Cette méthode permet l’enregistrement et la quantification de l’activité neuronale à travers les régions corticales bilatérales de souris pendant une période prolongée in vivo. La technique des deux photons a l’avantage de détecter l’activité simultanément dans une population neuronale importante ou dispersée sur une longue période. Les implications de cette technique se sont étendues à l’étude des modèles d’activité dans les populations neuronales définies dans différentes régions du cerveau vivant.
12 heures avant le début de la procédure, réchauffer les fenêtres optiques à 50 degrés Celsius à 70% d’éthanol. Une fenêtre optique se compose d’un verre rond de couverture supérieure de cinq millimètres de diamètre et d’une partie inférieure contenant un verre rond de couverture de trois millimètres de diamètre. À la fin de l’incubation de réchauffement, confirmer un manque de réponse à pincement d’orteil sur une souris anesthésiée de 20 à 25 grammes 1 1/2 à 2 1/2 mois Thy1 GCaMP6s souris, et appliquer de l’onguent sur les yeux de l’animal.
Placez la souris sur un coussin chauffant recouvert d’un drapé stérile et utilisez un adaptateur de fixation de la tête pour les souris afin de stabiliser la tête. Rasez la majeure partie du cuir chevelu avec un rasoir à double tranchant et nettoyez la peau exposée avec des coussinets de préparation à l’alcool stérile séquentiels et des gommages de solution povidone-iode. Ensuite, utilisez une paire de ciseaux pour faire une coupe rectangulaire de deux par trois millimètres dans le cuir chevelu sur le côté droit du crâne.
À l’aide d’un coton-tige, poussez la peau de côté pour créer une zone d’exposition de plus de trois millimètres de diamètre et utilisez une lame microchirurgicale émoussée pour enlever délicatement le tissu conjonctif attaché au crâne. À l’intérieur d’une perceuse dentaire, marquer délicatement un cercle de trois millimètres de diamètre autour de la zone S1. Après avoir fait un cercle similaire sur le côté gauche du crâne, appliquer une fine couche de superglue cyanoacrylate sur les deux côtés de l’os pour fournir une base pour une application de ciment dentaire.
Sous un microscope disséquant, utilisez une micro foreuse à grande vitesse pour éclaircir une rainure circulaire sur le côté droit du crâne autour de la zone S1 pour créer un bord lisse, aspirant les débris osseux avec un vide au besoin. Après qu’une profondeur d’os approximativement 2/3 ait été réalisée, lentement et soigneusement amincir le 1/3 restant de l’os jusqu’à ce qu’un aileron circulaire d’os ait été complètement libéré du crâne environnant. Utilisez une paire de 5/45 forceps pour enlever lentement et soigneusement le morceau circulaire d’os pour exposer le dura, en prenant soin d’éviter d’endommager les vaisseaux piaux.
Après avoir enlevé un aileron d’os du côté gauche du crâne de la même manière, rincez la fenêtre optique pour le côté droit du crâne avec la solution saline stérile, et vérifiez les imperfections sous un microscope stéréo. Installez la fenêtre optique au-dessus de la région de craniotomie avec la partie supérieure de la fenêtre reposant sur le crâne et la partie inférieure dans l’ouverture craniotomized, reposant sur le dura, en présence du fluide spinal cérébral. Utilisez la superglue cyanoacrylate pour sceller la partie supérieure du bord optique de la fenêtre vers le crâne.
Lorsque la colle a séché, appliquer du ciment dentaire noir sur le bord du verre, le reste du côté droit du crâne exposé, et les marges de la plaie pour bloquer la lumière. Installez ensuite la fenêtre optique gauche et permettez à l’animal de récupérer avec surveillance jusqu’à ce qu’il soit complètement couché. Sept à dix jours après l’intervention, placez l’animal anesthésié dans l’adaptateur de la tête sur un coussin chauffant sous un microscope à deux photons, en prenant soin que la fenêtre optique et le côté droit du crâne soient orientés perpendiculairement à l’axe optique du microscope.
Obtenez une image de carte de référence initiale de la fenêtre crânienne à l’aide de l’éclairage du champ lumineux au grossissement à quatre reprises. Après avoir acquis plusieurs images de la même région d’intérêt, imagez la dynamique du calcium dans la zone S1 dans l’hémisphère gauche et calculez les changements dans la fluorescence de chaque région d’intérêt des deux côtés du crâne. Dans ces images représentatives, des dendrites et un vaisseau sanguin au sein d’une souris exprimant l’EGFP ont été visualisés à différentes profondeurs dans la couche deux de la région S1 un jour après l’installation de la fenêtre optique.
Les images de projection Z ont été capturées aux premiers et sept jours après l’implantation de la fenêtre optique, illustrant un nombre remarquablement stable et l’emplacement des branches et des épines dendritiques au cours de la période expérimentale. La mesure du calcium intracellulaire transitoire chez les souris transgéniques Thy1 GCaMP6s permet la quantification de l’activité spontanée du calcium et des populations de neurones pyramidaux de couche cinq situés aussi profondément que plus de 500 micromètres au-dessous de la pia ainsi que le calcul du nombre moyen de réponses spontanées au fil du temps. Un chercheur formé à la fois à la préparation des fenêtres crâniens et aux techniques d’imagerie au calcium à deux photons in vivo devrait être en mesure d’obtenir des enregistrements de 100 à 200 neurones des deux côtés du crâne chez un à deux animaux par jour.
Avec une fenêtre optique ouverte de chaque côté du crâne, la méthode permet l’enregistrement de l’activité neuronale à travers les régions symétriques du cerveau des mammifères pour une imagerie prolongée et stable du calcium in vivo. Cette méthode peut également être utilisée pour étudier l’activité corticale et la plasticité après des blessures unilatérales au système nerveux périphérique ou central. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’installer des fenêtres crâniens bilatérales pour mesurer la dynamique du calcium à l’aide d’un microscope à deux photons chez les souris transgéniques Thy1 GCaMP6s.
