Este método permite el registro y cuantificación de la actividad neuronal a través de regiones corticales bilaterales del ratón durante un período prolongado in vivo. La técnica de los dos fotónicos tiene la ventaja de detectar actividad simultáneamente en población neuronal grande o dispersa durante un período prolongado. Las implicaciones de esta técnica se extendieron hacia la investigación de patrones de actividad en poblaciones neuronales definidas en diferentes regiones del cerebro vivo.
12 horas antes de comenzar el procedimiento, calentar las ventanas ópticas a 50 grados Celsius en 70%etanol. Una ventana óptica consiste en un vidrio redondo de la cubierta superior de cinco milímetros de diámetro y una parte inferior que contiene un vidrio redondo de cubierta de tres milímetros de diámetro. Al final de la incubación del calentamiento, confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie en un ratón anesthetizado de 20 a 25 gramos 1 1/2 a 2 1/2 mes de edad Thy1 GCaMP6s de edad, y aplicar ung mento a los ojos del animal.
Coloque el ratón sobre una almohadilla de calentamiento cubierta con una cortina estéril y utilice un adaptador de sujeción de la cabeza para que los ratones estabilicen la cabeza. Afeita la mayor parte del cuero cabelludo con una maquinilla de afeitar de doble filo, y limpia la piel expuesta con almohadillas de preparación de alcohol estéril secuencial y exfoliaciones de solución de povidona-yodo. Luego usa un par de tijeras para hacer un corte rectangular de dos por tres milímetros en el cuero cabelludo en el lado derecho del cráneo.
Usando un hisopo de algodón, empuje la piel a un lado para crear un área de exposición de más de tres milímetros de diámetro, y utilice una hoja microquirúrgica contundente para eliminar suavemente el tejido conectivo unido al cráneo. Con un taladro dental, marque suavemente un círculo de tres milímetros de diámetro alrededor del área S1. Después de hacer un círculo similar en el lado izquierdo del cráneo, aplicar una fina capa de superpegamento de cianoacrilato a ambos lados del hueso para proporcionar una base para una aplicación de cemento dental.
Bajo un microscopio de disección, utilice un micro taladro de alta velocidad para adelgazar una ranura circular en el lado derecho del cráneo alrededor del área S1 para crear un borde liso, aspirando los desechos óseos con un vacío según sea necesario. Después de que se haya logrado una profundidad ósea de aproximadamente 2/3, adelgaza lentamente y cuidadosamente el 1/3 restante de hueso hasta que un colgajo circular del hueso se haya liberado completamente del cráneo circundante. Utilice un par de fórceps de 5/45 para retirar lentamente y cuidadosamente la pieza circular de hueso para exponer la dura, teniendo cuidado de evitar dañar los vasos pial.
Después de extraer un colgajo óseo del lado izquierdo del cráneo de la misma manera, enjuague la ventana óptica para el lado derecho del cráneo con solución salina estéril, y compruebe si hay imperfecciones bajo un microscopio estéreo. Instale la ventana óptica sobre la región de craneotomía con la parte superior de la ventana apoyada en el cráneo y la parte inferior dentro de la abertura craneotomizada, descansando sobre la dura, en presencia de líquido cefalorraquídeo. Utilice el superpegamento de cianoacrilato para sellar la parte superior del borde de la ventana óptica al cráneo.
Cuando el pegamento se haya secado, aplique cemento dental negro en el borde del vidrio, el resto del lado derecho del cráneo expuesto y los márgenes de la herida para bloquear la luz. A continuación, instale la ventana óptica izquierda y permita que el animal se recupere con monitoreo hasta la recumbencia completa. Siete a 10 días después del procedimiento, coloque el animal anestesiado en el adaptador de sujeción de la cabeza en una almohadilla de calentamiento bajo un microscopio de dos fotones, teniendo cuidado de que la ventana óptica y el lado derecho del cráneo estén orientados perpendicularmente al eje óptico del microscopio.
Adquiera una imagen de mapa de referencia inicial de la ventana craneal utilizando la iluminación de campo brillante en el aumento cuatro veces. Después de adquirir múltiples imágenes de la misma región de interés, imagine la dinámica de calcio dentro del área S1 en el hemisferio izquierdo y calcule los cambios en la fluorescencia de cada región de interés a ambos lados del cráneo. En estas imágenes representativas, las dendritas y un vaso sanguíneo dentro de un ratón que expresa egFP se visualizaron a diferentes profundidades en la capa dos de la región S1 un día después de la instalación de la ventana óptica.
Las imágenes de proyección Z fueron capturadas en los días uno y siete después de la implantación de la ventana óptica, ilustrando un número notablemente estable y la ubicación de las ramas y espinas dendríticas durante el período experimental. La medición del transitorio de calcio intracelular en ratones transgénicos Thy1 GCaMP6 permite la cuantificación de la actividad espontánea del calcio y las poblaciones de neuronas piramidales de capa cinco situadas tan profundas como superiores a 500 micrómetros por debajo de la pia, así como el cálculo del número medio de respuestas espontáneas a lo largo del tiempo. Un investigador formado en la preparación de ventanas craneales y técnicas de imágenes de calcio de dos fotones in vivo debe ser capaz de obtener grabaciones de 100 a 200 neuronas a ambos lados del cráneo en uno a dos animales por día.
Con una ventana óptica abierta a cada lado del cráneo, el método permite el registro de la actividad neuronal a través de regiones cerebrales de mamíferos simétricos para imágenes de calcio prolongadas y estables in vivo. Este método también se puede utilizar para estudiar la actividad cortical y la plasticidad después de una lesión unilateral en el sistema nervioso periférico o central. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo instalar ventanas craneales bilaterales para medir la dinámica de calcio utilizando el microscopio de dos fotones en los ratones transgénicos Thy1 GCaMP6s.
