Questo metodo consente la registrazione e la quantificazione dell'attività neurale attraverso le regioni corticali bilaterali del topo per un periodo prolungato in vivo. La tecnica dei due fotoni ha il vantaggio di rilevare l'attività simultaneamente in una popolazione neuronale grande o dispersa per un lungo periodo. Le implicazioni di questa tecnica si estendevano verso lo studio dei modelli di attività in popolazioni neuronali definite in diverse regioni del cervello vivente.
12 ore prima di iniziare la procedura, riscaldare le finestre ottiche a 50 gradi Celsius in 70%etanolo. Una finestra ottica è costituita da un vetro di copertura superiore rotondo di cinque millimetri di diametro e una porzione inferiore contenente un vetro di copertura rotondo di tre millimetri di diametro. Alla fine dell'incubazione riscaldante, confermare una mancanza di risposta al dito del dito su un topo Thy1 GCaMP6s anestetizzato da 20 a 25 grammi da 1 1/2 a 2 1/2 mese e applicare un unguento agli occhi dell'animale.
Posizionare il mouse su un tappetino riscaldante coperto da un drappo sterile e utilizzare un adattatore per la tenuta della testa per i topi per stabilizzare la testa. Radere la maggior parte del cuoio capelluto con un rasoio a doppio bordo e pulire la pelle esposta con tamponi sequenziali sterili per la preparazione dell'alcol e scrub per soluzioni di povidone-iodio. Quindi usa un paio di forbici per fare un taglio rettangolare di due per tre millimetri nel cuoio capelluto sul lato destro del cranio.
Utilizzando un batuffolo di cotone, spingere la pelle da parte per creare un'area di esposizione di diametro superiore a tre millimetri e utilizzare una lama microchirurgica smussata per rimuovere delicatamente il tessuto connettivo attaccato al cranio. Con un trapano dentale, contrassegnare delicatamente un cerchio di tre millimetri di diametro intorno all'area S1. Dopo aver fatto un cerchio simile sul lato sinistro del cranio, applicare un sottile strato di supercolla cianoacrilato su entrambi i lati dell'osso per fornire una base per un'applicazione di cemento dentale.
Al microscopio sezionato, utilizzare un micro trapano ad alta velocità per assottigliare una scanalatura circolare sul lato destro del cranio intorno all'area S1 per creare un bordo liscio, aspirando i detriti ossei con un vuoto se necessario. Dopo aver raggiunto una profondità ossea di circa 2/3, assottigliare lentamente e con cura il restante 1/3 di osso fino a quando un lembo osseo circolare non è stato completamente liberato dal cranio circostante. Utilizzare un paio di pini 5/45 per rimuovere lentamente e con cura il pezzo circolare di osso per esporre la dura, facendo attenzione a evitare di danneggiare i vasi piali.
Dopo aver rimosso un lembo osseo dal lato sinistro del cranio nello stesso modo, sciacquare la finestra ottica per il lato destro del cranio con soluzione salina sterile e verificare la presenza di imperfezioni sotto un microscopio stereo. Installare la finestra ottica sulla regione craniotomica con la parte superiore della finestra appoggiata sul cranio e la parte inferiore all'interno dell'apertura craniotomizzata, appoggiata sulla dura, in presenza di liquido spinale cerebrale. Utilizzare la supercolla cianoacrilato per sigillare la parte superiore del bordo ottico della finestra al cranio.
Quando la colla si è asciugata, applicare il cemento dentale nero sul bordo del vetro, sul resto del lato destro del cranio esposto e sui margini della ferita per bloccare la luce. Quindi installare la finestra ottica sinistra e consentire all'animale di riprendersi con il monitoraggio fino alla piena rimortiquenza. Da sette a 10 giorni dopo la procedura, posizionare l'animale anestetizzato nell'adattatore per la tenuta della testa su una pastiglia riscaldante al microscopio a due fotoni, facendo attenzione che la finestra ottica e il lato destro del cranio siano orientati perpendicolarmente all'asse ottico del microscopio.
Acquisire un'immagine iniziale della mappa di riferimento della finestra cranici utilizzando l'illuminazione a campo luminoso al quattro volte l'ingrandimento. Dopo aver acquisito più immagini della stessa regione di interesse, immaginiamo la dinamica del calcio all'interno dell'area S1 nell'emisfero sinistro e calcola i cambiamenti nella fluorescenza da ogni regione di interesse su entrambi i lati del cranio. In queste immagini rappresentative, i dendriti e un vaso sanguigno all'interno di un topo che esprime EGFP sono stati visualizzati a diverse profondità nello strato due della regione S1 un giorno dopo l'installazione della finestra ottica.
Le immagini della proiezione Z sono state catturate nei giorni uno e sette dopo l'impianto della finestra ottica, illustrando un numero notevolmente stabile e la posizione di rami dendritici e spine nel periodo sperimentale. La misurazione del transitore intracellulare di calcio nei topi transgenici Thy1 GCaMP6s consente la quantificazione dell'attività spontanea del calcio e delle popolazioni di neuroni piramidali di livello cinque situati profondi fino a 500 micrometri sotto la pia, nonché il calcolo del numero medio di risposte spontanee nel tempo. Un ricercatore addestrato sia nella preparazione della finestra cranica che nelle tecniche in vivo di imaging del calcio a due fotoni dovrebbe essere in grado di ottenere registrazioni di 100-200 neuroni su entrambi i lati del cranio in uno o due animali al giorno.
Con una finestra ottica aperta su ciascun lato del cranio, il metodo consente la registrazione dell'attività neurale attraverso le regioni simmetriche del cervello dei mammiferi per l'imaging di calcio prolungato e stabile in vivo. Questo metodo può anche essere utilizzato per studiare l'attività corticale e la plasticità dopo lesioni unilaterali al sistema nervoso periferico o centrale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come installare finestre cranici bilaterali per misurare la dinamica del calcio usando il microscopio a due fotoni nei topi transgenici Thy1 GCaMP6s.
