Name: cryopreservation of zebrafish spermatogonia by whole testes needle immersed ultra-rapid cooling
Uploaded: 2018-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling at JoVE.com

Bu çalışmada ulusal araştırma, geliştirme ve yenilik Office Macaristan (grant 116912 ÁH için), maliyet office tarafından desteklenmiştir (Gıda ve tarım maliyet eylem FA1205: AQUAGAMETE), Stipendium Hungaricum burs programı (grant ZM için) ve yeni Macar Ulusal mükemmellik HGUGM Bursu (EK hibe).

Tüm yöntem tanımlamak burada Macar hayvan refah hukuk tarafından onaylanmıştır.
1. reaktif hazırlık
<ol><li>Hisse senedi çözümleri<ol>
<li>1 M trehalose de tamamen eriyene kadar trehalose dihydrate 0,378 g dH2O. Mix 1 mL ekleyerek hazırlayın.</li>
		<li>1 M Sükroz de tamamen eriyene kadar dH2O. Mix 1 mL sukroz 0.342 g ekleyerek hazırlayın.</li>
		<li>1 M HEPES de tamamen eriyene kadar dH2O. Mix 1 mL HEPES 0,238 g ekleyerek hazırlayın.</li>
		<li>20 mg/mL collagenase (290 U/mg) 100 mg 5 mL için PBS de ekleyerek hazırlayın. İyice eriyene kadar karıştırın. 0.2 µm filtreler steril filtreden. Aliquot 50 µL içine 0.2 mL PCR tüpleri ve 20 ° C'de - dondurma</li>
		<li>15 mg/mL tripsin hazırlamak (~ 10000 U/mg) 75 mg 5 mL için PBS de ekleyerek. İyice eriyene kadar karıştırın. 0.2 µm filtreler steril filtreden. Aliquot 50 µL içine 0.2 mL PCR tüpleri ve 20 ° C'de - dondurma</li>
		<li>1 mg/mL Dnaz hazırlamak ben (~ 3000 U/mg) 5 mg 5 mL için PBS de ekleyerek. İyice eriyene kadar karıştırın. 0.2 µm filtreler steril filtreden. Aliquot 50 µL içine 0.2 mL PCR tüpleri ve 20 ° C'de - dondurma</li>
		<li>%0,4 trypan mavi PBS için 10 mL trypan mavi 40 mg ekleyerek hazırlayın. 0.2 µm filtreler steril filtreden. 1.5 mL tüpler içine aliquot 1 mL.</li>
		<li>200 mg/L MS hazırlamak-de tamamen eriyene kadar ekleyerek MS-222 200 mg 1 litre dH2O. Mix 222 (Tricaine metan Sülfonat). Buna ek olarak, MS-222 çözüm nötr pH 7.0 için sodyum bikarbonat ile tampon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vitrifiye için çözümler<ol>
<li>Denge çözüm (ES) hazırlamak: ES 2 mL metanol (MeOH; 1,5 M), 121.5 µL karıştırılarak hazırlamak propilen glikol (PG; 1,5 M), 220 µL FBS (% 10), trehalose hisse senedi çözüm (0,1 M), 50 µL HEPES hisse senedi çözüm (25 mM) ve L-15 1208.5 µL 2 içine 200 µL 200 µL mL tüp.</li>
		<li>Vitrifiye çözüm (VS) hazırlamak: PG (3 M), Dimetil sülfoksit 426 µL 439 µL karıştırılarak vs 2 mL hazırlamak (bana2yani; 3 M), 200 FBS (% 10), trehalose hisse senedi çözüm (0,1 M), HEPES 50 µL 200 µL µL stok çözüm (25 mM) ve L-15 685 µL bir 2 mL tüp.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isınma için çözümler<ol>
<li>Isınma çözüm 1 (WS1) hazırlamak: WS1 1,5 mL 2 mL tüp içinde FBS (% 10), sukroz hisse senedi çözüm (3 M) 450 µL 150 µL karıştırarak hazırlayın ve L-15 900 µL.</li>
		<li>Isınma çözüm 2 (WS2) hazırlamak: WS2 1,5 mL 2 mL tüp içinde FBS (% 10), sukroz hisse senedi çözüm (1 M) 150 µL 150 µL karıştırarak hazırlayın ve L-15 1200 µL.</li>
		<li>Isınma çözüm 3 (WS3) hazırlamak: WS2 1,5 mL 2 mL tüp içinde karıştırma 150 µL FBS (% 10) tarafından hazırlamak ve L-15 1350 µL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sindirim çözüm hazırlamak: her örnek hazırlamak için sindirim çözeltinin 500 µL 50 µL collagenase hisse senedi çözüm (2 mg/mL), 50 µL tripsin hisse senedi çözüm (1.5 mg/mL) karıştırılarak, 10 µL Dnaz, ben (20 µg/mL) ve L-15 390 µL 2 ml tüp.</li>
	<li>Diseksiyon Araçları'nı edinmeniz: makas, microscissors, cımbız, eğri cımbız ve akupunktur iğneleri.</li>
</ol>2. testis koleksiyonu
<ol><li>200 mg/L MS içeren bir tabak içine yerleştirerek balık ötenazi-222 (pH = 7). Diseksiyon ile devam etmeden önce solungaçları hareket durdu ve o en az 10 dk ölüm hipoksi tarafından emin olmak için o andan beri geçti emin olun.</li>
	<li>Kağıt havlu üzerinde okşamaya tarafından kuru balık ve sırt tarafında bir diseksiyon Mat yerleştirin.<ol>
<li>Öncelikle pelvis ve göğüs yüzgeçleri daha kolay diseksiyon için kesti.</li>
		<li>Yatay olarak cilt üzerinde balık göğüs yüzgeçleri arasında göbek makasla kesme ve cilt ve temel kas göbek boyunca anal yüzgeç kadar kesti.</li>
		<li>Balık vücut boşluğuna açın ve iğnelerle diseksiyon mat sol ve sağ vücut duvara pin. Not: Testis Yüzme kesesi (şekil 1) her iki tarafında gastrointestinal organ yukarıda yer alır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kirlenmesini önlemek için sindirim organları almaz ama nazikçe onları bir kenara itmek ve testis karşı taraftan kaldırın. Testisler vücut duvara bağlı olan çok dikkatli bir şekilde çıkarın ve bağlantı Periton microscissors tarafından kesilmiş.</li>
	<li>Ayrıca, kirlenmesini önlemek için ilk olarak testis % 70 etanol 2 s ve sonra yer için onları koyarak sterilize buzda bir 96-şey tabakta L-15 onları. Not: gerekli ise, temiz testis yağ dokusu ve büyük damarları stereomicroscope altında tam kan</li>
</ol>3. hızlı testis dokusunun soğutma
<ol><li>Mark iğneler bağlı olarak örnek uygun etiketleri yazın ve denge (ES) ve Vitrifiye Çözümleri (VS) hazırlayın.</li>
	<li>Testis daha büyük bir iyi tabak veya çanak ve PIN iki ya da üç testisler (veya daha fazla iğne boyutuna bağlı olarak) bir steril akupunktur iğnesi aktarın.<ol>
<li>Öncelikle testis eğri cımbız üstüne getirin. Testis ortasında iğne üzerine getirin ve dikkatle testis yukarı cımbızla çekin.</li>
		<li>Testis delinme sonra hafifçe yukarı doğru iğne üst doğru çekin. Testis birbirinden ayrılır ve onlar are değil düşme ya da aşağı kayan olduğunu doğrulayın.</li>
		<li>2 mL tüp içinde sabitlenmiş testis iğnelerle dolu yer L-15 kadar vitrifikasyon ile (25 ˚C; saklama süresi 1 h geçmemelidir). Not: testis iğne sabitleme hızlı testis kurumasını önlemek için yapılmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Testis iğneyle denge çözüm içine aktarmak ve 25˚C, 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>İğne vitrifikasyon çözüm içine aktarmak ve 30 için kuluçkaya 25˚C s.</li>
	<li>İğne vitrifikasyon çözümden kaldırmak için hızlı bir şekilde ve yavaşça dokusundan kalan çözüm bir steril kağıt havlu emmek. Kağıt havlu yapışmasını veya düşme testis önlemek için dikkatli olun.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde sıvı azot bir Styrofoam kutusu yerleştirilmiş iğne yerleştirin. Not: hızlı bir şekilde sıvı azot buharı için doku maruz önlemek için bu adımı yapmak. Sıvı azot düşük hacimli Çapraz bulaşma örneklerin engellemek için kullanın.</li>
	<li>5-10dk için kapalı bir Styrofoam kutusu içinde sıvı azot iğne tutun.</li>
	<li>Bir açılan 4.5 mL cryotube ve onun cap aynı kutusunda precool.</li>
	<li>5-10 dk sonra sıvı azot yüzeyinin altında ayrı bir cryotube içine her iğne transfer ve cryotube kapatın. Dikkat: Her zaman (örneğin, İZOLELİ eldiven) koruyucu giysi kullandığınızda pozlama için şiddetli soğuktan yol açabilir gibi sıvı azot ile çalışma.</li>
	<li>Cryotube metal baston üzerine yerleştirin ve kısa sürede cryobank teneke kutu yerleştirin. Örnekleri bir teneke kutu depoda saklamak dewar kullanmaya devam etmenize kadar.</li>
</ol>4. ısınma yordamı
<ol><li>Her iğne ayrı ayrı sıcak. Tüm ısınma çözümler 25 ° C'de olmalıdır</li>
	<li>Cryotube metal baston üzerinden bağlantısını kesin ve sıvı azot bir strafor kutu içinde saklanan içine dalma.</li>
	<li>Cryotube (forseps kullanarak) sıvı azot Buhar açmak ve iğne sıvı azot bırakın.</li>
	<li>İğne çok hızlı ilk ısınma çözüm aktarmak ve (25 ° C'de) 1 dk. için kuluçkaya. Hızlı bir şekilde onun havada aktarım sırasında ısınma önlemek için iğne transfer emin olun.</li>
	<li>İğne ikinci ısınma çözüm içine aktarmak ve 3 dak (25 ° C'de) için kuluçkaya.</li>
	<li>İğne üçüncü ısınma çözüm içine aktarmak ve (25 ° C'de) 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Testis iğne üzerinden onları aşağıya doğru eğimli cımbızla kaydırarak serbest bırakın. Tek tek bir kuyuya ayrı (96-şey plaka) ısıtılan her testis dolu 250 µL % 10 ile desteklenmiş L-15 ile yer FBS. Kuyuları örnek göre etiketlenir emin olun. İyi plaka tüm örneklerini ısındı kadar buz üzerinde ve daha fazla çalışma kadar tutun.</li>
</ol>5. doku sindirim
<ol><li>Ayrılma çözeltinin 500 µL her örneği ayrı 2 mL tüpler için hazır olun. Örnek koduna göre tüpler etiketleyin. Oda sıcaklığında 5 min için hazırlanan ayrılma çözüm kuluçkaya.</li>
	<li>Sindirim çözüm içine ısıtılmış doku ekleyin ve küçük makas en az 30 hareketlerle küçük parçalar halinde kesin.</li>
	<li>Kesme doku 90 dk 25 ˚C az için titreyen bir plaka üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>L-15 ve 100 µL FBS, 400 µL ekleyerek sindirim işlemini durdurmak (% 10 FBS v/v). Kısaca çözüm sallamak ve oda sıcaklığında 1 dk. için kuluçkaya.</li>
	<li>Elde edilen çözüm 1.5 mL tüp içine 50 µm filtreler aracılığıyla filtre. Buna göre tüplere etiket.</li>
	<li>200 × g 10 dk 25 ˚C az için filtre uygulanmış çözüm santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Dikkatle süpernatant kaldırmak ve 20 µL % 10 ile desteklenmiş L15 Pelet resuspend FBS. Pelet tamamen eriyene kadar el ile tüp sallamak. Hücre süspansiyon 4 ˚C veya buz üzerinde daha fazla kullanımda kadar devam.</li>
</ol>6. canlılığı değerlendirme ve Hücre sayımı
<ol><li>Mix 5 µL hücre süspansiyon ve 5 µL % 0,4 trypan mavi çözüm bir uygun şekilde etiketlenmiş 0.2 mL PCR tüp. Farklı birimler kullanılırsa, emin olun seyreltme oranı 1:1 kalır.</li>
	<li>Bu süspansiyon, oda sıcaklığında (25 ° C) 1-3 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Bir hemasitometre mikroskop altında her örnekte canlılığı kontrol edin.</li>
	<li>15 alanları (trypan mavi tarafından günahı) canlı hücreleri saymak. Hücrelerde hücre süspansiyon 20 µm toplam sayısını hesaplayın. Süspansiyon artık herhangi bir aşağı akım uygulama için hazırdır. Not: yordamı büyük vücut büyüklüğü ile diğer türler için en iyi duruma getirme, eşit ağırlık, testis parçaları kullanın. Testis bir birey tüm deneysel grupları için gelen sonuçlarda bireysel farklılıklarına önlemek için kullanın. Zebra balığı söz konusu olduğunda, biz aslında bu sol yararlandı ve sağ testis germ hücreleri13 eşit (ya da çok benzer) sayısı içermelidir (temsilcisi sonuçları görmek). Sağ testis Vitrifiye/sıcak iken sol testis bir denetim olarak tutuldu. Canlılığı yüzdesi hesaplanmıştır taze testis izole hücre sayısı karşılaştırıldığında Vitrifiye/ısındı testislerden izole hücre sayısı.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+the+germplasm+of+animals+used+in+biological+and+medical+research:+Importance,+impact,+status,+and+future+directions.">Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions.</a> Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).</li><li>Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+In+Vitro+Fertilization+at+the+Zebrafish+International+Resource+Center.">Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center.</a> Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).</li><li>Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simplified+and+standardized+protocol+with+potential+for+high-throughput+for+sperm+cryopreservation+in+zebrafish+Danio+rerio.">Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio.</a> Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).</li><li>Morris, J. P., Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+sperm+cryopreservation+with+N,N-dimethylacetamide.">Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide.</a> Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).</li><li>Yoshizaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogonial+transplantation+in+fish:+A+novel+method+for+the+preservation+of+genetic+resources.">Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources.</a> Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).</li><li>Gao, D., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cryoinjury+in+living+cells.">Mechanisms of cryoinjury in living cells.</a> ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).</li><li>Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horv&#225;th, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress,+challenges+and+perspectives+on+fish+gamete+cryopreservation:+A+mini-review.">Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).</li><li>K&#225;sa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+sperm+vitrification+protocols+for+freshwater+fish+(Eurasian+perch,+Perca+fluviatilis)+and+marine+fish+(European+eel,+Anguilla+anguilla).">Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla).</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).</li><li>Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+channel+catfish+with+sperm+cryopreserved+by+rapid+non-equilibrium+cooling.">Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling.</a> Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).</li><li>Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle+immersed+vitrification:+A+practical+and+convenient+method+with+potential+advantages+in+mouse+and+human+ovarian+tissue+cryopreservation.">Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation.</a> Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Live+Offspring+from+Testicular+Tissue+Cryopreserved+by+Vitrification+Procedures+in+Japanese+Quail+(Coturnix+japonica).">Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica).</a> Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle-in-straw+vitrification+can+effectively+preserve+the+follicle+morphology,+viability,+and+vascularization+of+ovarian+tissue+in+Japanese+quail+(Coturnix+japonica).">Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica).</a> Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).</li><li>Lee, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+cryopreservation+of+spermatogonia+in+critically+endangered+Manchurian+trout+(Brachymystax+lenok).">Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok).</a> Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).</li><li>Marques, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+of+zebrafish+(Danio+rerio)+ovarian+follicles+after+vitrification+in+a+metal+container.">Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container.</a> Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).</li><li>Luji&#263;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+successful+vitrification+of+salmonid+ovarian+tissue.">First successful vitrification of salmonid ovarian tissue.</a> Cryobiology. 76, 154-157 (2017).</li><li>Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., Garc&#237;a-Xim&#233;nez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+on+cell+viability+of+three+zebrafish+testicular+cell+or+tissue+cryopreservation+methods.">Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods.</a> CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).</li><li>Marinovi&#263;, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosurvival+of+isolated+testicular+cells+and+testicular+tissue+of+tench+Tinca+tinca+and+goldfish+Carassius+auratus+following+slow-rate+freezing.">Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).</li><li>P&#353;eni&#269;ka, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+early+stage+Siberian+sturgeon+Acipenser+baerii+germ+cells,+comparison+of+whole+tissue+and+dissociated+cells.">Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells.</a> Cryobiology. 72, 119-122 (2016).</li><li>Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eggs+and+sperm+from+cryopreserved+whole+testes.">Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes.</a> Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu çalışmanın temel amacı iğne adapte kuş ve memeli türleri10,11,12 ' ye balık testis (Zebra balığı bir model olarak dondurma için geliştirilen hızlı soğutma yordamı dalmış oldu organizma). Zebra balığı genetik kaynakları dondurma ile ilgili önceki çalışmaların en öncelikle Zebra balığı sperm2,3,4dondurm...

Bilim ve biyoteknoloji yeni eğilimler fareler, Drosophila, Zebra balığı ve canlılar arasında Biyomedikal ve diğer Bilimler1kullanılan diğer türler yeni mutant satırları binlerce yaratılmasına yol açmıştır. Yeni teknolojiler geliştirdi ve kullanılabilir hale gelir, Ayrıca, mutant satırların numaralarını giderek2artar. Bu genetik kaynakları kolonileri damızlık tutmanın ortak uygulamalar ötesinde bir güvenli depolama için gerekliliğini yol açar. Belirsiz bir süre için genetik kaynaklarının güvenli depolama sağlayan bir yöntem olarak olarak üreme sezonu, uzantısı broodstock sürekli bakım gereksinimini kaçınmanızı sağlar ve daha fazla maliyet - dondurma birçok avantaj sunar ve emek verimli2.
Geçtiğimiz birkaç yıl2,3,4 sırasında geliştirilen sperm dondurma protokollerde Zebra balığı erkek genetik materyal başarılı Muhafazası için fırsat sunuyoruz. Ancak, yumurta veya balık embriyo dondurma henüz onların karmaşık yapısı ve sarısı malzeme büyük miktarda nedeniyle mümkün değildir. Son zamanlarda, primordial germ hücreleri (PGCs) veya spermatogonial (SSCs) kök hücre nakli pratiği fonksiyonel sperm ve yumurta nakli5sonra geliştirerek bu bariyer için yan yol sunmaktadır. Bu nedenle, dondurma SSCs, nadir ve değerli genetik kaynakların korunması yeni bir sınır sağlar.
Dondurma pek çok avantajları sunuyor olsa bile, yavaş hızı dondurma işlemi hücre hasarı2' ye neden olabilir birkaç koşulları oluşturur. Bu hücre içi ve hücre dışı buz oluşumu, dehidratasyon, cryoprotectant toksisite ve diğerleri içerir. Hücre içi buz hücreleri zarar, hücre dışı buz hücrelerden su Difüzyon sırasında yavaş kuru buz gibi su kaybı6için neden olabilir iken mekanik hücreleri, kırma için neden olabilir. Son zamanlarda, Vitrifiye buz oluşumu olumsuz etkilerini önleyen bir teknik olarak balık gamet7,8,9dondurma uygulanmıştır. Bir ultra hızlı soğutma tekniği ile iç ve dış ortam buz7,10crystalizing olmadan amorf/cam gibi bir duruma çevirmek sunar. Testis ve Yumurtalık dokusunun başarılı vitrifikasyon böylece uygulama için olanaklar balık de açılış kuş ve memeli türleri10,11,12' kanıtlandığı.
Bu çalışmada, biz iğne batırılır Vitrifiye (NIV) yordamı tüm Zebra balığı testis dondurma için mevcut. Zebra balığı aşamasındaki germ hücreleri kirlenme ve nispeten yüksek miktarda aşamasındaki germ hücreleri düşük varlığı diğer hücreleri, özellikle sperm hücreleri ile verimleri bir dondurma işlemi olmadan yalıtım için güvenilir bir yöntem gösterilmektedir. Bizim bilgi en iyi şekilde, bu ultra hızlı soğutma balık Gonad doku ve Zebra balığı germline hücreleri için detaylı bir görüntülenmeyecektir protokol göstermek için ilk çalışmadır. Ayrıca, tekrarlanabilirlik yönteminin beş farklı Zebra balığı suşları içinde gösterilmiştir: AB vahşi türü, casper (roy- / -; sedef- / -), leopard (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] ve Wilms tümörü [Tg (wt1b::eGFP 1)] transgenik hattı.

<table><tbody><tr><td>Leibovitz media (L-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>Supplemented with L-glutamine</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Acros Organics</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Acros Organics</td><td>99-20-7</td><td>Dihydrate</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Reanal</td><td>20740-0-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Propylene glycol</td><td>Reanal</td><td>08860-1-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Reanal</td><td>00190-1-01-65</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Gibco</td><td>9001-12-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Panreac AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Phospate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Tablets for preparation of 200 ml PBS solution</td></tr></tbody></table>

cryopreservation of zebrafish spermatogonia by whole testes needle immersed ultra-rapid cooling

Böylece kolonileri damızlık tutmanın ortak uygulamalar dışında genetik kaynaklarının güvenli depolama için yeni yöntemler için gerekliliğini önde gelen model organizmalar yeni satırları binlerce kurulması için bilim ve biyoteknoloji mevcut eğilimler yol. Bu çalışmanın temel amacı iğne adapte Vitrifiye (NIV) yordamı tüm Zebra balığı testis cryopreserve dalmış oldu. Özellikle nakli sonra erkek ve dişi gamet olgun beri dondurma bütün testisler tarafından aşamasındaki germ hücrelerinin NIV genetik kaynakları, Zebra balığı Muhafazası için olanaklar sunuyor. Testisler, iki cryoprotective medyada (1.5 M metanol ve 1,5 M propilen glikol; içeren denge çözüm ve Vitrifiye çözüm 3 M Dimetil sülfoksit ve 3 M propilen glikol içeren) equilibrated bir akupunktur iğnesi üzerinde pinned eksize ve sıvı azot içine daldı. Örnekleri bir dizi üç sonucu ısınma çözümleri ısındı. Bu teknik en önemli avantajları (1) sperm eksikliği aşağı akım manipülasyonlar; böylece kolaylaştırmak ısıtılan testis sindirim sonra vardır. (2) ultra hızlı sıvı nitrojen bu nedenle soğutma ve cryoprotectants, böylece onların toksisite azaltmak gerekli konsantrasyonu azaltarak en üst düzeye çıkarma en uygun maruz dokuların etkinleştirme soğutma; (3) birkaç testisler zaman uyumlu maruz kalma cryoprotectants ve sıvı azot; ve beş farklı Zebra balığı suşların % 50 üzerinde canlılık elde ederek (4) tekrarlanabilirlik gösterdi.

Ortalama olarak, aşamasındaki germ hücreleri tek taze Zebra balığı testislerden izole balığın büyüklüğüne bağlı olarak 40.000 ve 200.000 hücreler arasında değişmekteydi. Ne zaman tüm 5 suşları taze Zebra balığı testis sindirerek, erken germ hücreleri tek hücre hücre süspansiyonlar (Şekil 2) mevcut değildi. Aşamasındaki germ hücreleri çok sayıda sperm hücreleri de bulundu. Öte yandan, cryopreserved testis sindirim sonra ?...

Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling at JoVE.com

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Zebra balığı Spermatogonia bütün testis iğne tarafından dondurma hızlı soğutma dalmış

Bu çalışmanın temel amacı iğne adapte Vitrifiye (NIV) yordamı tüm Zebra balığı testis cryopreserve dalmış oldu. Ayrıca, beş farklı Zebra balığı suşları yönteminde tekrarlanabilirlik test edildi.

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

cryopreservation-zebrafish-spermatogonia-whole-testes-needle-immersed

Research

JoVE Journal

Biology

8.3K Görüntüleme.  Szent István University. Bu çalışmanın temel amacı iğne adapte Vitrifiye (NIV) yordamı tüm Zebra balığı testis cryopreserve dalmış oldu. Ayrıca, beş farklı Zebra balığı suşları yönteminde tekrarlanabilirlik test edildi.

Video: Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

Isıl Şok 2 Tedavi ile Zebra balığı Embriyolar ploidisi Manipülasyon

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

Gelişim Biyolojisi

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

Zebrabalığı Spermatositlerinden Meiotik Kromozom Spreadlerinin Hazırlanması

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Genetik

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging model systems. CRISPR-Cas genome editing systems use a synthetic guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to specific genomic DNA loci, where the Cas endonuclease generates a double-strand break. The repair of double-strand breaks by intrinsic error-prone mechanisms leads to insertions and/or deletions, disrupting the locus. Alternatively, the inclusion of double-stranded DNA donors or single-stranded DNA oligonucleotides in this process can elicit the inclusion of precise genome edits ranging from single nucleotide polymorphisms to small immunological tags or even large fluorescent protein constructs. However, a major bottleneck in this procedure can be finding and isolating the desired edit in the germline. This protocol outlines a robust method for screening and isolating germline mutations at specific loci in Danio rerio (zebrafish); however, these principles may be adaptable in any model where in vivo sperm collection is possible.

CRISPR-Cas technologies have revolutionized the field of genome editing. However, finding and isolating the desired germline edit remains a major bottleneck. Therefore, this protocol describes a robust method for quickly screening F0 CRISPR-injected zebrafish sperm for germline edits using standard PCR, restriction digest, and gel electrophoresis techniques.

Zebra balıklarında germline düzenlemelerinin hızlı izolasyonu için sperm taraması

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

Zebra balığı sperm Kriyoprezervasyon için bir Yüksek Verim Yöntem ve In Vitro Gübreleme

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Biyoloji

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from heterozygous females allow F1 mutagenized females to be screened directly for deleterious mutations in an accelerated forward genetic screen. Streisinger et al.1,2 described methods for making gynogenetic (homozygous) diploid zebrafish by activating zebrafish eggs with ultraviolet light-inactivated sperm and preventing either the second meiotic or the first zygotic cell division using physical treatments (heat or pressure) that deploymerize microtubules. The "early pressure" (EP) method blocks the meiosis II, which occurs shortly after fertilization. The EP method produces a high percentage of viable embryos that can develop to fertile adults of either sex. The method generates embryos that are homozygous at all loci except those that were separated from their centromere by recombination during meiosis I. Homozygous mutations are detected in EP clutches at between 50% for centromeric loci and less than 1% for telomeric loci. This method is reproduced verbatim from the Zebrafish Book3.

This is a method for generating gynogenetic diploid zebrafish embryos (embryos whose only genetic contribution comes from the mother) by blocking the second meiotic division immediately after fertilization with ultraviolet light-inactivated sperm. EP embryos are not fully homozygous due to recombination during the first meiotic division, however they are homozygous at all loci that have not been separated from their centromere by recombination.

Erken Basınç Gynogenetic Diployid Zebra balığı

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Zebrabalığı Embriyoları ve Larvalarında Tüm Mount Immunohistochemistry

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

Haploit Zebra balığı Embriyolar üretimi ile<em&gt; In Vitro</em&gt; Gübreleme

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Yüksek verim Uygulamaları Yetişkin Zebra Hearts Kurtarma

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from zebrafish has not been established. The previous methods for blood collection from zebrafish are lethal, such as lateral incision, decapitation and tail ablation. Thus we have developed a novel &#8220;repeated&#8221; blood collection method, and present here a detailed protocol outlining this procedure. This method is minimally invasive and results in a very low mortality rate (2.3%) for zebrafish, thus enabling repeated blood sampling from the same individual. The maximum volume of blood sampling is dependent on body weight of the fish. The volume for repeated blood sampling at intervals should be&#160;&#8804;0.4% of body weight every week or &#8804;1% every 2 weeks, which were evaluated by measurements of blood hemoglobin. Additionally, hemoglobin, fasting blood glucose, plasma triacylglycerol (TG) and total cholesterol levels in male and female adult zebrafish were measured. We also applied this method to investigate the dysregulation of glucose metabolism in diet-induced obesity. This blood collection method will allow many applications, including glucose and lipid metabolism and hematological studies, which will increase the use of zebrafish as a human disease model organism.

Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.

Yetişkin Zebra balığı Kan Testleri için Tekrarlanan Kan Alma

Repeated blood collection is one of the most common techniques performed on laboratory animals. However, a non-lethal protocol for blood collection from ...

Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish embryo is an excellent tool for examining such interactions with an in vivo model. Whole-mount immunohistochemical and immunofluorescence assays are frequently applied in zebrafish embryos to assess protein expression. However, it can be difficult to achieve accurate mapping of co-localized proteins in three-dimensional space. In addition, some studies may require the use of two antibodies that are not compatible with the same technique (e.g., antibody 1 is only suitable for immunohistochemistry and antibody 2 is only suitable for immunofluorescence). The purpose of the method described herein is to perform sequential immunofluorescence and/or immunohistochemistry on individual cryosections derived from early-stage zebrafish embryos. Here we describe the use of sequential rounds of immunofluorescence, imaging, immunohistochemistry, imaging for a single cryosection in order to achieve precise identification of protein expression at the single-cell level. This methodology is suitable for any study in early-stage zebrafish embryos that requires accurate identification of multiple protein targets in individual cells.

This protocol demonstrates sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosections from early-stage zebrafish embryos enabling precise colocalization analyses in specific cell populations.

Cryosec, zebrafish embriyo üzerinde sıralı Immünofluorescence ve Immünhistokimya

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish ...