Este método permite o registro e quantificação da atividade neural em regiões corticais bilaterais do camundongo por um período prolongado in vivo. A técnica de dois fótons tem a vantagem de detectar atividade simultaneamente em grande ou dispersa população neuronal por um longo período. As implicações dessa técnica se estenderam para a investigação de padrões de atividade em populações neuronais definidas em diferentes regiões do cérebro vivo.
12 horas antes de iniciar o procedimento, aqueça as janelas ópticas a 50 graus Celsius em 70% de etanol. Uma janela óptica consiste em um vidro de cobertura superior de cinco milímetros de diâmetro redondo e uma porção inferior contendo um vidro de cobertura de três milímetros redondo. Ao final da incubação do aquecimento, confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé em um anestesizado de 20 a 25 gramas 1/2 a 2 1/2 mês de idade, o rato Thy1 GCaMP6s, e aplique pomada aos olhos do animal.
Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento coberta com uma cortina estéril e use um adaptador de tenção de cabeça para os ratos estabilizarem a cabeça. Raspe a maior parte do couro cabeludo com uma navalha de duas bordas, e limpe a pele exposta com almofadas de preparação de álcool estéril sequencial e esfregões de solução de povidone-iodo. Em seguida, use um par de tesouras para fazer um corte retangular de dois por três milímetros no couro cabeludo no lado direito do crânio.
Usando um cotonete, empurre a pele de lado para criar uma área de exposição de mais de três milímetros de diâmetro, e use uma lâmina microcirúrgica cega para remover suavemente o tecido conjuntivo ligado ao crânio. Com uma broca dentária, marque suavemente um círculo de três milímetros de diâmetro ao redor da área S1. Depois de fazer um círculo semelhante no lado esquerdo do crânio, aplique uma fina camada de supercola cianoacrilato em ambos os lados do osso para fornecer uma base para uma aplicação de cimento dental.
Sob um microscópio dissecando, use uma micro broca de alta velocidade para diminuir uma ranhura circular no lado direito do crânio ao redor da área S1 para criar uma borda lisa, aspirando os detritos ósseos com um vácuo conforme necessário. Depois de uma profundidade óssea de aproximadamente 2/3 ter sido alcançada, lentamente e cuidadosamente fina o 1/3 restante do osso até que um retalho ósseo circular tenha sido completamente liberado do crânio circundante. Use um par de fórceps 5/45 para remover lentamente e cuidadosamente o pedaço circular do osso para expor a dura, tomando cuidado para evitar danificar os vasos de pial.
Depois de remover um retalho ósseo do lado esquerdo do crânio da mesma maneira, enxágue a janela óptica para o lado direito do crânio com soro fisiológico estéril, e verifique se há imperfeições sob um microscópio estéreo. Instale a janela óptica sobre a região da craniotomia com a parte superior da janela repousando sobre o crânio e a parte inferior dentro da abertura craniotomizada, descansando sobre a dura, na presença de fluido espinhal cerebral. Use a supercola de cianoacrilato para selar a parte superior da borda óptica da janela para o crânio.
Quando a cola secar, aplique cimento dental preto na borda do vidro, o resto do lado direito do crânio exposto e as margens da ferida para bloquear a luz. Em seguida, instale a janela óptica esquerda e permita que o animal se recupere com o monitoramento até a recumbência total. Sete a dez dias após o procedimento, coloque o animal anestesiado no adaptador de tenção de cabeça em uma almofada de aquecimento sob um microscópio de dois fótons, tomando cuidado para que a janela óptica e o lado direito do crânio sejam orientados perpendicularmente ao eixo óptico do microscópio.
Adquira uma imagem inicial do mapa de referência da janela craniana usando iluminação de campo brilhante na ampliação quatro vezes. Após a aquisição de múltiplas imagens da mesma região de interesse, imagem a dinâmica do cálcio dentro da área S1 no hemisfério esquerdo e calcule as mudanças na fluorescência de cada região de interesse em ambos os lados do crânio. Nestas imagens representativas, dendritos e um vaso sanguíneo dentro de um mouse expresso em EGFP foram visualizados em diferentes profundidades na camada dois da região S1 um dia após a instalação da janela óptica.
As imagens de projeção Z foram capturadas nos dias um e sete após a implantação da janela óptica, ilustrando um número notavelmente estável e localização de ramos e colunas dendríticas durante o período experimental. A medição do transitório de cálcio intracelular em camundongos transgênicos Thy1 GCaMP6s permite a quantificação da atividade espontânea de cálcio e populações de neurônios piramifecionais de camada cinco localizados tão profundos quanto 500 micrômetros abaixo da pia, bem como o cálculo do número médio de respostas espontâneas ao longo do tempo. Um pesquisador treinado tanto na preparação da janela craniana quanto em técnicas in vivo de imagem de cálcio de dois fótons deve ser capaz de obter gravações de 100 a 200 neurônios em ambos os lados do crânio em um a dois animais por dia.
Com uma janela óptica aberta em cada lado do crânio, o método permite o registro da atividade neural em regiões cerebrais míferas simétricas para imagens de cálcio prolongadas e estáveis in vivo. Este método também pode ser usado para estudar a atividade cortical e a plasticidade após lesões unilaterais ao sistema nervoso periférico ou central. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como instalar janelas cranianas bilaterais para medir a dinâmica do cálcio usando microscópio de dois fótons em camundongos transgênicos Thy1 GCaMP6s.
