Bu eser Geneplus – Beijing Enstitüsü tarafından desteklenir.

tümör örnekleri ve kan örnekleri Etik Komitesi, Pekin Üniversitesi insanlar tarafından onaylanmış bir protokolüne göre elde &#39; s hastane. Yazılı Onam saldırganın saklanıp örnekleri kullanmak için hastalardan elde edildi. Katılımcılar aşağıdaki kriterlere göre ekranlı: erkek, Gelişmiş sigara-küçük hücreli akciğer kanseri, EGFR p.L858R mutasyon belirtilen önceki Sanger sıralama tarafından hastalık ilerleme EGFR iki oturumu takip hedefli tedavi Erlotinib ile ve ER-ctDNA direnç nedeninin çözümlemek ve yeni hedef uyuşturucu bulmak için uygulanan Seq.
 1. DNA çekme--dan cfDNA ve genomik DNA (gDNA) için periferik kan <ol><li>periferik kan toplama tüp 10 mL toplamak, yavaşça yukarı ve aşağı 6 - 8 kez için tersine çevirin karıştırın. Hücre kesme önlemek. Kan örnekleri saklanabilir toplama tüp 6-37 ° c ilâ 72 saat.</li>
	<li>Toplama tüp, oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi 1600'de (±150) x g.</li>
	<li>Dört temiz 2 mL uygun şekilde santrifüj tüpleri Pelet Katmanı (beyaz kan hücreleri) bozmadan bir tek kullanımlık damlalıklı kullanarak etiketli koleksiyonu tüpünden süpernatant (plazma) transfer.</li>
	<li>Transfer1 mL 2 ml temiz tek kullanımlık damlalıklı uygun kullanarak hücre santrifüj tüpü etiketli. Hücreler saklı-20 ° c veya daha önce adım 1.8 daha soğuk olabilir.</li>
	<li>(Kimden adım 1.3) plazma 4 ° C'de 10 dakika ve 16000 (±150) için santrifüj kapasitesi g. x</li>
	<li>Transfer düzgün olarak etiketli santrifüj tüpleri temizlemek için plazma &#34; plazma &#34;, kirlenmesini önlemek için alt kısmında kalan birim ~0.1 mL bırakın. Adım 1,7 kadar plazma-80 ° C'de depolayın.</li>
	<li>Plazma adım 1.6 3 mL cfDNA (içeren ctDNA) belirlemek için kullanın üretici takip piyasada bulunan bir seti kullanarak &#39; s yönergeleri.</li>
	<li>Kullanım 200 µL üretici takip piyasada bulunan bir seti kullanarak gDNA yalıtmak için adım 1.3 beyaz kan hücrelerinin &#39; s yönergeleri. 
	Not: Her ikisi de cfDNA ve gDNA-20 ° c kullanmadan önce saklanabilir.</li>
	<li>CfDNA ve gDNA (Tablo 2) için farklı kalite denetimleri uygulanır. Kalite kontrol için örnek yıkımı ve/veya gDNA kirlenme düzeylerini belirlemek bioanalyzer standart bir yöntem yerine getirilir. CfDNA ayıklama kalitesini analizini tepe şekil 1 ' e benzer görünmelidir. 
	Not: CfDNA en yüksek boyutu yaklaşık 170 olduğunu bp. Not cfDNA nadir mutasyonların etkili tespiti için daha yüksek bir kalite kitaplığındaki DNA miktarını artırarak sonuçlanır. En az 30 ng cfDNA (30.000 kopya) kullanmanızı öneririz.</li>
</ol> 2. Kütüphane hazırlık Not: temel Kütüphane inşaat parçalanmış DNA ile ilgili olarak cfDNA en yüksek boyut ~ 170 bp ile parçaları bulunmaktadır ve böylece birleştirilmesi gerekmez.
<ol><li>Parça denetimi örneği (gDNA) tarafından sonication 200-250 bp parçaları elde etmek için.
	<ol><li>Hazırlamak 1 µg Tris-EDTA arabelleği bir temiz sonication tüp 100 µL gDNA örneğinin.</li>
		<li>Sonication programı 30 küme s 12 dk. toplam 12 döngüleri için kapalı açık ve 30 s</li>
		<li>Ürün (5 µL) içeren 200-250 bp parçaları % 2 özel jel ile bir analiz çalıştırarak sonication sonra onaylamak.</li>
		<li>Tüm parçalanma ürünleri için yeni bir 1,5 mL tüp aktarmak ve 150 µL doğru parçaları seçmek 5 min için manyetik boncuklar ile kuluçkaya.</li>
		<li>Süpernatant kaldırmak için 30 manyetik bir raf üzerinde tüp koyarak s.</li>
		<li>Manyetik raf kalan tüp boncuk 200 µL % 80 etanol (taze hazırlanmış) ile yıkayın. 30 için kuluçkaya süpernatant kaldırmadan önce s. Bir kez yineleyin.</li>
		<li>Hava kuru manyetik raf kalırken açık tüp kapaklı boncuk. DNA hedef de kurtarır emin olmak için overdried boncuk kaçının. DNA parçaları boncuk boncuk miktar tarafından UV/Vis spektroskopisi tarafından takip DNA parçalarının gidermek için 10 mm Tris-HCl (pH 8) 32 µL ekleyerek elute. 
		Not: en az 200 ng aşağıdaki deneyler için gerekli.</li>
	</ol></li> <li>Son hazırlık tepki Not: takip üretici &#39; s öğretim ve gerektiği gibi değiştirin. CfDNA kullanım 30 ng; ve gDNA denetim olarak 1 µg.
	CfDNA steril nükleaz ücretsiz tüp, <ol><li>eklemek 7 µL tepki arabelleği, enzim karışımı 30 3 µL ng ve GKD 2 O 60 µL toplam hacmi ekleyin. Ayrı bir tüp içinde yukarıdaki bileşenleri eklemek ama gDNA cfDNA yerine 1 µg.</li>
		<li>Mix ve karışımı 30 dk 65 ° C 30 dk içinde bir thermocycler için ısıtmalı kapağı takip için 20 ° C'de kuluçkaya. Hemen bir sonraki adıma devam.</li>
	</ol></li> <li>Bağdaştırıcısı ligasyonu <ol><li>ekleyin 30 µL ligasyonu ana karışımı, 1 µL ligasyonu artırıcı ve 4 µL karışıma benzersiz sıralaması bağdaştırıcısı adım 2.2.</li>
		<li>Incubate bir thermocycler ısıtmalı kapağı olmadan içinde 15 dakika 20 ° C'de.</li>
		<li>Manyetik boncuklar resuspend ve boncuklar, oda sıcaklığında en az 30 dk önce bir sonraki adım için bırakmak için girdap.</li>
		<li>87 µL resuspended manyetik boncuklar daha önce sözünü ettiğimiz karışıma ekleyin; de yukarı ve aşağı pipetting karıştırın ve sonra 5 dakika süreyle oda sıcaklığında kuluçkaya</li>
		<li>Yıkama ve hava kuru boncuk adım 2.1 içinde açıklandığı gibi.</li>
		<li>10 mm Tris-HCl (pH 8) 20 µL ekleyerek boncuk DNA hedeften elute.</li>
	</ol></li> <li>Bağdaştırıcısıyla bakmaksızın zenginleştirme DNA parçalarının <ol><li>Ekle 20 µL bakmaksızın bağdaştırıcısı DNA parçaları, dizin astar/i7 5 µL (2.5 µL astar-P7 (10 pM) ve astar-P5 (10 pM), 2,5 µL sıralama amaçları için), 25µL, Kütüphane amplifikasyon ana mix ve GKD 2 O toplam hacmiyle 50 µL.</li>
		<li>PCR yükseltmek bakmaksızın bağdaştırıcısı DNA ve termal döngüsü aşağıdaki gibi: 45 için 98 ° C'de ilk denatürasyon ardından 8 döngüsü (cfDNA) veya 4 döngüleri (gDNA) tavlama 15 ° C, s, s, 65 ° C 30 s, 30 72 ° C s) ve son bir uzantısı 60 72 ° C'de s sonra sıcaklık 4'te holding ° C.</li>
		<li>Alınan parçaları almak için PCR zenginleştirilmiş DNA için askıya alınmış manyetik boncuklar eklemek 45 µL.</li>
		<li>Elute DNA parçaları 10 mm Tris-HCl (pH 8) 30 µL bağdaştırıcılarla.</li>
	</ol></li> <li>Kütüphane kalite kontrol <ol><li>üretici takip &#39; s protokolü için bağdaştırıcı ölçmek ticari teçhizat bakmaksızın DNA toplama. Bioanalyzer DNA kalitesini belirlemek için kullanın.</li>
	</ol></li></ol> 3. Hedef DNA yakalama Not: hedef zenginleştirme bilinen tümör ilişkili sürücü mutasyonlar 12 kapsayan bir 1021 kb hedef zenginleştirme bölge için bir özel sıra yakalama-sonda özel olarak tasarlanmış kullanarak gerçekleştirilen yapıldı. tümör farklı türleri. Üretici değişiklikler &#39; s protokolü aşağıdaki adımları ayrıntılı.
<ol><li>Kütüphaneler havuz engelleme <ol><li>eklemek 1.5 µg (havuzu cfDNA için kitaplıklarına en fazla sayısı 6, gDNA 20) adım 2, P5 Block(100P), P7 Block(100P) 8 µL ve karyolası-1 DNA'ın 5 µL 8 µL (1 µg/µL) steril bir tüp. 60 dakikaya ayarla vakum yoğunlaştırıcı kullanarak tüp içeriğini kuru ° C.</li>
	</ol></li> <li>DNA yakalama probları ile kütüphane Hybridize.
	<ol><li>3.1: 8.5 µL 2 X hibridizasyon arabellek, hibridizasyon artırıcı, ve 1.8 µL GKD nükleaz ücretsiz 2 O. 2.7 µL adım tüpünden için aşağıdaki bileşenleri ekleyin</li>
		<li>Mix tarafından yukarı ve aşağı pipetting ve bir thermomixer 10 dakika süreyle 95 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>Kuluçka hemen özel yoklama, 4 µL ekleyin. 65 ve #17, termal cycler örneklerinde kuluçkaya6; C kapak ile ısıtılan 75 ° c 4 h için</li>
	</ol></li> <li>DNA parçaları yakalama <ol><li>streptavidin boncuk boncuk ilişkisiz DNA çıkarmak için yıkama tarafından takip ile melezleşmiştir hedef DNA kuluçkaya. Üretici göre ticari setini kullanın &#39; resuspended boncuk yakalanan DNA ile son 20 µL almak için s yönergeleri parçaları.</li>
	</ol></li> <li>Yakalanan DNA amplifikasyon parçaları <ol><li>gerçekleştirmek ticari kullanarak PCR kiti 2 µM omurga oligonucleotides ile üretici göre &#39; s yönergeleri.</li>
		<li>Ne zaman PCR reaksiyon tamamlandığında, askıya alınan boncuk 45 µL PCR ürüne doğrudan ekleme ve boncuk için 10 mM Tris-HCl (pH 8) ile 30 µL elüsyon tarafından bağlı güçlendirilmiş hedef DNA parçalarının zenginleştirmek.</li>
	</ol></li> <li>Sayısal Kütüphane miktar kiti ile DNA parçalarının ve Bioanalyzer ( Şekil 2) ortalama parça boyla belirlemek.</li></ol>
 4. sıralama <ol><li>sıra multiplexed 18 h. toplam veri üretilen 60 gigabayt için 75 bp eşleştirilmiş uç ishal üstünde bir benchtop sequencer kullanarak kütüphaneleri, 15 G hasta örnek cfDNA ve 1 G için denetim örnek gDNA için gerekli.</li></ol>
 5. veri analizi iş akışı Not: şekil 3 genel iş akışı ve veri analiz süreci görüntüler. Veri analiz parametrelerini ve komutları aşağıda gösterilir.
<ol><li>Filtre düşük kaliteli okuma ve hataları ve NCfilter kullanarak UID maskeleme için doğru. 
	NCfilter(own) NCfilter filtre -l 5 - q 0,5 -n 0.1 -T 3 - G -1 fastq1-2 fastq2 realSeq(own) python bin/realRealSeq MaskUID -1 fq1-2 fq2 -o çıkış dir -p önek -u 4 -s 7 - m 3 -i uidFile-f.</li>
	<li>Referencing genom hg19 (insan genomu 19), BWA (sürüm 0.7.12-r1039) mem kullanarak sıralama sonuçları bulun ve genom analizi Toolkit (GATK) (sürüm 3.4-46-gbc02625) yeniden hizalayın. 
	BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2 java-d64-sunucu - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g - Xmx10g - Djava.io.tmpdir=/tmp/-kavanoz GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-dbsnp bilinen &#8212; 
	allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 - ı cancerBam-ı normalBam java-d64-sunucu - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g &#8212; Djava.io.tmpdir=/tmp/-kavanoz GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-dbsnp bilinen - allowPotentiallyMisencodedQuals &#8212; targetIntervals aralıkları-ı cancerBam-ı normalBam</li>
	<li>Küme UID ve üsleri PCR/sıralama tarafından tanıtıldı ve temel kalite değiştirmek hata düzeltmek üzere şablon parçaları konumunu göre çoğaltmaları. 
	realSeq(own) python realSeq/bin/realSeq - p -b unmarkdup_sort_merge.bam - r chipRegion -o output_dir küme -m 6 önek</li> <li>BWA mem. tarafından kümelenmiş çoğaltmaları yeniden Hizala 
	BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2</li> <li>temel kalite puanı GATK (sürüm 3.4-46-gbc02625) kullanarak ayarlamayı tarafından takip yerel bir yeniden düzenlenmesi gerçekleştirmek. 
	Loacal yeniden düzenlenmesi: java-d64-sunucu - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-kavanoz GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals bilinen -nt 10 -CancerBam-ı normalBam java-d64-sunucu - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-kavanoz GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals - targetIntervals bilinen aralıkları-ı cancerBam-ı normalBam temel kalite puanı ayarlamayı: java-d64-sunucu - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/ - kavanoz GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator -R hg19 -L targetRegion - knownSites dbsnp - knownSites kozmik - allowPotentiallyMisencodedQuals - nct 10 - ben bam -o grp java-d64-sunucu - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-GenomeAnalysisTK.jar -T kavanoz PrintReads-ben bam - BQSR CTP -o outbam -R hg19 - nct 8 - allowPotentiallyMisencodedQuals</li> <li>(tek nükleotid varyant) SNV ve INDEL (küçük eklemelerin veya silmelerin) arama için düşük frekans mutasyonlar doğruluğunu daha da GSR (iyi destek okur) tarafından her ikisi ile doğrulanır ileriye ve geriye doğru strand çiftleri ve filtrasyon kontrol grubu (germline mutasyonlar) ve temel veritabanı aracılığıyla okuyun. 
	realDcaller(own) python realDcaller -f hg19 - r chipRegion - C baselineDB - O -L 2 cancerBam normalBam -p 30</li> <li>KNV (kopya numarası varyasyon) çağrıları yapmak için bir denetim olarak temel örnekleri kullanır. 
	NCcnv(own) python NCcnv -o cnvdir -t tmpdir - r chipRegion KNV--normgt normalBam tumgt--cancerBam--repdb repeatMarsk</li> <li>klipler ve SV (yapısal farklılıklar) aramak için uyumsuz çift okuma eşlenmemiş, Realigned. 
	NCsv(own) python NCsv -t tmpdir - r hg19 -o outputdir - x transkript -w bwapath -n 4 normalBam cancerBam</li></ol>

<ol>
	<li>Kennedy, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+ultralow-frequency+mutations+by+Duplex+Sequencing.">Detecting ultralow-frequency mutations by Duplex Sequencing.</a> Nat. Protoc. 9, 2586-2606 (2014).</li><li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Bettegowda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+tumor+DNA+in+early-+and+late-stage+human+malignancies.">Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies.</a> Sci. Transl. Med. 6, (2014).</li><li>Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+clinical+utility+of+ultrasensitive+circulating+tumor+DNA+detection+with+CAPP-Seq.">Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq.</a> Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).</li><li>Diaz, L. A., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsies:+genotyping+circulating+tumor+DNA.">Liquid biopsies: genotyping circulating tumor DNA.</a> J. Clin. Oncol. 32, 579-586 (2014).</li><li>Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+biopsy:+monitoring+cancer-genetics+in+the+blood.">Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 10, 472-484 (2013).</li><li>Su, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+platform+for+rapid+detection+of+multiple+oncogenic+mutations+with+relevance+to+targeted+therapy+in+non-small-cell+lung+cancer.">A platform for rapid detection of multiple oncogenic mutations with relevance to targeted therapy in non-small-cell lung cancer.</a> J. Mol. Diagn. 13, 74-84 (2011).</li><li>Kukita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fidelity+target+sequencing+of+individual+molecules+identified+using+barcode+sequences:+de+novo+detection+and+absolute+quantitation+of+mutations+in+plasma+cell-free+DNA+from+cancer+patients.">High-fidelity target sequencing of individual molecules identified using barcode sequences: de novo detection and absolute quantitation of mutations in plasma cell-free DNA from cancer patients.</a> DNA Res. 22, 269-277 (2015).</li><li>Schmitt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+small+genomic+targets+with+high+efficiency+and+extreme+accuracy.">Sequencing small genomic targets with high efficiency and extreme accuracy.</a> Nat. Methods. 12, 423-425 (2015).</li><li>Schmitt, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+ultra-rare+mutations+by+next-generation+sequencing.">Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 14508-14513 (2012).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+method+for+quantitating+circulating+tumor+DNA+with+broad+patient+coverage.">An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage.</a> Nat. Med. 20, 548-554 (2014).</li><li>Newman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+digital+error+suppression+for+improved+detection+of+circulating+tumor+DNA.">Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 547-555 (2016).</li><li>Alix-Panabie&#768;res, C., Schwarzenbach, H., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+and+circulating+tumor+DNA.">Circulating tumor cells and circulating tumor DNA.</a> Annu. Rev. Med. 63, 199-215 (2012).</li><li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer.">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 368, 1199-1209 (2013).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short-read+alignment+with+Burrows-+Wheeler+transform.">Fast and accurate short-read alignment with Burrows- Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li><li>Youn, A., Simon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+cancer+driver+genes+in+tumor+genome+sequencing+studies.">Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies.</a> Bioinformatics. 27, 175-181 (2011).</li><li>Forshew, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+identification+and+monitoring+of+cancer+mutations+by+targeted+deep+sequencing+of+plasma+DNA.">Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+mutation+and+resistance+of+non-small-cell+lung+cancer+to+gefitinib.">EGFR mutation and resistance of non-small-cell lung cancer to gefitinib.</a> N. Engl. J. Med. 352, 786-792 (2005).</li><li>Kuang, Y., Rogers, A., Yeap, Y., Wang, L., Makrigiorgos, M., Vetrand, K., Thiede, S., Distel, R. J., Ja&#776;nne, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+detection+of+EGFR+T790M+in+gefitinib+or+erlotinib+resistant+non-small+cell+lung+cancer.">Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer.</a> Clin. Cancer Res. 15, 2630-2636 (2009).</li><li>Taniguchi, K., Uchida, J., Nishino, K., Kumagai, T., Okuyama, T., Okami, J., Higashiyama, M., Kodama, K., Imamura, F., Kato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+of+EGFR+mutations+in+circulating+tumor+DNA+derived+from+lung+adenocarcinomas.">Quantitative detection of EGFR mutations in circulating tumor DNA derived from lung adenocarcinomas.</a> Clin. Cancer Res. 17, 7808-7815 (2011).</li><li>Leary, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+personalized+tumor+biomarkers+using+massively+parallel+sequencing.">Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing.</a> Sci. Transl. Med. 2, (2010).</li><li>Forshew, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+identification+and+monitoring+of+cancer+mutations+by+targeted+deep+sequencing+of+plasma+DNA.">Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Bratman, S. V., Newman, A. M., Alizadeh, A. A., Diehn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+clinical+utility+of+ultrasensitive+circulating+tumor+DNA+detection+with+CAPP-Seq.">Potential clinical utility of ultrasensitive circulating tumor DNA detection with CAPP-Seq.</a> Expert Rev. Mol. Diagn. 15, 715-719 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

CtDNA analizleri hala değil rutin klinik uygulamada uygulamadır ancak tümör DNA (ctDNA) dolaşan varlığını daha 30 yıl önce keşfedilmiştir. İlgi ctDNA yöntemleri pratik uygulama geliştirme teknolojileri ctDNA algılama ve çözümleme ile artmıştır. Tümör ctDNA ile izleme mikroskopik rezidüel hastalığı, tedavisi ve tümör moleküler profilleri altında arka plan tümör gelişimi ve intratumoral heterojenlik13Yanıt değerlendirilmesi için minimal invaziv bir yaklaş...

Yeni nesil sıralama (NGS), soykırım, sırlarını araştırmak için güçlü bir araç genetik değişiklikler ortaya çıkarabilir bilgi büyük miktarda sağlayabilir. NGS analizde klinik uygulama özellikle kişiselleştirilmiş tıp daha yaygın hale gelmiştir. NGS, en büyük sınırlamaları ancak, yüksek hata oranı biridir. Eğitim devralınan mutasyonlar için uygun sayılır, özellikle DNA analiz "sıvı biyopsisi" elde edilen nadir mutasyon analizi büyük ölçüde sınırlı1,2, olsa da.
Tümör dolaşan DNA (ctDNA) boş hücre DNA (cfDNA) tümör hücreleri döken kan var. Çoğu durumda ctDNA onun algılama ve analiz zorlayıcı olun son derece düşük miktarıdır. Ancak, ctDNA çok çekici özelliklere sahiptir: onun yalıtım minimal invaziv, tümör büyüme erken dönemlerinde algılanabilir, ctDNA düzeyi terapötik etkinlik yansıtır ve ctDNA içeren birincil ve metastatik lezyonlar bulunan DNA mutasyonları 3 , 4 , 5. bu nedenle, hızlı bir gelişme NGS tekniği ve analiz göz önüne alındığında, başvuru ctDNA algılama daha cazip oldu.
Farklı kitlesel paralel sıralama yaklaşımlar ctDNA tespiti için kullanılan ama bu yaklaşımlardan hiçbiri kliniklerde sınırlamaları nedeniyle rutin kullanım için kabul edildi: düşük duyarlılık, çok yönlülük eksikliği ve nispeten yüksek maliyetli6 ,7,8. Örneğin, bir benzersiz tanımlayıcı etiketi (UID), temel çift yönlü sıralama Art arda sıralama hatalarının en takviyeli-fikir birliği uzmanlığından hataları düzeltir. Ancak, bu yöntemin fizibilite düşük veri kullanımı9,10ve yüksek maliyet nedeniyle kaybolur. Doğruluk ve evrensellik bu yöntemlerin geliştirilmesi gerekir rağmen benzer şekilde, CAPP Seq ve geliştirilmiş, yineleme, CAPP-IDE11,12, büyük pratiklik cfDNA algılama var.
Doğru ctDNA algılama ve çözümlemesi geçerli ihtiyacını karşılamak için yeni bir strateji, nadir mutasyon zenginleştirmek (ER-Seq) sıralama geliştirdi. Bu yaklaşım aşağıdaki birleştirir: Çift yönlü hata düzeltmesi ve dışarı-in tek bir mutasyon ayırt yeteneği ile ctDNA molekülleri verimli bir şekilde kurtarmak için benzersiz sıralaması bağdaştırıcısı &#62; 1 × 107 vahşi tipi nükleotit; kapak üzerinde hedef bölgeleri ölçümü zenginleştirmek 1021 kb probları %95 12 tümörler akciğer kanseri, kolorektal kanser, mide kanseri, meme kanseri, böbrek kanseri, pankreas kanseri, karaciğer kanseri, tiroid kanseri, dahil olmak üzere, gelen tümör ile ilgili mutasyonların Rahim ağzı kanseri, yemek borusu kanseri ve rahim Karsinomu (tablo 1); ve verimli ve nadir mutasyonlar ctDNA içinde tam olarak algılamak kolay hale temel veritabanı eleme.
Temel veritabanı oluşturmak için ER-Seq tarafından tüm gen mutasyonlarının örnekleri (~ 1000 başına) aynı türde bir dizi bulmak. Bu gerçek mutasyonlar diğer çeşitli güvenilir algılama yöntemleri ve analiz tarafından doğrulanması gerekir. Daha sonra yanlış mutasyonların desen özetlemek ve tüm yanlış mutasyonlar ilk temel veritabanı oluşturmak için küme. Yanlış mutasyonlar sonraki sıralama deneylerden buldum bu veritabanına eklemeye devam edin. Bu nedenle, bu temel veritabanı sıralama doğruluğu önemli ölçüde artıran bir Dinamik Genişletilmiş veritabanı olur.
Tümör tanısı ve takibi devam teşvik etmek, ER-Seq, evrensel veri edinimi için düşük maliyetli ve uygulanabilir bir yöntem mevcut. Biz ER-Seq analizi, uygulanan bir vaka nadir mutasyonlar ve fizibilite kullanmak için klinikte algılama doğruluğunu gösteren mevcut.

<table><tbody><tr><td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51105</td><td>DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>Measure cfDNA concentration</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA BR Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32853</td><td>Measure library concentration</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 Reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-1504</td><td>Measure cfDNA and library fragments</td></tr><tr><td>The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina</td><td>NEB</td><td>E7645L</td><td>Library Preparation</td></tr><tr><td>Agencourt SPRIselect Reagent</td><td>Beckman</td><td>B23317</td><td>DNA fragment screening and purification</td></tr><tr><td>Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML</td><td>Sigma</td><td>93283</td><td>Dissolution</td></tr><tr><td>xGen Lockdown Probes</td><td>IDT</td><td>&amp;mdash;&amp;mdash;</td><td>xGen Custom Probe</td></tr><tr><td>Human Cot-1 DNA</td><td>Life</td><td>15279-011</td><td>Targeted DNA capture</td></tr><tr><td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td><td>Life</td><td>65305</td><td>Targeted DNA capture</td></tr><tr><td>xGen Lockdown Reagents</td><td>IDT</td><td>1072281</td><td>Targeted DNA capture</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>KAPA</td><td>KK2602</td><td>post-capture PCR enrichment libraries</td></tr><tr><td>KAPA Library Quantification Kit</td><td>KAPA</td><td>KK4602</td><td>Measure library concentration</td></tr><tr><td>NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles)</td><td>illumina</td><td>FC-404-2002</td><td>Sequence</td></tr><tr><td>Centrifuge5810</td><td>eppendorf</td><td>5810</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop8000</td><td>Thermo Scientific</td><td>8000</td><td>Measure gDNA concentration</td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Quantify</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>eppendorf</td><td></td><td>Incubation</td></tr><tr><td>16-tube DynaMagTM-2 Magnet</td><td>Life</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Concentrator plus</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>AB</td><td>simplyamp</td><td></td></tr><tr><td>QPCR</td><td>AB</td><td>7500Dx</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500</td><td>illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detection of rare mutations in ctdna using next generation sequencing

Tümör DNA (ctDNA) yeni nesil sıralama (NGS) kullanarak dolaşan analiz klinik Onkoloji gelişimi için değerli bir araç haline gelmiştir. Ancak, bu yöntem uygulama ctDNA kan eser miktarda analiz onun düşük duyarlılık nedeniyle zordur. Ayrıca, yöntem bu sıralama ve sonraki analiz yanlış pozitif ve negatif sonuçlar oluşturabilir. Fizibilite ve ctDNA algılama klinikte güvenilirliğini artırmak için burada sıralama, nadir mutasyon sıralama (ER-Seq) zenginleştirmek için nadir mutasyonlar zenginleştiren bir tekniği mevcut. ER-Seq son derece düşük frekanslı genetik değişiklikleri algılamak için umut verici bir araçtır ve böylece hastalık heterogenicity okumak çok yararlı olacak tek bir mutasyon 1 x 107 vahşi tipi nükleotit, dışarı ayırabilirsiniz. Benzersiz sıralaması bağdaştırıcısı'nın ligasyonu sayesinde bu yöntem aynı zaman hataları uzmanlığından (anlam ve Antisens) için düzeltme iken, ctDNA molekülleri, verimli bir kurtarma sağlar. 1021 kb sondalar bizim seçim kapak üzerinde hedef bölgeleri ölçümü zenginleştiren 12 tümör tümör ile ilgili sürücü mutasyonların % 95'i. Bu maliyet-etkin ve evrensel yöntem genetik veri benzersiz olarak başarılı bir birikimi sağlar. Verimli bir şekilde arka planda hata filtreleme sonra ER-seq nadir mutasyonlar tam olarak algılayabilir. Bir örnek çalışma kullanarak, sonda tasarım, Kütüphane yapı ve hedef DNA yakalama yöntemleri, veri analizi iş akışı da dahil olmak üzere süre gösteren ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut. Genellikle bu yöntem taşımak için işlem 1-2 gün sürer.

ER-Seq içinde kullanılan zenginleştirilmiş hedef bölgeleri tablo 1' de gösterilen 1021 kb probları hangi kapakları 12 ortak tümörler gen mutasyonlarının % 95'den fazla. Bu sondalar çeşitli kanser hastalarının çoğunluğu için geçerli bu işlem sağlar. Ayrıca, bizim benzersiz sıralaması bağdaştırıcısı ve temel veritabanı tarama nadir mutasyonlar kesin olarak tespit etmek mümkün kılar.
<p class="jove_content" fo:keep-to...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing at JoVE.com

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

Bu el yazması mutasyonlar düşük frekans ctDNA, ER-Seq. algılamak için bir teknik anlatılmaktadır Bu yöntem iki yönlü hata düzeltmesi, özel arka plan filtre ve verimli moleküler acquirement eşsiz kullanımı tarafından ayrıştırılan.

Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

detection-of-rare-mutations-in-ctdna-using-next-generation-sequencing

Research

JoVE Journal

Cancer Research

16.7K Görüntüleme.  Geneplus-Beijing Institute. Bu el yazması mutasyonlar düşük frekans ctDNA, ER-Seq. algılamak için bir teknik anlatılmaktadır Bu yöntem iki yönlü hata düzeltmesi, özel arka plan filtre ve verimli moleküler acquirement eşsiz kullanımı tarafından ayrıştırılan.

Video: Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific molecular profiles of a tumor may predict responsiveness to therapeutic agents or provide knowledge about prognosis. At our institution a tumor genotyping program was established as part of routine clinical care, screening both hematologic and solid tumors for a wide spectrum of mutations using two next-generation sequencing (NGS) panels: a custom, 33 gene hematological malignancies panel for use with peripheral blood and bone marrow, and a commercially produced solid tumor panel for use with formalin-fixed paraffin-embedded tissue that targets 47 genes commonly mutated in cancer. Our workflow includes a pathologist review of the biopsy to ensure there is adequate amount of tumor for the assay followed by customized DNA extraction is performed on the specimen. Quality control of the specimen includes steps for quantity, quality and integrity and only after the extracted DNA passes these metrics an amplicon library is generated and sequenced. The resulting data is analyzed through an in-house bioinformatics pipeline and the variants are reviewed and interpreted for pathogenicity. Here we provide a snapshot of the utility of each panel using two clinical cases to provide insight into how a well-designed NGS workflow can contribute to optimizing clinical outcomes.

This manuscript describes clinical protocols for two next-generation sequencing panels. One panel interrogates hematologic malignancies while the other panel targets genes commonly mutated in solid tumors. Molecular classification of driver mutations in human malignancies offers valuable prognostic and predictive information.

Katı ve Sıvı Tümörlerinde harekete geçirici Mutasyonlar Tespiti için Yeni Nesil Dizi

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Kanser Araştırmaları

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging resistance mutations during therapy, or when patients have few circulating tumor cells. Wild-type blocking PCR followed by sequencing analysis offers high sensitivity, flexibility, and simplicity as a methodology for detecting these low frequency mutations. By adding a custom designed locked nucleic acid oligonucleotide to a new or previously established conventional PCR based sequencing assay, sensitivities of approximately 1 mutant allele in a background of 1,000 WT alleles can be achieved (1:1,000). Sequencing artifacts associated with deamination events commonly found in formalin fixed paraffin embedded tissues can be partially remedied by the use of uracil DNA glycosylase during extraction steps. The optimized protocol here is specific for detecting MYD88 mutation, but can serve as a template to design any WTB-PCR assay. Advantages of the WTB-PCR assay over other commonly utilized assays for the detection of low frequency mutations including allele specific PCR and real-time quantitative PCR include fewer occurrences of false positives, greater flexibility and ease of implementation, and the ability to detect both known and unknown mutations.

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

Yabani tip PCR Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonlar Tespiti için oldukça hassas bir yöntem olarak doğrudan bölme imkanı Kombine Engelleme

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Genetik

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently developed method uses a medical wire functionalized with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies for in vivo isolation of circulating tumor cells (CTCs)1. A patient-matched cohort in non-metastatic prostate cancer showed that the in vivo isolation technique resulted in a higher percentage of patients positive for CTCs as well as higher CTC counts as compared to the current gold standard in CTC enumeration. As cells cannot be recovered from current medical devices, a new functionalized wire (referred to as Device) was manufactured allowing capture and subsequent detachment of cells by enzymatic treatment. Cells are allowed to attach to the Device, visualized on a microscope and detached using enzymatic treatment. Recovered cells are cytocentrifuged onto membrane-coated slides and harvested individually by means of laser microdissection or micromanipulation. Single-cell samples are then subjected to single-cell whole genome amplification allowing multiple downstream analysis including screening and target-specific approaches. The procedure of isolation and recovery yields high quality DNA from single cells and does not impair subsequent whole genome amplification (WGA). A single cell&#39;s amplified DNA can be forwarded to screening and/or targeted analysis such as array comparative genome hybridization (array-CGH) or sequencing. The device allows ex vivo isolation from artificial rare cell samples (i.e. 500 target cells spiked into 5 mL of peripheral blood). Whereas detachment rates of cells are acceptable (50 - 90%), the recovery rate of detached cells onto slides spans a wide range dependent on the cell line used (&#60;10 - &#62;50%) and needs some further attention. This device is not cleared for the use in patients.

This protocol is to recover and prepare rare target cells from a mixture with non-target background cells for molecular genetic characterization at the single-cell level. DNA quality is equal to non-treated single cells and allows for single-cell application (both screening based and targeted analysis).

Hedef hücre ön zenginleştirme ve tüm genom amplifikasyon tek hücre aşağı akım karakterizasyonu için

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. In the clinical setting, formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues are widely used for genetic testing. However, FFPE DNA is generally damaged and fragmented during the fixation process with formalin. Therefore, FFPE DNA is sometimes not adequate for genetic testing because of low quality and quantity of DNA. Here we present a method of touch imprint cytology (TIC) to obtain genomic DNA from cancer cells, which can be observed under a microscope. Cell morphology and cancer cell numbers can be evaluated using TIC specimens. Furthermore, the extraction of genomic DNA from TIC samples can be completed within two days. The total amount and quality of TIC DNA obtained using this method was higher than that of FFPE DNA. This rapid and simple method allows researchers to obtain high-quality DNA for genetic testing (e.g., next generation sequencing analysis, digital PCR, and quantitative real time PCR) and to shorten the turnaround time for reporting results.

Obtaining high-quality genomic DNA from tumor tissues is an essential first step for analyzing genetic alterations using next generation sequencing. In this article, we present a simple and rapid method to enrich tumor cells and obtain intact DNA from touch imprint cytology specimens.

Yüksek kaliteli tümör DNA klinik-patolojik numunelerin Touch Künye Sitoloji kullanarak elde etmek için basit ve hızlı yöntemi

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis as well as for the treatment selection and its response in cancer patients. The current gold standard method for detecting tumor mutations involves a genetic test of tumor DNA by means of tumor biopsies. However, this invasive method is difficult to be performed repeatedly as a follow-up test of the tumor mutational repertoire. Liquid biopsy is a new and emerging technique for detecting tumor mutations as an easy-to-use and non-invasive biopsy approach.
Cancer cells multiply rapidly. In parallel, numerous cancer cells undergo apoptosis. Debris from these cells are released into a patient&#8217;s circulatory system, together with finely fragmented DNA pieces, called cell-free DNA (cfDNA) fragments, which carry tumor DNA mutations. Therefore, for identifying cfDNA based biomarkers using liquid biopsy technique, blood samples are collected from the cancer patients, followed by the separation of plasma and buffy coat. Next, plasma is processed for the isolation of cfDNA, and the respective buffy coat is processed for the isolation of a patient&#39;s genomic DNA. Both nucleic acid samples are then checked for their quantity and quality; and analyzed for mutations using next-generation sequencing (NGS) techniques.
In this manuscript, we present a detailed protocol for liquid biopsy, including blood collection, plasma, and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

In this paper we present a detailed protocol for non-invasive liquid biopsy technique, including blood collection, plasma and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

Kanser Hastalarının Kan Plazma Örneklerinde Hücresiz DNA Tespiti

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using bioinformatics pipelines (&#34;dry bench&#34;). Both elements are essential to produce accurate and reliable results, which are particularly critical for clinical laboratories. Targeted NGS technologies have increasingly found favor in oncology applications to help advance precision medicine objectives, yet the methods often involve disconnected and variable wet and dry bench workflows and uncoordinated reagent sets. In this report, we describe a method for sequencing challenging cancer specimens with a 21-gene panel as an example of a comprehensive targeted NGS system. The system integrates functional DNA quantification and qualification, single-tube multiplexed PCR enrichment, and library purification and normalization using analytically-verified, single-source reagents with a standalone bioinformatics suite. As a result, accurate variant calls from low-quality and low-quantity formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fine-needle aspiration (FNA) tumor biopsies can be achieved. The method can routinely assess cancer-associated variants from an input of 400 amplifiable DNA copies, and is modular in design to accommodate new gene content. Two different types of analytically-defined controls provide quality assurance and help safeguard call accuracy with clinically-relevant samples. A flexible &#34;tag&#34; PCR step embeds platform-specific adaptors and index codes to allow sample barcoding and compatibility with common benchtop NGS instruments. Importantly, the protocol is streamlined and can produce 24 sequence-ready libraries in a single day. Finally, the approach links wet and dry bench processes by incorporating pre-analytical sample quality control results directly into the variant calling algorithms to improve mutation detection accuracy and differentiate false-negative and indeterminate calls. This targeted NGS method uses advances in both wetware and software to achieve high-depth, multiplexed sequencing and sensitive analysis of heterogeneous cancer samples for diagnostic applications.

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

Düşük kaliteli ve düşük miktar Tümör Biyopsilerinde ve Islak ve kuru Bench Süreçleri Entegrasyonu Hedefli optimize eder nesil Sıralama

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

Tıp

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Efforts to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The establishment of high-throughput, massively parallel "next-generation" sequencing has aided the discovery of many such mutations. To enhance the clinical and translational utility of this technology, platforms must be high-throughput, cost-effective, and compatible with formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue samples that may yield small amounts of degraded or damaged DNA. Here, we describe the preparation of barcoded and multiplexed DNA libraries followed by hybridization-based capture of targeted exons for the detection of cancer-associated mutations in fresh frozen and FFPE tumors by massively parallel sequencing. This method enables the identification of sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving all targeted genes. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus conferring high sensitivity for detecting low frequency mutations.

We describe the preparation of barcoded DNA libraries and subsequent hybridization-based exon capture for detection of key cancer-associated mutations in clinical tumor specimens by massively parallel "next generation" sequencing. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus yielding high sensitivity for detecting low frequency mutations.

Ekson yakalama ve Devasa Paralel Dizilimine tarafından Tümör Örneklerinin somatik genetik değişiklikler tespit

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Biyoloji

Droplet Digital Polymerase Chain Reaction: A Method to Generate Nanodroplet PCR Reactions for Detecting Rare Tumor Mutations

Source: Bonner, E. R. et al. <a href="https://www.jove.com/video/59721" target="_blank">Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids.</a> J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we present a step-by-step procedure to generate emulsified nano-droplets to detect target nucleic acids by digital polymerase chain reaction or dPCR.

Damlacık Dijital Polimeraz Zincir Reaksiyonu: Nadir Tümör Mutasyonlarını Tespit Etmek için Nanodamlacık PCR Reaksiyonları Oluşturmak İçin Bir Yöntem

Source: Bonner, E. R. et al. Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids. J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we ...