Name: fourier-based diffraction analysis of live caenorhabditis elegans
Uploaded: 2017-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Wir danken Juan Vasquez für seine rechnerische Beiträge mit diesem Projekt. Wir sind dankbar für die Unterstützung der Vassar College Undergraduate Research Summer Institute (URSI), Lucy Maynard Lachs Research Fund und der NSF Award Nr. 1058385.

1. C. Elegans Wachstum und Pflege <ol><li>Nematoden Kultur Gerichte vorbereiten.
	<ol><li>Füllen die Petrischalen mit einer Agar-Lösung und lassen Sie sie zu festigen, dann Samen mit einer E. Coli-Kultur von der OP50 9 , 10 Stamm.</li>
	</ol></li> <li>Start Einwohner Erwachsenen Nematoden auf jeder Platte indem mehrere Erwachsene Würmer auf frischen Agar gefüllten Petrischalen mit einem E. Coli-Patch vorzubereiten. Pflegen die Nematoden Kulturen bei 20 ° C in einem Inkubator. 
	Hinweis: Nematoden Sorten erhalten Sie bei Caenorhabditis Elegans Genome Center. Für diese Studie, dem Wildtyp, N2, Dehnung und die OH7547 (otls199 [Katze-2::GFP + Rgel-1 (F25B3.3):: DsRed + rol-6(su1006)]) Stamm, der einen Walze Phänotyp zeigt, waren ausgelastet.</li>
	<li>Würmer Propagate für zukünftige Kulturen.
	<ol><li>Entfernen die Petri-Schale mit C. Elegans und einen ungenutzten Lebensraum Petrischale aus dem temperierten Inkubator. Legen Sie sie auf der Bühne eines sezierenden Mikroskops.</li>
		<li>Licht der Bunsenbrenner und sterilisieren die Platin Nematoden Pick indem man das Metall in die Flamme, bis es rot glüht. Lassen Sie die Kommissionierung auf Raumtemperatur abkühlen. Nicht die Abholung festgelegt oder lassen die Pick in Kontakt mit Verunreinigungen kommen.</li>
		<li>Berühren sanft die Spitze der Abholung an den Rand des Kreises der Bakterien. Diese Substanz ist klebrig und Kommissionierung einzelnen Erwachsenen Nematoden einfacher machen.</li>
		<li>Bis zu 4 trächtige Nematoden auf eine Nematode Wachstum Medium (NGM) Agar gefüllt Petri Platte übertragen und bei 20 ° c inkubieren Die Würmer legen Eiern, die in vier Tagen fällig werden.</li>
		<li>Rückkehr die restlichen Nematoden in den Inkubator nach dem Umzug von vier Erwachsenen Nematoden.</li>
	</ol></li></ol> 2. Optischen Aufbau ( Abbildung 1) <ol><li>Secure die Helium-Neon laser nahe der Rückseite linke Ecke der optischen Workbench und schließen Sie es an eine Stromquelle. 
	Hinweis: Der Laser &#39; s-Beam muss erfüllen die Anforderungen für Oversampling. C. Elegans sind etwa 1 mm lang, daher sollte der Laserstrahl einen Durchmesser größer als 2 mm während der Vorfall auf der Nematoden, aber nicht größer als 5 mm haben, so dass das Beugungsmuster nicht schwer zu lokalisieren ist.</li>
	<li>Ein Graufilter zwischen der Helium-Neon-Laser und der Probe zu platzieren, so dass der Laserstrahl durch den Filter vor dem Erreichen der Probenmaterials reist.</li>
	<li>Mit zwei vorderen Oberfläche Aluminium Lenkung Spiegel, bauen ein Periskop durch die Sicherung des ersten Spiegels nach der Graufilter. Den zweite Spiegel ca. 10 cm unterhalb der erste Spiegel geben Raum, um den Laserstrahl zu steuern und legen die Küvette zwischen den Spiegeln zu sichern. Der Laserstrahl und Küvette so ausrichten, dass der Laserstrahl senkrecht durch die Küvette reist. 
	Hinweis: Der Abstand zwischen den diffracting Organismus die Fotodiode muss viel größer als der Organismus selbst Fernfeld Beugung zu erreichen sein. In diesem Experiment aus der Küvette die Fotodiode erreichen Sie nach 20 cm.</li>
	<li>Sichern die Photodiode direkt gegenüber den zweiten Spiegel mit seinem Sensor vor dem Spiegel. 
	Hinweis: Die Küvette mit der Fadenwurm wird zwischen den beiden spiegeln mit Chemie Klammern platziert werden. Siehe Abschnitte 4 und 5.</li>
	<li>Setzen ein Wasser gefüllten Küvette auf die Halterung. Die Höheneinstellung des Standes. Die Höhen und Winkel der Spiegel 1 und 2 Spiegel so einstellen, dass der Laserstrahl die Küvette gerichtet durchläuft, in der Nähe aber nicht direkt auf die Fotodiode.</li>
	<li>Hilfe einer Wasserwaage die Stände Form eine flache Oberfläche für die Küvette sicherzustellen. Ggf. die Spiegel weiter.</li>
	<li>Verbinden die Fotodiode, die digitales Oszilloskop mithilfe des USB-Kabels mit dem digital Oszilloskop zur Verfügung gestellt. Digitale Oszilloskop an den Computer, die verwendet werden, aufnehmen und Speichern der Daten anschließen.</li>
</ol> 3. Oszilloskop-Setup <ol><li>mit der Software für das Oszilloskop auf dem Computer soll mindestens 8 Hz, den Prügel-Zyklus des Wurms hinreichend zu lösen die Sample-Rate. 
	Hinweis: Die Sample-Rate sollte mehr als das Doppelte der erwarteten Prügel Frequenzen der Gattung so dass Nyquist Theorem 11 erfüllt ist.</li>
</ol> 4. Vorbereitung der Wurm und Küvette zur Datenerfassung <ol><li>übertragen vier Erwachsenen Nematoden auf einen frischen NGM 10 Agar gefüllt Petri Teller mit einem dünnen, flachen Platindraht Pick (siehe Abschnitt 1.3).</li>
	<li>Entfernen eine Einweg-Plastik-Küvette aus der Verpackung, wobei Sie darauf achten, nur die Küvette auf seine geriffelten Seiten berühren.</li>
	<li>Verwendung einer Mikropipette, destilliertes Wasser in die Küvette pipette, bis die Küvette ca. 80 % ist gefüllt mit destilliertem Wasser. 
	Hinweis: Es ist wichtig, nur mit destilliertem Wasser oder ionisierten Puffer z. B. M9 10 oder Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) beim Umgang mit der Nematodes wie Leitungswasser Mikroorganismen töten Verbindungen enthält.</li>
	<li>Legen die Petrischale mit C. Elegans sezierenden Rahmen verwendet werden.</li>
	<li>Mit dem Platin Pick, eine Reife C. Elegans aus der Petrischale und tauchen die Abholung in der Küvette, die Kommissionierung in Kreisen bewegen, wenn nötig, die Nematoden zu verdrängen.</li>
	<li>Verhindern Blasenbildung in der Küvette, die Küvette mit Wasser füllen, bis es leicht wölbt sich über die Küvette &#39; s oben. Füllen Sie die Küvette &#39; s-GAP vollständig mit Wasser dann schnell setzen Sie die Kappe auf die Küvette.</li>
	<li>Verwenden eine optische Reinigungstuch Wassertropfen zu entfernen, die vorbei und optische Reinigungspapier zur Reinigung kleinen verbleibenden Tropfen verschüttet haben kann.</li>
</ol> 5. Echtzeit-Datenerfassung von Beugung Muster Intensität Änderungen <ol><li>schalten Sie die Helium-Neon laser und Einstellung der Frequenz/Farbe, so dass es einen roten Strahl erzeugt. Schalten Sie den Sensor. 
	Vorsicht: Verwenden Sie einen niedrig-Energie-Strahl auf 632 nm, als C. Elegans vermeiden Hochfrequenz (blau) Licht 12.</li>
	<li>Suchen Sie den Wurm in die Küvette. Halten die Küvette auf seine geriffelten Seiten die Küvette leicht kippen, bis etwa in der Mitte des Teils der Küvette Nematoden ist. 
	Hinweis: Wackeln oder kippen die Küvette heftig bewirkt, dass den Wurm mit den Wänden der Küvette zu kollidieren. Dies kann die Nematode beschädigen.
	<ol><li>Ort die Küvette auf dem Ständer in das optische System, Zentrierung des Wurms innerhalb der Laser &#39; s-Beam von Mirror 1 Mirror 2 reflektiert. Achten Sie darauf, um Streulicht zu vermeiden.</li>
	</ol></li> <li>Center die Wurm in den Laserstrahl.
	<ol><li>Die Fotodiode in das Beugungsmuster zu platzieren, so dass die Lage der Fotodiode und zentrale maximal das Beugungsmuster stimmen nicht überein.</li>
		<li>Einstellen der Graufilter zur Sättigung der Fotodiode zu verhindern. Das neutrale Dichte Filterrad drehen, regelt die Lichtintensität.
		<ol><li>Drehen die neutrale Dichte so filtern, dass erhöht die Spannung, die Ausgabe von der Photodiode. 
			Hinweis: Die Ausgangsspannung wird mit der Software für die digitale Fotodiode beobachtet. Die Fotodiode ist gesättigt, wenn die Spannung nicht ändert. In diesem Fall drehen Sie die Graufilter, bis die Spannung reduziert, ohne eine minimale Lesung Verflachung. Sicherstellen Sie, dass das Spannungssignal nicht in den Peak-Lesungen, Angabe Sättigung der Fotodiode abflachen wird. Reduzieren Sie die Lichtintensität durch Drehen der neutralen Dichte Filterrad wenn Sättigung beobachtet wird.</li>
		</ol></li> <li>Sobald die beweglichen Beugungsmuster sichtbar, sammeln Daten mit der Fotodiode ist durch Klicken auf die Schaltfläche "Start" auf die Software steuert das Oszilloskop während der Überwachung des Wurms &#39; s-Bewegung. Nehmen Sie Messungen bis bewegt sich der Wurm aus der Laserstrahl und die diffracTion Muster verschwindet, das dauert in der Regel etwa 20 s.
		<ol><li>Stop der Datenerfassung Prozess indem Sie auf die Stopp-Taste auf die Software für das Oszilloskop. Speichern Sie jede Prüfung &#39; s-Daten im CSV oder txt Format.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Wiederholen Sie die Schritte 5.2-5.3 bis mindestens 50 Datensätze für jede Phänotyp gesammelt wurden. Acht bis zehn Tiere pro Testversion verwenden.</li>
	<li>Wenn die Küvette ist zerkratzt entsorgen und der Wurm, und wiederholen Sie Schritt 4. Wenn der Wurm bei der Übertragung beschädigt ist, entsorgen Sie ihn und die Küvette mit destilliertem Wasser spülen, bevor wiederholen Schritt 4 unter Verwendung der gleichen Küvette.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 5 mit der OH7547 &#34; Walze &#34; Stamm, achten Sie darauf, die Daten, um den Wurm Belastung zeigen beschriften.</li>
</ol> 6. Fourier-Spektrum von Daten <ol><li>importieren die Daten in eine Daten-Analyse-Programm in der Lage, diskrete Fourier Transformationen 3.</li>
	<li>Führen Sie Fourier wandelt auf jeder Datensatz mit Hilfe der schnellen Fourier-Transformation (FFT) Option der Software.</li>
	<li>Durchschnitt der Frequenzen aus der FFT-Ergebnisse für jeden Amplitude für die N2-Wildtyp Würmer.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 6.3 mit dem FFTs von der OH7547 &#34; Walze &#34; Würmer.</li>
</ol> 7. Modellierung von Fourier-Spektrum <ol><li>Programm binäre Modellcharakter für die Nematoden Fortbewegung (siehe Programm in der ergänzenden Materialien enthalten). 
	Hinweis: Dieses Modell ist eine grobe Annäherung, die auf zunächst die herausragende Merkmale der Wurm Bewegung zeigt. Das Modell kann verfeinert werden, die Ergebnisse sind im Vergleich mit tatsächlichen Würmer. Wurm-Formen sind Annäherungen mit Mikroskop Bilder 13.
	<ol><li>Sequentielle Frames Erstellen des binären Modells durch mindestens zwei Wurm-Zyklen ( Abbildung 2a). Sehen Sie die Videos in den ergänzenden Materialien; C-Wurm Video (CWorm.avi) und W Wurm Video (WWorm.avi).</li>
	</ol></li> <li>Sequentielle Beugungsmuster zu produzieren. Sehen Sie die Videos in den ergänzenden Materialien. C-Wurm Beugung Video (CWormDiff.avi) und W Wurm Video (WWormDiff.avi).
	<ol><li>Fourier-Transformation binäre Rahmen des Wurm-Bildes. Je größer der Abstand des Rahmens um den Wurm, desto besser die Auflösung des Bildes Beugung werden. 
		Hinweis: Der Absolute Wert jedes Fourier Transformierte Rahmens ist proportional zu den entsprechenden Beugungsmuster ( Abb. 2 b).</li>
		<li>Tune den Kontrast des Beugungsmusters durch Zuordnen einer logarithmischen Skala die Intensitäten der Beugungsmuster. 
		Hinweis: Kameras und Augen neigen dazu, auf einem nicht-linearen Maßstab funktionieren. Eine logarithmische Skalierung kann simulieren, wie ein Beugungsmuster in der Regel vom menschlichen Auge wahrgenommen wird.</li>
	</ol></li> <li>Die modellierten Beugung Signal zu extrahieren.
	<ol><li>Wählen Sie eine exzentrische Lage, das entspricht auf den Speicherort der die Fotodiode in das Beugungsmuster.</li>
		<li>Fügen Sie die benachbarten Matrixelemente rund um den Speicherort der Fotodiode, die Größe der Fotodiode zu simulieren. Die Größe der Fotodiode ist typischerweise 0,1 % des modellierten Beugungsmuster.</li>
		<li>Rekord und Handlung signalisiert die Sequenz von der Größenordnung der Beugung. Überprüfen Sie, ob das Signal physikalisch sinnvoll ist (d. h., bei periodischen Prügel, das Signal von der Photodiode sollte regelmäßige sowie).</li>
	</ol></li> <li>Fourier transformieren die Beugung Signal in 7.3 erhalten und vergleichen Sie die Ergebnisse mit den experimentellen Daten.</li>
	<li>Für verschiedene Stämme der Wurm zu wiederholen und zu vergleichen.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Darunter erstreckt sich von Daten mit Inaktivität wird die Ergebnisse verzerren, da künstliche niedrigere Frequenzen in die Ergebnisse gemittelt werden. Die Photodiode Sättigung erkennt man an flachen Spitzen oder "abgeschnitten" Gipfeln in den Rohdaten. Teilung jeder Rohdatensatz durch Peak Intensitäten helfen bei Bilanzierung von Schwankungen in der Laserintensität.
Die Peak-Frequenzen sind ein Indikator für die allgemeine Prügel Frequenz; Allerdings komplizierte Bewegung verursacht Störungen bei beat Frequenzen in das Beugungsmuster und müssen sorgfältig geprüft werden.
Diese Methode kann verwendet werden, um die Fortbewegung der anderen Nematoden zu untersuchen. Die Umwelt kann auf ein anderes Medium geändert werden. Wellenlängen können auch geändert werden. Arbeiten im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums ist die einfachste und sicherste.
Eine verfeinerte Modell simuliert die Beugung Spektren realistischer in die Zukunft. Ein Zukunftsmodell gehören einen Wurm, der Orientierungen, ändern die Frequenz Standorte aber relative Gipfel Höhen nicht beeinträchtigen würde. Ein realistischeres Modell würde eine probabilistische Verteilung der Prügel Frequenzen ermöglichen die die Gipfeln wie in den experimentellen Daten erweitern würde. Eine Ausbreitung in Frequenzen würden Variationen in Tracht Prügel Frequenzen ausmachen.
Die aktuelle Wurm-Form ist grob, vor allem in den Kopf und Schweif Region, die mehr als im aktuellen Modell verjüngt werden sollte. Es kann interessant sein, eine detaillierte Analyse der Zeitreihen des Signals zu führen, da es Hinweise auf die Komplexität der Fortbewegung in verschiedenen Mutanten geben könnte.
Es lohnt sich, die Praktikabilität der Erweiterung dieser Technik in mehreren Nematoden gleichzeitig Charakterisierung. Diese Methode sollte als ergänzende Methode zur bestehenden Methoden mit traditionellen Mikroskope verstanden werden. Diese Methode hat einen Vorteil in ein Mikroskop nicht während der Datenerfassung erfordern, so dass der Wurm aus der Brennebene bewegen kann. Die gemittelten Frequenz-Spektren zeigen deutliche Unterschiede in der Wurm Bewegung und von den vorherrschenden Frequenz Gipfeln quantifiziert werden können ist eine neuartige Methode bei der Quantifizierung Wurm Fortbewegung. Datenanalyse der Beugung Signaturen ist bei der Weiterentwicklung und wird hoffentlich zu einer automatisierten Identifikationsprozess mehrere Mutanten und Einzelpersonen führen.

Diese Methode vergleicht experimentelle und modellierten Frequenzspektren der Fortbewegung von C. Elegans mit zwei Sorten mit sehr unterschiedlichen lokomotorischen Muster. Die Ergebnisse zeigen, dass das Frequenzspektrum von zeitlichen Veränderungen abhängt, da die Nematoden in einer Wassersäule schwimmt, so dass klare mikroskopische Bilder nicht für die Analyse benötigt werden. Diese Methode ermöglicht die quantitative Echtzeit-Analyse und bietet ergänzende Informationen, Bilder und Videos mit traditionellen Mikroskope erhalten. Fraunhofer Beugung, auch genannt Fernfeld Beugung, bildet die Grundlage für den Erhalt der live Beugung Daten1,2. Die Lichtintensität an jedem einzelnen Punkt in das Beugungsmuster ist das Ergebnis der Überlagerung von Licht aus allen Richtungen in der Gliederung der Nematoden3. Infolgedessen trägt die Lichtintensität im Laufe der Zeit gesammelt Informationen über die Fortbewegung der Nematoden. Analyse der zeitabhängigen Beugung-Signal kann die charakteristische Bewegung der entsprechenden Mutante identifizieren, da analysieren alle Beteiligten in der Fortbewegung Frequenzen die traditionellen video-Analyse ergänzt. In diesem Fall werden die charakteristischen Unterschiede zwischen der Fortbewegung der "Walze" und Wildtyp C. Elegans bestätigt durch den Vergleich der Frequenz-Spektren von zwei verschiedenen Stämmen von Nematoden.
Einige frühere Merkmale wurden mit Frequenzanalyse der Beugung Signale wie Schwimmbad Frequenzen2,4bestätigt. Noch wichtiger ist, kann diese Methode verwendet werden als ergänzende Methode zur traditionellen Mikroskopie, um Fortbewegung in Echtzeit auf einem Computerbildschirm zu beobachten, wie die Daten erhoben werden. Das Frequenzspektrum der Würmer mit unterschiedlichen lokomotorischen Muster kann quantifiziert werden, unter Berücksichtigung, dass die Fourier Signal von der Beugung Signal umgewandelt.
Des interdisziplinären Charakters der Fourier-basierte Beugung in dieser Arbeit umfasst die Bereiche der Biologie und Physik. Beugung durch unter Probenahme wurde lange zur Kristallstrukturen in Biologie5 und anderen Bereichen zu untersuchen. In diesem Experiment schafft jedoch oversampling6,7 der Fernfeld Beugungsmuster so dass der Organismus in den Laserstrahl zentriert ist. Oversampling ist in der Regel für Objektiv-weniger bildgebende8 in Verbindung mit einer Phase Retrieval-Algorithmus verwendet, die ein Bild des ursprünglichen Objekts rekonstruiert. Phase Retrieval ist schwer zu erreichen wenn Streusignal vorhanden sind, wie der Fall mit einem Fadenwurm ist. Die zeitliche Beugung Unterschrift genügt, um Schlüsselfrequenzen der Wurm Bewegung zu bewerten. Diese Methode ist weniger rechnerisch Besteuerung und bietet eine optische Möglichkeit zur Fortbewegung zu quantifizieren. Diese Technik könnte ohne weiteres zur Analyse von Mutationen oder Umgebungsbedingungen, die Verhalten ändern angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>Tunable Helium-Neon laser</td><td>Research Electro-Optics</td><td>30602</td><td>Four wavelengths can be selected between 543 nm and 633 nm.</td></tr><tr><td>2 Front Surface Aluminum Mirrors</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-F01</td><td></td></tr><tr><td>Photodiode: SI Amplified Detector</td><td>Thorlabs</td><td>PDA 100A</td><td></td></tr><tr><td>Quartz Cuvette</td><td>Starna Cells</td><td>21/G/5</td><td>Plastic cells may be used as well.</td></tr><tr><td>MatLab (Software)</td><td>MathWorks</td><td>R2016b (9.1.0.441655)</td><td>Use the fft command to simulate diffraction</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>14.7.1</td><td>Used for data analysis of Figure 4</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans&lt;/em&gt; Roller</td><td>&lt;em&gt;University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC)&lt;/em&gt;</td><td>Strain: OH7547&lt;br/&gt; Genotype: otIs199.</td><td>https://cbs.umn.edu/cgc/home</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans&lt;/em&gt; Wild Type</td><td>&lt;em&gt;University of Minnesota Caenorhabditis elegans Center (CGC)&lt;/em&gt;</td><td>Strain:N2 Genotype: C. elegans wild isolate</td><td>https://cbs.umn.edu/cgc/home</td></tr></tbody></table>

fourier-based diffraction analysis of live caenorhabditis elegans

Dieses Manuskript beschreibt die Nematoden mit zeitlichen Fernfeld Beugung Signaturen zu klassifizieren. Ein einzelnes C. Elegans ruht in einer Wassersäule in einer optischen Küvette. Ein 632 nm kontinuierliche Welle HeNe-Laser wird durch die Küvette unter Verwendung der vorderen Oberfläche Spiegel gerichtet. Ein deutlichen Abstand von mindestens 20-30 cm reiste nach das Licht die Küvette durchläuft gewährleistet eine nützliche Fernfeld (Fraunhofer) Beugungsmuster. Die Beugung Muster Änderungen in Echtzeit wie die Nematoden schwimmt in den Laserstrahl. Die Fotodiode wird in das Beugungsmuster außermittig platziert. Das Spannungssignal von der Photodiode wird in Echtzeit beobachtet und über ein digitales Oszilloskop aufgezeichnet. Dieser Vorgang ist für 139 Wildtyp und 108 "Roller" C. Eleganswiederholt. Wildtyp-Würmer zeigen eine schnelle Schwingungsmuster in Lösung. Die "Roller" Würmer haben eine Mutation in eine Schlüsselkomponente der Nagelhaut, die mit glatten Fortbewegung behindert. Zeitintervalle, die nicht frei von Sättigung und Inaktivität werden verworfen. Es ist praktisch jeder Schnitt durch seine maximale relative Intensität zu vergleichen zu teilen. Das Signal für jeden Wurm ist, dass Fourier transformiert, damit ergibt sich die Frequenzmuster für jeden Wurm. Das Signal für jede Art von Wurm wird gemittelt. Die gemittelten Fourier-Spektren für die wilde Art und der "Roller" C. Elegans unterscheiden sich deutlich und zeigen, dass die dynamische Wurm Formen der beiden anderen Wurm Stämme mit Hilfe der Fourier-Analyse unterschieden werden können. Die Fourier-Spektren von jedem Wurm Stamm passen eine ungefähre Modell mit zwei verschiedenen binären Wurm-Formen, die Muskeln Momente entsprechen. Der Umschlag der gemittelten Häufigkeitsverteilung für tatsächliche und modellierten Würmer bestätigt, dass das Modell die Daten übereinstimmt. Diese Methode dient als Grundlage für die Fourier-Analyse für viele mikroskopisch kleine Arten, wie jeder Mikroorganismus seine einzigartige Fourier-Spektrum haben.

Der optische Versuchsaufbau in Abbildung 1 dargestellte ermöglicht die Studie der Mikroorganismen ohne Bindung an eine Brennebene. Das Prügel-Signal von der Photodiode kann in Echtzeit auf dem Bildschirm beobachtet werden, wie die Daten gesammelt werden. Ungewöhnliche Muster werden sofort sichtbar sein, ohne eine Video im Detail zu analysieren.
Beispiele für modellierte sequentielle Wurm Bewegung und entsprechende Beugung Muster in Abbildung 2dargestellt. Die modellierten Beugungsmuster qualitativ ähneln experimentelle Muster1 und gibt einen ersten Hinweis, dass die Simulationen erfolgreich die Nematoden Modell.
Eine Probe zeitliche Beugung Signatur der zwei Arten von C. Elegans studierte hier ist in Abbildung 3dargestellt. Qualitativ ist ersichtlich, dass jede Nematoden bei unterschiedlichen Geschwindigkeiten und Amplituden schlägt. Einige der Unterschiede kann durch Kurvenanpassung wie in einer früheren Publikation1quantifiziert werden. Die diskrete Fourier-Transformation zeigt jedoch mehr Details über eingebettete Frequenzen:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56154/56154eq1.jpg">, (1)
wo Fk ist die digitale Fourier-Transformation (FT) und f-n ist das zeitabhängige roh Beugung-Signal mit der diskreten Zeit ist Variable n und der diskrete Frequenz Variablen k. N die Gesamtzahl der Datenpunkte. Die durchschnittliche digitale Fourier-Transformation ermöglicht die Nematoden von Amplitude von der Beugung-Frequenz-Spektrum (Abbildung 4) identifiziert werden. Das Wildtyp-Spektrum wird von niedrigeren Frequenzen als die Walze Bewegung Spektrum dominiert.
Ein Modell, das nähert sich dem Wildtyp versus die Walze C. Elegans Noten tendenziell dem Wildtyp thrash im eine Wellenbewegung (W und S-Form) (Abbildung 2a), während die Walze tendenziell einseitig zu begünstigen, die etwa eine oszillierende C-Form ( ähnelt Abbildung 5). Dies bietet eine Erklärung für die unterschiedlichen Spektren. Die Walze wird meist eine C auf der einen Seite bilden, während die W-Schwingung als zwei gegenläufige Bewegungen C gedacht werden kann. Aus diesem Grund ist die W-Bewegung komplexer enthüllt weitere sekundäre tiefen Frequenzen als die C-Bewegung. Dieses Ergebnis wird in das Rechenmodell bestätigt. Die W-Form hat eine viel höhere Frequenz Dichte als die C-Form (Abbildung 6). Dies wird in das FFT in Abbildung 4 wo die Walze Frequenzen mehr gruppiert sind zwar nicht völlig diskret. Die Statistiken der Walze sind verzerrt, da die Walze Wildtyp Fortbewegung vorübergehend wiederherstellen kann.
Die geglättete Leistungsspektren der Rollentyp C. Elegans zeigt eine breite Spitze bei ~1.5 Hz, während dem Schwimmen Wildtyp C. Elegans eine multimodale Spektrum (einschließlich Peaks bei ~1.0 Hz und 1,75 Hz) aufweist. Die Fotodiode (PD) hat eine endliche Größe auf mehrere Matrixelemente verteilt. Einzelnen Matrixelemente oder Punkte auf das Beugungsmuster variieren in ihrer Intensität, da konstruktive und destruktive Interferenz variiert; Dennoch sind die Frequenzen, bei denen die Intensitäten variieren, das gleiche für alle Matrix-Elemente, wie in Abbildung 7ersichtlich. In Anbetracht der Zeitableitung GL. 1 ist ersichtlich, dass die Frequenzschwankungen nicht auf die Phase-Matrix, sondern nur auf das ursprüngliche Objekt Schwankungen abhängt:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56154/56154eq2.jpg">, (2).
Wie die PD über mehrere Matrixelemente ausbreitet, im Durchschnitt die Peak-Standorte zu einem einheitlichen Frequenz-Profil. Einige Abweichungen zu erwarten und kann geben Aufschluss über die Orientierung des Wurms. Die Häufigkeitsverteilung wird als der Gang der Wurm Änderungen ändern. Das aktuelle Modell ist ein einfaches Modell, das nur für die Bewertung der Peak Standorten eher als relative Gipfel Höhen ermöglicht. Unterschiedliche lokomotorischen Muster werden auf verschiedene Gipfel Standorte im Durchschnitt.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Versuchsaufbau. Die low-Power Laser Beam Reisen durch die Graufilter spiegelt sich durch Spiegel M1 nach unten durch die Küvette mit der Wurm auf Spiegel M2 und fährt in Richtung der Photodiode. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Sequentielle Wurm Formen und entsprechenden Beugungsmuster. (ein) wählen Sie einige sequenzielle binäre Abbilder von modellierten W Form Nematoden und die (b) entsprechende sequentielle Beugungsmuster. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig3.jpg"> 
Abbildung 3. Experimentelle Probe Beugung Signaturen. Beugung Unterschriften für (eine) OH7547 "Roller" und (b) N2 Wildtyp C. Elegans mit einer einzigen Fotodiode in das Beugungsmuster. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig4.jpg"> 
Abbildung 4. Experimentelle gemittelt Leistungsspektren von Rollen- und Wildtyp Fraunhofer Beugung Serie. Die Spektren-Show präsentieren die Frequenzen in gemittelte Fourier-Transformation der Zeitreihe mit Photodiode aufgenommen. Eine Gaußsche Filter Standardabweichung dient zum Glätten von 0,075 Hz, bei 3 Standardabweichungen abgeschnitten. Beachten Sie die breite spektrale Peak bei ~1.5 Hz im geglätteten Walze Spektrum, im Vergleich mit dem multimodalen geglättete Wildtyp-Spektrum (einschließlich der Lastspitzen bei ~1.0 und 1.75 Hz). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig5.jpg"> 
Abbildung 5. Beugung Bildung Illustration. Beugungsmuster können durch denken jedes Liniensegment als einer verschwindend kleinen geraden Linie (links) modelliert werden. Überlagerung von diesen Linien (rechts) zeigt den Bau der Fernfeld Beugungsmuster erzeugt von einem C-förmigen Nematoden. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig6.jpg"> 
Abbildung 6. Leistungsspektren von Rollen- und Wildtyp Fraunhofer Beugung Serie simuliert. (ein) C Form und (b) W Form Würmer mit der Fotodiode zentriert auf die Matrixelemente 200 (vertikal) und 175 (Horizontal). Die W-Form zeigt eine höhere Dichte der Frequenzen durch die komplexere Fortbewegung. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56154/56154fig7.jpg"> 
Abbildung 7. Leistungsspektren von Rollen- und Wildtyp Fraunhofer Beugung Serie an verschiedenen Photodiode Standorten simuliert. (ein) W Form Wurm und Wurms (b), C-Form für einzelne Matrixelemente an verschiedenen Standorten, die Simulation von verschiedenen Orten der Fotodiode. Peak-Höhen variieren für verschiedene Standorte; Peak Orte bleiben jedoch für bestimmte Formen gleich. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56154/56154fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

Dieses Manuskript wird beschrieben, wie verschiedene Nematoden Fernfeld Beugung Signaturen zu unterscheiden. Wir vergleichen die Fortbewegung von 139 Wildtyp und 108 "Roller" C. Elegans durch Mittelung Frequenzen die zeitliche Fraunhofer Beugung Signatur an einem Standort mit Hilfe eines Lasers kontinuierliche Welle zugeordnet.

Fourier-basierte Beugung Live-Analyse von Caenorhabditis elegans

This manuscript describes how to classify nematodes using temporal far-field diffraction signatures. A single C. elegans is suspended in a water column ...

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Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

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7.9K Aufrufe.  Vassar College. Dieses Manuskript wird beschrieben, wie verschiedene Nematoden Fernfeld Beugung Signaturen zu unterscheiden. Wir vergleichen die Fortbewegung von 139 Wildtyp und 108 "Roller" C. Elegans durch Mittelung Frequenzen die zeitliche Fraunhofer Beugung Signatur an einem Standort mit Hilfe eines Lasers kontinuierliche Welle zugeordnet.

Serie: Fourier-Based Diffraction Analysis of Live Caenorhabditis elegans

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, acceleration and forces involved in the locomotory behavior of nematodes suspended in a column of water in response to single wavelengths of light. We demonstrate how to evaluate the locomotion of a microscopic organism using Single Wavelength Shadow Imaging (SWSI) using two different examples.
The first example is a systematic and statistically viable study of the average descent of C. elegans in a column of water. For this study, we used living and dead wildtype C. elegans. When we compared the velocity and direction of nematode active movement with the passive descent of dead worms within the gravitational field, this study showed no difference in descent-times. The average descent was 1.5 mm/sec &#177; 0.1 mm/sec for both the live and dead worms using 633 nm coherent light.
The second example is a case study of select individual C. elegans changing direction during the descent in a vertical water column. Acceleration and force are analyzed in this example. This case study demonstrates the scope of other physical properties that can be evaluated using SWSI while evaluating the behavior using single wavelengths in an environment that is not accessible with traditional microscopes. Using this analysis we estimated an individual nematode is capable of thrusting with a force in excess of 28 nN.
Our findings indicate that living nematodes exert 28 nN when turning, or moving against the gravitational field. The findings further suggest that nematodes passively descend in a column of water, but can actively resist the force of gravity primarily by turning direction.

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

The technique presented here measures the path of freely swimming microscopic species using single wavelength exposure. C. elegans are used to demonstrate shadow imaging as an inexpensive alternative to costly microscopes. This technique can be adapted to accommodate various orientations, environments and species to measure direction, speed, acceleration and forces.

Einzel-Wellenlänge Schatten von Imaging<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Locomotion einschließlich Kraft-Schätzungen

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

Forschung

Ingenieurwesen

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in contrast, have been conducted using microscope-based approaches, which limit the movement and behavior to a narrow, nearly two-dimensional focal field.1 We present a novel analytical approach that provides real-time analysis of freely swimming C. elegans in a cuvette without dependence on microscope-based equipment. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through the cuvette. We measure oscillation frequencies for freely swimming nematodes.
Analysis of the far-field diffraction patterns reveals clues about the waveforms of the nematodes. Diffraction is the process of light bending around an object. In this case light is diffracted by the organisms. The light waves interfere and can form a diffraction pattern. A far-field, or Fraunhofer, diffraction pattern is formed if the screen-to-object distance is much larger than the diffracting object. In this case, the diffraction pattern can be calculated (modeled) using a Fourier transform.2
C. elegans are free-living soil-dwelling nematodes that navigate in three dimensions. They move both on a solid matrix like soil or agar in a sinusoidal locomotory pattern called crawling and in liquid in a different pattern called swimming.3 The roles played by sensory information provided by mechanosensory, chemosensory, and thermosensory cells that govern plastic changes in locomotory patterns and switches in patterns are only beginning to be elucidated.4 We describe an optical approach to measuring nematode locomotion in three dimensions that does not require a microscope and will enable us to begin to explore the complexities of nematode locomotion under different conditions.

Microscopic organisms like the free-swimming nematode C. elegans, live and behave in a complex three-dimensional environment. We report on a novel approach that provides analysis of C. elegans using diffraction patterns. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through a cuvette.

Quantitative Locomotion Study of Frei Schwimmen Mikroorganismen mittels Laserbeugung

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

Biotechnik

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Mikrofluidik-basierten electrotaxis für On-Demand-Quantitative Analyse von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Entwicklungsbiologie

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. Animals cope with these stimuli by modifying their behavior. Understanding the mechanisms underlying such behavioral modification requires quantification of neural activity during the behavior of interest. Here, we report a method for calcium imaging in freely behaving Caenorhabditis elegans with nonlocalized vibration of specific frequency, displacement, and duration. This method allows the production of well-controlled, nonlocalized vibration using an acoustic transducer and quantification of evoked calcium responses at single-cell resolution. As a proof of principle, the calcium response of a single interneuron, AVA, during the escape response of C. elegans to vibration is demonstrated. This system will facilitate understanding of neural mechanisms underlying behavioral responses to mechanical stimuli.

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Reported here is a system for calcium imaging in freely behaving Caenorhabditis elegans with well-controlled, nonlocalized vibration. This system allows researchers to evoke nonlocalized vibrations with well-controlled properties at nano-scale displacement and to quantify calcium currents during responses of C. elegans to the vibrations.

Kalziumbildgebung bei frei verhaltender Caenorhabditis elegans mit gut kontrollierter, nicht lokalisierter Schwingung

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

Verhalten

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of diverse human diseases. Worms are particularly well-suited for high-throughput genetic and drug screens to gain deeper insight into therapeutic targets and therapies by exploiting their fast development cycle, large brood size, short lifespan, microscopic transparency, low maintenance costs, robust suite of genomic tools, mutant repositories, and experimental methodologies to interrogate both in vivo and ex vivo physiology. Worm locomotor activity represents a particularly relevant phenotype that is frequently impaired in mitochondrial disease, which is highly heterogeneous in causes and manifestations but collectively shares an impaired capacity to produce cellular energy. While a suite of different methodologies may be used to interrogate worm behavior, these vary greatly in experimental costs, complexity, and utility for genomic or drug high-throughput screens. Here, the relative throughput, advantages, and limitations of 16 different activity analysis methodologies were compared that quantify nematode locomotion, thrashing, pharyngeal pumping, and/or chemotaxis in single worms or worm populations of C. elegans at different stages, ages, and experimental durations. Detailed protocols were demonstrated for two semi-automated methods to quantify nematode locomotor activity that represent novel applications of available software tools, namely, ZebraLab (a medium-throughput approach) and WormScan (a high-throughput approach). Data from applying these methods demonstrated similar degrees of reduced animal activity occurred at the L4 larval stage, and progressed in day 1 adults, in mitochondrial complex I disease (gas-1(fc21)) mutant worms relative to wild-type (N2 Bristol) C. elegans. This data validates the utility for these novel applications of using the ZebraLab or WormScan software tools to quantify worm locomotor activity efficiently and objectively, with variable capacity to support high-throughput drug screening on worm behavior in preclinical animal models of mitochondrial disease.

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

This study presents protocols for two semi-automated locomotor activity analysis approaches in C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms, namely, ZebraLab (a medium-throughput assay) and WormScan (a high-throughput assay) and provide comparative analysis among a wide array of research methods to quantify nematode behavior and integrated neuromuscular function.

Vergleichende Analyse experimenteller Methoden zur Quantifizierung der Tieraktivität bei Caenorhabditis elegans Modellen der mitochondrialen Erkrankung

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Agarose Mikrokammern für Langzeit Calcium Imaging von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Neurowissenschaften

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

Mikrofluidische Plattform für längs-Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Tracking Calcium in the Early Developmental Phases of C. elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode Caenorhabditis elegans provides several unique advantages for the study of the OET as it is transparent and has an ordered gonad that produces one mature oocyte every ~23 min at 20 &#176;C. We have modified the genetically encoded calcium indicator jGCaMP7s to fluorescently indicate the moment of fertilization within a living organism. We have termed this reporter &#34;CaFE&#34; for Calcium during Fertilization in C. elegans. The CaFE reporter was&#160;engineered into a safe harbor locus in single copy, has no significant impact on physiology or fecundity, and produces a robust signal upon fertilization. Here, a series of protocols is presented for utilizing the CaFE reporter as an in vivo tool for dissecting the OET and embryogenesis. We include methods to synchronize worms, examine the effects of RNAi knockdown, mount worms for imaging, and to visualize calcium in oocytes and embryos. Additionally, we present the generation of additional worm strains to aid in this type of analysis. Demonstrating the utility of the CaFE reporter to visualize the timing of fertilization, we report that double ovulation occurs when ipp-5 is targeted by RNAi and that only the first oocyte undergoes immediate fertilization. Furthermore, the discovery of single-cell calcium transients during early embryogenesis is reported here, demonstrating that the CaFE reporter persists into early development. Importantly, the CaFE reporter in worms is simple enough to use for incorporation into course-based undergraduate research (CURE) laboratory classes. The CaFE reporter, coupled with the ordered gonad and ease of RNAi in worms, facilitates inquiry into the cell-cell dynamics required to regulate internal fertilization and early embryogenesis.

Here, we present protocols and tools for visualizing calcium during fertilization and early embryogenesis using a genetically encoded calcium reporter expressed in the germline of the model nematode C. elegans.

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Untersuchung der Verbreitung und Toxizität von Prion-ähnlichen Proteine ​​Mit dem Metazoan Modellorganismus<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Fourier-basierte Beugung Live-Analyse von Caenorhabditis elegans

Zusammenfassung

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Einzel-Wellenlänge Schatten von Imaging

Quantitative Locomotion Study of Frei Schwimmen Mikroorganismen mittels Laserbeugung

Mikrofluidik-basierten electrotaxis für On-Demand-Quantitative Analyse von

Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

Kalziumbildgebung bei frei verhaltender Caenorhabditis elegans mit gut kontrollierter, nicht lokalisierter Schwingung

Vergleichende Analyse experimenteller Methoden zur Quantifizierung der Tieraktivität bei Caenorhabditis elegans Modellen der mitochondrialen Erkrankung

Agarose Mikrokammern für Langzeit Calcium Imaging von

Mikrofluidische Plattform für längs-Imaging in Caenorhabditis elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Untersuchung der Verbreitung und Toxizität von Prion-ähnlichen Proteine Mit dem Metazoan Modellorganismus

Fourier-basierte Beugung Live-Analyse von Caenorhabditis elegans

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Einzel-Wellenlänge Schatten von Imaging

Quantitative Locomotion Study of Frei Schwimmen Mikroorganismen mittels Laserbeugung

Mikrofluidik-basierten electrotaxis für On-Demand-Quantitative Analyse von

Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

Kalziumbildgebung bei frei verhaltender Caenorhabditis elegans mit gut kontrollierter, nicht lokalisierter Schwingung

Vergleichende Analyse experimenteller Methoden zur Quantifizierung der Tieraktivität bei Caenorhabditis elegans Modellen der mitochondrialen Erkrankung

Agarose Mikrokammern für Langzeit Calcium Imaging von

Mikrofluidische Plattform für längs-Imaging in Caenorhabditis elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Untersuchung der Verbreitung und Toxizität von Prion-ähnlichen Proteine ​​Mit dem Metazoan Modellorganismus

Untersuchung der Verbreitung und Toxizität von Prion-ähnlichen Proteine Mit dem Metazoan Modellorganismus