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の腫瘍の標本、血液サンプルは、北京大学人々 の倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って得られた &#39; s 病院。書面によるインフォームド コンセントは、それらのサンプルを使用する患者から得られました。参加者は、次の基準に従って上映: 女性、非小細胞肺癌を高度な egfr 遺伝子の 2 つのセッションの後、病気の進行、エルロチニブ併用療法を対象とした、以前サンガー シーケンスによって示される egfr 遺伝子の p.L858R 変異と抵抗の原因を分析し、新薬のターゲットを見つけるに葉緑体に適用した ER-Seq。
 1 です。 cfDNA とゲノム DNA (gDNA) の末梢血からの DNA 抽出 <ol><li>10 mL 採取管の末梢血を収集、反転優しく上下 6-8 回をミックス。細胞の剪断を避けるため。72 時間 6-37 ° C でコレクションの管に血液サンプルを格納できます</li>。
	<li>1600 (± 150) で 10 分間室温でコレクションの管を遠心分離機 g. x</li>
	<li>コレクションの管からペレット層 (白血球) を乱すことがなく使い捨てピペットを用いた遠心管を適切にラベル 4 つのきれいな 2 mL に上清 (プラズマ) を転送します</li>。
	きれいな使い捨てピペット 2 ml を適切に使用するセルの <li>Transfer1 mL 遠心管をラベル付けされます。セルは、-20 ° C で保存またはステップ 1.8 の前に寒いをすることができます</li>。
	<li>遠心分離機の 4 ° C で 10 分間の 16000 (± 150) (手順 1.3) からプラズマ x の g.</li>
	<li>転送として正しくラベル付け遠沈管をきれいにするプラズマ &#34; プラズマ &#34;、汚染を避けるために下部 ~0.1 mL 残気量を残します。ステップ 1.7 まで-80 ° C でプラズマを格納します</li>。
	<li>CfDNA (緯度が含まれています) を分離するステップ 1.6 からプラズマ 3 mL を使用して次のメーカー市販のキットを使用して &#39; の指示</li>。
	<li>次のメーカー市販のキットを使用して gDNA を分離する手順 1.3 から白血球細胞の使用 200 μ L &#39; の指示 。
	注: 両方 cfDNA と gDNA を使用する前に-20 ° C で保存できます</li>。
	<li>は、cfDNA と gDNA (表 2) のさまざまな品質コントロールを適用します。バイオアナライザー サンプル劣化や gDNA 汚染のレベルを決定するための標準化された方法によって品質管理を実行します。CfDNA 抽出の質のピーク解析を 図 1 のように表示されます 。
	注: cfDNA のピーク時のサイズは約 170 跪く注 cfDNA でまれな突然変異の検出に効果的で高品質ライブラリである DNA の量を増やすこと。少なくとも 30 ng cfDNA (30,000 枚) の使用をお勧めします</li>。
</ol> 2。図書館準備 注: 断片化された DNA の基本ライブラリ構築に関する cfDNA ピーク サイズ 〜 170 bp の断片的に存在して、断片化される必要はありません。
200-250 bp フラグメントを取得する超音波処理によって <ol><li>フラグメント コントロール サンプル (gDNA)。
	<ol><li>GDNA クリーン超音波管内トリス EDTA バッファーの 100 μ L のサンプルの準備 1 μ g.</li>
		<li>超音波処理プログラムを 30 として設定 s 12 分の合計のための 12 のサイクルをオフにおよび 30 s</li>
		<li>、超音波処理後製品 (5 μ L) 2% の agarose のゲルの分析を実行して、200-250 bp の断片が含まれて確認します</li>。
		<li>の断片化のすべての製品を新しい 1.5 mL チューブに転送し、正しいフラグメントを選択する 5 分用の磁気ビーズの 150 μ L でインキュベートします</li>。
		<li>磁気ラック 30 用に管を置くことによって上澄みを除去 s ・</li>
		<li>は、磁気のラックの上にチューブ (新鮮な) 80% エタノール 200 μ L でビーズを洗ってください。30 間インキュベート上澄みを削除する前に s。もう一度繰り返します</li>。
		<li>エアー乾燥管蓋が磁気ラックにとどまっている間開いたままビーズです。DNA ターゲットがうまく回復するかどうかを確認する overdried ビーズを避けてください。紫外/可視分光法による定量化続く DNA のフラグメントを解決するビーズに 10 mm トリス-HCl (pH 8) 32 μ L を追加することによってビーズからの DNA のフラグメントを溶出します 。
		注: 少なくとも 200 ng は次の実験に必要な</li>。
	</ol></li> <li>終わり準備反応 注: フォロー メーカー &#39; s 命令し必要に応じて変更します。CfDNA; の使用 30 ngコントロールと gDNA 1 μ g。
	滅菌ヌクレアーゼ フリー チューブで cfDNA の <ol><li>を追加 7 μ L 反応バッファー、酵素ミックス、30 の 3 μ L の ng ddH 2 O 60 μ L の容量を追加するとします。別のチューブで上記のコンポーネントを追加、1 μ g の cfDNA ではなく gDNA</li>。
		<li>ミックスと 20 ° C、30 分続いて、たちで 30 分の 65 ° C 加熱蓋なしで混合物を孵化させなさい。次のステップに進んでください</li>。
	</ol></li> <li>アダプター結紮 <ol><li>結紮マスター ミックスの追加 30 μ L、結紮エンハンサーの 1 μ L と 2.2 の段階から混合物に一意のシーケンス アダプターの 4 μ L.</li>
		<li>20 の ° c 加熱蓋なしたちで 15 分間加温します</li>。
		<li>磁気ビードを再停止しなさい、次のステップの前に少なくとも 30 分間室温でビーズを残して渦</li>。
		<li>前述のように混合物に再懸濁の磁気ビーズの 87 μ L を追加; 上下ピペッティングでよく混ぜるし 5 分間室温でインキュベート</li>
		<li>洗浄し、空気乾燥ビーズ ステップ 2.1 で説明されているようです</li>。
		<li>10 mM トリス-HCl (pH 8) の 20 μ L を追加することによってビーズから DNA ターゲットを溶出します</li>。
	</ol></li> <li>アダプターと結紮濃縮 DNA 断片 <ol><li>追加 20 μ L アダプター結紮 DNA のフラグメント化、インデックス プライマー/i7 の 5 μ L (2.5 μ L プライマー P7 (22) とシーケンス用プライマー P5 (22) の 2.5 μ L) の 25µLライブラリ増幅マスター ミックスと ddH 2 O 50 μ L の総ボリュームにします</li>。
		<li>PCR 増幅アダプター結紮 DNA と熱サイクル通り: 45 98 ° C で初期変性 s、15 ° C の熱処理の後に 8 サイクル (cfDNA) または 4 サイクル (gDNA) s、65 ° C、30 s、72 ° C、30 s)、および 60 のための 72 ° C で最終的な拡張 s、4 で温度を保持し、° C</li>
		<li>に買収したフラグメントを取得する DNA を PCR 濃縮浮遊磁気ビーズの追加 45 μ L.</li>
		<li>溶出 DNA 断片の 10 mm トリス-HCl (pH 8) 30 μ L でアダプターを使用します</li>。
	</ol></li> <li>ライブラリ品質管理 <ol><li>製造元に従う &#39; s プロトコル アダプターを測定する市販キットの結紮 DNA 濃度。バイオアナライザーを使用して DNA の品質を決定します</li>。
	</ol></li></ol> 3。ターゲット DNA キャプチャ 注: ターゲット濃縮を特別に設計されたカスタム シーケンス キャプチャ ・ プローブを使用してカバーする 12 から知られている腫瘍関連ドライバー変異 1021 kb ターゲット濃縮地域をして行った異なったタイプの腫瘍です。メーカーに変更 &#39; s プロトコルの詳細については、次の手順を実行します。
<ol><li>ライブラリをプールのブロック <ol><li>追加 1.5 μ g (cfDNA のプールにライブラリの最大数は 6、gDNA は 20) ステップ 2 で P5 Block(100P) P7 Block(100P) の 8 μ L、5 μ L ベッド 1 DNA の 8 μ L (1 μ g/μ L) 生殖不能の管に。60 に設定真空濃縮を使用して管の内容を乾燥 ° C</li>
	</ol></li> <li>DNA キャプチャ プローブ ライブラリを交配させる。
	<li>3.1: 8.5 μ L 2 X 交配バッファー、交配エンハンサーとヌクレアーゼ フリー ddH 2 O. 1.8 μ L の 2.7 μ L のステップからチューブに次のコンポーネントを追加</li> <ol>
		<li>ミックスで上下にピペッティングおよび 95 ° C で 10 分間で thermomixer で孵化させなさい</li>
		<li>次の孵化、すぐにカスタム プローブの 4 μ L を追加。65 ・ #17 でサーマルサイクラーにサンプルをインキュベートします。6;4 h の 75 ° C に加熱してふた付き C</li>
	</ol></li> <li>DNA 断片のキャプチャ <ol><li>非連結の DNA を削除するビーズ洗浄続いてストレプトアビジン ビーズを交配させられたターゲット DNA を孵化させなさい。メーカーによると市販のキットを使用して &#39; フラグメントのキャプチャされた DNA の再懸濁のビーズの最終的な 20 μ L を得るための指示します</li>。
	</ol></li> <li>キャプチャされた DNA の増幅断片 <ol><li>コマーシャルを使用して実行の PCR は、メーカーによると 2 μ M のバックボーンのオリゴヌクレオチド、キット &#39; の指示</li>。
		<li>ビーズ 10 mm トリス-HCl (pH 8) 30 μ L の溶出によってバインドされる増幅対象 DNA のフラグメントの場合、PCR の反作用が完了すると、PCR の製品に直接中断されたビーズの 45 μ L を追加豊か</li>。
	</ol></li> <li>ライブラリ定量キットと DNA のフラグメントを定量化し、バイオアナライザー ( 図 2) で平均フラグメントの長さを決定します</li></ol>。
 4 シーケンス <ol><li>シーケンスが生成された 18 h 合計データは最大 60 ギガバイト ベンチトップ シーケンサー上で 75 bp ペアエンド動作を使用してライブラリを多重化、15 G は制御サンプル gDNA 患者サンプル cfDNA と 1 G 必要です。</li></ol>。
 5。 データ解析ワークフロー 注: 図 3 一般的な作業の流れとデータ分析のプロセスが表示されます。データ解析パラメーターとコマンドは以下に示す。
<ol><li>低画質読み取りのフィルター処理、エラーおよび NCfilter を使用して UID のマスキング用に修正します 。
	NCfilter(own) NCfilter フィルター -l 5 - q 0.5 n 0.1 T 3 G-1 fastq1-2 fastq2 realSeq(own) python 箱/realRealSeq MaskUID-1 fq1-2 fq2 o 出力ディレクトリ -p プレフィックス -u 4 s 7 m 3 -i uidFile-f.</li>
	<li>参照ゲノム hg19 (ヒトゲノム 19) を見つけて mem BWA (バージョン 0.7.12-r1039) を使用して結果を配列ゲノム解析ツールキット (GATK) (バージョン 3.4-46-gbc02625) を再編成します 。
	bwa mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2 java-d64-サーバー - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g - Xmx10g - Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar T RealignerTargetCreator R hg19 -L targetRegion-dbsnp 知られている &#8212; 
	allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 - 私 cancerBam-私 normalBam java-d64-サーバー - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g &#8212; Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar T IndelRealigner R hg19-dbsnp を知られています。 - allowPotentiallyMisencodedQuals &#8212; targetIntervals 間隔-私 cancerBam-私 normalBam</li>
	<li>クラスター UID と拠点 PCR/シーケンスによって導入された、基本品質を変更エラーを修正テンプレート フラグメントの位置によると重複します 。
	realSeq(own) python realSeq/箱/realSeq クラスター b unmarkdup_sort_merge.bam - r chipRegion -o しかし-p プレフィックス -m 6</li> <li>BWA 槍玉によるクラスターの重複を再調整 
	bwa mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2</li> <li>GATK (バージョン 3.4-46-gbc02625) を使用して基本品質スコアの再校正に続いてローカル再編を実行します 。
	付近の再編: java-d64-サーバー - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar T RealignerTargetCreator R hg19 -L targetRegion-dbsnp allowPotentiallyMisencodedQuals を知られている -nt 10● cancerBam-私 normalBam java-d64-サーバー - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar T IndelRealigner R hg19-dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals-targetIntervals を知られています。間隔-私 cancerBam-私 normalBam 基本品質スコア再校正: java-d64-サーバー - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/- GenomeAnalysisTK.jar -T の瓶 BaseRecalibrator R hg19 -L targetRegion -knownSites dbsnp - knownSites 宇宙 allowPotentiallyMisencodedQuals 高専 10 - 私 bam-o grp java-d64-サーバー - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-GenomeAnalysisTK.jar -T の jar PrintReads-私 bam - BQSR grp ooutbam -R hg19 高専 8 - allowPotentiallyMisencodedQuals</li> <li>SNV (単一ヌクレオチドのバリアント) や塩基 (小さな挿入または削除) を呼び出す、低周波変異の精度はさらに確認 GSR (良いサポート読み取り) で両方の前方および逆引きのストランドを読むペアと対照群 (生殖細胞系突然変異) とベースライン データベースによるろ過します 。
	realDcaller(own) python realDcaller -f hg19 - r chipRegion - C baselineDB - O-L 2 cancerBam normalBam -p 30</li> <li>CNV (コピー数変異) を呼び出すのためのコントロールとして基準サンプルを使用します 。
	NCcnv(own) python NCcnv -o cnvdir -t tmpdir - r chipRegion cnv - normgt normalBam - tumgt cancerBam - repdb repeatMarsk</li> <li>Realigned、マップされていないクリップと耳障りなペアの読み取り SV (構造変化) を呼び出します 。
	NCsv(own) python NCsv-t tmpdir - r hg19-o outputdir x トラン スクリプト -w bwapath -n 4 normalBam cancerBam</li></ol>

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

しかし葉緑体解析法の応用はまだ臨床ルーチンではない循環腫瘍 DNA (葉緑体) の存在は 30 年以上も前を発見されました。葉緑体メソッドの実用的なアプリケーションに興味は、葉緑体の検出・解析技術の開発と増加しています。腫瘍監視緯度微小残存病変、療法および腫瘍の進化と腫瘍内の不均一性の13、背景の下で腫瘍分子プロファイルへの応答の評価のための低侵襲...

次世代シーケンス (NGS) ゲノムの謎を調査するための強力なツールは、大量の情報は、遺伝子変異を明らかにする可能性を提供できます。クリニックで NGS 解析のアプリケーションより一般的な特に個人化された薬のためになりました。NGS の最大の制限の 1 つは、高いエラー率です。勉強の受継がれた突然変異に最適と判断されるがまれな突然変異の解析は大幅に制限された1,2, 特に「液体生検」から得られた DNA を分析です。
DNA (葉緑体) 腫瘍を循環腫瘍細胞から流された血の DNA (cfDNA) では。ほとんどの場合、葉緑体の量は極めて低いを作るその検出と分析非常に挑戦的です。ただし、緯度は多くの魅力的な機能: その分離は低侵襲、それが腫瘍の成長の初期の段階で検出できる、葉緑体レベルは、治療効果を反映、葉緑体を含むプライマリおよび転移性の病変は、DNA の変異3,4,5します。 したがって、NGS の手法と分析の急速な発展を考えると、葉緑体の検出アプリケーションがより魅力的になります。
大量並列シーケンスの異なるアプローチは、葉緑体の検出のため利用されているが、これらの方法のどれも彼らの制限のための診療所で日常的に受け入れられている: 低感度、汎用性の欠如、コストが比較的高い6 ,7,8。たとえば、両面印刷順序は、一意の識別子 (UID)、タグに基づいて繰り返しほとんどのシーケンス エラーの是正、コンセンサスの双方向でのエラーを修正します。ただし、この手法の有効性は、その高コストと低データ利用9,10のため失われます。同様に、CAPP Seq およびその改良型反復、CAPP IDE11,12、大きい実用性にある cfDNA 検出精度とこれらの方法の普遍性改善が必要、
正確な緯度の検出と解析のための現在の必要性を満たすためには、我々 は豊かにまれな変異配列 (ER Seq)、新しい戦略を開発しました。このアプローチを組み合わせた次: 緯度分子、双方向エラー訂正とのうち単一の突然変異を区別する能力を効率的に回復するユニークなシーケンス アダプター &#62; 1 × 107野生型ヌクレオチド;豊かにそのカバーの上ターゲット領域の測定プローブは 1021 kb 12 腫瘍、肺癌、大腸癌、胃癌、乳癌、腎臓癌、膵臓癌、肝臓癌、甲状腺癌などの腫瘍関連遺伝子変異の 95%子宮頸癌、食道癌、子宮体癌 (表 1)。ベースライン データベースが効率的かつ正確に葉緑体のまれな突然変異を検出する簡単なことをスクリーニングします。
ベースライン データベースを構築するには、サンプル (冒頭 ~ 1000) のタイプの同じ数から ER Seq によってすべての遺伝子変異を見つけます。これらの実際の突然変異は、いくつかの他の信頼性の高い検出方法および分析によって確認されなければなりません。次に、偽の突然変異のパターンを要約し、クラスターの最初のベースライン データベースを構築するすべての偽の突然変異。このデータベースにそれに続くシーケンス実験から発見された偽の変異を追加していきます。したがって、このベースライン データベース配列決定精度が大幅に向上、動的拡張のデータベースとなります。
腫瘍診断および監視の進歩を促進するため、ER-Seq、普遍的なデータの取得のため低コストかつ実現可能な手法を提案する.クリニックでまれな突然変異との使用のための可能性を検出するための精度を示す ER Seq 解析を施行した症例の検討を提案します。

<table><tbody><tr><td>QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit</td><td>Qiagen</td><td>55114</td><td>DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51105</td><td>DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>Measure cfDNA concentration</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA BR Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32853</td><td>Measure library concentration</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 Reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-1504</td><td>Measure cfDNA and library fragments</td></tr><tr><td>The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina</td><td>NEB</td><td>E7645L</td><td>Library Preparation</td></tr><tr><td>Agencourt SPRIselect Reagent</td><td>Beckman</td><td>B23317</td><td>DNA fragment screening and purification</td></tr><tr><td>Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML</td><td>Sigma</td><td>93283</td><td>Dissolution</td></tr><tr><td>xGen Lockdown Probes</td><td>IDT</td><td>&amp;mdash;&amp;mdash;</td><td>xGen Custom Probe</td></tr><tr><td>Human Cot-1 DNA</td><td>Life</td><td>15279-011</td><td>Targeted DNA capture</td></tr><tr><td>Dynabeads M-270 Streptavidin</td><td>Life</td><td>65305</td><td>Targeted DNA capture</td></tr><tr><td>xGen Lockdown Reagents</td><td>IDT</td><td>1072281</td><td>Targeted DNA capture</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>KAPA</td><td>KK2602</td><td>post-capture PCR enrichment libraries</td></tr><tr><td>KAPA Library Quantification Kit</td><td>KAPA</td><td>KK4602</td><td>Measure library concentration</td></tr><tr><td>NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles)</td><td>illumina</td><td>FC-404-2002</td><td>Sequence</td></tr><tr><td>Centrifuge5810</td><td>eppendorf</td><td>5810</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop8000</td><td>Thermo Scientific</td><td>8000</td><td>Measure gDNA concentration</td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Quantify</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>eppendorf</td><td></td><td>Incubation</td></tr><tr><td>16-tube DynaMagTM-2 Magnet</td><td>Life</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Concentrator plus</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>AB</td><td>simplyamp</td><td></td></tr><tr><td>QPCR</td><td>AB</td><td>7500Dx</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500</td><td>illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detection of rare mutations in ctdna using next generation sequencing

次世代シーケンス (NGS) を用いた腫瘍 DNA (葉緑体) の循環の解析臨床腫瘍学の発展のための貴重なツールとなっています。ただし、このメソッドのアプリケーションは葉緑体血液中のトレース量の分析で低感度のために挑戦。さらに、メソッドは、この順序付けとその後の分析から偽の肯定的な否定的な結果を生成する可能性があります。実現可能性とクリニックで葉緑体検出の信頼性を向上させるため、ここで紹介豊かにまれな変異配列 (ER Seq) 配列のためまれな突然変異を豊かにする手法。ER Seq 1 x 107野生型ヌクレオチドから超低周波の遺伝子変異を検出する有望なツールになりますし、したがって病 heterogenicity の勉強に非常に役に立つでしょう単一の突然変異を識別できます。ユニークなシーケンス アダプターの ligation のおかげでは、このメソッドは、双方向のエラー (センスおよびアンチセンス) を同じ時間補正が葉緑体分子の効率的な回復をできます。1021 kb プローブの我々 の選択を豊かにそのカバーの上ターゲット領域の測定 12 腫瘍における腫瘍関連ドライバー変異の 95%。この費用対効果および普遍的な方法は一意に成功した遺伝的データ蓄積をできます。グラウンドでエラーを効率的にフィルター処理後 ER seq はまれな突然変異を正確に検出できます。事例を使用して、データ解析のワークフローも、プローブの設計、図書館の建設や、ターゲット DNA キャプチャ方法論を示す詳細なプロトコルを提案する.通常このメソッドを実行するプロセスは、1-2 日かかります。

1021 kb プローブの ER Seq で使用される濃縮対象地域は、表 1に示すように 12 の共通の腫瘍における遺伝子変異の 95% 以上をカバーします。これらのプローブの広い範囲は、癌患者の大半に適用されるこのプロセスになります。さらに、当社独自シーケンス アダプターとベースライン データベース スクリーニング、まれな突然変異を正確に検出...

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Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

本稿では葉緑体 ER 以下の低頻度の変異を検出するための手法を説明しますこのメソッドは、2 方向エラー訂正、特別なバック グラウンド フィルター、および分子の効率的な獲得の独自の使用によって区別されます。

次世代シーケンシングによる葉緑体の稀な遺伝子変異の検出

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

detection-of-rare-mutations-in-ctdna-using-next-generation-sequencing

Research

JoVE Journal

Cancer Research

16.7K ビュー.  Geneplus-Beijing Institute. 本稿では葉緑体 ER 以下の低頻度の変異を検出するための手法を説明しますこのメソッドは、2 方向エラー訂正、特別なバック グラウンド フィルター、および分子の効率的な獲得の独自の使用によって区別されます。

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Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific molecular profiles of a tumor may predict responsiveness to therapeutic agents or provide knowledge about prognosis. At our institution a tumor genotyping program was established as part of routine clinical care, screening both hematologic and solid tumors for a wide spectrum of mutations using two next-generation sequencing (NGS) panels: a custom, 33 gene hematological malignancies panel for use with peripheral blood and bone marrow, and a commercially produced solid tumor panel for use with formalin-fixed paraffin-embedded tissue that targets 47 genes commonly mutated in cancer. Our workflow includes a pathologist review of the biopsy to ensure there is adequate amount of tumor for the assay followed by customized DNA extraction is performed on the specimen. Quality control of the specimen includes steps for quantity, quality and integrity and only after the extracted DNA passes these metrics an amplicon library is generated and sequenced. The resulting data is analyzed through an in-house bioinformatics pipeline and the variants are reviewed and interpreted for pathogenicity. Here we provide a snapshot of the utility of each panel using two clinical cases to provide insight into how a well-designed NGS workflow can contribute to optimizing clinical outcomes.

This manuscript describes clinical protocols for two next-generation sequencing panels. One panel interrogates hematologic malignancies while the other panel targets genes commonly mutated in solid tumors. Molecular classification of driver mutations in human malignancies offers valuable prognostic and predictive information.

固体と液体の腫瘍におけるアクショナブル変異の検出のための次世代シーケンシング

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

がん研究

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging resistance mutations during therapy, or when patients have few circulating tumor cells. Wild-type blocking PCR followed by sequencing analysis offers high sensitivity, flexibility, and simplicity as a methodology for detecting these low frequency mutations. By adding a custom designed locked nucleic acid oligonucleotide to a new or previously established conventional PCR based sequencing assay, sensitivities of approximately 1 mutant allele in a background of 1,000 WT alleles can be achieved (1:1,000). Sequencing artifacts associated with deamination events commonly found in formalin fixed paraffin embedded tissues can be partially remedied by the use of uracil DNA glycosylase during extraction steps. The optimized protocol here is specific for detecting MYD88 mutation, but can serve as a template to design any WTB-PCR assay. Advantages of the WTB-PCR assay over other commonly utilized assays for the detection of low frequency mutations including allele specific PCR and real-time quantitative PCR include fewer occurrences of false positives, greater flexibility and ease of implementation, and the ability to detect both known and unknown mutations.

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

低周波体細胞変異の検出のための高感度な方法として直接配列決定と組み合わせるPCRをブロックする野生型

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

遺伝学

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal gastric mucosa. Recently, we detected CDH1a transcript variant in fresh-frozen tumor tissues obtained from patients with GC. The expression of this variant in tissue samples was investigated by the chip-based digital PCR (dPCR) approach presented here. dPCR offers the potential for an accurate, robust, and highly sensitive measurement of nucleic acids and is increasingly utilized for many applications in different fields. dPCR is capable of detecting rare targets; in addition, dPCR offers the possibility for absolute and precise quantification of nucleic acids without the need for calibrators and standard curves. In fact, the reaction partitioning enriches the target from the background, which improves amplification efficiency and tolerance to inhibitors. Such characteristics make dPCR an optimal tool for the detection of the CDH1a rare transcript.

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

The manuscript describes a chip-based digital PCR assay to detect a rare CDH1 transcript variant (CDH1a) in fresh-frozen normal and tumor tissues obtained from patients with gastric cancer.

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトラン スクリプト変種の検出

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The technique is highly efficient with millions of sequencing reads being produced in a short time span and at relatively low cost. Specifically, targeted NGS is able to focus investigations to genomic regions of particular interest based on the disease of study. Not only does this further reduce costs and increase the speed of the process, but it lessens the computational burden that often accompanies NGS. Although targeted NGS is restricted to certain regions of the genome, preventing identification of potential novel loci of interest, it can be an excellent technique when faced with a phenotypically and genetically heterogeneous disease, for which there are previously known genetic associations. Because of the complex nature of the sequencing technique, it is important to closely adhere to protocols and methodologies in order to achieve sequencing reads of high coverage and quality. Further, once sequencing reads are obtained, a sophisticated bioinformatics workflow is utilized to accurately map reads to a reference genome, to call variants, and to ensure the variants pass quality metrics. Variants must also be annotated and curated based on their clinical significance, which can be standardized by applying the American College of Medical Genetics and Genomics Pathogenicity Guidelines. The methods presented herein will display the steps involved in generating and analyzing NGS data from a targeted sequencing panel, using the ONDRISeq neurodegenerative disease panel as a model, to identify variants that may be of clinical significance.

Targeted next-generation sequencing is a time- and cost-efficient approach that is becoming increasingly popular in both disease research and clinical diagnostics. The protocol described here presents the complex workflow required for sequencing and the bioinformatics process used to identify genetic variants that contribute to disease.

対象に次世代シーケンサーとバイオインフォマティクス パイプライン体質性疾患の遺伝的決定因子を評価するには

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication stress, ionizing radiation, unrepaired UV damage), DSBs occur in most cells each day. In addition to cell death, unrepaired DSBs reduce genome integrity and the resulting mutations can drive tumorigenesis. These risks and the prevalence of DSBs motivate investigations into the mechanisms by which cells repair these lesions. Next generation sequencing can be paired with the induction of DSBs by ionizing radiation to provide a powerful tool to precisely define the mutations associated with DSB repair defects. However, this approach requires computationally challenging and cost prohibitive whole genome sequencing to detect the repair of the randomly occurring DSBs associated with ionizing radiation. Rare cutting endonucleases, such as I-Sce1, provide the ability to generate a single DSB, but their recognition sites must be inserted into the genome of interest. As a result, the site of repair is inherently artificial. Recent advances allow guide RNA (sgRNA) to direct a Cas9 endonuclease to any genome locus of interest. This could be applied to the study of DSB repair making next generation sequencing more cost effective by allowing it to be focused on the DNA flanking the Cas9-induced DSB. The goal of the manuscript is to demonstrate the feasibility of this approach by presenting a protocol that can define mutations that stem from the repair of a DSB upstream of the CD4 gene. The protocol can be adapted to determine changes in the mutagenic potential of DSB associated with exogenous factors, such as repair inhibitors, viral protein expression, mutations, and environmental exposures with relatively limited computation requirements. Once an organism's genome has been sequenced, this method can be theoretically employed at any genomic locus and in any cell culture model of that organism that can be transfected. Similar adaptations of the approach could allow comparisons of repair fidelity between different loci in the same genetic background.

Presented here is sgRNA/CAS9 endonuclease and next-generation sequencing protocol that can be used to identify the mutations associated with double strand break repair near the CD4 promoter.

次世代シーケンシングを使用して、CD4プロモーター近傍のCAS9誘導二本鎖切断の修復に関連する変異を同定

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using bioinformatics pipelines (&#34;dry bench&#34;). Both elements are essential to produce accurate and reliable results, which are particularly critical for clinical laboratories. Targeted NGS technologies have increasingly found favor in oncology applications to help advance precision medicine objectives, yet the methods often involve disconnected and variable wet and dry bench workflows and uncoordinated reagent sets. In this report, we describe a method for sequencing challenging cancer specimens with a 21-gene panel as an example of a comprehensive targeted NGS system. The system integrates functional DNA quantification and qualification, single-tube multiplexed PCR enrichment, and library purification and normalization using analytically-verified, single-source reagents with a standalone bioinformatics suite. As a result, accurate variant calls from low-quality and low-quantity formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fine-needle aspiration (FNA) tumor biopsies can be achieved. The method can routinely assess cancer-associated variants from an input of 400 amplifiable DNA copies, and is modular in design to accommodate new gene content. Two different types of analytically-defined controls provide quality assurance and help safeguard call accuracy with clinically-relevant samples. A flexible &#34;tag&#34; PCR step embeds platform-specific adaptors and index codes to allow sample barcoding and compatibility with common benchtop NGS instruments. Importantly, the protocol is streamlined and can produce 24 sequence-ready libraries in a single day. Finally, the approach links wet and dry bench processes by incorporating pre-analytical sample quality control results directly into the variant calling algorithms to improve mutation detection accuracy and differentiate false-negative and indeterminate calls. This targeted NGS method uses advances in both wetware and software to achieve high-depth, multiplexed sequencing and sensitive analysis of heterogeneous cancer samples for diagnostic applications.

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

ウェットとドライベンチ・プロセスの統合は、低品質と低量腫瘍生検の標的次世代シーケンシングを最適化

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

医学

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Efforts to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The establishment of high-throughput, massively parallel "next-generation" sequencing has aided the discovery of many such mutations. To enhance the clinical and translational utility of this technology, platforms must be high-throughput, cost-effective, and compatible with formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue samples that may yield small amounts of degraded or damaged DNA. Here, we describe the preparation of barcoded and multiplexed DNA libraries followed by hybridization-based capture of targeted exons for the detection of cancer-associated mutations in fresh frozen and FFPE tumors by massively parallel sequencing. This method enables the identification of sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving all targeted genes. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus conferring high sensitivity for detecting low frequency mutations.

We describe the preparation of barcoded DNA libraries and subsequent hybridization-based exon capture for detection of key cancer-associated mutations in clinical tumor specimens by massively parallel "next generation" sequencing. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus yielding high sensitivity for detecting low frequency mutations.

次世代シーケンシングによる葉緑体の稀な遺伝子変異の検出

要約

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固体と液体の腫瘍におけるアクショナブル変異の検出のための次世代シーケンシング

低周波体細胞変異の検出のための高感度な方法として直接配列決定と組み合わせるPCRをブロックする野生型

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトランスクリプト変種の検出

対象に次世代シーケンサーとバイオインフォマティクスパイプライン体質性疾患の遺伝的決定因子を評価するには

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

ホットスポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタルポリメラーゼの連鎖反応

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

次世代シーケンシングを使用して、CD4プロモーター近傍のCAS9誘導二本鎖切断の修復に関連する変異を同定

ウェットとドライベンチ・プロセスの統合は、低品質と低量腫瘍生検の標的次世代シーケンシングを最適化

エクソンキャプチャと超並列配列決定することにより腫瘍標本における体細胞遺伝子変異を検出する

次世代シーケンシングによる葉緑体の稀な遺伝子変異の検出

要約

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固体と液体の腫瘍におけるアクショナブル変異の検出のための次世代シーケンシング

低周波体細胞変異の検出のための高感度な方法として直接配列決定と組み合わせるPCRをブロックする野生型

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトラン スクリプト変種の検出

対象に次世代シーケンサーとバイオインフォマティクス パイプライン体質性疾患の遺伝的決定因子を評価するには

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

次世代シーケンシングを使用して、CD4プロモーター近傍のCAS9誘導二本鎖切断の修復に関連する変異を同定

ウェットとドライベンチ・プロセスの統合は、低品質と低量腫瘍生検の標的次世代シーケンシングを最適化

エクソンキャプチャと超並列配列決定することにより腫瘍標本における体細胞遺伝子変異を検出する

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトランスクリプト変種の検出

対象に次世代シーケンサーとバイオインフォマティクスパイプライン体質性疾患の遺伝的決定因子を評価するには

ホットスポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタルポリメラーゼの連鎖反応