脳定位固定装置のアームの持ち上げ後掘削するスポット。</li>
	<li>ドリル (ドリル先端 Ø: 0.8 mm; ドリル速度: 1,000 rpm) スポットでマークされている頭蓋骨。掘削手順の中で硬膜を貫通しないには、注意が必要です。穴あけ中、骨の損傷と壊死を回避する滅菌生理食塩水を点滴します。</li>
	<li>プラスチック パラフィン フィルムの小片をカットし、頭蓋骨の上に置きます。10 μ L ピペットを使用して、プラスチック パラフィン フィルムに注入する溶液の一滴を作る。ポンプを停止、わずかポンプのプッシャーを取得し、インジェクション注射器のピストンをゆっくり引いて、キャピラリー中で少し空気の泡を作成します。</li>
	<li>定位ロワーアームを針の先端に達するドロップまで。(非常にゆっくり) 任意の気泡を避け、マイクロインジェクション注射器のピストンを引いてサンプルを描画します。ピストンと接触してポンプの補助機関車を置き換える、次の手順に進む前にドロップ (数分) の形成まで流量 0.3 μ L/分待機でポンプを入れます。 注: 存在例実験で線条体に注入された人工髄液 (アプライド) (AP: 1.5 ML: 2.7;DV:-5.0)、背側の海馬 (AP:-3.5 ML: ±2.1;DV:-3.5;硬膜から mm)、2 μ L/サイト。2 注入法との比較を容易にするには、脳の各領域は、1 つの半球で 26 G 鈍チップ水晶針または他の 30 G ベベル ヒント ステンレス鋼針を使用して注入しました。</li>
	<li>0.1 μ L/分への流れを下げる、ステンレスかさ先端針で硬膜をニックし、脳組織に入る背腹斧で定位の腕をゆっくりと下ろします。目的の位置に達すると、追加 0.1 mm、ポンプを停止、0.1 mm 定位の腕を上げるし、再び 0.3 μ L/分の流量でポンプを起動を行きます。 注意: 針を削減しながら低速流を維持する理由は、針自体の組織の小さな断片の侵入を回避する正圧を確保するためです。このようなイベントには、ヒント、ソリューションの提供を損なうことが妨害されます。流量は約 10 s/mm 針および低下の速度を下げることが非常に遅いため、これは針トラックに沿って残っている液量が無視できるターゲット サイトで注入されたものと比較することを意味します。側面の穴に針を使用する場合は、この予防措置を避けることができます。</li>
	<li>タイマーを開始し、注入する音量に応じて必要な時間 (2 μ L 注入する場合は 6 分 40 秒など) を待ちます。注入しながらバブルの移動を監視します。最後に、ポンプを停止し、ゆっくりと針を取得する前に 5 分を待ちます。水晶針は完全に抽出されると、再びポンプを起動し、針の先端でドロップの形成のため確認します。</li>
	<li>骨ワックス頭蓋骨表面に開口部をシール、止血クリップを削除して頭皮を縫合、(例えばネオスポリン) 抗生物質のクリームで傷口周辺のコート、ホームのケージに動物を返します。 注: この資料に記載されている実験のため機関倫理委員会によって承認された安楽死プロトコルに従って動物深く 43 mg/kg ケタミンおよび 7 mg/kg キシラジン、i. p. 注射で麻酔され断頭します。48 h のパラフィン埋め込まれたホルマリンの接尾辞をつけた脳が削除されました。頭脳のコロナ セクション (8 μ m) は、ミクロトームを使用してスライスされました。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kirik, D., Rosenblad, C., Bj&#246;rklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+behavioral+and+neurodegenerative+changes+following+partial+lesions+of+the+nigrostriatal+dopamine+system+induced+by+intrastriatal+6-hydroxydopamine+in+the+rat.">Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat.</a> Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).</li><li>Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eltoprazine+prevents+levodopa-induced+dyskinesias+by+reducing+striatal+glutamate+and+direct+pathway+activity.">Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity.</a> Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).</li><li>Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+pay+attention:+attentional+performance+time-stamped+prefrontal+cholinergic+activation,+diurnality,+and+performance.">Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance.</a> J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).</li><li>Shoichet, M. S., Winn, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+delivery+to+the+central+nervous+system.">Cell delivery to the central nervous system.</a> Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).</li><li>Simonato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+gene+therapy+for+neurological+disorders.">Progress in gene therapy for neurological disorders.</a> Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).</li><li>Bj&#246;rklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-and+Long-Term+Consequences+of+Intracranial+Injections+of+the+Excitotoxin,+Quinolinic+Acid,+as+Evidenced+by+GFA+Immunohistochemistry+of+Astrocytes.">Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes.</a> Brain Res. 317, 267-277 (1986).</li><li>Paradiso, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+delivery+of+fibroblast+growth+factor-2+and+brain-derived+neurotrophic+factor+reduces+spontaneous+seizures+in+an+epilepsy+model.">Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).</li><li>Falcicchia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+Status+Epilepticus-Induced+BDNF+Expression+with+Herpes+Simplex+Virus+Type-1+Based+Amplicon+Vectors.">Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors.</a> PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).</li><li>Munoz, J. L., Coles, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quartz+micropipettes+for+intracellular+voltage+microelectrodes+and+ion-selective+microelectrodes.">Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes.</a> J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+research:+reporting+in+vivo+experiments:+the+ARRIVE+guidelines.">Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).</li><li>Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+cell+therapies+to+the+clinic:+characteristics+of+cell+suspensions+in+large-diameter+injection+cannulae.">Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae.</a> Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

この資料で説明する手法は、様々 な目的の12に対して実行される薬剤を最適化するための導入に記載されているニーズを満たします。ここで説明した針は、最小、本質的に検出可能レベルに損傷を軽減します。(曲げる傾向がある) ガラス針で分散、水晶針が剛性、深い座標でも必要な脳の領域の信頼性の高いヒットを確保します。さらに、側の穴は、先端穴を?...

薬剤は、特定の脳領域のニューロンの活動を調節する薬理活性化合物の配信のため長い間使用されています。さらに、彼らは神経変性イベント特定の病気、たとえば 6-ヒドロキシドーパミン パーキンソン病を模倣する黒質線条体ドーパミン系の特性を模倣するように、特定の神経集団近く毒素を注入するために使用されています。1,2または巣コリン作動性システム3immunotoxin 192 IgG saporin。最近では、遺伝子や細胞治療の実験的脳障害4,5ウイルスのベクトルまたは細胞移植を提供するマイクロインジェクション プロシージャが使用されています。
これらの研究で用いられる針の古典的なタイプはステンレス スチール製します。問題6数が簡単で使用する実用的な鋼の針である: 比較的大きい、血液脳関門の漏出とアストロ サイトの活性化組織の損傷を引き起こす可能性がありますまた、障害物を作成するか、目的のソリューションの流れを完全に回避する針に脳組織のコアリングを出す可能性があります。最近では、準備されたアドホック毛細血管から導入されているガラス針は7、8を使用します。これらは重要な組織の損傷もアストロ サイトの活性化が発生しないが、比較的、ローカリゼーション (個人的な観察) の精度低下の深層構造に導入されたときに曲がる可能性があります。
したがって精度と再現性を高めながら損傷と同じくらい (特にときのダメージを回復するための実験を実行する) を減らす必要がある (すなわち、すべての解決策が配信されることを確認し、正しいローカリゼーション)。また、さまざまなジオメトリと脳の領域に注入されたソリューションの最適な配分を確保するため別の針のデザインを使用することが望ましいででしょう。この記事で準備し、齧歯動物の頭脳の薬剤の水晶針を使用するプロトコルについて述べる。高融点のため水晶毛細血管は従来の引き手でプルすることはできません、したがって、使用されていない過去の針を生成します。水晶、しかし、ガラス、特に高剛性とブレーク抵抗9以上のいくつかの重要な利点を提供しています。その剛性のため水晶針は腹側脳部位への注入に最適です。破損への高抵抗のため彼らは場合でも、複雑な形状の10による脳領域をターゲットに最も効果的な証明するかもしれない設計を得る複数の穴を含むようにモデル化できます。

<table><tbody><tr><td>Quartz capillaries</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA USA</td><td>Q100-50-10</td><td>Without filament</td></tr><tr><td>Puller</td><td>Sutter</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette storage jar</td><td>World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA</td><td>E210</td><td></td></tr><tr><td>Laser microdissector</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td><td>LMD6500</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe</td><td>Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, St&amp;Yuml;tzerbach, Germany</td><td>19138-U</td><td></td></tr><tr><td>Microinfusion pump</td><td>Univentor, Zejtun, Malta</td><td>Model 864</td><td></td></tr><tr><td>Manual microinjection pump kit</td><td>WPI</td><td>Item#: MMP-KIT</td><td>Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame</td></tr><tr><td>Precision Drill</td><td>Proxxon</td><td>28510 MicroMot 50/E</td><td>Ball bearing drive shaft with variable speed</td></tr><tr><td>Artficial Cerebral Spinal Fluid</td><td>Tocris</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel</td><td>Hamilton</td><td>26 G Blunt: 19138-U&lt;br/&gt; 30 G Bevel: 20757</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica, Germany</td><td>LEICA RM212RT</td><td></td></tr></tbody></table>

personalized needles for microinjections in the rodent brain

薬剤は、薬や特定の脳領域内毒素の配達のための長い時間のために使用されているし、最近では、彼らは遺伝子や細胞療法製品を提供に使用されています。残念ながら、現在のマイクロインジェクション技術使用、複数の理由で最適ではない鋼またはガラスの針: 特に、鋼の針は、組織損傷を引き起こす可能性があり、ターゲット領域が不足している脳に深く下げたときガラス針を曲げるかもしれません。この記事の準備の便利な機能の数を組み合わせる水晶針を使用するプロトコルについて述べる。これらの針は、検出可能な組織の損傷を作り出さないし、深い座標を使用する場合でも、必要な脳の領域の信頼性の高い配信を確保する非常に厳格であること。また、希望の直径の複数の穴をあけ、針のデザインをカスタマイズすることが可能です。複数の穴は、大きい穴セルの注入を容易にするのに対し大量の大きな領域内の溶液の注入を促進します。さらに、これらの水晶針を掃除し、プロシージャの費用対効果となるよう、再使用できます。

ラット背側海馬、線条体の 2 つの古典的な 26 G 鈍い端 30 G ベベル エッジと比較して水晶針 (60 μ M 外径先端; 1 つ 20 μ M 径側の穴が図 1C 型) を使用して直接マイクロインジェクションによる損傷を比較しました。ステンレス スチール製の針。この目的我々 は右にアプライドの 2 μ L 注入し、左背側海馬線条体投与後、それぞれに石英の鉄の針と、...

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Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

ここで水晶針を使用して齧歯動物の脳でのマイクロインジェクションのプロトコルについて述べる。これらの針は検出可能な組織の損傷を生成しないし、深部にも信頼性の高い配信を確保します。さらに、彼らはお好みのデザインで研究のニーズに合わせることができるし、再利用することができます。

パーソナライズされた齧歯動物の脳でのマイクロインジェクション針

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K ビュー.  University of Ferrara. ここで水晶針を使用して齧歯動物の脳でのマイクロインジェクションのプロトコルについて述べる。これらの針は検出可能な組織の損傷を生成しないし、深部にも信頼性の高い配信を確保します。さらに、彼らはお好みのデザインで研究のニーズに合わせることができるし、再利用することができます。

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Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

無傷の3 - D脳の回路のウイルス標的のためのスケーラブルな流体インジェクタの配列

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

神経科学

Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an injecting needle produces during its trajectory is a major concern especially in the mouse brain for not only the brain is small but also sometimes multiple injections are needed.  We show here a method to produce glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen which significantly reduces the brain damage and allows a precise targeting into the rodent brain. This method allows a delivery of small volumes (from 20 to 100 nl), reduces bleeding risks, and minimizes passive diffusion of drugs into the brain parenchyma. By using different size of capillary glass tubes, or changing the needle lumen, several types of substances and cells can be injected. Microinjections with a glass capillary tube represent a significant improvement in injection techniques and deep brain targeting with minimal collateral damage in small rodents.

In this article, we show a method to make glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen. This technique significantly reduces the brain damage, minimizes passive diffusion of drugs and allows a precise targeting into the rodent brain.

薬の配達のためのMicroinjections、ウイルスベクター、または細胞移植で脳深部構造のターゲティング

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.

Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.

動機付け行動の分子基質を研究するために齧歯類の脳マイクロインジェクション

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

行動学

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing system was developed that allows for the injection of a drug while recording electrophysiological signals from the affected neuronal population. This method provides a simple and economical alternative to commercial solutions. A glass pipette was modified by combining it with a hypodermic needle and a silver filament. The injectrode is attached to commercial microsyringe pump for drug delivery. This results in a technique that provides real-time pharmacodynamics feedback through multi-unit extracellular signals originating from the site of drug delivery. As a proof of concept, we recorded neuronal activity from the superior colliculus elicited by flashes of light in rats, concomitantly with delivery of drugs through the injectrode. The injectrode recording capacity permits the functional characterization of the injection site favoring precise control over the localization of drug delivery. Application of this method also extends far beyond what is demonstrated here, as the choice of chemical substance loaded into the injectrode is vast, including tracing markers for anatomic experiments.

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

同時電気生理学的記録およびげっ歯類の脳における阻害剤のマイクロ注射

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Syringe-injectable Mesh Electronics for Stable Chronic Rodent Electrophysiology

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal resolution from shallow and deep brain regions. Their use has been hindered, however, by mechanical and structural mismatches between the probes and brain tissue that commonly lead to micromotion and gliosis with resulting signal instability in chronic recording experiments. In contrast, following the implantation of ultraflexible mesh electronics via syringe injection, the mesh probes form a seamless, gliosis-free interface with the surrounding brain tissue that enables stable tracking of individual neurons on at least a year timescale. This protocol details the key steps in a typical mouse neural recording experiment using syringe-injectable mesh electronics, including the fabrication of mesh electronics in a standard photolithography-based process possible at many universities, loading mesh electronics into standard capillary needles, stereotaxic injection in vivo, connection of the mesh input/output to standard instrumentation interfaces, restrained or freely moving recording sessions, and histological sectioning of brain tissue containing mesh electronics. Representative neural recordings and histology data are presented. Investigators familiar with this protocol will have the knowledge necessary to incorporate mesh electronics into their own experiments and take advantage of the unique opportunities afforded by long-term stable neural interfacing, such as studies of aging processes, brain development, and the pathogenesis of brain disease.

Mesh electronics probes seamlessly integrate and provide stable, long-term, single-neuron level recording within the brain. This protocol uses mesh electronics for in vivo experiments, involving the fabrication of mesh electronics, loading into needles, stereotaxic injection, input/output interfacing, recording experiments, and histology of tissue containing mesh probes.

注射器注射メッシュ電子安定した慢性の齧歯動物の生理

Implantable brain electrophysiology probes are valuable tools in neuroscience due to their ability to record neural activity with high spatiotemporal ...

生物工学

Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, manipulate, and follow single cells in the brain tissue with high resolution over time. This task is extremely challenging due to the complexity of tissues in the brain. We have recently developed a robot, that guide a microinjection needle into brain tissue upon utilizing images acquired from a microscope to deliver femtoliter volumes of solution into single cells. The robotic operation increases resulting an overall yield that is an order of magnitude greater than manual microinjection and allows for precise labeling and flexible manipulation of single cells in living tissue. With this, one can microinject hundreds of cells within a single organotypic slice. This article demonstrates the use of the microinjection robot for automated microinjection of neural progenitor cells and neurons in the brain tissue slices. More broadly, it can be used on any epithelial tissue featuring a surface that can be reached by the pipette. Once set up, the microinjection robot can execute 15 or more microinjections per minute. The microinjection robot because of its throughput and versality will make microinjection a broadly straightforward high-performance cell manipulation technique to be used in bioengineering, biotechnology, and biophysics for performing single-cell analyses in organotypic brain slices.

This protocol demonstrates the use of a robotic platform for microinjection into single neural stem cells and neurons in brain slices. This technique is versatile and offers a method of tracking cells in tissue with high spatial resolution.

ロボットマイクロインジェクションを用いた脳スライスにおける単一神経幹細胞とニューロンの操作

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

ラットおよびマウス脳への神経幹細胞の動脈内デリバリー:脳虚血への応用

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

フリーハンドアプローチを用いたマウスにおける脳室内注射の実施

Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice

The investigation of neuroendocrine systems often requires the delivery of drugs, viruses, or other experimental agents directly into the brains of mice. An intracerebroventricular (ICV) injection allows the widespread delivery of the experimental agent throughout the brain (particularly in the structures near the ventricles). Here, methods for making free-hand ICV injections in adult mice are described. By using visual and tactile landmarks on the heads of mice, injections into the lateral ventricles can be made rapidly and reliably. The injections are made with a glass syringe held in the experimenter&#39;s hand and placed at approximate distances from the landmarks. Thus, this technique does not require a stereotaxic frame. Furthermore, this technique requires only brief isoflurane anesthesia, which permits the subsequent assessment of mouse behavior and/or physiology in awake, freely behaving mice. Free-hand ICV injection is a powerful tool for the efficient delivery of experimental agents into the brains of living mice and can be combined with other techniques such as frequent blood sampling, neural circuit manipulation, or in vivo recording to investigate neuroendocrine processes.

著者スポットライト:生殖神経制御における洞察、イノベーション、および将来の道筋 

Here, a simple and rapid approach for performing intracerebroventricular injections in mice using a free-hand approach (that is, without a stereotaxic device) is described.

マウスにおけるフリーハンド脳室内注射

The investigation of neuroendocrine systems often requires the delivery of drugs, viruses, or other experimental agents directly into the brains of mice. ...

パーソナライズされた齧歯動物の脳でのマイクロインジェクション針

要約

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無傷の3 - D脳の回路のウイルス標的のためのスケーラブルな流体インジェクタの配列

薬の配達のためのMicroinjections、ウイルスベクター、または細胞移植で脳深部構造のターゲティング

動機付け行動の分子基質を研究するために齧歯類の脳マイクロインジェクション

同時電気生理学的記録およびげっ歯類の脳における阻害剤のマイクロ注射

注射器注射メッシュ電子安定した慢性の齧歯動物の生理

ロボットマイクロインジェクションを用いた脳スライスにおける単一神経幹細胞とニューロンの操作

ラットおよびマウス脳への神経幹細胞の動脈内デリバリー:脳虚血への応用

マウスにおけるフリーハンド脳室内注射

マウスにおけるフリーハンド脳室内注射

マウスにおけるフリーハンド脳室内注射