Yazarlar Marit Warrer mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz. Bu eser bağımsız araştırma için Danimarka Konseyi tarafından desteklenmiştir | Doğa Bilimleri [1323-00343B] ve [DNRF120] Danimarka Ulusal Araştırma Vakfı.

1. bakteriyel kültürlerde hazırlanması.
<ol><li>Grow bütün kültürlerde Erlenmeyer şişeler ile bir kültür/şişesi hacim oranı en az 1/6. 37,0 ° C'de kültürler ve tercih edilen karbon kaynağı, örneğin % 0,2 glikoz, en az 10 ile takıma morpholinepropanesulfonic asit (paspas) en az orta 18 160 rpm'de sallayarak tipik bir deneysel Kur içinde büyümek RNA hasat önce üst üste nesilleri.</li>
	<li>RNA hasat, önceki gün seyreltik BEZLERİ en az orta ertesi gün istediğiniz saatte istediğiniz OD 436 ulaşacak şekilde istenen yük outgrown bir kültür. Aşılama için formül tarafından kullanmak için kültür geçmek hacmi hesaplamak: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56212/56212eq1.jpg" /> Not: Burada, OD Yeni istenen OD 436 gösterir Kuluçka sonra V Yeni gösterir seyreltilmiş kültür hacmi, OD eski gösterir üzerinden seyreltilmiş outgrown kültürünün OD 436, G gösterir kültür büyür, nesil sayısı üzerinden seyreltme (TRT 1) gün sonra (t 2) gerekli değildir ve olarak hesaplanan zaman zaman: zaman farklılığı (dk) arasında TRT 1 ve t 2 nesil süresi (dk) bölünür. Örnekleme zamanında kararlı durum büyüme sağlamak için G olmalıdır &#8805; 10; V eski taze ortamına aktarılması gerektiğini dışı yetiştirilen kültür seviyesini gösterir. Bu denklem için herhangi bir gecikme aşama hesaba katmaz bir yaklaşım olduğunu; seyreltme taze medya dışı yetişkin bir kültür sonra sık sık gözlenen bir fenomen.
	<ol><li>Büyüme koşulları deneme amacına bağlı olarak değişiklik gösterir, ama hücre hücre varyasyon tRNA düzeyleri ve sonuçları (önerilen), tekrarlanabilirlik artırmak için büyümek örnekleme öncesi durumunu sürekli kültürler sınırlamak için 19.</li></ol></li></ol> 2. Spike hücreler hazırlanması Not: tRNA selC bir izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) kontrolü altında kodlama selC gen ifade E. coli zorlanma MAS1074,- indüklenebilir organizatörü spike zorlanma kullanılır.
<ol><li>Dilute MAS1074 outgrown bir kültür 0,05 BEZLERİ içinde bir OD 436 için en az orta 100 µg/mL Ampisilin ve % 0,2 glikoz ile desteklenmiştir. 160 rpm'de sallayarak 37 ° C'de kültür büyümek. 
	Not: tartışma bir alternatif başvuru zorlanma kullanımı için bkz.</li>
	<li>, OD 436 ~ 0,1, tRNA selC ifade ikna etmek için 1 mM son bir konsantrasyon IPTG ekleyin. Kültür OD 436 ~0.5 için büyümek (~ 3-4 s büyüme) ve kültür şişeye bir buz banyosu için hareket. RNA arıtma için tüm örneklerini hasat kadar buz spike hücre kültür devam.</li>
</ol> 3. Deneysel örnekleri hasat.
<ol><li>Öncesi sıcak (37 ° C) bir şapkalı 100 mL Erlenmeyer şişesi (veya benzeri) bir sıcak su banyosunda yerleştirerek her örnek için 4 mL % 10 (w/v) trichloroacetic asit (TCA) içeren. 
	Not: dikkat, hidrojen klorür ve kloroform gibi toksik ve aşındırıcı duman üreten Isıtma üzerine TCA parçalanır. Güçlü bir asit suda çözümdür; Bu şiddetle üsleri ile reaksiyona girer ve birçok metaller atmış. Bu sıvı kullanırken gerekli tedbirleri alınmalıdır.</li>
	<li>Hemen önce hücre hasat, ölçmek ve kültür OD 436 rekor.</li>
	<li>Hücreleri hasat, kültür 4 mL TCA içeren önceden ısıtılmış bir şişesi transfer.</li>
	<li>İçin 5 s. karıştırma TCA ile hemen tüm enzimatik faaliyetleri devre dışı bırakır ve böylece tRNA şarj düzeyini korur şişeye el ile dönen tarafından örnek mix. 
	Not: Eğer birden fazla örnekleri toplanması için tüm örnekleri toplayana kadar hasat örnekleri TCA buz üstünde tutun.</li>
</ol> 4. Ayrıca spike hücreler Not: spike hücreler hazırlanması adım 2'de açıklanan.
<ol>Ne zaman tüm örnekleri için RNA hazırlık <li>toplanmıştır, her örnek için (OD üzerinde göre) % 5 spike hücreler ekleyin. 
	Not: Gerekli spike hücre kültür hacmi formülle hesaplanır: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56212/56212eq2.jpg" /> V spike gerekli, spike-in hücre kültürü hacmi gösterir nerede V exp hacmi gösterir (TCA) olmadan hasat deneysel hücre kültürü, OD exp deneysel hücre kültürü OD 436 hasat TCA içine zaman gösterir. OD spike spike hücre kültürünün OD 436 gösterir. Eğer birden fazla örnekleri farklı ODs hasat, birimin eklendi spike hücreler her örnek için formüle göre ayarlanmalıdır.</li>
	Spike hücreler katkısı faiz, RNA türü ölçmek için <li>sadece 4 mL spike hücreler 4 mL TCA ile karıştırılarak spike hücreler içeren bir örnek hazırlamak. RNA bu örnekten diğer örnekleri için aynı şekilde hazırlayın.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, spike hücreler, olmadan sadece deneysel örnek içeren başka bir şişe al ve tRNA için deneysel örnek katkısını ölçmek için içerir selC düzeyleri; tRNA selC endojen düzeyleri E. coli K-12 negligibly düşük.</li>
</ol> 5. RNA'ın hazırlık Not: Burada açıklanan RNA hazırlık protokoldür esasen Varshney ve ark. tarafından açıklanan 1; Aminoacylated tRNA deacylation arıtma sırasında önlemek için asidik pH ve arıtma seyri boyunca 0 ° C'de örnekleri tutmak önemlidir. Örnekleri ve çözümleri tutmak için temiz steril tüpler/şişeler kullanın ve tüm çözümler ultrasaf (18,2 MΩ·cm direnci ile) su hazırlayın.
<ol><li>Bir buz soğuk santrifüj tüpü dönüştürmek dökün 8 mL. Örnekleri de 4 ° C. tamamen Kaldır süpernatant 9.500 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi ve 0.3 mL soğuk 0,3 M sodyum asetat içinde pH 4.5 ve 10 mM EDTA resuspend.</li>
	<li>Her örnek için bir soğuk 1.5 mL microcentrifuge tüp nakletmek ve eklemek ile aynı tampon equilibrated 0.3 mL fenol. 
	Not: dikkat, fenol zehirli gazlar oluşturur ve cilt için son derece korozif.</li>
	<li>Girdap her örnek 10 x 15 için en az 1 dk her girdap arasında bir iyimsersin. Vortexing arasında örnekleri 0 tutmak ° C. örnekleri soğuk kalmasını sağlamak için sık sık duraklar kullanın.</li>
	<li>İçin 20.000 x g 4 de 15 dk santrifüj örnekleri ° C. Transfer (üst aşama) su aşamaya yeni 1.5 mL microcentrifuge tüpleri. 0.3 mL soğuk fenol ve girdap 4 x 15 s daha önce olduğu gibi ekleyin.</li>
	<li>4'de 20.000 x g, 10 dk santrifüj ° C. Transfer 2,5 kat % 96 etanol (~ 750 µL) birimi içeren yeni, soğuk 1.5 mL microcentrifuge su aşamaya tüpleri. Tüpler için 1 h-20 ° C veya gecede-80 kuluçka tarafından RNA çökelti ° C.</li>
	<li>İçin 20.000 x g 4 de 30 dk santrifüj örnekleri ° C. süpernatant atmak ve RNA Pelet bozmadan 1 mL soğuk % 70 etanol dikkatle ekleyin. Yavaşça iç etanol ile tüplerin yıkamak için bir kez tersine çevirin. 
	Not: Pelet Bu adımda görmek zor olabilir.</li>
	<li>4'de 20.000 x g, 10 dk santrifüj ° C. tamamen süpernatant kaldırmak ve kadar hiçbir etanol sol Pelet kuruması. Pelet tarafından şiddetle vortexing 20 µL soğuk 10 mM sodyum asetat pH 4.5 ve 1 mm EDTA resuspend. 
	Not: o-ecek var olmak resuspend zor gibi Pelet aşırı kuru değil.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, RNA konsantrasyonu 260 Absorbans ölçerek değerlendirmek nm.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, özel Jel Elektroforez 20 tarafından arıtılmış RNA kalitesini değerlendirmek.</li>
	<li>Mağaza örnekleri-80, ° C. 
	Not: Burada protokol duraklatılmış.</li>
</ol> 6. Kimyasal olarak deacylated denetimi örneğini hazırlanması Not: aminoacylated grup ayırt etmek için Kuzey üzerinde deacylated karşılığından tRNA leke, bir kimyasal deacylated aliquot alkali tedavisi tarafından hazırlanmıştır. Çoğu amaç için Kuzey her leke için deacylate tek bir örnek yeterli.
Buz <ol><li>tezcan RNA örnek. 4 µL aliquot RNA örneği için yeni bir tüp aktarın. 46 µL Tris-HCl pH 9.0 ekleyin. 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya</li>
	<li>PH 4.5 0,3 M sodyum asetat 15 µL ekleyip daha sonra 125 µL % 96 etanol ekler. -20 ° c için 1 h. RNA çökelti</li>
	<li>İçin 20.000 x g 4 de 30 dk santrifüj ° C. tamamen süpernatant kaldırmak ve 4 µL soğuk 10 mM sodyum asetat pH 4,5 ve 1 mM EDTA içinde resuspend. 
	Not: örnek-80 depolanıyorsa, protokol, duraklatılmış ° C.</li>
</ol> 7. Jel Elektroforez ve Kuzey kurutma <ol><li>Mix 4 µL örnek (tedavi edilmemiş veya kimyasal olarak deacylated) ile 6 µL yükleme arabellek (0.1 M sodyum asetat (pH 5,0), 8 M üre, % 0.05 bromophenol mavi ve % 0.05 Ksilen cyanol). 
	Not: yalnızca spike hücreler, içeren örnek eklemeyi unutmayın kimyasal olarak deacylated sample (ve bir hazır spike hücreler, olmadan).</li>
	<li>Örnekleri üzerine bir 0.4 mm kalınlığında % 6,5 polyacrylamide 0.1 M sodyum asetat arabellek (pH 5,0) 8 M üre içeren jel (19:1 acrylam - ide:bisacrylamide) yükleyin. TRNA türler uygun ayırma için 60 cm uzun jelleri kullanın.</li>
	<li>Ayrı RNA, 4 ° C'de 10 V/cm Jel Elektroforez tarafından mavi bromophenol kadar ulaşır jel (~ 20 h) alt.</li>
	<li>Alan Ksilen cyanol boya ve bromophenol mavi doğru aşağı 20 cm boya kurutma için kullanılır (iki boyalar arasındaki uzaklığı 25-30 cm olmalıdır). Böylece jel onlardan biri kalır iki cam levha, dikkatlice ayırın. Filtre kağıdı ince bir parçası istenen blotting alan boyutuna kesme ve kurutma için kullanılacak jel parçası üzerine yerleştirilir. Filtre kağıdı tarafından kapsanmayan jel parçaları kesilmiş ve atılan. jel parça cam levha uzak çýkýntýdan için filtre kağıdı kullanın. 
	Not: Büyük jel çok kırılgandır çok özenle ele.</li>
	<li>Pozitif yüklü naylon membran (örneğin Hybond N + membran) jel üstüne yerleştirilir ve bu electroblotted 20 V 90 dk 40 mM Tris-asetat (pH 8.1), 2 mM EDTA Aktarım arabellek kullanarak için.</li>
	<li>Crosslink RNA UV ışık kullanarak membran için (0,12 J/cm 2). 
	Not: Membran-ebilmek şimdi var olmak stok oda sıcaklığında ve protokol burada duraklatıldı.</li>
</ol> 8. Tasarım ve sondalar doğrulanması Not: dikkatli tasarım ve Kuzey leke probları doğrulanması güvenilir sonuçlar elde etmek ve diğer RNA türleri ile istenmeyen çapraz hibridizasyon önlemek için çok önemli.
<ol><li>Kullanım probları olarak kısa sentetik oligonucleotides. Sonda sıra faiz tRNA dizisi en benzersiz bir parçası için tamamlayıcı - bu kez antikodon döngü olduğunu bir şekilde Tasarla. 
	Not: Çeşitli organizmalar üzerinden tahmin edilen tRNA sıralarının listesini veritabanı (GtRNAdb) 21 genomik tRNA bulunabilir.</li>
	<li>Ayarlama bir tahmin almak için dizinin uzunluğunu erime sıcaklığı 55-65 ° c</li>
	<li>Patlama (temel yerel hizalama arama aracı) seçilmiş sıra sıra 22 içinde açıklandığı gibi seçili tRNA için benzersiz olduğunu doğrulamak için deneyde kullanılan bakteriyel zorlanma genom dizisi karşı. 
	Not: Tablo 1 E. coli K12 birkaç farklı tRNA için önerilen sonda serilerini listeler. Sonda faiz tRNA için belirli ise, sadece iki grup Kuzey leke (şarj edilmiş ve doldurulmamış tRNA) görünür ve yalnızca bir grup şeritte deacylated örnek (doldurulmamış tRNA) ile görülür. Daha--dan iki grup varsa veya daha fazla sonda özgüllük doğrulanmasını isterseniz, bkz.</li>
</ol> 9. Kuzey blot hibridizasyon Not: Aşağıdaki adımlarda, membran sırayla probları başvurusu için belirli bir sonda da dahil olmak üzere istediğiniz belirli tRNA tamamlayıcı ile melezleşmiştir tRNA selC.
<ol><li>Membran bir hibridizasyon tüpü yerleştirin ve 6 mL hibridizasyon çözüm ekleyin (0.9 M NaCl, 0,05 M NaH 2 PO 4 (pH 7,7), 5 mM EDTA, %0,5 (w/v) SDS, 100 mg/mL sheared ve denatüre ringa balığı sperm DNA ve 5 x Denhardt &#39; s çözüm (100 x Denhardt &#39; s çözüm % 2 sığır serum albümin, % 2 polyvinylpyrrolidone 40 ve % 2 = Ficoll)).</li>
	<li>Ön arabellek için 1S 42 ° C. Ekle 30 pmol radyoaktif oligo-DNA prob 5 dönen membran melezlemek &#39; - sonu - etiketli ile 32 (Sambrook et al. tarafından açıklandığı gibi hazırlanmış P 23) Not: dikkat, 32 P yüksek enerjili beta emisyonları önemli cilt ve göz doz tehlike sunabilirim. 32 s. radyoaktif atık kullanarak, uygun kurumsal güvenlik protokollerini göre atılmalıdır zaman gerekli tedbirleri alınmalıdır.</li>
	<li>Membran gece 42, dönen sonda kuluçkaya ° C. Kaldır tek kullanımlık 10 mL pipet kullanarak soruşturma. 
	Not: Eğer bir dolaba saklanan sonda kullanılabilmesinden.</li>
	<li>Hibridizasyon tüpte membran 0.3 M NaCl, 30 mM sodyum sitrat, % 0,1 (w/v) SDS oda sıcaklığında 50 mL kısa bir süre içinde yıkayın. 
	Not: Bu ilk yıkama çok ilişkisiz sonda içerir ve son derece olarak radyoaktif işlenmeli.</li>
	<li>Tekrar bir kez 9,4 adım, o zaman bir düz plastik konteyner veya bir kapak dahil olmak üzere tepsi membran taşıma. Yıkama solüsyonu (0.3 M NaCl, 30 mM sodyum sitrat, % 0,1 (w/v) SDS) membran kapak ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Yıkama çözüm değiştirin ve çamaşır kadar tatmin edici bir sinyal-gürültü oranı (, çözüm yıkama kez 3-4 değişiklikleri) elde etti. Nasıl boş bir alanı radyasyondan membran ölçerek gürültü oranı sinyal değişiklikleri algılamak ve nerede sonda özellikle tRNA melezleşmiştir alanına karşılaştırmak için bir Geiger-Müller tüpü kullanın.</li>
	Sonda zar maruz kaldıktan sonra şerit edebilmek için <li>emin olun (önemli) membran önce striptiz yordamı kurumasına olduğunu. Membran bir ince plastik torba veya sıkıca plastik kullanarak sarın ve hava-teyp veya kaynak tarafından sıkı sıkıya bağlanmanızı mühür şal yerleştirin. Mühürlü membran phosphorimaging ekrana koyun. 
	Not: Phosphorimaging ekrandaki gerekli çekim hızı belirlenir sonda, özel faaliyetin tarafından RNA miktarı fo probedr ve sonda ve can hibridizasyon etkinliğini büyük ölçüde değişir; birkaç gün için bir kaç dakika uzaklıktadır. Deneyimi ile membran Geiger-Müller tüpü ile algılanan radyasyon şiddetini gerekli çekim hızı iyi bir gösterge sağlar. Güvenilir miktar için ekran değil pozlanmış önemli.</li>
	<li>Bir lazer tarayıcı kullanarak phosphorimaging ekran tarama ve dosyaya kaydetmek &#34; .gel &#34; biçimi. 
	Not: Bir yüksek sinyal gürültü oranı güvenilir miktar için gereklidir. Bir tRNA sondalama iki bantlarında sonuçlanmalıdır; bir içeren aminoacylated tRNA (daha yavaş geçiş) ve bir içeren deacylated tRNA (daha hızlı geçiş). Bkz: Şekil 2.</li>
</ol> 10. Membran sıyırma Not: membran için başka bir tRNA probed önce önceki sonda ilk membran sıyırma tarafından kaldırılmalıdır.
Membran kapak ve membran dökmek için <ol><li>ısı yeterince sıyırma arabellek (15 mM NaCl, 1.5 mM sodyum sitrat, % 0,1 (w/v) SDS). 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>Tekrarlama adım 10.1 radyasyon yok kadar bir Geiger-Müller tüpü ile tespit; membran-ebilmek şimdi var olmak bölüm 9 açıklanan adımları izleyerek yeniden melezleşmiştir.</li>
</ol> 11. TRNA miktarının ve düzeyleri şarj <ol><li>yükü görüntüleme .gel dosyasına yazılım (Tablo reçetesi görmek). Nereye sinyal 3A rakam gösterildiği gibi düzensiz, olabilir bu yolun genişliğini çoğunu yayılmıştır ancak bantları kenarları hariç böyle bir şekilde her örnek yolları boyunca dikey bir çizgi çizmek.</li>
	<li>Visualize'ı tıklatarak her şeritli gelen sayar &#34; analiz &#34;-&#62; &#34; grafik oluşturmak &#34;. Şarj edilmiş ve doldurulmamış tRNA her şeritli gelen temsil eden iki doruklarına şekil 3B ' gösterildiği gibi tanımlarken.</li>
	<li>Edinmek sayıları her ayında en yüksek tıklatarak &#34; analiz &#34;-&#62; &#34; alan rapor &#34; ve her iki doruklarına altına alan kayıt.</li>
	Ne zaman leke tRNA selC ve en az bir tRNA ilgi için probed <li>tRNA tRNA selC ilgi düzeyleri normale.
	<ol><li>Her şeritte spike hücreler kaynaklanan tRNA oranını hesaplamak ve toplam sinyal denklemi kullanarak bu şeritte değerden çıkarmak: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56212/56212eq3.jpg" /> Not: Burada, Örnek tRNA bir tek şeritli bir membran için istenen tRNA; probed elde edilen sinyal = Örnek selC tRNA selC için; probed aynı membran aynı lane elde edilen sinyal = Ref tRNA için istenen tRNA; probed aynı membran hücre yalnızca spike içinde RNA içeren lane elde edilen sinyal = Ref selC tRNA selC için probed aynı membran hücre yalnızca spike içinde RNA içeren lane elde edilen sinyal =.</li>
		Normalize etmek <li>tRNA selC sinyal aynı Lane tarafından düzeltilen tRNA değeri her Lane bölmek. 
		Not: tRNA selC sinyal katkısı örneklenen hücrelerden ihmal edilebilir düzeydedir (bkz: Şekil 2, lane etiketli &#34;-selC &#34;).</li>
	</ol></li> <li>Her iki zirveleri sinyal toplamı ile dolu tRNA temsil eden en yüksek sinyal bölerek düzeyinde her lane için şarj oluyor tRNA hesaplamak (ücret + doldurulmamış).</li></ol>

<ol>
	<li>Varshney, U., Lee, C. -. P., RajBhandary, U. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+aminoacylation+levels+of+tRNAs+in+vivo.+Application+to+studying+recognition+of+Escherichia+coli+initiator+tRNA+mutants+by+glutaminyl-tRNA+synthetase.">Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase.</a> J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).</li><li>Sorensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel(+)+and+Rel(-)+strains+during+amino+acid+starvation:+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy.">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).</li><li>Kr&#252;ger, M. K., S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoacylation+of+hypomodified+tRNAGlu+in+vivo.">Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo.</a> J. Mol. Biol. 284 (3), 609-620 (1998).</li><li>Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Mu&#241;oz-G&#243;mez, A. J., S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNA+is+highly+unstable+during+early+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).</li><li>Enriquez, J. A., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+aminoacylation-induced+conformational+changes+in+human+mitochondrial+tRNAs.">Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).</li><li>Parker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+and+alternatives+in+reading+the+universal+genetic+code.">Errors and alternatives in reading the universal genetic code.</a> Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).</li><li>Traxler, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global,+ppGpp-mediated+stringent+response+to+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).</li><li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNAs+Mediate+the+Rapid+Adaptation+of+Escherichia+coli+to+Oxidative+Stress.">Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress.</a> PLoS Genet. 11 (6), e1005302 (2015).</li><li>Kane, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rare+codon+clusters+on+high-level+expression+of+heterologous+proteins+in+Escherichia+coli.">Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli.</a> Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).</li><li>Baca, A. M., Hol, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+codon+bias:+a+method+for+high-level+overexpression+of+Plasmodium+and+other+AT-rich+parasite+genes+in+Escherichia+coli.">Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli.</a> Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).</li><li>Li, S., Pelka, H., Schulman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anticodon+and+discriminator+base+are+important+for+aminoacylation+of+Escherichia+coli+tRNA+(Asn).">The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn).</a> J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).</li><li>Rizzino, A. A., Freundlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+in+vivo+aminoacylation+by+periodate+oxidation:+tRNA+alterations+and+iodate+inhibition.">Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition.</a> Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).</li><li>Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation.">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li><li>Zhou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+reference+genes+for+quantifying+transcriptional+responses+of+Escherichia+coli+to+protein+overexpression+by+quantitative+PCR.">Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR.</a> BMC Mol Biol. 12 (1), 18 (2011).</li><li>Jacobson, A., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+events+occurring+during+recovery+from+prolonged+glucose+starvation+in+Escherichia+coli.">Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).</li><li>McCarthy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+magnesium+starvation+on+the+ribosome+content+of+Escherichia+coli.">The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).</li><li>Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+ribosome+degradation+during+starvation+in+Escherichia+coli.">Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli.</a> Rna. 15 (5), 977-983 (2009).</li><li>Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+degradation+in+growing+bacteria.">Ribosome degradation in growing bacteria.</a> EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).</li><li>Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependency+on+medium+and+temperature+of+cell+size+and+chemical+composition+during+balanced+grown+of+Salmonella+typhimurium.">Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium.</a> J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentrations+of+ppGpp+decrease+the+RNA+chain+growth+rate.+Implications+for+protein+synthesis+and+translational+fidelity+during+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli.</a> J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).</li><li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Curtailing+of+the+Stringent+Response+by+Toxin-Antitoxin+Module-Encoded+mRNases.">Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases.</a> J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı aynı anda belirli E. coli şarj düzeyini ölçmek açıklar tRNA ve farklı örneklerinde tRNA göreli düzeyleri karşılaştırın. 1) örnekleri hücresel tRNA şarj düzeyleri, 2) tRNA miktarları göreli tRNA düzeyleri farklı örneklerinde güvenilir bir şekilde karşılaştırılabilir şekilde normale ve sp 3) tutulduğunu böyle bir şekilde işlemek için protokol kritik noktaları vardır tRNA ilgi için seçili sonda ecificity. Bu noktalar aşağıda ayrı ayrı ele alınmakt...

Aşağıda, biz belirli tRNA miktarının bir yöntem mevcut ve kendi şarj ölçme düzeyleri Kuzey Blot tarafından. Bu yöntem ilk Varshney vd tarafından geliştirilen bir teknik üzerinde dayanır 1. hücre trichloroacetic asit (TCA) hasat ve RNA arıtma boyunca 0 ° C'de örnekleri tutmak, korunmuş2,3,4arasında tRNA ve amino asit ester bağı olduğunu. Aminoacylated tRNA nonacylated karşılıkları Jel Elektroforez ve seçkin Kuzey kurutma, tarafından kusura bakmayın ama aminoacylated azalmış bir hareketlilik için tRNA kovalent bağlı amino asit5tarafından neden jel içinde. Ayrıca, biz tRNA miktarları sık kullanılmayan tRNAselC 4overexpressing spike hücreler ilavesi ile normalize için bir iletişim kuralı mevcut.
tRNA bakteri hücre ve çeviri makineleri kesinlikle hayati bir parçası en bol moleküllerin bazıları. tRNA amino asitleri bağlama ve çeviri ribozomlara aktarabilirsiniz. Aminoasitler tRNA (aminoacylation veya şarj) için bağlama aminoasil tRNA sentetaz tarafından yönetilir. Farklı ücret tRNA göreli bolluk protein sentezi, kalitesini sağlamak için önemli çünkü tRNA için verilen mesajcı RNA (mRNA) kodon konağımız yakınındaki tRNA eşitlenmesi olasılığını artırır konağımız underrepresentation tahsil Yanlışlıkla onun amino asit büyüyen polipeptid zinciri ribozom6teslim. Şarj edilmiş tRNA önemini E. coli hücre geniş yanıt bir tRNA şarj düzeyleri ciddi bir düşüş olarak yansıtılır; sıkı yanıt. Sıkı tepki sırasında tRNA, ribozomal RNA'ların ve çoğu mRNA sentezi, amino asit biyosentezi ve stres hayatta kalma ile ilişkili belirli mRNA'lar transkripsiyon lehine indirilir ve hücrelerin büyüme oranı önemli ölçüde düşürdü7 . Ayrıca, bize ve diğerleri tarafından son iş E. coli aktif tRNA düzeyleri ayarlama olabileceğini düşündüren onun tRNA yanıt olarak çeviri4,8, limit gerilmeler çoğunluğu düşürür gösterdi Böyle stres ile başa çıkma için önemli. Böylece, güvenilir ölçümler tRNA zenginliği ve düzeyleri şarj tamamen bakteriyel stres yanıt-e doğru anlamak için önemli bir araç olacak.
E.coli rekombinant protein hızlı için yaygın olarak kullanılır ve türler arasında kodon kullanım farklılıkları nedeniyle bir sorun kez karşı karşıya9suboptimal ifadesidir. Bu ek tRNA rekombinant mRNA10çevirmek için gerekli ifade tarafından atlatılabilir. Böyle suşları seviyelerinde şarj tRNA ölçümleri sorun giderme çabaları rehberlik ve protein ifade en iyi duruma getirmek.
Bu yöntem, aynı zamanda "mischarging"; algılama sağlar Konağımız olmayan amino asit ile bir tRNA molekül aminoacylated. Farklı amino asitler tarafından Aminoacylation-polyacrylamide jeller1,11biraz farklı hızları ile geçirilecek bir tRNA neden olabilir. Bazı durumlarda, yöntem aynı zamanda aksi takdirde aynı tRNA3farklı değişiklik desenleri ayırt etmek için kullanılabilir.
Düzeyleri şarj tRNA incelenmesi olduğunu periodate için oksidasyon başka bir biyokimyasal yordamı kurdu. TRNA korunuyorsunuz aminoacylated periodate oksidasyon ve doldurulmamış tRNA değil gözlem yöntemi kullanır. Sonra tRNA şarj şarj düzeyleri hasat RNA'ın tahmin etmek için kullanılan oksidasyon tedavi periodate. Ancak, birkaç tRNA şarj böylece biraz yanlışlık12-mek şartıyla tedavi tarafından etkilendiği gösterilmiştir. Yöntem burada doğrudan saf RNA şarj, böylece herhangi bir önyargıları kimyasal veya enzimatik reaksiyonlar hariç önlemler sundu. Bu yöntemin bir sınırlama yalnızca bir o tRNA türler algılandığında bir zamanda, öylesine her ne kadar aynı Kuzey leke-ebilmek var soymak ve birden çok tRNA için reprobed zaman alan ve pek çok tRNA üzerinde veri toplamak biraz zahmetli olması.
Örnekleri birbirlerine normalleştirme için güvenilir bir yol hedefi farklı örnekler üzerindeki göreli bir molekül düzeyde karşılaştırmak için nerede çalışmalarda önemlidir. Burada küçük bir aliquot nadir tRNAselC overexpressing E. coli hücre içinde bir spike RNA arıtma önce deneysel örnekleri eklendiği RNA için normalleştirme işlemi tanıtmak. Bu yöntem sadece tRNA incelerken ama RNA'ın herhangi bir türün göreli miktar için deneysel Kur öyle ki hiçbir endojen RNA olmak güvenilir olabilir ne zaman tüm örnekleri aynı hücresel konsantrasyon mevcut yararlı olur. Örneğin, göreli miktarları arasında farklı başka bir RNA'ın karşılaştırmak için endojen bir başvuru13örnekleri gibi bir "temizlik" RNA gibi ribozomal RNA düzeyini kez kullanılır. Ama örnekleme bir stres yanıt15,16,17 veya sırasında oluşursa ribozomal RNA için durum olabilir gibi bu küçük kullanımı başvuru RNA hücresel konsantrasyonu örnekleri arasında değişir durağan faz17girmesinden. Spike hücreler RNA arıtma önce deneysel örnekleri için ek normalleştirme örnekleme kurulumunu bağımsız sağlam ve doğru bir yol sağlar. Başka bir belirli bir veya daha fazla spike içinde RNA'ların deneysel örnekleri eklenmesinden sonra RNA arınma yoludur. Ancak, bu yöntem için RNA kurtarma farklılıklarını örnekler arasındaki hesap değil.
E. coli hücreleri kullanarak bir deneyde E. coli olarak (bkz: şekil 1) spike hücreler olarak RNA gönderme yapıyor bunun dezavantajı o overexpress Ayrıca eksojen E. coli az miktarda toplam RNA örnekleri. Biz bu ek için yalnızca spike hücreler (bkz. Şekil 2, lane "selC" etiketli leke Kuzey) deneysel örnekleri ile paralel olarak içeren bir örnek analiz ederek doğru. Sunulan protokolü E. coli K-12 için geliştirilmiş ancak çoğu bakteriyel türler için geçerli olması muhtemeldir.

<table><tbody><tr><td>Urea</td><td>Merck</td><td>57-13-6</td><td>Purity &gt;99%</td></tr><tr><td>Polyacrylamide</td><td>Serva</td><td>79-06-7</td><td></td></tr><tr><td>Bis (N,N&#039;-Methylene-bis-acrylamide)</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0201</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid (TCA)</td><td>Sigma</td><td>76-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Merck</td><td>108-95-2</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Citrate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Herring Sperm DNA</td><td>Sigma</td><td>100403-24-5</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polivinylpyrrolidone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P32 &amp;gamma;ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA oligos (probes)</td><td>TAG Copenhagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybond N&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; membrane</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Crosslinker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electroblotter</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000 Scanner</td><td>GE Healthcare</td><td>28955809</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydridization oven</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geiger-M&amp;uuml;ller tube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphor imager screen</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybridization tube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Culture Flasks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ml centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantification of the abundance and charging levels of transfer rnas in escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) herhangi bir canlı translasyonel makinelerin önemli bir parçasıdır. tRNA bağlamak ve amino asitler için çeviri ribozom aktarın. Farklı tRNA göreli seviyeleri ve aminoacylated oranı tRNA toplam tRNA, şarj düzeyi olarak bilinen için doğruluk ve çeviri hızını belirlemede önemli faktörlerdir. Bu nedenle, bolluk ve şarj tRNA düzeyde protein sentezi, örneğin çeşitli stres koşullarında okurken ölçmek için önemli değişkenlerdir. Burada, tRNA hasat ve doğrudan göreli bereket ve Escherichia colibelirli tRNA türler mutlak şarj düzeyini ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. TRNA tRNA ve onun amino asit arasında değişken bağ korunmuş şekilde hasat edilir. RNA sonra Jel Elektroforez ve kurutma, ücret ve doldurulmamış tRNA ayrılması hangi sonuçlar Kuzey tabi tutulur. Normalleştirme spike hücreler ilavesi nedeniyle farklı örneklerinde belirli tRNA düzeyde karşılaştırılabilir. Önce RNA arıtma, her örnek için nadir tRNAselC yatırıma E. coli hücrelerinin % 5 ekleyin. Bir örnek ilgi tRNA tür miktarı o zaman tRNAselC aynı örnek miktarı için normalleştirilmiş. Ayrıca spike hücreler RNA arıtma önce Ayrıca hücre lizis verimliliği tüm farklılıkları örnekleri arasında için hesaplar arıtılmış spike bileşenini RNA'lar ek avantajı vardır.

Yordamı kullanarak burada, bereket ve üç tRNA düzeyde E. coli K-12 öncesi ve amino asit açlık sırasında ölçüldü şarj açıklanır.
Arginin auxotroph süzün NF9154 (thr Leyi onun argH thi mtl supE44) BEZLERİ en az orta % 0,4 gliserol, 50 µg/mL treonin, lösin, arginin ve 5 µg/mL histidin, sallayarak 37 ° C'de ile takıma en az on nesiller için yetiştirilen oldu 160 d/...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli at JoVE.com

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Miktar bolluk ve Escherichia coli olarak Transfer RNA'ların düzeyde şarj

Burada doğrudan transfer RNA transfer RNA'ın göreli düzeyleri, ya da herhangi bir kısa diğer RNA, spike-in toplama göre farklı örnekleri arasında karşılaştırmak için bir yol yanı sıra arıtılmış Escherichia coli RNA düzeyleri şarj ölçmek için bir yöntem mevcut hücre başvurusu gen ifade.

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

quantification-abundance-charging-levels-transfer-rnas-escherichia

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

9.2K Görüntüleme.  University of Copenhagen. Burada doğrudan transfer RNA transfer RNA'ın göreli düzeyleri, ya da herhangi bir kısa diğer RNA, spike-in toplama göre farklı örnekleri arasında karşılaştırmak için bir yol yanı sıra arıtılmış Escherichia coli RNA düzeyleri şarj ölçmek için bir yöntem mevcut hücre başvurusu gen ifade.

Video: Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Genetik

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for protein synthesis by translating codons in mRNA into amino acid sequences. tRNAs were long considered as house-keeping molecules that lacked regulatory functions. However, a growing body of evidence indicates that cellular tRNA levels fluctuate in correspondence to varying conditions such as cell type, environment, and stress. The fluctuation of tRNA expression directly influences gene translation, favoring or repressing the expression of particular proteins. Ultimately comprehending the dynamic of protein synthesis requires the development of methods able to deliver high-quality tRNA profiles. The method that we present here is named SPOt, which stands for Streamlined Platform for Observing tRNA. SPOt consists of three steps starting with metabolic labeling of cell cultures with radioactive orthophosphate, followed by guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction of radioactive total RNAs and finally hybridization on in-house printed macroarrays. tRNA levels are estimated by quantifying the radioactivity intensities at each probe spot. In the protocol presented here we profile tRNAs in Mycobacterium smegmatis mc2155, a nonpathogenic bacterium often used as a model organism to study tuberculosis.

We describe an original transfer RNA analysis platform named SPOt (Streamlined Platform for Observing tRNA). SPOt simultaneously measures cellular levels of all tRNAs in biological samples, in only three steps, and in less than 24 hours.

Metabolik etiketleme ve Transfer RNA Macroarrays kullanarak profil oluşturma

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Bakterilerde protein RNA bağlayıcı ölçümü için bir tahlil

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

AQRNA-seq Kullanarak tRNA Dinamiklerini Analiz Etme

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate quantification of the pool of small RNAs. The AQRNA-seq library preparation procedure described here involves the use of custom-designed sequencing linkers and a step for reducing methylation RNA modifications that block reverse transcription processivity, which results in an increased yield of full-length cDNAs. In addition, a detailed implementation of the accompanying bioinformatics pipeline is presented. This demonstration of AQRNA-seq was conducted through a quantitative analysis of the 45 tRNAs in Mycobacterium bovis BCG harvested on 5 selected days across a 20-day time course of nutrient deprivation and 6 days of resuscitation. Ongoing efforts to improve the efficiency and rigor of AQRNA-seq will also be discussed here. This includes exploring methods to obviate gel purification for mitigating primer dimer issues after PCR amplification and to increase the proportion of full-length reads to enable more accurate read mapping. Future enhancements to AQRNA-seq will be focused on facilitating automation and high-throughput implementation of this technology for quantifying all small RNA species in cell and tissue samples from diverse organisms.

Yazar Spotlight: Küçük RNA'ların Haritalanmasında ve Protein Translasyon Mekanizmalarının Çözülmesinde AQRNA-seq Rolü

Absolute quantification RNA sequencing (AQRNA-seq) is a technology developed to quantify the landscape of all small RNAs in biological mixtures. Here, both the library preparation and data processing steps of AQRNA-seq are demonstrated, quantifying changes in the transfer RNA (tRNA) pool in Mycobacterium bovis BCG during starvation-induced dormancy.

Küçük RNA'ları Ölçmek için AQRNA-seq

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of this method, in comparison to other approaches, is its ability to monitor translation by precisely mapping the position and number of ribosomes on a mRNA transcript.
In this article, we describe the consecutive stages of sample collection and preparation for RIBO-seq method in bacteria, highlighting the details relevant to the planning and execution of the experiment.
Since the RIBO-seq relies on intact ribosomes and related mRNAs, the key step is rapid inhibition of translation and adequate disintegration of cells. Thus, we suggest filtration and flash-freezing in liquid nitrogen for cell harvesting with an optional pretreatment with chloramphenicol to arrest translation in bacteria. For the disintegration, we propose grinding frozen cells with mortar and pestle in the presence of aluminum oxide to mechanically disrupt the cell wall. In this protocol, sucrose cushion or a sucrose gradient ultracentrifugation for monosome purification is not required. Instead, mRNA separation using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by the ribosomal footprint excision (28-30 nt band) is applied and provides satisfactory results. This largely simplifies the method as well as reduces the time and equipment requirements for the procedure. For library preparation, we recommend using the commercially available small RNA kit for Illumina sequencing from New England Biolabs, following manufacturer&#39;s guidelines with some degree of optimization.
The resulting cDNA libraries present appropriate quantity and quality required for next generation sequencing (NGS). Sequencing of the libraries prepared according to the described protocol results in 2 to 10 mln uniquely mapped reads per sample providing sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is quick and relatively easy and can be performed with standard laboratory equipment.

Here we describe the stages of sample collection and preparation for RIBO-seq in bacteria. Sequencing of the libraries prepared according to these guidelines results in sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is simple, uses standard laboratory equipment and takes seven days from lysis to obtaining libraries.

Bakterilerde RIBO-seq: NGS Dizilimi için Örnek Toplama ve Kütüphane Hazırlama Protokolü

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Biyokimya

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

Degrade Yapıcılar veya Fraksiyonasyon Sistemleri Olmadan Polizom Profilleme

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene transcripts from infected tissues. Pathogen RNA constitutes a tiny portion of the total RNA isolated from infected tissue samples. Both microarray and RNAseq technologies have difficulties in generating reliable reads for weakly expressed pathogen genes. Mutant pathogen strains with reduced in vivo proliferation pose an even bigger challenge. Here we describe an in vivo gene expression profiling protocol that is very fast, extremely sensitive and highly reproducible. We developed this protocol during our investigation of the fungal pathogen Candida albicans in a murine model of hematogenously disseminated candidiasis. Using this protocol, we have documented time courses of dynamically regulated C. albicans gene expression during kidney infection, and discovered unexpected features of gene expression responses to antifungal drug treatment in vivo.

We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

Dijital Çizgi-kodlama Platform&#39;u kullanarak bulaşmasını Mikroplar Gen İfadesi profil

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

Mikroarray&#39;ler kullanarak tRNA Aminoacylation (Şarj) Seviyeler genom Analizi

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Miktar bolluk ve Escherichia coli olarak Transfer RNA'ların düzeyde şarj

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Metabolik etiketleme ve Transfer RNA Macroarrays kullanarak profil oluşturma

Bakterilerde protein RNA bağlayıcı ölçümü için bir tahlil

Küçük RNA'ları Ölçmek için AQRNA-seq

Küçük RNA'ları Ölçmek için AQRNA-seq

Küçük RNA'ları Ölçmek için AQRNA-seq

Bakterilerde RIBO-seq: NGS Dizilimi için Örnek Toplama ve Kütüphane Hazırlama Protokolü

Degrade Yapıcılar veya Fraksiyonasyon Sistemleri Olmadan Polizom Profilleme

Dijital Çizgi-kodlama Platform'u kullanarak bulaşmasını Mikroplar Gen İfadesi profil

Mikroarray'ler kullanarak tRNA Aminoacylation (Şarj) Seviyeler genom Analizi