Этот метод позволяет записывать и количественной оценки нейронной активности в мышиных двусторонних корковых регионах в течение длительного периода in vivo. Преимущество двух фотонной техники заключается в одновременном обнаружении активности в большой или рассеянной популяции нейронов в течение длительного периода времени. Последствия этого метода распространились на исследование моделей активности в определенных нейронных популяциях в различных областях живого мозга.
За 12 часов до начала процедуры прогреть оптические окна при 50 градусах цельсия при 70%этаноле. Оптическое окно состоит из круглого пятимиллиметрового диаметра верхнего стекла крышки и нижней части, содержащей круглое стекло крышки диаметром три миллиметра. В конце потепления инкубации, подтвердить отсутствие реакции на боль в глаза щепотку на анестезированной 20 до 25-граммовой 1 1/ 2 до 2 1 / 2 месяца Thy1 GCaMP6s мыши, и применить мазь на глазах животного.
Поместите мышь на грелку, покрытую стерильной шторой, и используйте адаптер для головы для мышей, чтобы стабилизировать голову. Бритье большую часть кожи головы с двойной кромки бритвы, и очистить открытые кожи с последовательными стерильных спирта подготовки колодки и povidone-йод раствор скрабы. Затем используйте ножницы, чтобы сделать прямоугольный два на три миллиметра вырезать в кожу головы на правой стороне черепа.
Используя ватный тампон, отодвините кожу в сторону, чтобы создать область воздействия более трех миллиметров в диаметре, и используйте тупой микрохирургический лезвие, чтобы аккуратно удалить соединительной ткани, прикрепленной к черепу. С помощью зубной дрели аккуратно отметите круг диаметром три миллиметра вокруг области S1. Сделав аналогичный круг на левой стороне черепа, нанесите тонкий слой цианоакрилатного суперклея на обе стороны кости, чтобы обеспечить основу для применения зубного цемента.
Под рассечением микроскопа используйте высокоскоростную микробуру, чтобы разбвести круговую канавку в правой части черепа вокруг области S1, чтобы создать гладкий край, аспирируя костный мусор вакуумом по мере необходимости. После того, как примерно 2/3 глубины кости была достигнута, медленно и тщательно разжижает оставшиеся 1/3 кости до тех пор, пока круговой лоскут кости не будет полностью освобожден от окружающего черепа. Используйте пару 5/45 типсов, чтобы медленно и осторожно удалить круговой кусок кости, чтобы разоблачить дуру, заботясь, чтобы избежать повреждения пиальных сосудов.
После удаления костного лоскута с левой стороны черепа таким же образом, промыть оптическое окно для правой стороны черепа стерильным солевым раствором, и проверить на несовершенство под стерео микроскопом. Установите оптическое окно над областью краниотомии с верхней частью окна, опираясь на череп, и нижней частью внутри краниотомизного отверстия, опираясь на дуру, в присутствии спинномозговой жидкости. Используйте цианоакрилат суперклей, чтобы запечатать верхнюю часть оптического края окна к черепу.
Когда клей высохнет, нанесите черный зубной цемент на край стекла, остальную часть правой стороны открытого черепа, и раны поля, чтобы заблокировать свет. Затем установите левое оптическое окно и позвольте животному восстановиться с мониторингом до полного лежачих времени. Через семь-десять дней после процедуры поместите обезболивающее животное в головной адаптер на грелке под двухкороновым микроскопом, заботясь о том, чтобы оптическое окно и правая сторона черепа были ориентированы перпендикулярно оптической оси микроскопа.
Приобрети исходное изображение эталонной карты черепного окна с помощью ярко-полевого освещения при четырехзамеженном увеличении. После получения нескольких изображений одной и той же области интереса, изображение динамики кальция в области S1 в левом полушарии и рассчитать изменения в флуоресценции из каждой области интереса по обе стороны черепа. На этих репрезентативных снимках дендриты и кровеносный сосуд в мыши, выражаюной EGFP, были визуализированы на разных глубинах во слое два региона S1 на следующий день после установки оптического окна.
Изображения проекции были сняты в первые и семь дней после имплантации оптического окна, иллюстрируя удивительно стабильное количество и расположение дендритных ветвей и шипов в течение экспериментального периода. Измерение внутриклеточного кальция, преходящем у трансгенных мышей Thy1 GCaMP6s, позволяет количественно оценить спонтанную активность кальция и популяции пяти пирамидальных нейронов слоя, расположенных на глубине более 500 микрометров ниже пиа, а также расчет среднего количества спонтанных реакций с течением времени. Исследователь, обученный как подготовке черепного окна, так и двухкороновой визуализации кальция, должен иметь возможность получать записи от 100 до 200 нейронов по обе стороны черепа от одного до двух животных в день.
С открытым оптическим окном на каждой стороне черепа, метод позволяет записывать нейронную активность через симметричные области мозга млекопитающих для длительной и стабильной визуализации кальция in vivo. Этот метод также может быть использован для изучения корковой активности и пластичности после одностороннего повреждения периферической или центральной нервной системы. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как установить двусторонние черепные окна для измерения динамики кальция с помощью двух-фотон микроскопа в Thy1 GCaMP6s трансгенных мышей.
