Name: fourier-based diffraction analysis of live caenorhabditis elegans
Uploaded: 2017-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Juan Vasquez bu proje ile hesaplama yaptığı katkılarından dolayı teşekkür ediyoruz. Vassar Koleji lisans araştırma yaz Enstitüsü (URSI), Lucy Maynard somon Araştırma Fonu ve NSF Ödülü No 1058385 destek için sana şükrediyoruz.

1. C. elegans büyüme ve bakım <ol><li>hazırla nematodunun kültür yemekleri.
	<ol><li>Petri yemekler agar çözümünü ile doldurun ve sonra 9 , 10 OP50 bir E. coli kültürü ile tohum zorlanma kuvvetlendirmek için bırakın.</li>
	</ol></li> <li>Her plaka üzerinde yetişkin nematodlar başlangıç nüfusu birkaç yetişkin solucanlar taze agar dolu Petri yemekler bir E. coli yama ile taşıyarak hazırlamak. Bir kuluçka 20 ° C'de nematodunun kültürleri korumak. 
	Not: Nematodunun suşları Caenorhabditis elegans genom Merkezi'nden temin edilebilir. Bu çalışmada, vahşi türü, N2, zorlanma ve OH7547 (otls199 [kedi-2::GFP + rgel-1 (F25B3.3):: dsRed + bir silindir fenotip sergiler, rol-6(su1006)]) zorlanma kullanılan.</li>
	<li>Gelecek kültürler için Propagate solucanlar.
	C. elegans ve kullanılmayan bir habitat Petri kabına ısı kontrollü kuluçka makinesi üzerinden içeren <ol><li>Kaldır Petri tabağı. Onları diseksiyon mikroskop sahnesinde yerini.</li>
		<li>Bunsen burner ışık ve kırmızı renkte yanıyor kadar metal alevin içine yerleştirerek Platin nematodunun çekme sterilize. Oda sıcaklığında soğumaya çekme sağlar. Çekmeyi bırak veya kirletici maddeler ile temas gel çekme izin değil.</li>
		<li>Çekme bakteri çemberi kenarına ucu hafifçe dokun. Bu madde yapışkan ve bireysel yetişkin nematodlar daha kolay picking yapacak.</li>
		<li>4 gravid nematodlar bir yuvarlak solucanlar büyüme orta (NGM) agar dolu Petri tabağa aktarın ve 20 ° C'de kuluçkaya Solucanlar dört gün içinde olgun yumurta yatıyordu olacaktır.</li>
		<li>Dört yetişkin nematodlar taşıdıktan sonra da kuluçka için kalan nematodlar iade.</li>
	</ol></li></ol> 2. Optik kurulum ( şekil 1) <ol><li>güvenli helyum-neon lazer optik tezgah arka sol köşesine yakın ve bir güç kaynağına bağlayın. 
	Not: Lazer &#39; s eni deπiµtirebilme için gereksinimleri yerine getirmek gerekir. C. elegans yaklaşık 1 mm uzun, kırınım deseni bulmak zor değil bu nedenle lazer ışını bir çapı 2 mm Yuvarlak solucanlar üzerinde olay ama 5 mm daha büyük ise daha büyük olmalıdır.</li>
	<li>Lazer ışını örnek ulaşmadan önce filtre üzerinden geçecek şekilde bir nötr yoğunluk filtresi helyum-neon lazer ve örnek arasında yerleştirin.</li>
	<li>Kullanma açık yüzey alüminyum iki direksiyon aynalar, nötr yoğunluk filtresi sonra ilk ayna güvenlik altına alma bir Periskop kurmak. İkinci ayna yaklaşık 10 cm lazer ışını yönlendirmek ve küvet aynalar arasında eklemek için yer vermek için ilk ayna aşağıda güvenli. Lazer ışını, dikey olarak küvet geçecek şekilde lazer ışını ve küvet hizalayın. 
	Not: Diffracting organizma Uzaklik fotodiyot organizma kendisi uzakta-tarla kırınım elde etmek için çok daha büyük olması gerekir. Bu deneyde, küvet fotodiyot 20 cm mesafedir.</li>
	<li>Güvenli doğrudan ikinci ayna karşısında fotodiyot aynaya bakan onun sensörlü. 
	Not: Yuvarlak solucanlar içeren küvet kimya kelepçeler kullanılarak iki aynalar arasında yer alacak. Bölüm 4 ve 5 bkz.</li>
	<li>Su dolu bir küvet sandalyesine koyun. Stand yüksekliğini ayarlayın. Lazer ışını yakınındaki ama fotodiyot, doğrudan amaçlı küvet ile seyahat yükseklik ve açı ayna 1 ve 2 ayna ayarlayın.</li>
	<li>Standları formu küvet için düzeltilmiş bir yüzey sağlamak için bir seviyede kullanın. Gerekirse daha fazla aynaları ayarlayın.</li>
	<li>Dijital osiloskop ile verilen USB kablosunu kullanarak dijital osiloskop fotodiyot bağlayın. Dijital osiloskop kaydetmek veya verileri kaydetmek için kullanılan bilgisayara bağlayın.</li>
</ol> 3. Osiloskop kurulum <ol><li>en az 8 Hz için yeterince dayak döngüsü solucanın gidermek için ayarla örnek hızı için bilgisayardaki osiloskop yazılım kullanarak. 
	Not: Nyquist teoremi 11 memnun örnek hızı iki kat daha fazla bu türlerin beklenen dayak frekansların olmalıdır.</li>
</ol> 4. Solucan ve küvet veri toplama için hazırlanması <ol><li>bir ince, düzleştirilmiş Platin tel çekme (bakınız Bölüm 1.3) kullanarak bir taze NGM 10 agar dolu Petri tabağı için dört yetişkin nematodlar Transfer.</li>
	<li>Bir tek kullanımlık plastik küvet küvet onun ridged iki tarafta sadece dokunmak dikkatli olmak onun paketi kaldırmak.</li>
	<li>Kullanımı ile dolu küvet yaklaşık % 80'i kadar distile su küvet pipet için bir micropipette distile su. 
	Not: musluk suyu mikroorganizma-öldürme bileşikler içermektedir olarak nematodlar işlerken yalnızca kullanım distile su veya M9 10 veya fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) gibi iyonize arabellekleri önemlidir.</li>
	<li>C. elegans diseksiyon kapsamına kullanılmak üzere içeren Petri kabına yerleştirin.</li>
	<li>Platin pick kullanarak, bir olgun C. elegans Petri kabına kaldır ve pick pick çevrelerde Yuvarlak solucanlar çıkarmak gerekirse hareketli küvet daldırın.</li>
	Küvet içinde şekillendirme kabarcıklar önlemek için <li>biraz bu küvet üzerinde çıkıntı kadar su ile küvet doldurmak &#39; s üst. Küvet doldurmak &#39; s kap tamamen suyla sonra hızlı bir şekilde koymak kap küvet.</li>
	<li>Bitti ve optik kağıt herhangi bir küçük kalan damlacıkları temizlemeye temizliği dökülen Su damlacıkları kaldırmak için bir optik temizlik bezi kullanın.</li>
</ol> 5. Gerçek zamanlı veri-edinimi kırınım deseni yoğunluk değişiklikleri <ol><li>açmak helyum-neon lazer ve kırmızı bir ışın ürettiği frekans/renk ayarını ayarlayın. Sensör üzerinde açın. 
	Uyarı: Düşük enerjili ışın 632 kullanın nm, C. elegans kaçının yüksek frekanslı (mavi) ışık 12.</li>
	<li>Solucan küvet içinde bulun. Küvet ridged yanları üzerinde tutarak hafifçe eğimli küvet kadar Yuvarlak solucanlar küvet kısmını Merkezi'nde yaklaşık. 
	Not: Sallayarak veya küvet şiddetle devirme küvet duvarlar ile çarpıştığında solucan neden olur. Bu Yuvarlak solucanlar zarar verebilir.
	<ol><li>Lazer içinde solucan merkezleme yer küvet stand optik sistemi üzerine &#39; s eni yansıyan küçük 1 ayna 2'ye. Kaçak ışık ortadan kaldırmak emin olun.</li>
	</ol></li> <li>Lazer ışını solucan Merkezi.
	<ol><li>Fotodiyot konumunu ve merkezi en fazla kırınım deseninin denk değil fotodiyot kırınım deseni yerleştirin.</li>
		<li>Fotodiyot doygunluk önlemek için nötr yoğunluk filtresi ayarlayın. Nötr yoğunluk filtresi direksiyonu döndürme ışık yoğunluğunu düzenlemektedir.
		<ol><li>Nötr yoğunluk filtre fotodiyot çıkış voltajı artar döndür. 
			Not: Yazılım için dijital fotodiyot kullanma voltaj çıkışı görülmektedir. Eğer gerilim değişmez fotodiyot doymuş yağlardır. Bu durumda, en az bir okuma düzleştirme olmadan gerilim azaltır kadar nötr yoğunluk filtresi döndürün. Gerilim sinyali fotodiyot doygunluk gösteren en yüksek değerlere, dümdüz değil emin olun. Doygunluk gözlem yapılırsa nötr yoğunluk filtresi tekerlek döndürerek ışık yoğunluğunu azaltmak.</li>
		</ol></li> <li>Hareketli kırınım deseni fotodiyot görünür, ödemeli verilerle osiloskop solucan süre izleme kontrol yazılımı Başlat düğmesini bir kez &#39; s hareketi. Lazer ışını ve diffrac dışarı belgili tanımlık kurt taşır kadar ölçümler alarak devam ediyorTion desen kaybolur, hangi genellikle yaklaşık 20 sürer s.
		<ol><li>Veri toplamayı durdurmak osiloskop yazılımı stop butonuna tıklayarak işlemi. Her deneme kaydetmek &#39; s veri .csv veya .txt biçiminde.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>En az 50 veri kümeleri için her fenotip toplayana kadar 5.2-5,3 adımları yineleyin. 8-10 hayvan başına deneme kullanın.</li>
	Küvet ise <li>Bu ve solucan ve adımı yineleyin 4 atmayın kaşıdı. Solucan aktarımda zarar gelirse, bertaraf ve önce 4 aynı küvet kullanarak yinelenen adım küvet distile su ile durulayın.</li>
	<li>Tekrarlama adım 5 OH7547 kullanarak &#34; silindir &#34; zorlanma, solucan zorlanma belirtmek için veri etiketi için dikkatli olmak.</li>
</ol> 6. Fourier spektrum veri <ol><li>bir veri analiz programı ayrık Fourier dönüşümleri 3 sahip alınan verileri alın.</li>
	<li>Gerçekleştirmek Fourier dönüşümleri veri yazılım Hızlı Fourier dönüşümü (FFT) seçeneğini kullanarak her sette.</li>
	<li>Her genlik N2 vahşi türü için solucanlar için frekansları FFT sonuçlarından ortalama.</li>
	<li>Tekrarlama adım 6.3 OH7547 üzerinden FFTs kullanarak &#34; silindir &#34; solucanlar.</li>
</ol> 7. Fourier spektrumu modelleme <ol><li>Program Yuvarlak solucanlar ikili bir model hareket (bkz. ek malzemeler programı). 
	Not: Bu model ilk solucan hareket belirgin özelliklerini görüntüler hangi kaba bir yaklaşım değildir. Sonuçları gerçek Kurtlarla karşılaştırılır model rafine olabilir. Solucan, mikroskop görüntüleri 13 kullanarak yaklaşımları şekillerdir.
	<ol><li>İkili modelinin en az iki kurt arasında geçiş yapar ( şekil 2a) taşıma oluştur ardışık çerçeveler. Ek malzemeler videoları görmek; C solucan video (CWorm.avi) ve W solucan video (WWorm.avi).</li>
	</ol></li> <li>Üretmek sıralı kırınım desenleri. Ek malzeme videolarını gör. C solucan kırınım video (CWormDiff.avi) ve W solucan video (WWormDiff.avi).
	<ol><li>Fourier dönüşümü her ikili çerçeve solucan görüntünün. Büyük doldurma solucan çevresinde çerçevesinde daha iyi kırınım görüntünün çözünürlüğünü olacak. 
		Not: Her Fourier dönüştürülmüş çerçeve mutlak değeri karşılık gelen kırınım deseni ( şekil 2b) ile doğru orantılıdır.</li>
		<li>Tune kırınım deseninin kontrast için Logaritmik ölçek kırınım deseninin yoğunluklarda eşleyerek. 
		Not: Fotoğraf makineleri ve gözleri doğrusal bir ölçek üzerinde çalışması eğilimindedir. Logaritmik ölçek nasıl bir kırınım deseni genellikle insan gözü tarafından algılanan benzetilebilir.</li>
	</ol></li> <li>Modellenmiş kırınım sinyal ayıklayın.
	<ol><li>Kırınım deseni fotodiyot konumuna karşılık gelen bir kapalı Merkezi konumu seçin.</li>
		<li>Fotodiyot boyutunu benzetimini yapmak için fotodiyot konumunu çevreleyen komşu matris öğelerini ekleyin. Fotodiyot genellikle %0,1 modellenmiş kırınım deseninin boyutudur.</li>
		<li>Kayıt ve arsa kırınım büyüklüğü dizisi sinyalleri. Sinyal fiziksel olarak makul olup olmadığını kontrol edin (Yani, periyodik dayak, söz konusu olduğunda fotodiyot sinyalini olmalıdır periyodik de).</li>
	</ol></li> <li>Fourier 7.3 içinde elde kırınım sinyal dönüşümü ve deneysel veriler ile karşılaştırılması.</li>
	<li>Çeşitli solucan suşlar için yineleyin ve karşılaştırmak.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Magnes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Freely+Swimming+C.+elegans+Using+Laser+Diffraction.">Analysis of Freely Swimming C. elegans Using Laser Diffraction.</a> Open J. Biophys. 2, 101-107 (2012).</li><li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Eells, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Locomotion+Study+of+Freely+Swimming+Micro-organisms+Using+Laser+Diffraction.">Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction.</a> J. Vis. Exp. (68), (2012).</li><li>James, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Student's Guide to Fourier Transforms with Applications in Physics and Engineering. , (1995).</li><li>Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensation+and+mechanical+load+modulate+the+locomotory+gait+of+swimming+C.+elegans.">Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans.</a> J. Exp. Biol. 210, (2007).</li><li>Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+femtosecond+crystallography:+A+revolution+in+structural+biology.">Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology.</a> Arch. Biochem. Biophys. 602, 32-47 (2016).</li><li>Thibault, P., Rankenburg, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+diffraction+microscopy+in+a+teaching+laboratory.">Optical diffraction microscopy in a teaching laboratory.</a> Amer. J. Phys. 75 (9), 827-832 (2007).</li><li>Miao, J., Ishikawa, T., Anderson, E. H., Hodgson, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+retrieval+of+diffraction+patterns+from+non+crystalline+samples+using+the+oversampling+method.">Phase retrieval of diffraction patterns from non crystalline samples using the oversampling method.</a> Phys. Rev. B. 67, 174104 (2003).</li><li>Zhang, Y. P., Zhang, J. Q., Xu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+eliminating+zero-order+diffraction+in+lensless+Fourier+transform+digital+holography.">Method for eliminating zero-order diffraction in lensless Fourier transform digital holography.</a> Optik - International Journal for Light and Electron Optics. 124 (21), 4873-4875 (2013).</li><li>Brody, A. H., Chou, E., Gray, J. M., Pokrywka, N. J., Raley-Susman, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mancozeb-induced+behavioral+deficits+precede+structural+neural+degeneration.">Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration.</a> NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Dasalukunte, D., &#214;wall, V., Rusek, F., Anderson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Faster than Nyquist Signaling. Algorithms to Silicon. , (2014).</li><li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+molecular+solution+for+ultraviolet+light+detection+in+Caenorhabditis+elegans.">A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 6 (8), e198 (2008).</li><li>Bilbao, A., Wajnryb, E., Vanapalli, S. A., Blawzdziewicz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nematode+Locomotion+in+Confined+and+Unconfined+Fluids.">Nematode Locomotion in Confined and Unconfined Fluids.</a> Phys. Fluids. 25, 081902 (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Beri yapay düşük frekanslar sonuçlara ortalama veri menziller hareketsizlik ile dahil sonuçları çarpık. Fotodiyot doyurarak düz tepeler veya "kes" tepeler ham veri olarak kabul edilebilir. Her ham veri kümesi tarafından en yüksek yoğunluklarda bölen lazer şiddeti dalgalanmalar için muhasebe ile yardımcı olacaktır.
En yüksek frekansları genel bir göstergesidir dayak frekansı; Ancak, karmaşık hareket girişim beat frekanslarda kırınım deseni neden olur ve dikkatli bir şekilde incelenmesi gerekir.
Bu yöntem diğer nematodlar gezisidir araştırmak için kullanılabilir. Çevre başka bir orta olarak değiştirilebilir. Dalga boyu de değiştirilebilir. Elektromanyetik spektrum görünür aralığında çalışma en kolay ve en güvenli olduğunu.
Daha rafine bir model kırınım spectra gelecekte daha gerçekçi benzetimini yapmak. Gelecekteki manken frekans yerlerde ama göreli tepe yükseklikleri etkilemeyeceği yönlendirmeleri değiştirebilirsiniz bir solucan içerebilir. Daha gerçekçi bir model doruklarına deneysel veriler gibi genişletmek dayak Frekanslar, olasılıkçı dağıtımı için izin verecek. Formaya frekanslarda dayak frekanslarda çeşitleri için hesap olacaktır.
Geçerli solucan geçerli modelde daha konik olması gereken özellikle kafa ve kuyruk bölgesinde, ham, şekildir. Bu farklı mutantlar gezisidir karmaşıklığı hakkında ipuçları verebilir beri sinyal zaman dizi ayrıntılı bir analizini yapmak ilginç olabilir.
Sanki aynı anda birden fazla nematodlar karakterize içine bu teknik genişletme pratiklik dikkate değer. Bu yöntem mevcut yöntemler geleneksel mikroskoplar kullanarak için tamamlayıcı bir yöntem olarak anlaşılmalıdır. Bu yöntem solucan odak düzlem dışında hareket edebilir böylece mikroskop veri toplama sırasında gerektirmeyen bir avantajı vardır. Solucan hareket miktarının içinde bir roman yöntemi olan ortalama frekans spectra solucan hareket net farklılıklar gösterir ve yaygın frekans doruklarına tarafından sayılabilir. Veri analizi kırınım imzaları daha fazla geliştirme ve umut verici bir biçimde birden fazla mutantlar ve bireyler için bir Otomatik tanımlama süreci yol açacaktır.

Bu yöntem iki suşları ile çok farklı locomotory desen kullanarak C. elegans gezisidir deneysel ve modellenmiş frekans spectra karşılaştırır. Sonuçlar net mikroskobik görüntüleri analiz için gerekli değildir böylece su sütununda Yuvarlak solucanlar yüzer gibi frekans spektrumu geçici değişiklikler üzerinde bağlıdır gösterir. Bu yöntem için nicel gerçek zamanlı analiz sağlar ve fotoğraf/videoları ile geleneksel mikroskoplar elde tamamlayıcı bilgiler sağlar. Fraunhofer bükülmesi, uzakta-tarla kırınım, olarak da adlandırılan canlı kırınım veri1,2almak için temel sağlar. Kırınım deseni herhangi bir tek noktada ışık şiddeti nematodunun3ana hatları her noktasına gelen ışık superimposing sonucudur. Sonuç olarak, zaman içinde toplanan ışık şiddeti Yuvarlak solucanlar hareket hakkında bilgi taşır. Hareket içinde yer alan tüm frekanslarda analiz geleneksel video analiz tamamlar bu yana saat-bağımlı kırınım sinyal analiz karşılık gelen mutant karakteristik hareket tanımlayabilirsiniz. Bu durumda, "roller" hareket ve vahşi türü C. elegans karakteristik farklılıkları Yuvarlak solucanlar iki farklı soyu frekans spectra karşılaştırarak onaylanır.
Önceki bazı özellikleri frekans analizi kırınım sinyallerin frekansları2,4yüzme gibi kullanarak teyit edilmiştir. Daha da önemlisi, bu yöntem geleneksel mikroskopi için tamamlayıcı bir yöntem olarak hareket bir bilgisayar ekranında gerçek zamanlı verilerin toplanmakta olan olarak gözlemlemek için kullanılabilir. Frekans spektrumu Worms ayrı locomotory desenleri ile sinyal kırınım sinyal Fourier dönüşüm göz önünde bulundurarak sayılabilir.
Fourier tabanlı kırınım bu çalışmada multidisipliner doğa Biyoloji ve fizik alanlarında içerir. Örnekleme altında tarafından kırınım uzun kristal yapıları Biyoloji5 ve diğer alanları araştırmak için kullanılmıştır. Organizma lazer ışını ortalanacak şekilde bu deneyde, ancak,6,7 oversampling uzakta-tarla kırınım deseni oluşturur. Deπiµtirebilme genellikle objektif-az görüntüleme8 orijinal nesnenin görüntüsünü yeniden yapılandırır bir faz alma algoritması ile birlikte kullanılır. Faz alma bir yuvarlak solucanlar modelinde olduğu gibi scatterers bulunduğunda elde etmek zordur. Zamansal kırınım imza solucan hareket anahtar frekansları değerlendirmek için yeterli olacaktır. Bu yöntem daha az hesaplama açısından vergi ve hareket ölçmek için optik bir yol sağlar. Bu teknik kolayca mutasyonlar veya davranış değiştirme çevre koşulları analiz için adapte olabilir.

<table><tbody><tr><td>Tunable Helium-Neon laser</td><td>Research Electro-Optics</td><td>30602</td><td>Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm.</td></tr><tr><td>2 Front Surface Aluminum Mirrors</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-F01</td><td></td></tr><tr><td>Photodiode: SI Amplified Detector</td><td>Thorlabs</td><td>PDA 100A</td><td></td></tr><tr><td>Quartz Cuvette</td><td>Starna Cells</td><td>21/G/5</td><td>Plastic cells may be used as well.</td></tr><tr><td>MatLab (Software)</td><td>MathWorks</td><td>R2016b (9.1.0.441655)</td><td>Use the fft command to simulate diffraction</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>14.7.1</td><td>Used for data analysis of Figure 4</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans&lt;/em&gt; Roller</td><td>&lt;em&gt;University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC)&lt;/em&gt;</td><td>Strain: OH7547&lt;br/&gt; Genotype: otIs199.</td><td>https://cbs.umn.edu/cgc/home</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans&lt;/em&gt; Wild Type</td><td>&lt;em&gt;University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC)&lt;/em&gt;</td><td>Strain:N2 Genotype: C. elegans wild isolate</td><td>https://cbs.umn.edu/cgc/home</td></tr></tbody></table>

fourier-based diffraction analysis of live caenorhabditis elegans

Bu el yazması nematodlar zamansal uzakta-tarla kırınım imza kullanma sınıflandırmak açıklar. Tek C. elegans su sütunu bir optik küvet içinde bekletilir. 632 nm sürekli dalga Helene lazer açık yüzey aynalar kullanarak küvet yönlendirilir. Önemli bir mesafe en az 20-30 cm küvet ışık geçtikten sonra seyahat bir yararlı uzakta-tarla (Fraunhofer) kırınım deseni sağlar. Kırınım deseni değişiklikleri gerçek zamanlı olarak Yuvarlak solucanlar lazer ışını içinde yüzüyor. Fotodiyot Merkezi kapalı kırınım deseni içinde yer alıyor. Fotodiyot voltaj sinyalini gerçek zamanlı olarak görülmektedir ve dijital osiloskop kullanarak kaydedilen. Bu işlem 139 vahşi türü ve 108 "roller" C. elegansiçin yinelenir. Vahşi türü solucanlar çözüm hızlı salınım desende sergi. "Roller" solucanlar ile düzgün hareket engelleyen kütikül önemli bir bileşeni bir mutasyon var. Doygunluk ve hareketsizlik ücretsiz değildir zaman aralıkları atılır. Her ortalama göreli yoğunluklarda karşılaştırmak için maksimum tarafından bölmek pratiktir. Her solucan için dönüştürülmüş Fourier frekans desen her solucan için ortaya çıkıyor böylece sinyaldir. Sinyal solucan her türü için ortalama. Vahşi türü ve "roller" C. elegans için ortalama Fourier spectra belirgin farklı ve dinamik solucan şekillerin iki farklı solucan suşlarının Fourier analizi ile seçkin ortaya koyuyor. Fourier spectra her solucan baskı locomotory anları için karşılık gelen iki farklı ikili solucan şekilleri kullanarak yaklaşık bir modeli aynı. Ortalama frekans dağılımı gerçek ve modellenmiş solucanlar için zarf modeli eşleşen verileri doğruluyor. Her mikroorganizma kendi benzersiz Fourier spektrum olacak gibi bu yöntem birçok mikroskobik türler için Fourier analizi için bir temel olarak hizmet verebilir.

Şekil 1 ' de gösterilen optik deneysel Kur ezelî varlık bağlı bir odak düzlemi mikroorganizmaların incelenmesi için sağlar. Verileri toplanır gibi fotodiyot dayak sinyalini bilgisayar ekranında gerçek zamanlı olarak görülebilir. Sıradışı desen hemen bir video ayrıntılı çözümlemek zorunda kalmadan görünür.
Örnekler modellenmiş sıralı solucan hareket ve karşılık gelen kırınım desenleri Şekil 2' de gösterilmiştir. Modellenmiş kırınım desen niteliksel deneysel desenler1 benzer ve simülasyonlar başarıyla Yuvarlak solucanlar model ilk bir gösterge vardır.
Örnek zamansal kırınım imza burada okudu C. elegans iki tür şekil 3' te gösterilmiştir. Niteliksel her yuvarlak solucanlar farklı fiyatlar ve genlikleri de Fires görülebilir. Bazı farklılıklar bir önceki yayın1' olduğu gibi uygun eğrisi aracılığıyla sayısal. Ayrık Fourier dönüşümü, ancak, katıştırılmış frekansları ile ilgili daha fazla bilgi ortaya koymaktadır:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56154/56154eq1.jpg">, (1)
Burada Fk dijital Fourier dönüşümü (FT), fn zamana bağımlı ham kırınım sinyal ayrık zamanla değişken n ayrı frekans değişken k. N ise toplam sayısı veri noktaları. Onun kırınım frekans spektrumu (şekil 4) genlik tarafından belirlenecek Yuvarlak solucanlar için ortalama dijital Fourier dönüşümü sağlar. Vahşi tipi spektrum silindiri hareket spektrum daha düşük frekanslar hakimdir.
Silindir C. elegans notlar karşı vahşi türü tahmini olarak gösteren bir model vahşi türü silindir kabaca bir salınım C şekil ( benzer bir tarafı lehine eğilimi ise wavelike (W veya S şekli) çekimde (şekil 2a) thrash eğilimi Şekil 5). Bu farklı spectra bir açıklaması bulunmaktadır. W salınım, iki C hareketleri karşıt düşünülebilir ise silindir çoğunlukla C bir yana oluşturacak. Bu nedenle, W hareket daha ortaya daha fazla ikincil düşük frekanslarda C hareket daha karmaşıktır. Bu sonuç hesaplama modelinde doğrulanır. W şekil C şekli (şekil 6) daha bir çok daha yüksek bir frekans yoğunluğu vardır. Bu şekil 4 nerede silindir frekansları daha tamamen ayrı iken kümelenir FFT doğruladı. Silindir vahşi türü hareket için geçici olarak dönebilirsiniz beri silindir istatistikler çarpık.
Yüzme vahşi türü C. elegans multimodal spektrum (dahil doruklarına ~1.0 Hz ve 1,75 Hz) sergiler Ise düzgünleştirilmiş güç spectra silindir türü C. elegans ~1.5 Hz, geniş bir pik gösterir. Fotodiyot (PD) birkaç matris öğe üzerinde yayılan sonlu kaplıyor. Yapıcı ve yıkıcı girişim değişir bu yana bireysel matris öğeleri veya kırınım deseni noktalarında şiddeti değişir; Yine de, hangi farklı yoğunluklarda Frekanslar tüm matris öğeler için aynı Şekil 7' de görüldüğü gibi bulunmaktadır. Zaman türev EQ 1 göz önüne alındığında, bu frekans dalgalanmaları faz matris ama sadece orijinal nesnenin dalgalanmaları güvenmeyin görülebilir:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56154/56154eq2.jpg">, (2).
PD birkaç matris öğe üzerinde yayılır gibi en yüksek yerleri tutarlı frekans profilini bir ortalama. Bazı varyasyon beklenebilir ve solucan yönünü hakkında ipuçları verebilir. Frekans dağılımı solucan değişiklikler yürüyüş değişecektir. Geçerli modeli yalnızca göreli tepe yükseklikleri yerine en yüksek yerleri değerlendirilmesi için sağlar basit bir modeldir. Locomotory desenleri farklı farklı en yüksek konumlara ortalamasını alır.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig1.jpg"> 
Şekil 1. Deneysel Kur. Düşük güç lazer ışını seyahatleri nötr yoğunluk filtresi ile yansıtılır ayna M1 tarafından aşağı ayna M2 ve seyahat doğru fotodiyot üzerine solucan içeren küvet ile. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig2.jpg"> 
Şekil 2. Sıralı solucan şekiller ve karşılık gelen kırınım desenler. (bir) bazı modellenmiş W şekil nematodlar ve (b) karşılık gelen Sıralı kırınım desen sıralı ikili görüntüler'i seçin. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig3.jpg"> 
Şekil 3. Deneysel örnek kırınım imza. (Bir) OH7547 "merdane" ve (b) N2 vahşi türü için tek bir fotodiyot kırınım deseni. kullanarak C. elegans kırınım imzalar toplanan <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig4.jpg"> 
Şekil 4. Güç Spectra Roller ve vahşi tip Fraunhofer bükülmesi serisi deneysel ortalama. Frekansları saat serisi ortalama Fourier dönüşümü içinde mevcut spectra gösteri ile fotodiyot kaydetti. Gauss filtre standart sapması 0.075 Hz, 3 standart sapmalar kesilmiş yumuşatma için kullanılır. ~1.5 Hz (tepeler ~1.0 ve 1 de dahil olmak üzere multimodal düzgünleştirilmiş vahşi tipi spektrum ile karşılaştırıldığında düzgünleştirilmiş silindir spektrumda geniş tayf zirvesinde Not.75 Hz). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig5.jpg"> 
Şekil 5. Kırınım oluşumu illüstrasyon. Kırınım desenleri düşünerek her çizgi parçasının infinitesimally küçük bir düz çizgi (solda) olarak modellenebilir. Bu satırları (sağda) superimposing inşaat uzakta-tarla kırınım desen C Yuvarlak solucanlar şeklinde tarafından oluşturulan gösterir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig6.jpg"> 
Şekil 6. Roller ve vahşi tip Fraunhofer bükülmesi serisi güç Spectra simüle. (bir) C şekli ve (b) W şekil Kurtlarla fotodiyot matris öğeleri 200 (dikey) ve 175 (yatay) merkezli. W şekil frekansları daha karmaşık hareket nedeniyle yüksek yoğunluklu gösterir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig7.jpg"> 
Şekil 7. Güç Spectra Roller ve vahşi tip Fraunhofer bükülmesi serisi farklı fotodiyot yerlerde simüle. (bir) W şekil solucan ve (b) C şekil solucan tek matris öğeler çeşitli yerlerinde çeşitli yerleri fotodiyot simüle için. Tepe yükseklikleri için çeşitli yerlerde farklı; Ancak, en yüksek yerlerde belirli şekiller için aynı kalır. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

Bu makale farklı nematodlar uzakta-tarla kırınım imza kullanma ayırmak nasıl açıklar. Biz hareket 139 vahşi türü ve 108 "Roller" C. elegans frekansları sürekli dalga bir lazer kullanarak tek bir yerde geçici Fraunhofer bükülmesi imzayla ilişkili sayı ortalaması alınarak karşılaştırın.

Kırınım Analizi hayatın Caenorhabditis elegans Fourier tabanlı

This manuscript describes how to classify nematodes using temporal far-field diffraction signatures. A single C. elegans is suspended in a water column ...

fourier-based-diffraction-analysis-of-live-caenorhabditis-elegans

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Electrical Engineering

Engineering

Unit 1

Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

Fourier Series

SCIENTISTS IN ACTION

7.9K Görüntüleme.  Vassar College. Bu makale farklı nematodlar uzakta-tarla kırınım imza kullanma ayırmak nasıl açıklar. Biz hareket 139 vahşi türü ve 108 "Roller" C. elegans frekansları sürekli dalga bir lazer kullanarak tek bir yerde geçici Fraunhofer bükülmesi imzayla ilişkili sayı ortalaması alınarak karşılaştırın.

Video: Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, acceleration and forces involved in the locomotory behavior of nematodes suspended in a column of water in response to single wavelengths of light. We demonstrate how to evaluate the locomotion of a microscopic organism using Single Wavelength Shadow Imaging (SWSI) using two different examples.
The first example is a systematic and statistically viable study of the average descent of C. elegans in a column of water. For this study, we used living and dead wildtype C. elegans. When we compared the velocity and direction of nematode active movement with the passive descent of dead worms within the gravitational field, this study showed no difference in descent-times. The average descent was 1.5 mm/sec &#177; 0.1 mm/sec for both the live and dead worms using 633 nm coherent light.
The second example is a case study of select individual C. elegans changing direction during the descent in a vertical water column. Acceleration and force are analyzed in this example. This case study demonstrates the scope of other physical properties that can be evaluated using SWSI while evaluating the behavior using single wavelengths in an environment that is not accessible with traditional microscopes. Using this analysis we estimated an individual nematode is capable of thrusting with a force in excess of 28 nN.
Our findings indicate that living nematodes exert 28 nN when turning, or moving against the gravitational field. The findings further suggest that nematodes passively descend in a column of water, but can actively resist the force of gravity primarily by turning direction.

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

The technique presented here measures the path of freely swimming microscopic species using single wavelength exposure. C. elegans are used to demonstrate shadow imaging as an inexpensive alternative to costly microscopes. This technique can be adapted to accommodate various orientations, environments and species to measure direction, speed, acceleration and forces.

Tek Dalgaboyu Gölge Görüntüleme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Locomotion dahil Kuvvetleri Tahminleri

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

Mühendislik

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in contrast, have been conducted using microscope-based approaches, which limit the movement and behavior to a narrow, nearly two-dimensional focal field.1 We present a novel analytical approach that provides real-time analysis of freely swimming C. elegans in a cuvette without dependence on microscope-based equipment. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through the cuvette. We measure oscillation frequencies for freely swimming nematodes.
Analysis of the far-field diffraction patterns reveals clues about the waveforms of the nematodes. Diffraction is the process of light bending around an object. In this case light is diffracted by the organisms. The light waves interfere and can form a diffraction pattern. A far-field, or Fraunhofer, diffraction pattern is formed if the screen-to-object distance is much larger than the diffracting object. In this case, the diffraction pattern can be calculated (modeled) using a Fourier transform.2
C. elegans are free-living soil-dwelling nematodes that navigate in three dimensions. They move both on a solid matrix like soil or agar in a sinusoidal locomotory pattern called crawling and in liquid in a different pattern called swimming.3 The roles played by sensory information provided by mechanosensory, chemosensory, and thermosensory cells that govern plastic changes in locomotory patterns and switches in patterns are only beginning to be elucidated.4 We describe an optical approach to measuring nematode locomotion in three dimensions that does not require a microscope and will enable us to begin to explore the complexities of nematode locomotion under different conditions.

Microscopic organisms like the free-swimming nematode C. elegans, live and behave in a complex three-dimensional environment. We report on a novel approach that provides analysis of C. elegans using diffraction patterns. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through a cuvette.

Serbestçe Mikro-organizmalar Yüzme Kantitatif Locomotion Eğitim Lazer Kırınım kullanma

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

Biyomühendislik

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

On-talep Kantitatif Analiz için mikroakışkan tabanlı Electrotaxis<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Gelişim Biyolojisi

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. Animals cope with these stimuli by modifying their behavior. Understanding the mechanisms underlying such behavioral modification requires quantification of neural activity during the behavior of interest. Here, we report a method for calcium imaging in freely behaving Caenorhabditis elegans with nonlocalized vibration of specific frequency, displacement, and duration. This method allows the production of well-controlled, nonlocalized vibration using an acoustic transducer and quantification of evoked calcium responses at single-cell resolution. As a proof of principle, the calcium response of a single interneuron, AVA, during the escape response of C. elegans to vibration is demonstrated. This system will facilitate understanding of neural mechanisms underlying behavioral responses to mechanical stimuli.

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Reported here is a system for calcium imaging in freely behaving Caenorhabditis elegans with well-controlled, nonlocalized vibration. This system allows researchers to evoke nonlocalized vibrations with well-controlled properties at nano-scale displacement and to quantify calcium currents during responses of C. elegans to the vibrations.

İyi Kontrollü, Lokalize Olmayan Titreşimli Serbest Davranan Caenorhabditis elegans'ta Kalsiyum Görüntüleme

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

Davranış

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of diverse human diseases. Worms are particularly well-suited for high-throughput genetic and drug screens to gain deeper insight into therapeutic targets and therapies by exploiting their fast development cycle, large brood size, short lifespan, microscopic transparency, low maintenance costs, robust suite of genomic tools, mutant repositories, and experimental methodologies to interrogate both in vivo and ex vivo physiology. Worm locomotor activity represents a particularly relevant phenotype that is frequently impaired in mitochondrial disease, which is highly heterogeneous in causes and manifestations but collectively shares an impaired capacity to produce cellular energy. While a suite of different methodologies may be used to interrogate worm behavior, these vary greatly in experimental costs, complexity, and utility for genomic or drug high-throughput screens. Here, the relative throughput, advantages, and limitations of 16 different activity analysis methodologies were compared that quantify nematode locomotion, thrashing, pharyngeal pumping, and/or chemotaxis in single worms or worm populations of C. elegans at different stages, ages, and experimental durations. Detailed protocols were demonstrated for two semi-automated methods to quantify nematode locomotor activity that represent novel applications of available software tools, namely, ZebraLab (a medium-throughput approach) and WormScan (a high-throughput approach). Data from applying these methods demonstrated similar degrees of reduced animal activity occurred at the L4 larval stage, and progressed in day 1 adults, in mitochondrial complex I disease (gas-1(fc21)) mutant worms relative to wild-type (N2 Bristol) C. elegans. This data validates the utility for these novel applications of using the ZebraLab or WormScan software tools to quantify worm locomotor activity efficiently and objectively, with variable capacity to support high-throughput drug screening on worm behavior in preclinical animal models of mitochondrial disease.

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

This study presents protocols for two semi-automated locomotor activity analysis approaches in C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms, namely, ZebraLab (a medium-throughput assay) and WormScan (a high-throughput assay) and provide comparative analysis among a wide array of research methods to quantify nematode behavior and integrated neuromuscular function.

Caenorhabditis elegans Mitokondriyal Hastalık Modellerinde Hayvan Aktivitesini Ölçmek için Deneysel Yöntemlerin Karşılaştırmalı Analizi

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Uzun süreli Kalsiyum Görüntüleme için Agaroz microchambers<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Nörobilim

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

Boyuna Imaging'de Caenorhabditis elegans için bir mikrosıvısal Platform

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Tracking Calcium in the Early Developmental Phases of C. elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode Caenorhabditis elegans provides several unique advantages for the study of the OET as it is transparent and has an ordered gonad that produces one mature oocyte every ~23 min at 20 &#176;C. We have modified the genetically encoded calcium indicator jGCaMP7s to fluorescently indicate the moment of fertilization within a living organism. We have termed this reporter &#34;CaFE&#34; for Calcium during Fertilization in C. elegans. The CaFE reporter was&#160;engineered into a safe harbor locus in single copy, has no significant impact on physiology or fecundity, and produces a robust signal upon fertilization. Here, a series of protocols is presented for utilizing the CaFE reporter as an in vivo tool for dissecting the OET and embryogenesis. We include methods to synchronize worms, examine the effects of RNAi knockdown, mount worms for imaging, and to visualize calcium in oocytes and embryos. Additionally, we present the generation of additional worm strains to aid in this type of analysis. Demonstrating the utility of the CaFE reporter to visualize the timing of fertilization, we report that double ovulation occurs when ipp-5 is targeted by RNAi and that only the first oocyte undergoes immediate fertilization. Furthermore, the discovery of single-cell calcium transients during early embryogenesis is reported here, demonstrating that the CaFE reporter persists into early development. Importantly, the CaFE reporter in worms is simple enough to use for incorporation into course-based undergraduate research (CURE) laboratory classes. The CaFE reporter, coupled with the ordered gonad and ease of RNAi in worms, facilitates inquiry into the cell-cell dynamics required to regulate internal fertilization and early embryogenesis.

Here, we present protocols and tools for visualizing calcium during fertilization and early embryogenesis using a genetically encoded calcium reporter expressed in the germline of the model nematode C. elegans.

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Metazoan Model Organizma kullanma Serim ve toksisitesi prion-benzeri Proteinler incelenmesi<em&gt; ° C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Kırınım Analizi hayatın Caenorhabditis elegans Fourier tabanlı

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Tek Dalgaboyu Gölge Görüntüleme

Serbestçe Mikro-organizmalar Yüzme Kantitatif Locomotion Eğitim Lazer Kırınım kullanma

On-talep Kantitatif Analiz için mikroakışkan tabanlı Electrotaxis

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

İyi Kontrollü, Lokalize Olmayan Titreşimli Serbest Davranan Caenorhabditis elegans'ta Kalsiyum Görüntüleme

Caenorhabditis elegans Mitokondriyal Hastalık Modellerinde Hayvan Aktivitesini Ölçmek için Deneysel Yöntemlerin Karşılaştırmalı Analizi

Uzun süreli Kalsiyum Görüntüleme için Agaroz microchambers

Boyuna Imaging'de Caenorhabditis elegans için bir mikrosıvısal Platform

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Metazoan Model Organizma kullanma Serim ve toksisitesi prion-benzeri Proteinler incelenmesi