Name: agarose microchambers for long-term calcium imaging of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2015-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Max Planck Kurumu ve HB için Göttingen Enstitüsü Genç Grubu stipend bu işi finanse.

1. Göstergeler, Kültür Medya ve Yemekleri <ol><li> Odak numune tutma kapasitesine sahip olan ve bir otomatik aşama ile donatılmış bir mikroskop kullanarak. Bir ısmarlama kapak ısıtıcı kurmak veya ticari bir çözüm satın alın. Kameranın poz üreticinin talimatlarına kullanarak TTL sinyali ile LED aydınlatma tetikler hangi bir LED-EMCCD kamera sistemi kurun. Not: Ayrıntılar için tartışma bakın. </li><li> Polydimethylsiloxan (PDMS) pulları: <ol><li> Bir Mikroakiskan tesisinde PDMS pulları Üretiyor ya da ticari bir dökümhane tarafından üretilen PDMS pul var. Ticari bir dökümhane kullanmak için, cihazın (örneğin 15 um) derinliği şirkete AutoCAD dosya göndermek ve belirtin. Dökümhaneden Doğumdan sonra, bir neşter kullanarak 16 pulları içine PDMS çip kesti. </li><li> Hava plazma kullanarak bir bardak slayt her damga Bond. Yapıştırma için, PDMS damga ve hava plazmaya cam slayt hem maruznöbeti 1 dakika (0.5 mbar, en yüksek plazma ayarlarını kullanarak). Yapıştırılması için yüzeyleri plazma tedavisi sırasında yukarı doğru baktığından emin olun. Ardından, cam slayt üzerine PDMS damga yerleştirin. </li></ol></li><li> 3,5 cm alt çanak alın ve dikey freze makinesi ve keskin döner kesiciler kullanarak çanak alt merkezine 18 x 18 mm kare alana kesip. Sürtünme tarafından üretilen ısı nedeniyle erimesi ile ilgili plastik önlemek için kesici ve yavaş besleme düşük dönme hızı kullanın. Aynı anda birkaç yemekler hazırlayın. Not: Alt çanak deney sonrasında birçok kez tekrar kullanılabilir saf etanol O / N ıslatıldıktan sonra temizlenir eğer. </li><li> Agaroz: <ol><li> 100 ml 3 g, yüksek erime noktalı agaroz eritilir S-Bazal (5.85 g NaCI, 1 g K 2 HPO 4, 6 gr KH 2 PO 4 etanol, 1 mi kolesterol (5 mg / ml), H2 O, 1 L, kaynatarak) otoklavlanarak sterilize edin. 2 ml Eppendorf tüpleri ve stor agaroz eritilir hacimde yapmake. Ayrıca, yüksek erime noktalı agaroz ile tam olarak aynı şekilde, düşük erime noktalı agaroz toplu hazırlar. </li><li> 98 ° C - kullanmayın agaroz 95 bir ısıtma bloğu üzerine yüksek erime noktası 3 bölüntülerin yerleştirmek için önce. 35 ° C - 30 ° C&#39;de bir ısıtma bloğu üzerine daha sonra eritilip kadar 98 ° C - 95 ile agaroz bir ısıtma bloğu üzerinde, kullanımı, düşük erime noktasına sahip olan bir kısım yer önce. </li></ol></li></ol> Hayvanların 2. Seçimi <ol><li> Temiz hayvanları elde etmek için seribaşı NGM plakalar üzerinde düşük yoğunlukta solucanlar büyütün. Gıda ve sadece birkaç hayvanların bol plaka üzerinde olduğundan emin olun. </li><li> Görüntüleme L1 larvaları için, taze bir numaralı seribaşı NGM plaka üzerine simit aşamasında embriyoları içeren yaklaşık 30 yumurta transferi. Daha sonra larva aşamalarını veya yetişkin C aktarmak için elegans, taze numaralı seribaşı NGM plaka üzerine yaklaşık 30 solucanlar aktarın. </li></ol> Agaroz microchambers 3. hazırlanması <ol><li> Yemeğin hazırlanması: <ol><li>Altındaki 18 x 18 mm kare bir açıklığı olan bir plastik tabak almak ve ters yukarı bakacak şekilde açılması ile yerleştirin. Deliğin üzerine 20 x 20 mm çift taraflı yapışkan bant parçası koyarak ağzını kapatınız. Yapışkan bant altta olacak şekilde çanak Arkanı dön ve sert bir yüzeye çanak yerleştirin. Ücretsiz neşter kullanılarak açılış kesin. </li><li> P1000 pipet kullanarak, çanak içine S-bazal içinde% 3 yüksek erime noktalı agaroz 2 ml doldurun. Açılış çevreleyen alan üzerine agaroz yerleştirin ve katılaşmaya edelim. Agaroz katı kadar bekleyin. </li><li> Çanak Arkanı dön ve yapışkan garnitür kalır ve maruz kalacağı ve böylece çift taraflı yapışkan bant kaplayan koruyucu filmi soyulabilir. Not: Sonuç olarak, yapışkan bant ince bir halka açma dışında saracaktır. Agaroz sonra numuneyi çevreleyen bir nem deposu olarak hizmet vermektedir. </li></ol></li><li> Microchambers dökümü: <ol><li> Th Açığa60 saniye - 20 hava plazma ile kalıplama e PDMS yüzeyi. Not: Bu plazma tedavisi hava kabarcıkları yakalama engeller ve daha keskin baskılar üretir, PDMS hidrofil yüzey oluşturur. </li><li> 9 cam slaytlar - 5 istifleme eşit yükseklikte iki ayırıcılar oluşturun. Yeri, uzun tarafı, ilk aralama yığını daha sonra tek bir cam slayt, sonra tekrar bir boşluk yığınına paralel olarak. Aralama karşısında dik PDMS damga içeren cam slayt yerleştirin. PDMS damga kalıp yüzeyi ve tek cam slayt arasında yaklaşık 1.5 mm&#39;lik bir boşluk var ki aralama yüksekliğini ayarlayın. </li><li> PDMS sıvı agaroz içine dikey olarak damga slayt hızla PDMS damga yakın tek cam slayt üzerine sıcak sıvı yüksek erime noktası agaroz bir damla koyun ve. Agaroz katılaşmaya edelim. Genellikle yaklaşık 2 dakika sürer opak bir görünüm, alır emin olun. Tek hareket ile dikey damgasını çekin. Not: gl için uygundurue bırakıcı çift taraflı yapışkan bant ile birlikte slaytlar. damganın dikey hareketi agaroz sıkışıp gelen hava kabarcıkları önler. </li></ol></li><li> Ince bir platin tel çekme kullanarak agaroz üzerine OP50 bakteri ile birlikte yumurta veya solucanlar aktarın. Bir kirpik kullanan gıda ile birlikte bir yumurta ya da odasının başına bir solucan dağıtın. Tek agaroz ped üzerine yaklaşık 30 yumurta doldurun. </li><li> Bu yemeğin ağzına güzel uyuyor ki yaklaşık 15 x 15 mm kare içine doldurulan microchambers içeren agaroz levha kesti. Forseps ile kare agaroz levha Pick up ve 20 x 20 mm cam lamel üzerine baş aşağı yerleştirin. Bir kez düştü, tekrar yukarı kaldırın veya bu bakteri ve solucanlar kendi odalarının dışına itti neden olabilir, çünkü etrafta kaydırın yok. </li><li> Yemeğin Meclisi: <ol><li> Plastik tabak açılması üzerine cam lamel yerleştirin. Yavaşça çift taraflı yapışkan bant yapılmış halkası üzerine cam lamel bastırın.Camı kırmak için özen gösterin. </li><li> Baş aşağı çevirin ve çanak yaklaşık 30 ° C&#39;ye kadar soğutulur microchambers içeren agar levha ve sıvı düşük erime noktası agaroz ile agaroz rezervuar arasındaki boşluğu doldurmak için P1000 pipet kullanın. Agaroz katılaşmış kadar bekleyin. </li><li> Bir kapak ile çanak mühür. Ters mikroskoplar için ısıtmalı kapak kullanın. Dik mikroskoplar için normal bir kapak kullanımı ve Parafilm çanak mühür. </li></ol></li><li> Microchambers hazırlanmasını bitirdikten sonra, bir stereo mikroskop altında onları kontrol edin. Doğru dolgu çok önemlidir. Ayrıntılar için tartışma bakın. </li></ol> 4. Kalsiyum Görüntüleme <ol><li> Böyle HBR16 27 ([PNÖH&#39;ün-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: unc-54-3&#39;UTR, unc-119 (+)] goeIs5) olarak genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri ifade transgenik suşları kullanın. </li><li> Geniş alan Epifloresans için donatılmış bir bileşik mikroskop kullanın. Için EMCCD kameranın TTL çıkışını bağlayınKamera örneği yanar bir çerçeve kaydeder her zaman böylece LED TTL girişi. Yaklaşık 5 msn bir pozlama süresi kullanın. 50-300 aralığında EM kazanç kullanın. </li><li> Her 15 görüntülü her solucanı 24 saat bir patlama film çalışan belirtin - daha sonra ilk 30 dakika DIC ile 20 saniye boyunca, GCaMP kaydetmek ve sonra mKate2 sinyalinin son görüntüyü çekmek için bir GFP floresan ile 20 sn alınır sentezleme seviyeleri için kontrolü. Her patlama sırasında 2 / sn kare hızı kullanın. </li><li> Görsel veri denetimi için, floresan küçük değişiklikler görünürlüğünü artırmak için yanlış renk haritası kullanın. F floresan ortalama başlangıç ​​değeri olan ile mesafe kadar taşınmış / F olarak arsa floresan veri. Kalsiyum veri analizi ayrıntılı bir açıklaması literatüründe 20 bulunabilir. </li></ol> Çoklu Worms 5. Paralel AMI <ol><li> , Mikroskop üzerine microchambers içeren çanak yerleştirin örnek üzerinde odaklanmak ve autofo meşgulcus. Kamera solucan başına 1.920 kare, verilerin makul bir miktarın neden olacaktır 24 saat, 20 saniye içinde her yarım saatte 40 resim karelerinin bir patlama kazanır, böylece bir yazılım protokolünü ayarlayın. Bu sahne kullanarak her solucanı ziyaret böylece tarama ayarlayın. Tek vadede yaklaşık 30 solucanlar film hedefleyin. </li><li> Daha düşük büyütme kullanılarak, yani uzaklaştırma Image birden solucanlar. Kamera çip ile birkaç microchambers kapsayacak ve aynı anda birden fazla bitişik microchambers film düşük büyütme kullanın. Görüntü elde etme sonunda, bir hayvan kapsayan bir ilgi bölge kırpma yoluyla her odası için verileri ayırın. </li><li> Hızlı hareketlilik verilerini değerlendirmek için, çerçeve çıkarma 28-32 kullanın. </li></ol> C. 6. Görüntüleme Farklı Yaşam Evreleri elegans <ol><li> C. tüm yaşam evrelerinde agaroz microchambers kullanın elegans L1 yetişkin ve dahil dauers için. Dif için uygun odacık boyutlarını kullanınTablo 1 &#39;de gösterilmiştir ferent ömrü aşamaları. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Hayat aşaması </td><td> Oda boyutu </td><td> Kamara derinliği </td><td> Normal kayıt süresi </td><td> Büyütme </td></tr><tr><td> L1 </td><td> 190 x 190 mm </td><td> 10-15 um </td><td> Yumurta - orta L2 </td><td> 400X </td></tr><tr><td> L2 </td><td> 370 x 370 mm </td><td> 15 um </td><td> Yumurta - L3 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> Dauer larva </td><td> 370 x 370 mm </td><td> 25 mikron </td><td> 4 gün </td><td> 200X </td></tr><tr><td> L3 </td><td> 700 x 700 mm </td><td> 45 mikron </td><td> L2 - L4 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> L4 </td><td> 700 x 700 mm </td><td> 45 mikron </td><td> Genç L4 - genç erişkin </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Genç erişkin </td><td> 700 x 700 mm </td><td> 45 mikron </td&gt; <td> 12-24 saat </td><td> 100X </td></tr></tbody></table> Farklı yaşam evrelerinde Tablo 1. Odası boyutları. Gösterildi vardır 8 x 8 mm kamera çipi için optimize çeşitli aşamalarında için yararlıdır odası boyutları ve büyütme.

<ol>
	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , 1-17 (2012).</li><li>Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+Caenorhabditis+elegans+behavioral+phenotypes.">A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes.</a> Nature Methods. 10, 877-879 (2013).</li><li>Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+tracking+and+behavioral+measurement.">C. elegans tracking and behavioral measurement.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. , e4094 (2012).</li><li>Yemini, E., Kerr, R. A., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+movement+behavior+of+multiple+worms+on+food.">Tracking movement behavior of multiple worms on food.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1483-1487 (2011).</li><li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+behavioral+analysis+in.">High-throughput behavioral analysis in.</a> C. elegans. Nature Methods. 8, 592-598 (2011).</li><li>Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parallel+Worm+Tracker:+a+platform+for+measuring+average+speed+and+drug-induced+paralysis+in+nematodes.">The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes.</a> PLoS One. 3, e2208 (2008).</li><li>Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, E4266-E4273 (2013).</li><li>Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+hydrogel+microcompartments+for+imaging+sleep-+and+wake-like+behavior+and+nervous+system+development+in+Caenorhabditis+elegans+larvae.">Agarose hydrogel microcompartments for imaging sleep- and wake-like behavior and nervous system development in Caenorhabditis elegans larvae.</a> Journal of Neuroscience Methods. 201, 78-88 (2011).</li><li>Yu, C. C., Raizen, D. M., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-well+imaging+of+development+and+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Multi-well imaging of development and behavior in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 223, 35-39 (2014).</li><li>Luke, C. J., Niehaus, J. Z., O'Reilly, L. P., Watkins, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-microfluidic+methods+for+imaging+live.">Non-microfluidic methods for imaging live.</a> C. elegans. Methods. 68, 542-547 (2014).</li><li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research.">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. , 1-19 (2013).</li><li>Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet-based+microfluidic+system+for+individual+Caenorhabditis+elegans+assay.">Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay.</a> Lab Chip. 8, 1432-1435 (2008).</li><li>Krajniak, J., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+high-resolution+imaging+and+culture+of+C.+elegans+in+chip-gel+hybrid+microfluidic+device+for+developmental+studies.">Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies.</a> Lab Chip. 10, 1862-1868 (2010).</li><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li><li>Kerr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+calcium+transients+in+neurons+and+pharyngeal+muscle+of.">Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of.</a> C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).</li><li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+C.+elegans+mechanosensory+neurons+demonstrates+a+specific+role+for+the+MEC-4+channel+in+the+process+of+gentle+touch+sensation.">In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation.</a> Neuron. 39, 1005-1017 (2003).</li><li>Hilliard, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+C.+elegans+ASH+neurons:+cellular+response+and+adaptation+to+chemical+repellents.">In vivo imaging of C. elegans ASH neurons: cellular response and adaptation to chemical repellents.</a> EMBO Journal. 24, 63-72 (2005).</li><li>Frokjaer-Jensen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+voltage-gated+calcium+channel+subunit+genes+on+calcium+influx+in+cultured+C.+elegans+mechanosensory+neurons.">Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons.</a> Journal of Neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).</li><li>Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+activity+of+neurons+and+muscles.">Imaging the activity of neurons and muscles.</a> WormBook. , 1-13 (2006).</li><li>Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+quantitative+Ca2++measurements+using+improved+cameleons.">Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96, 2135-2140 (1999).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19, 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6 (2), (2013).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+molecular+solution+for+ultraviolet+light+detection+in+Caenorhabditis+elegans.">A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 6, e198 (2008).</li><li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans.">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nat Neurosci. 11, 916-922 (2008).</li><li>Turek, M., Lewandrowski, I., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AP2+transcription+factor+is+required+for+a+sleep-active+neuron+to+induce+sleep-like+quiescence+in.">An AP2 transcription factor is required for a sleep-active neuron to induce sleep-like quiescence in.</a> C. elegans. Current Biology. 23, 2215-2223 (2013).</li><li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Notch+Signaling+Regulates+Adult+Chemosensory+Response+and+Larval+Molting+Quiescence.">C. elegans Notch Signaling Regulates Adult Chemosensory Response and Larval Molting Quiescence.</a> Current Biology. 21, 825-834 (2011).</li><li>Raizen, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethargus+is+a+Caenorhabditis+elegans+sleep-like+state.">Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state.</a> Nature. 451, 569-572 (2008).</li><li>Iwanir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microarchitecture+of+C.+elegans+behavior+during+lethargus:+homeostatic+bout+dynamics,+a+typical+body+posture,+and+regulation+by+a+central+neuron.">The microarchitecture of C. elegans behavior during lethargus: homeostatic bout dynamics, a typical body posture, and regulation by a central neuron.</a> Sleep. 36, 385-395 (2013).</li><li>Nagy, S., Raizen, D. M., Biron, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+behavioral+quiescence+in+Caenorhabditis+elegans.">Measurements of behavioral quiescence in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. , (2014).</li><li>Nagy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+longitudinal+study+of+Caenorhabditis+elegans+larvae+reveals+a+novel+locomotion+switch,+regulated+by+Galphas+signaling.">A longitudinal study of Caenorhabditis elegans larvae reveals a novel locomotion switch, regulated by Galphas signaling.</a> eLife. 2, e00782 (2013).</li><li>Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dauerlarva,+a+post-embryonic+developmental+variant+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 46, 326-342 (1975).</li><li>Schwarz, J., Lewandrowski, I., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+activity+of+a+sensory+neuron+during+a+sleep-like+state+in+Caenorhabditis+elegans.">Reduced activity of a sensory neuron during a sleep-like state in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology. 21, R983-R984 (2011).</li><li>Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+muscle+contraction+and+a+relaxed+posture+during+sleep-like+Lethargus.">Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus.</a> Worm. 1, 12-14 (2012).</li><li>Schwarz, J., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+sleep-like+quiescence+in+both+hyperactive+and+hypoactive+mutants+of+the+Galphaq+Gene+egl-30+during+lethargus+in+Caenorhabditis+elegans.">Reduced sleep-like quiescence in both hyperactive and hypoactive mutants of the Galphaq Gene egl-30 during lethargus in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 8, e75853 (2013).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Donanım Bir mikroskop odak noktası genellikle uzun süreli görüntü alımı sırasında sürüklenir. Bileşik Mikroskop, odak tutma sistemleri önemli mikroskop üreticilerden satın alınabilir. Odak kontrolü ile bir bileşik mikroskop çok pahalı durumda, basit bir alternatif Stereomikroskopta kullanmak olacaktır. Bileşik mikroskoplar yüksek sayısal açıklık (NA) ile hedeflerin kullanımına izin ve kolayca otomatik hale getirilebilir. 40X petrol hedefleri uygundur. Suya daldırma lensler nedeniyle uzun süreli görüntüleme sırasında buharlaşma ideal değildir. Diferansiyel girişim kontrast (DIC) morfolojik ve davranışsal değişiklikleri takip için yardımcı hoş bir kontrast oluşturur, ama basit parlak alan görüntüleme de kullanılabilir. DIC veya parlak bir alan görüntüleme için, mikroskop dia-aydınlatma yoluna bir kırmızı ışık filtresi koyarak kırmızı ışık kullanın. Birkaç microchambers taranması için otomatik sahne gereklidir. En iyi performans acbir sahne doğrusal olmayan hızlanma ve yavaşlama vardır ve tarama sırasında hayvanların rahatsız engellemek için düşük tarama hızı ayarlanabilir olduğu kullanıldığında hieved. Biz solucanın mechanosensitive sistemini aktive değil aslında o yavaş tarama düşündüren davranışsal tepkiler ya da tarama sırasında mechanosensitive nöronların (ALM ve PLM) kalsiyum artışı gözlenen değil (veriler gösterilmemiştir). Ticari LED sistemler kullanılabilir. Birçok şirket, farklı dalga boylarında LED&#39;ler dahil hazır kullanımlı çözümleri sunuyoruz. LED dışarıdan bir TTL sinyali ile LED tetikleme seçeneği olmalıdır. Bir çok duyarlı kamera hayvanlar hareketli kalsiyum görüntüleme için gereklidir. EMCCD kameraları piyasadaki en hassas kameralar. Kamera pozlama sırasında bir TTL çıkışı (aynı zamanda sözde &quot;ateş&quot; çıkışı) olması gerekir. Bir kapak ısıtıcı, bir ters mikroskop kullanılarak, eğer kapak üzerinde yoğunlaşmasını önlemek için gereklidir. Dik bir mikroskop, çanak alınacaktır böylece kapak wialtta olacak ve ll böylece yoğuşma önlenir ve hiçbir kapak ısıtma gereklidir. kapak uzun süreli görüntüleme sırasında suyun buharlaşmasını önlemek için çanak yakın sıkıca gerekir. PDMS pulları agaroz kalıplama için yapısını içeren PDMS damga yüzeyi uzak PDMS damga destekleyen cam slayt, gelen karşı karşıya. Özel mikroakışkan cips sunan şirketlerle bir liste Wikipedia&#39;da (bulunabilir <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies" target="_blank">http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies</a> ). Onların odalarına nematodların Dolum Bu protokolde en kritik adımdır ve aşağıdaki noktalar dikkate alınmalıdır: A) agaroz nemlilik solucanlar aktarmak için ve görüntüleme için çok önemlidir. Agaroz, yani çok nemli ise, bir sıvı cov varBirkaç microchambers bir alanı ering, sıvı bakteri akıp yapacak çünkü kontrollü bir şekilde bakteriyel gıda ve solucanlar dağıtılması mümkün olmayacaktır. Agaroz çok kuru ise, bakteri ve solucanlar artan kuvvet kolayca agaroz zarar verir solucanlar ve bakteri damla kullanılması ihtiyacı var demektir kolayca seçim kurtulmak olmayabilir. Solucanlar bir sürü doldururken agaroz kadar kuru olabilir. En kötü durumda agaroz odaları çökecek sonunda çok kuru olacak. Agaroz çok kuru ise hiçbir solucanlar vardır çip yüzüne küçük bir damla S-Bazal (yaklaşık 2 ul) koyarak rehidre edilebilir. Sonra sıvı içine almak platin tel daldırma ve hatta odaları solucanlar ile doldurulur alana sıvı bazı çekin. B) Gıda miktarı uzun vadede başarılı görüntüleme için kritik önem taşımaktadır. Yeterli yiyecek yoksa, solucanlar dışarı çalıştırabilir. Aşırı gıda bölmesi boşluğu varsabir sıvı gibi değil, bir katı gibi davranmaz ve solucanlar bakterileri iterek odasına kaçmak için izin verecektir. Tüm odasını dolduran bir bakteri süspansiyonu elde etmek hedefliyoruz. solucanlar deney sırasında kendi uzunluğunun büyük bir kısmı boyunca agar ve cam yüzeyi ile fiziksel olarak sürekli temas halindedir ve tarama davranışı sıvıda dayak bir plaka üzerinde hareket benzer ve farklı gibi görünmektedir. Denemeyi berbat edebilir agaroz zararlı C) Mekanik. İnce seçim esastır. Bu keskin köşeleri olmamalıdır. Bir pipet ucuna bağlı bir seçenek kirpik platin çekme kullanmak yerine bölmelerine bakteri veya solucan hareket ettirmek için kullanılabilir. Çoğu durumda, bununla birlikte, fazla kurutulmuş agaroz hasarı nedeni budur. seçim veya kirpik, ideal olarak, sadece zar zor solucanlar ve bakterileri çekip gereken agaroz yüzeyinde agaroz kendisi ve su filmi temas etmelidir. Odaları sızdırmazlık zaman, yine, agaroz nem gereklidir. Orada olmamalıBu mühürleme sırasında bakteri ve solucanlar yıkayacak çünkü agaroz yüzey üzerinde herhangi bir serbest sıvı olabilir. Büyük kabarcıklar yavaşça agar kütüğün bir köşe kaldırarak uzaklaştırılabilir. Genellikle odaların içinde sıkışıp olsun odasının daha küçüktür Küçük kabarcıklar. Bu kabarcıklar bir sorun değildir ve emilim yoluyla kaybolur. Çanak montaj sonra, agaroz çok kuru ya da çok ıslak olmadığını tekrar kontrol edin. odaları güzel mühürlü olmalı ve odacıklar arasında herhangi bir sıvı akışı olmamalıdır. Agaroz çok ıslak ise, odaları düzgün mühür olmaz. Solucanlar kaçabilir ya da yiyecek arınacak. Numune çok nemli ise, basit kapağı açın ve bir iki dakika için agaroz kurumaya bırakın. Agaroz çok kuruysa, odalar çökebilir ve solucanlar kaçacaktır. Uzaklaştırma tarafından ölçeklendirme Floresan görüntüleme için, uzaklaştırma, düşük büyütmede elde edilen ışığın düşük miktarı ile sınırlıdır. Ayrıca, EMCCD kameralar duyarlılık için optimize edilmiş ve genellikle nispeten düşük çözünürlüğe sahiptir. Ancak, görüntüleme dört kat yukarı ölçeklendirme de mümkündür. 140x (20X Amaç ve 0.7X kamera montaj kullanılarak elde) büyütme ve 512 x 512 piksel, 8 x 8 mm kamerayı kullanırken Örneğin, 190 um x 190 um dört odaları tek bir kare üzerine sığabilecek. (Örneğin sCMOS kameralar, 16.6 mm x 14 mm yonga, 2560 x 2560 piksel = 5,5 Megapiksel gibi) büyük bir çip ile yüksek çözünürlüklü kamera DIC ve parlak saha görüntüleme ölçeklendirme optimize. Bir 100x büyütme kullanırken Örneğin, 190 mikron 30 L1 solucanlar kadar x 190 mikron odaları (bakınız Şekil 3) Bu kameranın her kare üzerine sığabilecek. Prensip olarak, uzaklaştırma ve tarama da hayvanların daha büyük sayıda elde etmek için kombine edilebilir. Sadece bir odak düzlemi görüntülü gerektiğini, böylece çoğu nöronlar, odakta oldukça iyi muaftır. Nöronlar piezo sürücüsü kullanarak taramayı AZ, odak dışına taşımak için tespit edilirse her zaman p alınabiliroint. Farklı davranışları Uyum Bu protokol uzun zaman ölçeklerinde karşısında davranış iyi bir fikir verir. Açıktır ki, patlamaların zamanlaması farklı davranış ve yaşam evrelerinde adapte edilmesi gerekmektedir. Tekniğin Sınırlamalar Çeşitli faktörler görüntüleme süresini sınırlamak. En önemli gıda miktarıdır. Gıda tüketilen sonra, larvalar gelişmekte durdurmak. Böylece, küçük odacıklarda (190 x 190 mm) solucanlar L3 aşamasına kadar gelişebilir ve ardından tutuklama. Uzun görüntüleme zamanı gerekli ise, daha büyük bölümler kullanılması gerekir. 3 gün - Uzun süreli görüntüleme maksimum süresi 2.5 aralığındadır. Uzun görüntüleme gerekli ise, solucanlar geri kazanılır ve yeni odalarına yerleştirilmesi gerekir. Erişkin solucanlar görüntüleme yaparken, başka bir sınırlama bu solucanların yavru kaynaklanır. Yetişkin solucanlar hangi larva yumurtadan yumurta yatıyordu. Bu larvalar da odasının içine kalacak, Gıda tüketmek ve görüntü analizi rahatsız edebilir. Yavrular bir sorun varsa, çözüm steril yetişkin kullanmak ya da taze odalarına solucanlar defalarca yerleştirmektir. Solucanlar kurtarmak için, odacık içeren agaroz kütük bir bisturi ile kesilip olup, lamel çekilir ve solucanlar elde edilebilir olan bir NGM plaka üzerine yerleştirilir. Başka bir sınır nispeten küçük alanlara solucanlar kısıtlamadır. Uzun menzilli hareketi analiz edilmesi gerekir, bu bir sorun olabilir. Odalarına hayvanlar mekanik ve optogenetically 21,27,34,35 stimüle edilebilir olsa da, odanın mühürlü doğası zor çözünür veya uçucu uyarıcılar uygulamak için yapacaktır. Bu oksijen veya karbon dioksit gibi Biyolojik olarak önemli gazlar agar serbestçe yayılabilir. çanak büyük hava deposu deneyleri için gerekli zaman içinde sabit odalarına gaz konsantrasyonlarını tutmalı. Ancak, zihin yerel oksijen konsantrasyon içinde tutulmalıdırn odasında daha plaka üzerinde kültürden daha sıvı kültüründe bulunan koşulları benzeyebilir. Mevcut yöntemlere göre önemi Mikroakışkan cihazlar büyük ölçüde C okudu davranışsal ve gelişimsel gelişmiş elegans. Çoğu zaman, mikro-akışkan yapı PDMS 12 yapılmıştır. Burada agaroz yapılan mikroakışkan kültür odaları oluşturmak için bir protokol açıklar. Bu tekniğin mukavemetli, yüksek görüntü kalitesi, fizyolojik ölçümler, uzun vadeli bir görüntüleme ve oldukça yüksek bir verimlilik ile davranış korelasyon birleşimidir. Yüksek görüntü kalitesi yüksek NA hedeflerini kullanarak cam lamel sayesinde görüntüleme elde edilir. Bunun bir sonucu olarak, örneğin kalsiyum görüntüleme ve hücre içi yapıların konfokal görüntüleme gibi floresan görüntüleme gerçekleştirilebilir. Hayvanlar, diğer sistemlerde olduğu gibi hareketsiz olmadığından, fizyolojik ölçümler davranış bir korelasyon verir. Because hayvanlar bol gıda var, onlar uzun vadeli görüntüleme izin gelişmekte devam. Bu sistem hayvanların belirlenen odalarına bir vadede görüntü pek çok solucan kısıtlanır çünkü. Böylece, bu yöntem kolayca 9,27,34-36 kadar ölçeklendirilebilir. Gelecekteki uygulamalar Şimdiye kadar, bu sistem, C uyku davranışı incelemek için ağırlıklı olarak kullanılmaktadır elegans L1 larvaları. Bununla birlikte, tüm aşamalarında uyum mümkün da dauers ve yetişkinlerde davranışlarının geniş bir çalışma için yapacaktır. Davranışları geniş bir dizi çiftleşme gelen yumurtlama kadar bu teknikle ele alınabilir.

Caenorhabditis elegans has been established as a model system to study behavior1. Due to its amenability to genetics, the molecular and cellular mechanisms underlying behavior can be studied. Many behaviors occur on long time scales. Two principal approaches can be used to observe motile animals over long time scales. The first approach is following the animal during movement using an automated stage or camera2-8 and the second is to restrict the movement to a range that is at least as small as the field of view of the camera9-14. Both methods have their advantages. Tracking allows following an animal over long spatial ranges but limits the number of animals that can be discerned in one experiment. Restricting the movement of the animals allows scaling up the observation to many individuals at the same time by using arrays of restricted compartments. 
Because the nematode is transparent, live fluorescent imaging can be performed non-invasively15. Calcium imaging provides a functional readout for the activity of excitable cells and is established for C. elegans16-20. Calcium enters the cell via channels in the plasma membrane that open upon depolarization. Thus, calcium acts as a proxy for neural activity. Calcium sensors can be grouped in two major classes, ratiometric and non-ratiometric sensors. Both classes employ conformational changes of calcium-binding proteins induced upon binding of calcium. Ratiometric sensors contain two fluorescent proteins. When the lower-wavelength fluorescent protein is excited, a part of the light energy is transmitted to the higher wavelength fluorescent protein as a function of their distance in a process called Fluorescence Resonance Energy Transfer or F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)21. Non-ratiometric sensors are based on circularly permuted GFP and employ de-quenching of the fluorophore caused by calcium binding22. Each class has its advantages. While ratiometric sensors are less sensitive to movement or expression artifacts, non-ratiometric sensors typically have a higher dynamic range. Both ratiometric and non-ratiometric sensors have been useful to study the activity of excitable cells in C. elegans16-20,23,24. 
When doing long-term fluorescence imaging, the experimenter will have to deal with several potential challenges: 1. Disturbance of behavior through excitation light: Worms are sensitive to short-wavelength fluorescence excitation light and avoid light from the violet to blue range that is used for calcium imaging25,26. Worms respond with either a backward or a forward escape response25,26. Thus, the amount of light needs to be controlled. 2. Bleaching of the fluorescent sensor protein: Often, bleaching of the fluorescent protein hampers long-term imaging. Typically, however, light intensities that are needed to observe bleaching are higher than the light intensities that cause disturbing effects on the behavior of the animals. Thus, bleaching is only a theoretical problem in this type of calcium imaging. 3. Worms inside the microchambers are not fixed and move constantly during wake behavior and images may appear blurred if the worm is not immobilized. All these challenges can be solved using extremely short exposure times with low light intensity. This can be realized by using a highly sensitive EMCCD camera with short exposure times and external triggering of a light emitting diode (LED). To expose the worms to the illumination light as briefly as possible (only during the exposure time of the camera) the LED is externally triggered using a transistor-transistor logic (TTL) signal that the camera emits during exposure resulting in an illumination of the worm for precisely the time the camera chip is exposed. This also means that the EMCCD chip will be dark during data readout, which is optimal for readout performance of this chip. 
Previously, agarose microchambers have been developed for long-term fluorescence imaging of C. elegans larvae9. Here, it is described how agarose micro-chambers can be used for long-term calcium imaging for any life stage of C. elegans, how calcium imaging can be performed, and how this method can be upscaled to assay many individual worms in parallel.

<table><tbody><tr><td>High melting point agarose</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP(E)164-1000</td><td></td></tr><tr><td>Top Vision low melting point agarose</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0801</td><td></td></tr><tr><td>LED system</td><td>CoolLED</td><td>pE-2</td><td></td></tr><tr><td>Compound microscope</td><td>Nikon</td><td>TiE</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD camera</td><td>Andor</td><td>iXon 897</td><td>now sold as iXon Ultra 897</td></tr><tr><td>sCMOS camera</td><td>Andor</td><td>Neo</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick</td><td>PDC-23G2</td><td></td></tr><tr><td>Lid heater</td><td>MPI workshop</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Plastic dish</td><td>Falcon</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>Z-stage for the microscope</td><td>Prior</td><td>Nano Scan Z</td><td></td></tr><tr><td>X-Y stage for the microscope</td><td>Prior</td><td>Proscan III</td><td></td></tr><tr><td>PDMS stamp</td><td>Abbott Laboratories</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Red light filter</td><td>Chroma</td><td>ET660/50m</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dish</td><td>Falcon</td><td>Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning</td><td></td></tr><tr><td>Double sided sticky tape</td><td>Sellotape/Henkel</td><td>double sided 25 mm x 33 m</td><td>alternatively advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used.</td></tr></tbody></table>

agarose microchambers for long-term calcium imaging of caenorhabditis elegans

Davranış sinir sistemi tarafından kontrol edilir. Kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis çeşitli davranışları sırasında nöron aktivitesinin ölçülmesi için elegans şeffaf bir nematod basit bir yöntemdir. Davranışı ile sinir aktivitesi ilişkilendirmek için, hayvan immobilize olmamalı taşımak gerekir. Birçok davranış değişiklikleri, uzun zaman ölçeklerinde sırasında meydana ve davranış birçok saat boyunca kayıt gerektirir. Bu aynı zamanda, kültür gerekli gıda mevcudiyetinde solucanlar yapar. Nasıl solucanlar kültüre ve sinirsel aktivite uzun zaman ölçeklerinde üzerinden görüntülü olabilir? Agaroz Microchamber Görüntüleme (AMI) daha önce kültür geliştirilmiştir ve küçük larvaları gözlemlemek ve şimdi C. yetişkin aşamasına kadar erken L1 tüm yaşam evrelerini incelemek için adapte edilmiştir edildi elegans. AMI C. çeşitli yaşam evrelerinde yapılabilir elegans. Uzun vadeli kalsiyum görüntüleme com kısa dışarıdan tetiklenen pozlama kullanarak hayvanları hareketsiz olmadan elde edilirşarj çiftli cihaz (EMCCD) kamera kaydını çarparak bir elektron ile kombine. Uzaklaştırma veya tarama paralel 40 solucanlar kadar görüntü bu yöntemi kadar ölçeklendirilebilir. Böylece, bir yöntem C. tüm yaşam evrelerinde uzun zaman ölçeklerinde üzerinde görüntü davranış ve sinirsel aktivite açıklanan elegans.

Agaroz microchambers C arasında herhangi bir yaşam aşamasında uygulanabilir elegans. Şekil 1A&#39;da görüldüğü gibi, L1 lethargus sırasında larva gelişimi ve uyku davranışı görülmektedir. Derin 190 x 190 mm, 10 mm olan bölme boyutları Gösterildi. Daha uzun bir zaman ölçekleri gerekliyse, daha büyük odaları kullanılabilir. Daha büyük boyutlu (370 x 370 um, 25 um derinliğinde) olan bir odacığı kullanılarak, Şekil 1B&#39;de görüldüğü gibi C geliştirilmesini sağlar elegans yumurtadan yetişkin kadar. Şekil 1C yetişkin kadar yumurtadan bir odasında yetişen bir solucanın çerçeve çıkarma kullanarak davranışı uzun vadeli değişikliklerin analizini göstermektedir. Sonrasında ve lethargus sırasında seçilen patlamaları için çerçeve çıkarma sonrası ortalama şiddetleri gösterilir vardır. solucanın hareketlilik alt çerçeve çıkarma değerleri sonrası ortalama yoğunluğudur düşük. Gösterilen bir uyandırma durumu ve larva dönemi başına bir lethargus durumundan patlama izleri seçilir.gelişimi sırasında ortalama yoğunluk gözlenen artış hayvanın artan kontrast ve büyüklüğü çoğunlukla kaynaklanmaktadır. Şekil 1D bir Dauer larva, olumsuz çevre koşulları 33 sırasında devreye girer alternatif yaşam aşamasını gösterir. Oda boyutu 370 x 370 mm, 15 mm derin. Dauer larva aşamasından çıkmak neden olur ki, Dauer larva bakteriyel gıda olmadan odasına konuldu unutmayın. Şekil 1E zaten odasına birçok yumurta atmıştır yetişkin bir solucan göstermektedir. Yetişkin için kullanılan Kazan boyutları derin 700 x 700 mm, 45 mm idi. Son olarak, Şekil 1F yetişkin hermafrodit ve yetişkin bir bölme içinde bir erkek çiftleşme göstermektedir. Hareketli solucanlar Kalsiyum görüntüleme. GCaMP kalsiyum sensörleri ile mümkündür 2A, L1 larva 27 komut interneuron AVA B gösterisi kalsiyum görüntüleme Rakamlar. 2C sa kalsiyum faaliyet gösterecek D, RakamlarBir yetişkin hayvan nöron beni türü. Uzun vadeli görüntüleme ölçeklendirme tarayarak ve uzaklaştırma ile mümkündür. 3A, 5 megapiksel kamera ile tek kamera çip 30 solucanlar eşzamanlı görüntüleme görüntü kalitesini gösterir. Şekil 3B aynı anda görüntülü 4 solucanlar kalsiyum görüntü kalitesini göstermektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" width="700" /> C. tüm yaşam evrelerine AMI 1. Adaptasyon Şekil 190 x 190 mm ​​odalarına erken L2 aşamasına kadar erken L1 görüntülü elegans. (A) Larva. 370 x 370 mm odasında yetişkin kadar yumurtadan (B) geliştirilmesi. Bir solucanın (C) Hareketlilik çerçeve çıkarma kullanılarak değerlendirildi. Her larva sta için bir seçili patlama film için çerçeve çıkarma sonra görüntünün tüm resimlerin ortalama yoğunluğu Gösterildisonrasında ve lethargus davranış ge. 370 x 370 um odası içinde gıda olmadan (D) bir Dauer larva. 700 x 700 mikron odasına koydu birçok yumurta (E) Yetişkin hermafrodit. (F) bir erkeğin Çiftleşme ve 700 x 700 mikron odasının içine bir hermafrodit. YA genç yetişkin anlamına gelmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" width="700" /> AMI Şekil 2. Kalsiyum görüntüleme. AVA nmr-1 promotör kullanarak L1 larvaların komuta interneuron içinde GCaMP3 ile (A) Kalsiyum görüntüleme. İki yanlış renkli görüntüler gösterilir vardır. Sol resimde, AVA aktivitesi düşüktür ve solucan bir geriye hareketi yapmıyor. Sağ resimde AVA aktivitesidir<html> yüksek ve solucan geriye hareket ediyor. L1 solucanı için zamanla (B) Kalsiyum geçici. (C, D) yetişkin hayvan Kalsiyum transientler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52742/52742fig3highres.jpg" width="700" /> Yakınlaştırıp uzaklaştırarak paralel Şekil 3. Görüntüleme birden solucanlar. (A) Eşzamanlı 190 x 190 mikron odaları kullanarak kare başına 30 L1 solucanlar görüntüleme ve 100X büyütme (10X objektif kullanılarak) ve 16,6 x 14 mm kamera çipi. (B) 370 x 370 mm odaları ve 100X büyütme ve 16,6 x 14 mm kamera çip ilgi bir bölge kullanarak çerçeve başına dört L3 solucanlar Simultane görüntüleme.et = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Watch this Scientific Journal Video about Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Uzun süreli Kalsiyum Görüntüleme için Agaroz microchambers<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

agarose-microchambers-for-long-term-calcium-imaging-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

9.5K Görüntüleme.  Max Planck Institute for Biophysical Chemistry. Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans. 

Video: Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Biyokimya

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Nörobilim

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. Animals cope with these stimuli by modifying their behavior. Understanding the mechanisms underlying such behavioral modification requires quantification of neural activity during the behavior of interest. Here, we report a method for calcium imaging in freely behaving Caenorhabditis elegans with nonlocalized vibration of specific frequency, displacement, and duration. This method allows the production of well-controlled, nonlocalized vibration using an acoustic transducer and quantification of evoked calcium responses at single-cell resolution. As a proof of principle, the calcium response of a single interneuron, AVA, during the escape response of C. elegans to vibration is demonstrated. This system will facilitate understanding of neural mechanisms underlying behavioral responses to mechanical stimuli.

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Reported here is a system for calcium imaging in freely behaving Caenorhabditis elegans with well-controlled, nonlocalized vibration. This system allows researchers to evoke nonlocalized vibrations with well-controlled properties at nano-scale displacement and to quantify calcium currents during responses of C. elegans to the vibrations.

İyi Kontrollü, Lokalize Olmayan Titreşimli Serbest Davranan Caenorhabditis elegans'ta Kalsiyum Görüntüleme

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

Davranış

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

Boyuna Imaging'de Caenorhabditis elegans için bir mikrosıvısal Platform

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Biyomühendislik

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means of identifying radiosensitive sites in living organisms. This paper describes a series of on-chip immobilization methods developed for the targeted microbeam irradiation of live individuals of Caenorhabditis elegans. Notably, the treatment of the polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chips that we previously developed to immobilize C. elegans individuals without the need for anesthesia is explained in detail. This chip, referred to as a worm sheet, is resilient to allow the microfluidic channels to be expanded, and the elasticity allows animals to be enveloped gently. Also, owing to the self-adsorption capacity of the PDMS, animals can be sealed in the channels by covering the surface of the worm sheet with a thin cover film, in which animals are not pushed into the channels for enclosure. By turning the cover film over, we can easily collect the animals. Furthermore, the worm sheet shows water retention and allows C. elegans individuals to be subjected to microscopic observation for long periods under live conditions. In addition, the sheet is only 300 &#181;m thick, allowing heavy ions such as carbon ions to pass through the sheet enclosing the animals, thus allowing the ion particles to be detected and the applied radiation dose to be measured accurately. Because selection of the cover films used for enclosing the animals is very important for successful long-term immobilization, we conducted the selection of the suitable cover films and showed a recommended one among some films. As an application example of the chip, we introduced imaging observation of muscular activities of animals enclosing the microfluidic channel of the worm sheet, as well as the microbeam irradiation. These examples indicate that the worm sheets have greatly expanded the possibilities for biological experiments.

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

A series of immobilization methods has been established to allow the targeted irradiation of live Caenorhabditis elegans individuals using a recently developed ultra-thin polydimethylsiloxane microfluidic chip with water retention. This novel on-chip immobilization is also adequate for imaging observations. The detailed treatment and application examples of the chip are explained.

Bir Ultra-thin Polydimethylsiloxane mikrosıvısal çip su tutma ile kullanarak canlı Caenorhabditis elegans bireylerin immobilizasyon

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...

Tracking Calcium in the Early Developmental Phases of C. elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode Caenorhabditis elegans provides several unique advantages for the study of the OET as it is transparent and has an ordered gonad that produces one mature oocyte every ~23 min at 20 &#176;C. We have modified the genetically encoded calcium indicator jGCaMP7s to fluorescently indicate the moment of fertilization within a living organism. We have termed this reporter &#34;CaFE&#34; for Calcium during Fertilization in C. elegans. The CaFE reporter was&#160;engineered into a safe harbor locus in single copy, has no significant impact on physiology or fecundity, and produces a robust signal upon fertilization. Here, a series of protocols is presented for utilizing the CaFE reporter as an in vivo tool for dissecting the OET and embryogenesis. We include methods to synchronize worms, examine the effects of RNAi knockdown, mount worms for imaging, and to visualize calcium in oocytes and embryos. Additionally, we present the generation of additional worm strains to aid in this type of analysis. Demonstrating the utility of the CaFE reporter to visualize the timing of fertilization, we report that double ovulation occurs when ipp-5 is targeted by RNAi and that only the first oocyte undergoes immediate fertilization. Furthermore, the discovery of single-cell calcium transients during early embryogenesis is reported here, demonstrating that the CaFE reporter persists into early development. Importantly, the CaFE reporter in worms is simple enough to use for incorporation into course-based undergraduate research (CURE) laboratory classes. The CaFE reporter, coupled with the ordered gonad and ease of RNAi in worms, facilitates inquiry into the cell-cell dynamics required to regulate internal fertilization and early embryogenesis.

Here, we present protocols and tools for visualizing calcium during fertilization and early embryogenesis using a genetically encoded calcium reporter expressed in the germline of the model nematode C. elegans.

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

Gelişim Biyolojisi

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Ratiometric kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis Elegans davranışlar içinde bireysel nöronların

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Büyümesi ve Görüntülenmesi için Basit Bir Mikroakışkan Çip

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Calcium Imaging: A Method to Visualize Neural Activity in Live C. elegans

Source: Turek, M. et al. <a href="https://www.jove.com/video/52742/agarose-microchambers-for-long-term-calcium-imaging-caenorhabditis">Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of&#160;Caenorhabditis elegans.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video introduces the concepts behind calcium imaging and includes an example protocol for time-lapse imaging of worms contained in molded agarose wells.

Kalsiyum Görüntüleme: Canlı C. elegans'ta Nöral Aktiviteyi Görselleştirmek İçin Bir Yöntem

Source: Turek, M. et al. Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of&#160;Caenorhabditis elegans.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video ...

Uzun süreli Kalsiyum Görüntüleme için Agaroz microchambers

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler