Biz Viyana Drosophila Kaynak Merkezi ve Drosophila suşları sağlamak için Bloomington Drosophila stok Merkezi (NIH P40OD018537) kabul edersiniz. Bize ada tahlil ve Martijn Eidhof Adası tahlil kurulum oluşturmak için tanıtmak için Klämbt laboratuvar için sana şükrediyoruz. Bu çalışma yapıldı bölümünde E-nadir-3 Uluslararası arayıp tarafından desteklenen hibe "terapiler otozomal resesif ataxias için hazırlanıyor" hazırlama (NWO 9003037604), Hollanda organizasyon için bilimsel araştırma (NWO) ve tarafından en iyi hibe (912-12-109) iki DCN/Radboud Üniversitesi Tıp Merkezi Doktora Bursu. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.

<ol>
	<li>Smeets, C. J., Verbeek, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+ataxia+and+functional+genomics:+Identifying+the+routes+to+cerebellar+neurodegeneration.">Cerebellar ataxia and functional genomics: Identifying the routes to cerebellar neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1842, 2030-2038 (2014).</li><li>Liu, Y. T., Lee, Y. C., Soong, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+have+learned+from+the+next-generation+sequencing:+Contributions+to+the+genetic+diagnoses+and+understanding+of+pathomechanisms+of+neurodegenerative+diseases.">What we have learned from the next-generation sequencing: Contributions to the genetic diagnoses and understanding of pathomechanisms of neurodegenerative diseases.</a> J Neurogenet. 29, 103-112 (2015).</li><li>He, J., Mangelsdorf, M., Fan, D., Bartlett, P., Brown, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+Genetic+Studies:+From+Genome-wide+Association+Mapping+to+Genome+Sequencing.">Amyotrophic Lateral Sclerosis Genetic Studies: From Genome-wide Association Mapping to Genome Sequencing.</a> Neuroscientist. 21, 599-615 (2015).</li><li>Lill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Parkinson's+disease.">Genetics of Parkinson's disease.</a> Mol Cell Probes. 30, 386-396 (2016).</li><li>Bjedov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+life+span+extension+by+rapamycin+in+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster.">Mechanisms of life span extension by rapamycin in the fruit fly Drosophila melanogaster.</a> Cell Metab. 11, 35-46 (2010).</li><li>Hada, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-chiro-inositol+and+pinitol+extend+the+life+span+of+Drosophila+melanogaster.">D-chiro-inositol and pinitol extend the life span of Drosophila melanogaster.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 68, 226-234 (2013).</li><li>Schmidt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+heavy+chain+function+in+Drosophila+glial+cells+controls+neuronal+activity.">Kinesin heavy chain function in Drosophila glial cells controls neuronal activity.</a> J Neurosci. 32, 7466-7476 (2012).</li><li>Kochinke, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Phenomics+Analysis+Deconvolutes+Genes+Mutated+in+Intellectual+Disability+into+Biologically+Coherent+Modules.">Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules.</a> Am J Hum Genet. 98, 149-164 (2016).</li><li>Volkenhoff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Glycolysis+Is+Essential+for+Neuronal+Survival+in+Drosophila.">Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila.</a> Cell Metab. 22, 437-447 (2015).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A language and environment for statistical computing. , (2008).</li><li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).</li><li>Rothblum-Oviatt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxia+telangiectasia:+a+review.">Ataxia telangiectasia: a review.</a> Orphanet J Rare Dis. 11, 159 (2016).</li><li>Petersen, A. J., Rimkus, S. A., Wassarman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+kinase+inhibition+in+glial+cells+activates+the+innate+immune+response+and+causes+neurodegeneration+in+Drosophila.">ATM kinase inhibition in glial cells activates the innate immune response and causes neurodegeneration in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E656-E664 (2012).</li><li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li><li>. ImageJ User Guide - IJ 1.46 Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html</a> (2012)</li></ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Bu iletişim kuralı kantitatif Drosophila motor davranış sırasında ada tahlil değerlendiriyor"Drosophila Adası tahlil" makro açıklar. Makro doğru platform üzerinde sinekler zamanla, son derece hassas ve Lokomotor kusurların nicel yüksek üretilen iş değerlendirme için uygun ada tahlil yapma sayar. Metodoloji uyuşturucu pozlama da dahil olmak üzere farklı genetik ve/veya çevresel koşullar altında yetiştirilen sinekler ile herhangi bir koşulu, karşılaştırma için sağlar. Bu okuma böylece büyük genetik veya ilaç ekranlar, Drosophila modelleri hareket bozuklukları ve diğer nörolojik hastalıkların okurken gerçekleştirirken veya hareket ya da uçuş incelerken keşif aracı olarak yararlıdır davranış.
Bu el yazması sunulan Adası tahlil iletişim kuralı mevcut/alternatif yöntemler üzerinde avantajları sağlar. Örneğin, video izleme hareket çok daha zaman alıcı ve örneklerin boyutu büyük test etmek için daha az uygun olacaktır. Ada tahlil yüksek üretilen iş tarama aracı ve bu anlamda hızlı etkileşimli negatif geotaxis (yüzük) tahlil16için karşılaştırılabilir olduğunu. İkisi arasındaki fark Adası deneyleri Lokomotor sorunları geniş bir algılama için sağlanmıştır; sinekler ve yetersizlik platformu terk kusurları uçuşta, Zıplama, neden olabilir veya davranış yürüyüş kanat (kas/nöronal) ve/veya bacak (kas/nöronal) tarafından kaynaklanan kusurlar. Öte yandan, yüzük tahlil kusurları tırmanma/yürüyüş davranış (kas/nöronal) bacak kusurları tarafından neden değerlendiriyor. Kullanıcılar birden fazla davranışsal sonuçlar ilgileniyor musunuz diye, ada tahlil de kolayca RING tahlil gibi diğer deneyleri ile birleştirilebilir. Buna ek olarak, optogenetics için gerekli lazerler Adası tahlil kutusunda kolayca kurulabilir ve belgili tanımlık tertibat o kolayca nerede sıcaklık ve ışık kontrol edilebilir bir oda için hareket edebilir basittir.
Başarı ve tekrarlanabilirlik burada açıklanan Adası testin emin olmak için çeşitli öneriler takip edilmelidir. Aliquot ve transfer deneysel test uçmaktadır sulandırıldığında en az bir gün önce CO2 veya soğuk anestezi etkileri önlemek için deneyin. Deneysel şişeleri kalabalık değil (şişe 10-15 sinekler kullanın; her zaman sinekler aynı sayıda şişe yerleştirmek en iyisi). Taze Gıda sinekler her zaman tutun. Eğer değil henüz tahlil iletken aşina, pratik atma verimi en üst düzeye çıkarmak için bir platform uçar. Aynı zamanda hızlı bir şekilde el geri çeker uygulama ve veri analizi (görüntü analizi ve yalnızca resmin dışında eldir başlangıç saymaya sinek) ile müdahale daha sonra şu. Çevre ve deneysel koşullar aynı karşılaştırılmak üzere gereken deneylerde tutmak (Örneğin, denetimler mutantlar veya bir genotip karşı test farklı yaş). Her zaman günün aynı anda deneyler yapmak ve kontrollü sıcaklık ve nem koşullarında şişeleri korumak. İstatistiksel güç için biyolojik REPLICATE başına en az üç teknik çoğaltır sınama.
Açıklanan makro başarılı performansı elde etmek için burada, web kamerası ve görüntü ayarlarını maksimal kontrast elde etmek için ayarlanması gerekir: siyah beyaz bir platformda nesneleri olarak beliren uçar. Sinekler sayısı düzgün makro tarafından sayılır değildir zaman, kontrast ayarlarını, yatırım Getirisi düzgün seçili olup olmadığını kontrol edin ve platform üzerinde sinekler boyutunu belirtilen en az olduğundan emin olun (bkz. Adım 8.3 Bu protokol) boyutunu ayarlama sinek. Ayarları yalnızca bir kez tanımlanmış olması gerekir. Web kamerası ve platform arasındaki mesafe değişmez sürece tüm deneyler için geçerlidir. Döngüsellik parçacıkların Circularity_min ve max ayarlarını tanımlayın (parçacıklar sayılan sinekler =) analizi için dikkate alınacaktır (uçar sayılan nesneler =). 1 tam bir daire ve bir satır170 gösterir. Sinekler her zaman belirli bir ölçüde (karıncayı düz bir çizgi bulunamaz) circularity mevcut 1'de "Circularity_max" ayarını ayarlayın ve "Circularity_min" ayarı 0,4 ayarlanır. Bu kullanıcının bu ayarları yapmak gereken düşüktür.
Bir sinek platform sınır yakın bulunduktan sonra makro bazen sayım hata yapar. Sinekler güvenli ama buradan girip kullanıcı tanımlı ROI uçamaz oluşabilir. Çoğu durumda, (bu platforma mümkün olduğunca uygun) YG yeniden kolayca bu sorunu çözebilir. Ancak, "Ada tahlil analiz" komut dosyası tespit edebilmektedir ve doğru yanlış veri sayar içinde ve dışında yatırım Getirisi oldukça iyi yürüme sinekler tarafından neden oldu. Burada sunulan webcam çözünürlüğü sinekler yakın oldukça iyi ayırımcılık için yüksek olsa da, biz diğer algoritmalar"Drosophila Adası tahlil" makro görüntü işleme yordamı gibi hayata geçirdik havza ve işlev17aşındırmak. Bu platform üzerinde birbirine yakın olan sinekler uygun tarif kolaylaştırmak. Ayrıca, makro platformu atladı veya ondan uçtu sinekler arasında ayırt edemiyor. Yine de, bu genellikle sağlıklı genç sinek suşları ise büyük sinek ve sinek Lokomotor açıkları ile platformda daha uzun kalır ve sonunda atlamak veya platformdan düşmek hemen platform üzerine düştü uzaklara uç görülmektedir. Bu sınırlamaları rağmen tahlil ve analiz Lokomotor davranış çok doğru bir ölçü sağlar.
"Island tahlil analiz" komut dosyası başarılı performansı sağlamak için kullanıcının iletişim kuralında belirtilen komut satırında giriş ve çıkış dosyalarının doğru yolu girin ve doğru klasöre biçiminde veri (belirtildiği gibi sağlamak için emin olun gerekir. Şekil 2' de). Kullanıcı güvenilir olmayan deneysel veriler çok sıkı filtre uygulamak için kullanılan ölçüt bulursa (satır 68: "Count" sütunundaki ilk değeri; 5 eşit veya daha az satır 71: sinekler üzerinde platfo atılan toplam sayısı daha yüksek "Sayı" sütununda ilk değerdir RM + 3), 68 ve 71 "Ada tahlil analiz" komut dosyasında satırlardaki metnin önüne # ekleyerek bu filtre ayarları kapat. Bu durumda, tüm veri kümeleri analize dahil. Alternatif olarak, filtre ayarlarını 68 ve kullanıcı ihtiyaçlarına göre 71 satırlardaki değerleri ayarlayarak değiştirebilirsiniz. Olası değerleri say ""Drosophila Adası tahlil"makro tarafından oluşturulan dosyasýna" içinde aktarımında da el ile ayarlanabilir ve komut dosyası yeniden ayarlanan veriler üzerinde çalıştırılabilir. Ne zaman kullanıcı ilgilenen daha--dan 10 kare/sn veya daha--dan 10 işleniyor "Ada tahlil analiz" komut dosyası tarafından işlenen kare sayısı s veri gerekirayarlanabilir. İstatistiksel analiz kullanıcı tanımlı alternatifler tarafından da değiştirilebilir.
"Örnekler Adası tahlil örnekleri içeren görüntü zaman Adası tahlil kullanılarak elde serileri ile" adlı bir klasör-ebilmek bulunmak vasıl ertesi gün website: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. "Örnekler Adası tahlil" ─░ndirme ve hızlı bir şekilde dosya depolama, "Drosophila Adası tahlil" makro ve "Ada tahlil analiz" ile görüntü işleme yapısı ile tanımaya olmak için bu iletişim kurallarını açıklanan adımları izleyin komut dosyası.
Ada tahlil gelişmiş makro ve analiz komut dosyası ile birlikte değerlendirmek ve ataksi Telanjiektazi Drosophila modelinin anormal hareket davranışını ölçmek için kullanılabilir. Tahlil çeşitli yaş için verimli bir şekilde uygulanabilir olduğu, fenotipleri potansiyel olarak ilerici doğa analiz için uygundur.
Özet olarak,"Drosophila Adası tahlil" makro ve "Ada tahlil analiz" komut dosyası ile birlikte Adası tahlil objektif olarak analiz etmek ve Lokomotor kusurlarý ölçmek için düşük maliyetli, güvenilir ve yüksek verimli bir tahlil olduğunu. Drosophila bir yüksek-den geçerek şekilde hareket bozuklukları modelleri.

Son yıllarda, yeni nesil sıralama teknolojileri gelişmeler büyük ölçüde dejeneratif hareket bozuklukları beyin (Örneğin, serebellar ataksi ve Parkinson), periferik nöronal, altta yatan genlerin tanımlaması için katkıda bulunmuştur Kaynak (Örneğin, amyotrofik lateral skleroz ve herediter Spastik parapleji) ve kas kökenli (Örneğin, Duchenne kas distrofisi ve miyotonik Distrofi)1,2,3,4 . Buna rağmen bu bozuklukların çoğunun altında yatan moleküler mekanizmaları hakkında az şey bilinir. Bu mekanizmalar daha iyi anlaşılmasını tedaviler geliştirmek için önemlidir.
İnsanlar olduğu gibi canlılar, uçuş ve Drosophila, hareket gibi hareket orta beyin, periferik sinir sistemi ve kas tarafından kontrol edilir. Ayrıca, hızlı oluşturma süresi Drosophila genetik alet bu model organizma genler ile yüksek-den geçerek taranması için özellikle uygun yapmak ilgili ve hareket bozuklukları ve uyuşturucu testi5,6 için . Böyle ekranlar, güvenilir, uygun maliyetli ve göreli basit deneyleri gibi araçlar otomatik bir şekilde çıktı sonuçları ölçmek için test edilebilir için gereken koşulları önemli sayıda nedeniyle, son derece arzu edilir.
Schmidt vd. (2012) 7 açıklanan "ada tahlil" adında bir düşük maliyetli testiniz Drosophila Lokomotor davranışını değerlendirmek için. Ada tahlil başarıyla büyük ölçekli gösterimleri glia özgü işlevleri ile7, Drosophila modelleri Fikri Engellilik8ve genel değerlendirilmesi için değerlendirilmesinde genlerin tanımlamak için kullanılmıştır motor davranış9sinek. Ada tahlil ilke tasarımını yükseltilmiş bir platform üzerine birkaç sinek atılır oluşur. Bu platformdan saniye içinde kaçmak sağlıklı sinek sağlar doğuştan gelen bir motor davranış neden olmaktadır. Tahlil platformda saat7,8,9üzerinde kalan sinek sayısını ölçer. Tüm bu özellikler Adası tahlil hareket bozuklukları ilgili genler için güçlü tarama aracı olabilir gösterir.
Şu anda, kantitatif analiz filme Adası tahlil verilerin el ile7,8,9yapılır. Tahlil verimliliğini artırmak için yarı otomatik olarak sinekler platform kaçış ölçmek için bir düşük maliyetli yöntem geliştirilmiştir. Kur üzerinde sinekler platformunda sayısı quantifies platformu çerçeveler ile dizi s. çerçeveler sonra"Drosophila Adası tahlil" makro ile işlenen her 0.1 alınan görüntü zaman toplamak için bir dizüstü bilgisayar için bağlı basit bir web kamerası kullanır zaman. "Drosophila Adası tahlil" makro üç bağımsız alt makro ayrılmıştır: (I) ve "Create yığını ve projeksiyon," alt makro farklı alt klasörlerinde depolanan farklı ada deneyler tanımlar ve bir yığın ve her bir projeksiyon oluşturur saat serisi. (II "Platformu Define" alt makro arka arkaya bu noktada el ile ada platformu faiz (ROI) bölgesi olarak tanımlamak için kullanıcı talep deneysel alt klasörleri bireysel içinde bulunan tüm "Projection_image_name.tif" dosyaları açılır. (III) "analiz" otomatik olarak saat serisi sırasında platform üzerinde kalan sinek sayısı quantifies. Art arda (bir çalışma) alt makroları çalıştırabilirsiniz veya bağımsız olarak. İstatistiksel veri analizi için bir komut dosyası otomatik olarak elde edilen verileri işlemek için ve tedaviler/genotip önemli ölçüde birbirinden farklı (şekil 1) davranır olup olmadığını belirlemek için bir istatistiksel test uygulamak için geliştirilmiştir. Son olarak, bu kurulum değerlendirmek ve ataksi Telanjiektazi (AT) için bir Drosophila model anormal Lokomotor yeteneği ölçmek için kullanılabilir uygulaması gösterilmiştir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td class="xl19">25 x 95 mm Drosophila vials</td>
			<td class="xl19">Flystuff</td>
			<td class="xl20">32-116SB</td>
			<td class="xl19">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl21">Logitech C525 HD Webcam</td>
			<td class="xl19">Logitech</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Any webcam with USB connection is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Stand to hold webcam</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Lamp</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">12 V LED lights are appropriate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Pounding pad</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Any mouse pad works</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island Assay box</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island Assay bath</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 42x38x25 cm. Non white.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Island/platform</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Soap</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Standard dishwashing detergent is suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Computer</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Scripts run both on Windows and Mac</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl22">Image-recording software: HandiAvi&#174;</td>
			<td class="xl23">AZcendant&#174;</td>
			<td class="xl23">-</td>
			<td class="xl19">HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl22">Image-recording software: WebcamCapture</td>
			<td class="xl25">-</td>
			<td class="xl25">-</td>
			<td class="xl25">Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the &#34;Drosophila Island Assay&#34; macro on this data, no text should be present in the &#34;First frame identifier&#34; setting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">Fiji</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">R studio</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl24">Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl19">R</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl19">-</td>
			<td class="xl24">Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput analysis of locomotor behavior in the drosophila island assay

Yeni nesil sıralama teknolojileri gelişmeler (aday) hastalık genleri hareket bozuklukları ve diğer nörolojik hastalıkların artan bir hızda tanımlaması katkıda bulunur. Ancak, bu bozuklukların altında yatan moleküler mekanizmaları hakkında az şey bilinir. Drosophila melanogaster genetik, moleküler ve davranışsal araç bu model organizma yeni hastalık genler ve mekanizmaları bir yüksek-den geçerek şekilde karakterize etmek özellikle kullanışlıdır. Yine de, yüksek üretilen iş ekranlar bu, ideal olarak, düşük maliyetli ve özellikleri automatized miktar için bu bozuklukları için ilgili izin verimli ve güvenilir deneyleri gerektirir. Ada tahlil bir maliyet-etkin olduğunu ve kolayca kurulum yöntemi Drosophila Lokomotor davranışını değerlendirmek için. Bu tahlil, sinekler bir platform üzerine sabit bir yükseklikten atılır. Bu platformdan saniye içinde kaçmak sinek sağlar doğuştan gelen bir motor yanıt neden olmaktadır. Şu anda, kantitatif analiz filme Adası deneyleri el ile özellikle büyük ekran gerçekleştirirken zahmetli bir girişim olduğu yapılır.
Bu el yazması"Drosophila Adası tahlil" ve "Ada tahlil analiz" algoritmaları yüksek üretilen iş, otomatik bilgi işlem ve ada tahlil veri miktar için açıklar. Tahlil yapılır iken kurulumunda bir laptop için bağlı basit bir web kamerası bir görüntü serisi platformu toplar. Açık kaynak yazılım Fiji için geliştirilen"Drosophila Adası tahlil" algoritması bu görüntü serisi işler ve quantifies, deneysel her koşul için sinekler zamanla platformda sayısı. R, özgür yazılımla uyumlu "Ada tahlil analiz" komut dosyası, otomatik olarak elde edilen verileri işlemek için ve tedaviler/genotip istatistiksel olarak farklı olup hesaplamak için geliştirilmiştir. Bu büyük ölçüde Adası tahlil verimliliğini artırır ve temel hareket ve uçuş davranış için güçlü bir okuma yapar. Böylece sinek Lokomotor yeteneği, Drosophila modelleri hareket bozuklukları ve ilaç etkinliğini araştıran büyük ekranlara uygulanabilir.

Açıklanan protokolünde, Drosophila Adası tahlil verileri alınan ve üç adımda işlenir. İlk olarak, ada platform üzerine atılmış Drosophila uçuş kaçış tepkisi ile bir web kamerası kaydedilir ve bireysel .bmp görüntü (iletişim kuralı bölümleri 1-7) olarak depolanır. İkinci olarak,"Drosophila Adası tahlil" makro (Adım 8) üreten bir "result.txt" metin dosyası içinde her çerçevede tespit nesne sayısını özetlenen, (tablo 1), çerçeveler ve görüntü yığını "Result_stack.tiff, gösteren" işler Her çerçeve içinde belgili tanımlık peron alanı içinde tespit nesneler. Üçüncü olarak, "Ada tahlil analiz" komut dosyası (iletişim kuralı Bölüm 9) bireysel deneyler "dosyasýna" dosyalarında saklanan makro verileri işler. Birkaç adım filtre uygulamak ve verileri istatistiksel analiz için birleştirmek için komut dosyasında dahil edilmiştir. Sinekler platformda atılır ilk kare algılanır ve 1 saat noktası kabul. Önceki çerçeve kümesinden ortadan kalkar. 100 çerçeveler zaman aşağıdaki işaretleyin 1 (10'a karşılık gelen s) analiz için seçilir. Tespit sinekler platformunda ilk sayısı 5'ten küçük olan deneyler güvenilmez sonuçlar yeterince güçlü deneyler ortadan kaldırarak analizi, otomatik olarak dışarıda bırakılır. Hangi "Şişe başına sinekler sayısı" ayarı artı tolerans 3 tespit sinekler platformunda ilk sayısını aşıyor deneyler de dışarıda bırakılır. Bu hangi gürültü parçacıklar yanlışlıkla sinekler algılanan veri kümeleri ortadan kaldırır. Komut dosyası daha sonra dizide tespit sinekler en yüksek sayısına göre her zaman için tespit sinekler yüzdesini hesaplar. Veri kümeleri yürüyüş (sinekler yüzdesi bir artış platformda zamanla ardından bir düşüş olarak tespit) YG içinde ve dışında uçar kaynaklanan hataları otomatik olarak tarafından onları ile ilgili olarak sürekli mevcut platform üzerinde daha önceki aşamalarında düzeltilir . Ana dizinde bulunan tüm çoğaltma veri kümeleri belirli bir deneysel koşulu için birleştirilir ve "data_all_conditions.csv" dosyasına dışa. Onun sütunlar Tablo 2' de açıklanan değişkenleri temsil eder. Komut dosyası da bir çizgi grafik verileri içeren klasörü göre adlı deneysel her koşul için dışa aktaracaktır. Bu grafik sinekler olan deneysel (uçuş kaçış yanıt) zamanla platform üzerinde kalan yüzde çoğaltır kendi klasöründe ()şekil 3Amevcut gösterir-B). Ortalama, SD ve SEM deneysel her koşul için hesaplanır ve "İstatistik summary.csv" dosyasında özetlenmiştir. "Escape_response_all_conditions.tiff" adı verilen bir çizgi grafik ortalama uçuş kaçış yanıt ilâ 12 deneysel koşullar ()şekil 3 c)ana klasöründe mevcut gösterir. Son olarak, tüm deneysel koşullar ana klasöründe için eğri altındaki alan hesaplanan ve "AUC.csv" dosyasında özetlenmiştir. Koşullar ana klasöründe sayısına bağlı olarak, komut dosyası ya da bir iki uçlu unpaired Welch t-Testi (2 koşulları) ya da bir ANOVA Tukey düzeltme ile birden çok (2'den fazla koşullar) belirlemek test etmek için gerçekleştirir olup olmadığını deneysel koşullar önemli ölçüde birbirinden farklı. Bu sonuçlar "Welch_t-test_results.txt" veya "AUC_anova_results.txt." özetlenen ANOVA gerçekleştirirken komut dosyası da demek AUC farklılığı ve % 95 güven aralıkları karşılaştırılır deneysel koşullar görüntüler bir "AUC_anova.tiff" dosyası dışa aktaracaktır. Mutlak alan tüm deneysel koşullar için deneysel çoğaltır eğri altındaki değerleri tek tek veri noktalarını medians içinde "AUC.tiff" (şekil 3D) ile görüntülenir.
Ataksi Telanjiektazi (AT) serebellar ataksi ataksi Telanjiektazi mutasyona uğramış (ATM) gen14mutasyonların nedeniyle erken başlangıçlı ile karakterize bir otozomal resesif hareket bozukluğu var. ATM, tefu, Drosophila orthologue mutantlar kusurları hareketlilik ve uzun ömürlü15içinde görüntüler. "Drosophila Adası tahlil" makro değerlendirmek için Drosophila manken at Adası assay olarak test edilmiş ve makro veri çıkışı el ile veri sayıları için karşılaştırıldı. O her yerde tefu sonuç nakavt (w-; Actin-Gal4/GD11950) Bu sinekler (w-; onların genetik arka plan kontrollere göre platformu terk yeteneğini önemli ölçüde azaltır Actin-Gal4/+) ()şekil 4). 1 sonra s, % 50'sini kontrol sinekler kaçtı platformu, aksine &#60; tefu% 1 - RNAi uçar. Önemlisi, sayma, makroyu Adası tahlil veri miktar ve hareket kusurları () değerlendirilmesi için kullanılan güvenilir bir araç olduğunu belirten el kitabı tarafından elde edilen veriler ile makro sadakatle elde edilen veriler çoğaltılamaz Şekil 4 A-B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig1.jpg"> 
Şekil 1: gereksinimleri, deneysel bir işlem ve analiz Adası testin özetleyen akış çizelgesi. (A)Adası donanımları assay. (B) Adası tahlil için deneysel Kur. (C) Adası tahlil. (D)"Drosophila Adası tahlil" makro ile ada tahlil verilerin işlenmesi. "Drosophila Adası tahlil" makro 3 alt makroları oluşmaktadır: 1) yığını ve projeksiyon yapmak, 2) tanımlamak platformu ve 3) analizi. (E) işleme ve "Ada tahlil analiz" komut dosyası kullanarak verilerin istatistiksel değerlendirme. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig2.jpg"> 
Şekil 2: farklı ayarlar iletişim kuralı sırasında gerekli örnekleri. (A) gerekli dizin yapısı hangi Island'da, veri işleme ve analiz için tahlil deneyler depolanmalıdır. (Sinekler görünmesi gerekir video ayarlarını ayarlarkenB) siyah beyaz bir arka plan üzerinde. (C) resim çerçevesi çıktı dosyalarıBu el yazması açıklanan görüntü kayıt yazılımı tarafından kaydedilmiş gibi. (D) sarı anahat platform seçimi gösterir. Saklı platformu seçim "ROI Yöneticisi'nde" mavi renkle vurgulanır. (E) sinekler "en az sinek boyutu ayarını." ayarından sırasında beyaz noktalar gösterilir Sonuçları penceresinde alan "Sineklerin Tanrısı" piksel olarak gösterir. (F) bir tek kaydedilmiş resim çerçevesi (solda) ve"Drosophila Adası tahlil" makro (sağda) ile elde edilen sonuç Görüntü yığınındaki karşılık gelen çerçeve örneği. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig3.jpg"> 
Şekil 3: sonuç görüntüleri elde edilen veri işleme "Ada tahlil analiz" filmi ile sonra (A)satırının her biri için uçuş kaçış tepki gösteren grafik kontrol deneysel çoğaltılır. (B) hattı uçuş kaçış yanıt için her tefu RNAi deneysel REPLICATE gösteren grafik. (C) ortalama uçuş kaçış yanıt belirtilen deneysel koşullar için; hata çubukları denetim ve mutant koşulları için eğri dağılımı alanında temsil eden SEM (D) nokta araziler temsil eder. Deneysel çoğaltır koşulların her ikisi de tefu RNAi ve kontrol için tek tek veri noktaları (siyah) olarak medians (kırmızı çizgi) ile görüntülenir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55892/55892fig4.jpg"> 
Şekil 4: Her yerde tefu devirme sinekler platformu bırakmak önemli ölçüde azalma yeteneği gösterir. Zaman (s) için denetim (w-; içinde sinekler platformunda yüzde verileri temsil Actin-Gal4/+) ve tefu RNAi (w-; Actin-Gal4/GD11950) uçar. (çoğaltır sayısı = 5; hata çubukları SEM temsil eder). "Drosophila Adası tahlil" makro ile elde edilen(a)ham veri. (B) nokta çizer"Drosophila Adası tahlil" makro ile elde edilen denetim ve tefu RNAi koşulları için eğri dağıtım alanında temsil eden (Welch unpaired t-Testi, ** p &#60; 0,01). (C) ham veri elle sayılması tarafından elde edilen mevcut saniyede adada uçar. (D) nokta çizer denetim ve el-sayılarak elde Tefu RNAi koşulları için eğri dağılımı alanında temsil eden (Welch unpaired t-Testi, ** p &#60; 0,01). Hata çubukları SEM temsil <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55892/55892fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sütun adı</td>
			<td colspan="3">Açıklama</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilim</td>
			<td colspan="3">Çerçeve adı.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Count</td>
			<td colspan="3">Platformu (ROI) sınırları çerçevesinde tespit nesnelerinin sayısı.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toplam alan</td>
			<td colspan="3">Piksel cinsinden platformu (ROI) sınırları çerçevesinde tespit nesnelerinin toplam alan.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ortalama boyutu</td>
			<td colspan="3">Toplam alan platformu (ROI) sınırları içinde nesneleri sayısı bölü çerçevesinde tespit nesneler.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>% Alanı</td>
			<td colspan="3">Alan Toplam alan (ROI) platformu ile ilgili nesneler tarafından işgal yüzdesi.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perim.</td>
			<td colspan="3">Toplam çevre platformu (ROI) piksel sınırları çerçevesinde tespit nesneler.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Min. sinek boyutu</td>
			<td colspan="3">En azından uçmak"Drosophila Adası tahlil" makro (piksel cinsinden) grafik arayüzü kullanıcı tarafından tanımlanan boyutu ayarı.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alan yatırım Getirisi</td>
			<td colspan="3">Alt makro Çalıştır sırasında kullanıcı tarafından tanımlanan platformu (ROI) alanını tanımlamak platformu (piksel cinsinden).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sinekler sayısı</td>
			<td colspan="3">"Drosophila Adası tahlil" makro grafik arayüzü kullanıcı tarafından tanımlanan deneme başına kullanılan sinekler sayısı.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1:"Drosophila Adası tahlil" makro tarafından ölçülen parametreler. Bu tabloda açıklanan parametreleri"Drosophila Adası tahlil" makro çalıştıran üzerine "sonuç.txt" dosyasında görünür.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sütun adı</td>
			<td colspan="3">Açıklama</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilim</td>
			<td colspan="3">Çerçeve numarası.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Count</td>
			<td colspan="3">Sinekler platformu (ROI) sınırları çerçevesinde tespit sayısı.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Area</td>
			<td colspan="3">Toplam alan platformu (ROI) piksel sınırları çerçevesinde tespit Sineklerin Tanrısı.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Min. sinek boyutu</td>
			<td colspan="3">En azından"Drosophila Adası tahlil" makro (piksel cinsinden) grafik arayüzü kullanıcı tarafından tanımlanan boyutu giriş ayarı sinek.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alan yatırım Getirisi</td>
			<td colspan="3">Alt makro çalıştıran "tanımladığınızda platformu" kullanıcı tarafından tanımlanan platformu (YG, piksel) alanı.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sinekler sayısı</td>
			<td colspan="3">"Drosophila Adası tahlil" makro grafik arayüzü kullanıcı tarafından tanımlanan deneme başına kullanılan sinekler sayısı.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X.Count</td>
			<td colspan="3">% platformu çerçevesinde ilgili dilim/platform üzerinde deneme sırasında tespit sinekler en yüksek sayısına oranla mevcut uçar.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timepoint</td>
			<td colspan="3">Zaman noktası 1 analiz edilecek ilk kareyi temsil eder ve sinekler platformda ilk görüntülendiği çerçevenin karşılık gelir. Var a toplam 100 kare / analiz çoğaltılır (10'a karşılık gelen açıklanan ayarlarını kullanırken s.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deney</td>
			<td colspan="3">Koşul başına çoğaltır sayısı.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koşul</td>
			<td colspan="3">Deneysel durumuna (göre verileri içeren klasörü kullanıcı tarafından tanımlanan adı) adını gösterir.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 2: değişkenleri açıklaması elde edilen veri "Ada tahlil analiz" filmi ile işledikten sonra Bu tabloda açıklanan parametreleri "Ada tahlil analiz" komut dosyası ile veri işleme üzerine "data_all_conditions.csv" dosyasında görünür.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay at JoVE.com

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Ada tahlil Drosophila melanogastertemel Lokomotor davranışını değerlendirmek için kullanılan nispeten yeni, düşük maliyetli bir tahlil olduğunu. Bu el yazması için otomatik veri işleme ve ada tahlil veri, bu hassas, yüksek üretilen iş göstergesi büyük genetik veya farmakolojik ekranlar için tahlil yaparken objektif miktar algoritmaları açıklar.

Yüksek üretilen iş analiz Locomotor davranış Drosophila Adası tahlil

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

high-throughput-analysis-locomotor-behavior-drosophila-island

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

8.8K Görüntüleme.  Radboud University Medical Center. Ada tahlil Drosophila melanogastertemel Lokomotor davranışını değerlendirmek için kullanılan nispeten yeni, düşük maliyetli bir tahlil olduğunu. Bu el yazması için otomatik veri işleme ve ada tahlil veri, bu hassas, yüksek üretilen iş göstergesi büyük genetik veya farmakolojik ekranlar için tahlil yaparken objektif miktar algoritmaları açıklar.

Video: High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Böcekler Tek Sensillum Kayıtlar Drosophila melanogaster Ve Anofel gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Nörobilim

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

Assaying Lokomotor, Öğrenme ve Hafıza Açıkları. Drosophila Nörodejenerasyon, modeller

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Studying the Neural Basis of Adaptive Locomotor Behavior in Insects

Studying the neural basis of walking behavior, one often faces the problem that it is hard to separate the neuronally produced stepping output from those leg movements that result from passive forces and interactions with other legs through the common contact with the substrate. If we want to understand, which part of a given movement is produced by nervous system motor output, kinematic analysis of stepping movements, therefore, needs to be complemented with electrophysiological recordings of motor activity. The recording of neuronal or muscular activity in a behaving animal is often limited by the electrophysiological equipment which can constrain the animal in its ability to move with as many degrees of freedom as possible. This can either be avoided by using implantable electrodes and then having the animal move on a long tether (i.e. Clarac et al., 1987; Duch &amp; Pfl&uuml;ger, 1995; B&ouml;hm et al., 1997; Gruhn &amp; Rathmayer, 2002) or by transmitting the data using telemetric devices (Kutsch et al, 1993; Fischer et al., 1996; Tsuchida et al. 2004; Hama et al., 2007; Wang et al., 2008). Both of these elegant methods, which are successfully used in larger arthropods, often prove difficult to apply in smaller walking insects which either easily get entangled in the long tether or are hindered by the weight of the telemetric device and its batteries. In addition, in all these cases, it is still impossible to distinguish between the purely neuronal basis of locomotion and the effects exerted by mechanical coupling between the walking legs through the substrate. One solution for this problem is to conduct the experiments in a tethered animal that is free to walk in place and that is locally suspended, for example over a slippery surface, which effectively removes most ground contact mechanics. This has been used to study escape responses (Camhi and Nolen, 1981; Camhi and Levy, 1988), turning (Tryba and Ritzman, 2000a,b; Gruhn et al., 2009a), backward walking (Graham and Epstein, 1985) or changes in velocity (Gruhn et al., 2009b) and it allows the experimenter easily to combine intra- and extracellular physiology with kinematic analyses (Gruhn et al., 2006).
We use a slippery surface setup to investigate the timing of leg muscles in the behaving stick insect with respect to touch-down and lift-off under different behavioral paradigms such as straight forward and curved walking in intact and reduced preparations.

We describe a method to record motor activity, timed to the electrically recorded tarsal contact signal in a tethered insect, walking on a slippery surface. This is used to study the neural basis of adaptive behavior under reduced influence of mechanical interaction between legs through the substrate.

Böcekler Adaptif Lokomotor Davranış Sinir Dayanak incelenmesi

Studying the neural basis of walking behavior, one often faces the problem that it is hard to separate the neuronally produced stepping output from those ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Test için Yöntemler Drosophila Davranış

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Yılında Escape Davranış Optogenetic Uyarım<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

Toplayıcılık Davranış için Tek-sinek Deneyi<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Olarak spontan lokomotor aktivitenin belirlenmesi<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

Yüksek Verimli Testi Bireyin Yumurta Yumurtlayan Tercihler incelemek için<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Kullanımı Ödül arayan davranış değişiklikleri Tedbir Basit Yolu<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Yüksek üretilen iş analiz Locomotor davranış Drosophila Adası tahlil

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Böcekler Tek Sensillum Kayıtlar Drosophila melanogaster Ve Anofel gambiae

Assaying Lokomotor, Öğrenme ve Hafıza Açıkları. Drosophila Nörodejenerasyon, modeller

Böcekler Adaptif Lokomotor Davranış Sinir Dayanak incelenmesi

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

Test için Yöntemler Drosophila Davranış

Yılında Escape Davranış Optogenetic Uyarım

Toplayıcılık Davranış için Tek-sinek Deneyi

Olarak spontan lokomotor aktivitenin belirlenmesi

Yüksek Verimli Testi Bireyin Yumurta Yumurtlayan Tercihler incelemek için

Kullanımı Ödül arayan davranış değişiklikleri Tedbir Basit Yolu