Sistemimiz, araştırmacıların ölçeklendirilmemiş yer değiştirmede iyi kontrol edilen özelliklere sahip lokalize olmayan titreşimleri uyandırmalarına ve tahriş edici maddelerin titreşimlere tepkileri sırasında kalsiyum akımını ölçmelerine olanak tanır. Bu tekniğin temel bir avantajı olarak, davranışın altında yatan mekanizmalar olan nöral mekanizmaları invaziv olmayan bir şekilde araştırabiliriz. Escherichia coli OP50'nin bir hücre yayıcı kullanılarak kare bir desende çizgilendiği yeni bir nematod büyüme ortamı veya NGM plakası hazırlayın, böylece solucan kalsiyum görüntüleme sırasında çoğu zaman bakterilerde geçirir.
Bir kalsiyum görüntüleme deneyinden dört gün önce, iki yetişkin ST12 solucanını plakaya aktarın ve plakayı dört gün boyunca 20 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Stimülasyon için akustik dönüştürücü bir cihaz, 2x objektif lens, yüksek hızlı CMOS kamera, görüntü bölme optikleri ile donatılmış bir mikroskop kullanarak kalsiyum görüntüleme gerçekleştirin. X Y motorlu kademe kontrolöründeki hassas bilgisayarı açın.
Ardından amplifikatörü açın ve ses ayarlayıcıyı tabanda 10'a ve tiz ayarlayıcıları sekize ayarlayın. GCaMP'yi heyecanlandırmak ve RFP'yi etiketlemek için LED ışık kaynağının 488 ve 560 nanometre ışıklarını açın. Işık kaynağındaki kontrol bölmesinin 470 ve 550 nanometre göstergelerini% 5'e ayarlayın, böylece LED ışığının yoğunluğu görüntüleme için uygundur.
Aşağıdaki yazılım paketlerini ve pencereleri indirin ve yükleyin. Fare makro yazılımı, titreşim kontrolü yazılımı, izleme çalıştırma yazılımı ve veri analizi yazılımı. İzleme yazılımı dosyasına çift tıklayın, ardından pozlama süresini 0,033 saniyeye ayarlayın ve sorunsuz görüntü alımı sağlamak için ikişer ikişer ciltleyin.
Çalıştır düğmesine tıklayın ve yazılımı stabilize etmek için beş dakika bekleyin. Görüntü alma için bilgileri girin. Örneğin, aralıksız 500 görüntü kaydetmek için toplam görüntü kutusuna 500, görüntüler kutusuna 500 ve aralıklar kutusuna sıfır girin.
Alma düğmesini açtıktan sonra, görüntü bölme optiklerini kullanarak floresan görüntüsünü bölün, GCaMP kanalını yansıtın ve RFP kanalını CMOS kameranın iki yarısına etiketleyin. GCaMP'nin koordinatlarını kalibre edin ve RFP kanallarını etiketleyip ayarları kaydedin. Ardından dizini veri dosyasının çıktısını alacak şekilde ayarlayın ve alımı kapatın.
Testi okuyun. fare imlecinin koordinatlara ve o dosyadaki programa göre kontrol edilmesi için fare makro sistemine sahip metin dosyası ve titreşim kontrolü için yazılım dosyasına çift tıklayın. Kaydı başlattıktan sonra uyarılana kadar bekleme süresinde fare imlecinin koordinatlarını ayarlayın, ardından titreşim kontrolü için yazılımdaki frekansı ve genlik değerlerini ayarlayın.
Hem GCaMP'yi ifade eden hem de RFP'yi etiketleyen tek bir solucanı, inkübe edilmiş plakadan E coli OP50'nin çizildiği yeni bir NGM plakasına aktarın. NGM plakasını şeffaf yapışkan bant kullanarak akustik dönüştürücüye takın. Kalsiyum görüntüleme için, edinme düğmesini açın ve solucanı 2,5x büyütmede bulun.
Görüş alanını piksel başına 2,6 mikron çözünürlüğe sahip 1,1 x 1,1 milimetre olarak ayarlayın. Parlak ışığı kapatın ve solucanın maksimum yoğunluk bölgesini etiket RFP görüntüsündeki görüş alanının ortasında tutmak için X Y aşamasının hareketini başlatan bir solucanın floresan noktasını izlemek için yönlendirme düğmesine tıklayın. Yoğunluk değerlerinin yaklaşık 1000 olduğundan emin olun.
Değilse, ışık kaynağındaki kontrol bölmesinin 470 ve 550 nanometre göstergelerine ince ayar yapın. Fare imleci denetimine izin vermek için fare makro sistemindeki çalıştır düğmesine basın ve çıktı BMP dosyasının uygun şekilde oluşturulduğunu doğrulayın. Veri analizi için, masaüstünde bir klasör oluşturun ve buna Kalsiyum Görüntüleme" adını verin, ardından Kalsiyum Görüntüleme klasörünün içinde bir klasör oluşturun ve çıktı sonuç dosyaları için CI sonucu olarak adlandırın.
Çift görünümlü görüntülemeye çift tıklayın. Veri analiz yazılımında MB dosyası yazılır ve BMP dosyasının bulunduğu klasördeki CI sonuç klasörüne dosya yollarını ekler. RFP etiketi görüntüsündeki maksimum yoğunluk bölgesinin değerini kullanan otomatik bir analiz başlatmak için shift tuşuna basın ve tuşları aynı anda döndürün.
Son olarak, çıktı dosyalarının CI sonuç klasöründe uygun şekilde oluşturulup oluşturulmadığını denetleyin. Temsili analizde, GCaMP ve etiket RFP kanal verileri bir dizi görüntü olarak elde edilmiştir. Lokalize olmayan titreşim sistemi tarafından indüklenen Petri kabının yer değiştirmesi de ölçüldü.
Yer değiştirme, titreşim kontrolü için yazılımdaki genlik değerini, ses ayarlayıcıyı ve amplifikatörünü ayarlayarak kontrol edilebilir. Oysa frekans, yazılımdaki frekans değeri ayarlanarak düzenlenebilir. AVA nöronlarının geçici bir kalsiyum yanıtı, 630 Hertz frekansına ve saniyede yaklaşık 4.5 mikrometrelik bir yer değiştirmeye sahip titreşimlerle stimülasyon üzerine gözlendi, bu da Ava nöronun, bir solucanın lokalize olmayan stimülasyona geri tepkisi sırasında aktive edildiğini gösterdi.
Prosedürümüzde, sadece tek bir nöronu ölçebiliriz. Bununla birlikte, bu sistem, birden fazla nöronu ve hatta tüm beyni noninvaziv olarak ölçmek için biyometrik bir görüntüleme yöntemiyle de birleştirilebilir.
