Michael VanNieuwenhze (Indiana Üniversitesi) Resim 2 ve şekil 4kullanılan FDAAs hediye için teşekkür ediyoruz. Bu el yazması hazırlanması sırasında üye kahverengi laboratuarının geribildirim için teşekkür. A. tumefaciens hücre büyümesi ve bölünme kahverengi laboratuarında Araştırma Ulusal Bilim Vakfı (IOS1557806) tarafından desteklenmektedir.

1. A. tumefaciens suşlarının büyüme
<ol><li>
A. tumefaciens suşları kültür
	<ol>
<li>Bir koloni istediğiniz baskı ile ATGN büyüme ortamının (tarifi için malzemeler listeye bakın) 1 mL aşılamak için steril bir tahta sopa ya da damlalıklı ipucu kullanın. Not: A. tumefaciens tükenmesi suşları için ATGN 1 mM IPTG temel protein biyosentezi korumak için bir uyarıcı içermelidir.</li>
		<li>A. tumefaciens suşları gecede ATGN 225 rpm'de sallayarak ile 28 ° C'de içinde büyümek.</li>
		<li>Hücreleri 600 optik yoğunluğunu ölçmek bir Spektrofotometre kullanarak nm (OD600). Hücre kültürü bir OD600 seyreltik ~0.2 = ve OD600 kadar büyümeye devam = ~0.6 ulaşıldığında. Tükenmesi suşları için OD600 kadar uyarıcı ile büyümeye devam = ~0.6 ulaşıldığında.</li>
		<li>A. tumefaciens wildtype ve mutant suşları OD600 kullanın = ~0.6 hedef özel boyama ve/veya hızlandırılmış mikroskobu (bkz: Bölüm 2 ve 3.1). Tükenmesi suşları için uyarıcı (bakınız Bölüm 1.2.) yıkamak</li>
	</ol>
</li>
	<li>
A. tumefaciens protein tükenmesi suşları karakterizasyonu için uyarıcı kaldırılması
	<ol>
<li>Üstel kültürünün 1 mL cips (OD600 ~0.4-0.6 =) tarafından Santrifüjü 7000 x g 5 dakika içinde oda sıcaklığında masaüstü santrifüj için de.</li>
		<li>Yıkamak için süpernatant kaldırın ve uyarıcı olmadan taze medya Pelet resuspend ve hücreleri (1.2.1) açıklandığı gibi cips. Hücreleri toplam taze medya 3 kez yıkayın.</li>
		<li>Son Pelet taze medyada resuspend ve konsantre bir OD600 hücrelere hemen hedef özel boyalar (Bölüm 2 ve şekil 4B-D) veya hızlandırılmış mikroskobu (Bölüm 3.2 ve şekil 4A) ile boyama için ~0.8 = . Alternatif olarak, hücreleri istediğiniz süreyi için medya olmadan önce boyama ve hücreleri Imaging uyarıcı hücrelerde büyüyen tarafından önceden tüketmek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hedef özel boyama A. tumefaciens hücre
<ol><li>
Floresan d-amino asit hücre duvarı etiketleme Not: FDAAs kolayca A. tumefaciens peptidoglikan dahil edilmiştir toksik olmayan floresan d amino asitleri vardır. Bu basit etiketleme yordamı büyüme canlı hücreleri6' desenlendirme sondalar. Dört FDAAs sentezi için kullanılabilir38iletişim kurallarıdır.<ol>
<li>Üstel kültürünün 500 µL cips (OD600 ~0.4-0.6 =) tarafından Santrifüjü 7000 x g 5 dakika içinde Masaüstü santrifüj için de. Hücre Pelet taze medya 100 µL içinde resuspend.</li>
		<li>5 FDAA için yıkanmış ve hücrelerin konsantre ve karanlıkta 2 min için kuluçkaya mm 5 µL ekleyin. Not: Sınırlamak FDAA ışığa maruz kalma. Kuluçka süresi zorlanma büyüme hızının bağlı olarak değişir. Genellikle, kuluçka kez katlama zaman%65-10 olmalıdır.</li>
		<li>Hücreleri tarafından Santrifüjü cips ve hücre topakları fosfat tamponlu tuz (PBS) ile üç kez yıkayın.</li>
		<li>Pelet ~ 50 µL PBS içinde resuspend. Not: PBS resuspension için kullanılan birim Pelet boyutuna göre değişebilir.</li>
		<li>0,8-1 uygulamak µL hücre bir özel defteri ve hemen epifluorescence mikroskobu (bkz: bölümler 3.1 ve 3.2) kullanarak görüntü için.<ol>
<li>Alternatif olarak, daha fazla etiket birleşme buz gibi % 70 etanol ile hücreleri düzelterek durdurmak. Hücre Pelet 1 mL buz gibi % 70 etanol resuspend ve 15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya.</li>
			<li>Santrifüjü tarafından hücreleri toplamak ve daha sonra görüntüleme için PBS küçük bir hacim içinde resuspend. Hücre süspansiyonlar 4 ° C ve görüntü 48 saat içinde saklayın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA DAPI veya turuncu leke ile boyama Not: DNA gözlemlemek için yapısı, hücre DAPI ya da portakal (ölü hücre leke) ile etiketlenir. Her ne kadar klasik bir "ölü hücre leke" açıklanan, turuncu permeant, photostable ve canlı hücre DNA10Imaging etkinleştirme bakteri hücrelerinin büyümesini etkilemez. A. tumefaciens, turuncu etiketleme işleri canlı hücreler içinde iyi ve hızlandırılmış mikroskobu (şekil 3) için uygundur. Buna ek olarak, ultraviyole (UV) ışık pozlama görüntüleme DAPI lekeli hücreler için gerekli Fototoksik (şekil 3) ve böylece DAPI boyama için anlık görüntüleme veya sabit hücreleri boyama canlı hücreleri boyama için en uygun olan.<ol>
<li>DAPI hücreleri boyama<ol>
<li>Üstel kültürünün 1 mL cips (OD600 ~0.4-0.6 =) tarafından Santrifüjü 7000 x g 5 dakika içinde Masaüstü santrifüj için de.</li>
			<li>İsteğe bağlı olarak, hücre boyama önce düzeltmek için hücre Pelet 1 mL % 70 buz gibi etanol resuspend. 10-15 dk. içinde 2.2.1.1 hücreler Santrifüjü tarafından açıklanan toplamak için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
			<li>Hücre Pelet 1 mL 1 µL DAPI hisse senedi çözüm (1 mg/mL; bkz: Malzemeler tablo) içeren PBS resuspend. Pipetting tarafından karışımı yavaşça ve 5 dakika içinde belgili tanımlık karanlık kuluçkaya.</li>
			<li>Hücreleri tarafından Santrifüjü 7000 x g 5 min için de cips ve 1 mL aşırı DAPI kaldırmak için PBS resuspend. Hücreleri iki kez daha yıkama ve Pelet 50 µL PBS veya medya resuspend.</li>
			<li>0,8-1 uygulamak µL hücre bir özel defteri ve hemen epifluorescence mikroskobu kullanarak görüntü için. 3.1 ve 3.2 bölümlerine bakın. Not: Bu protokol kromozom dynamics (şekil 3) gözlemlemek hızlandırılmış mikroskopi için en uygun değildir. Turuncu boyama (bakınız Bölüm 2.2.2) alternatif olarak kullanmayı düşünün.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Turuncu canlı hücreleri boyama</li>
		<li>Üstel kültürünün 1 mL cips (OD600 ~0.4-0.6 =) tarafından Santrifüjü 7000 x g 5 dakika içinde Masaüstü santrifüj için de. Hücre Pelet 1 mL 1 µL turuncu hisse senedi çözüm içeren PBS resuspend (malzeme listeye bakın). Pipetting tarafından karışımı yavaşça ve karanlıkta 5 min için kuluçkaya.</li>
		<li>Hücreleri tarafından Santrifüjü cips ve 1 mL aşırı turuncu kaldırmak için PBS resuspend. Hücreleri iki kez daha yıkama ve Pelet 50 µL PBS resuspend.</li>
		<li>0,8-1 uygulamak µL hücre bir özel defteri ve hemen epifluorescence mikroskobu kullanarak görüntü için. 3.1 ve 3.2 bölümlerine bakın. Not: Bu protokol de canlı hücreleri ile çalışır ve hızlandırılmış mikroskobu kromozom dynamics (şekil 3) gözlemlemek uygundur. Hemen görüntüye uygun değilse, hücreler buz gibi % 70 etanol (bakınız Bölüm 2.2.1.2) sabit olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Membran etiketleme Not: Lipofilik styryl floresan boya 4-64 yaygın bakteriyel hücre membran gözlemlemek için kullanılmıştır. Birçok bakteri, aksine 4-64 A. tumefaciens hücreleri etiketli düzgün etiket değil, ama oldukça sık sergi "nal" desen14,15. Dikkat çekici, büyüme Kutbu yaklaşık leke yoksun ise eski pole yoğun bir şekilde etiketlenmiştir. Böylece, 4-64 hücre büyüme desen ve A. tumefaciensmembran yapısı görselleştirme sağlar.<ol>
<li>8 µg/mL üssel faz hücre kültürü 1 ml nihai bir konsantrasyon FM 4-64 ekleyin ve 5 dakika içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>5 dakika içinde Masaüstü santrifüj için 7000 x g de Santrifüjü tarafından etiketli hücreleri cips ve hücre Pelet PBS 1 mL resuspend. Hücreleri aşırı boya kaldırmak için üç kez toplam yıkayın.</li>
		<li>PBS ve hemen görüntü için bir özel defteri yerinde küçük bir cilt hücrelerinde resuspend. (3.1 ve 3.2 bölümlerine bakın) Dikkat: Hücreleri hemen karakteristik etiketleme desen gözlemlemek için yansıması gerekir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. A. tumefaciens hücreleri görüntüleme
<ol><li>
Özel yüzey hazırlama Not: Resim 1 resim silsilesi (Masası'nda) ve şematik (Masası B) hızlandırılmış mikroskopi için hazırlanan bir tipik özel ped içerir. Özel yastıkları genellikle gerektiği gibi hazırlanır.<ol>
<li>3.1.1. bir coverslip bir 22 x 22 mm laboratuvar kare film (malzeme listesini görmek) kenarlarda neşterden çalıştırarak bir rehber ve kesim olarak kullanın.</li>
		<li>~ 2-5 bırakarak laboratuvar film Merkez dışında bir kare şeklinde bir kesik mm kenarlık için özel yastık bir conta olarak hizmet için. Merkezi kesme atmak.</li>
		<li>Bir amonyak ve alkol içermeyen temizleyici ile (bkz: malzeme listesi) temiz bir cam slayt (75 mm x 25 mm) üzerine film conta yeri ve film biraz cam ( şekil1a en iyi görüntü) üzerine erimiş kadar ısı. Laboratuvar film eritmek için 70 ° C ısı blok kümesine kenarına kullanın veya hafifçe bir ateşte eritin.</li>
		<li>Özel çözüm ~0.075 g özel karıştırarak hazırlayın (malzeme listesini görmek) küçük bir şişeye medyada 5 ml. Isı ile periyodik özel eriyene kadar karıştırın ve çözüm için dönen bir mikrodalga çözümde açıktır. Özel çözüm 55-70 ° C de tutabilir ve 48 saat içinde birden çok özel yastıkları inşaat için kullanabilirsiniz.</li>
		<li>1.2-%1.5 özel conta ortasına içeren medya pipet. Not: Medya hacmi genellikle 50-60 µL olmakla birlikte conta boyutuna göre değişir. Soğuk bir slayt için medya çok hızlı bir şekilde kuvvetlendirmek özel neden olabilir eklemek, böylece slayt sıcak bir yüzey üzerinde tutulmalıdır. Bir ısı blok kenarına ayarlayın 70 ° C çalışır iyi. Su özel veya fosfat tamponlu tuz (PBS) gibi arabelleğe alınan özel çözümler içeren özel uygulamalar sürekli hücre büyümesini gerekli değildir için medya yerine kullanılabilir. Tükenmesi suşları görüntüleme için uyarıcı olabilir sunmak da yok medyada. Uyarıcı yokluğu-ecek açığa vurmak tükenmesi fenotip ise uyarıcı varlığı bir denetim olarak kullanılabilir.</li>
		<li>Bir coverslip özel olarak dağıtabilmenizi conta yerleştirin.</li>
		<li>Slayt bu buruşuk yüzeyinde özel defteri ve yüzeye uygulanan hücre süspansiyon havuzu da yol açar gibi ~ 2 dk. kaçının özel yastık •kızılötesi için kuvvetlendirmek için serin, düz bir yüzey üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Dikkatle coverslip özel yastık kapalı kaydırın. Dikkat: Bu adımı acele etmeyelim. Özel yastık kolayca gözyaşı ve düzensiz özel yastık görüntüleme zorlaştırabilir.</li>
		<li>Ped yüzeyi kuru görünene kadar hava için özel defteri oda sıcaklığında 1-2 min için Kuru izin. Bir neşter kullanarak, özel hava boşluğuna (orta görüntü, şekil 1A); oluşturmak için a küçük soymak kaldırmak hava boşluğu genellikle ~ 2 x 7-10 mm ve A. tumefaciens hücreleri hava boşluğu (şekil 1 c) en iyi büyümeye eğilimindedir. Not: Sabit hücre veya büyüme nerede izlenmiyor koşullar altında görüntüleme için hava boşluğuna gerekli değildir.</li>
		<li>Nokta 0,8-1 µL özel defteri ve yeni bir coverslip ile kapak sayfasında bulunan bir hücreler. Yavaşça coverslip hücreleri özel ped yüzeyi boyunca dağıtmak için özel yastık tepesinden yerleştirin.</li>
		<li>Erimiş VALAP kullanarak coverslip kenarlarını kapatın (bkz: Malzemeler tablo için tarifi; Şekil 1A, alt resim). Tüm kenarları ve köşeleri coverslip mühür hücreleri görüntüleme sırasında sürüklenen götürecek özel ped kurutma neden olabilir. Not: Mühürleme coverslip sadece uzun vadeli zaman hata görüntüleme için gereklidir.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56497/56497fig1.jpg"> Şekil 1: özel yastık hazırlık. (A)görüntü özel yastık hazırlık protokolü sırasını. Resim 1 laboratuvar film conta ile bir slayttır. Resim 2, özel defteri ve hava boşluğu görüntülenir. Son olarak, Resim 3 tam özel yastık altında bir coverglass hücreleri ile gösterir ve VALAP ile mühürlenmiş. (B) A şematik bir özel ped hızlandırılmış mikroskopi için sağlanır. Anahtar şekil-in belgili tanımlık özel yastık şematik etiketlenir. (C) hava boşluğu A. tumefaciens büyüme özel yastıkları üzerinde terfi. Görüntüleri bir özel yastık üzerinde 20 saat boyunca yetiştirilen wildtype A. tumefaciens hücre gösterilir. Görüntüleri mevzilerine hava cebinden giderek uzak alındı. Görüntünün en yakın kenara uzaklığı hava boşluğu için yukarıdaki her görüntü gösterilir. Ölçek çubuğu 10 µm. = <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56497/56497fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol start="2"><li>
Görüntüleme Not: Fark girişim kontrast, faz kontrast ve epifluorescence görüntüleme yapılır donanım tabanlı autofocusing, otomatik bir sahne, standart filtrelere, bir LED ışık kaynağı, 60 X yağı daldırma ile donatılmış bir ters mikroskobu ile Hedefler (1.4 NA) faz kontrast veya fark girişim kontrast (DIC) ve 1K elektron teksir makinesi şarj-birleştiğinde-cihaz (EMCCD) kamera. Mikroskop bir sıcaklık kontrollü odada yer almalıdır. Alternatif olarak, bir sahne daha sıcak veya odası tutarlı sıcaklık görüntüleme sırasında korumak için kullanılabilir.<ol>
<li>Epifluorescence mikroskobu Not: floresan görüntüleme için canlı hücre, resim satın alma sayısını sınırlamak ve pozlama süresi photobleaching ve fototoksisite en aza indirmek için en iyi duruma getirmek için gerekli. Her boya görüntüleme için bu yeterli Floresans algılama sağlar ancak photobleaching veya fototoksisite yol değil bir en uygun çekim hızı bulmak için tavsiye edilir. Şekil 2-4' te, pozlama süreleri 200 MS tüm Floresans resimler için kullanılmıştır. Şekil 3' te gösterilen hızlandırılmış dizileri için her 10 min 3 h için görüntüleri elde.<ol>
<li>Daldırma yağ istenen hedefte yerleştirin ve ters Slayt Slayt tutucusuna sahne alanı üzerine yerleştirin. Odaklama topuzlar hücreleri odak haline getirmek için kullanın.</li>
			<li>Aşama (ya da DIC) Albümdeki ve istenen floresan filtre edinme. Not: Maksimal uyarma ve emisyon dalga boylarında Şekil 2, şekil 3ve şekil 4 kullanılan lekeler için aşağıdaki gibidir: HADA (405/460), NADA (450/555), TADA (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), Orange (547/570).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Hızlandırılmış mikroskobu Not: bilgisayar kontrollü hızlandırılmış mikroskobu sırasında aşağıdaki özellikleri şunlardır: x, y ve z konum, panjurlar ve floresan filtreler. Bir donanım tabanlı otomatik odaklama sistemi odak zaman hata görüntüleme sırasında korumak için en iyi yöntemdir. Alternatif olarak, bir yazılım tabanlı otomatik odaklama döngü kullanılabilir.<ol>
<li>Daldırma yağ istenen hedefte yerleştirin ve ters Slayt Slayt tutucusuna sahne alanı üzerine yerleştirin. Odaklama topuzlar hücreleri odak haline getirmek için kullanın.</li>
			<li>İsteğe bağlı olarak: Elde birden fazla (x, y) pozisyonlar. Rastgele 10 alan hücre yakın özel yastıkları hava boşluğu seçin.</li>
			<li>Sistem saat sıra satın görüntü için faz veya DIC istenilen zaman aralığında. Not: şekil 4' te gösterilen hızlandırılmış sırası için 30 ms maruz her 10 min 14 h ile DIC görüntüleri elde. Floresans görüntüleme sırasında hızlandırılmış mikroskobu kullanırken, photobleaching ve fototoksisite en aza indirmek için satın alma aralığı ve pozlama zamanını ayarlayın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu protokol A. tumefaciens tükenmesi wildtype ve mutant suşları incelenmesi için işlemler bir dizi içerir. Bu protokol bölümünde listelenen tüm yordamları büyüme medya, sıcaklık ve büyüme oranları için hesabınıza ek değişiklikler ile diğer bakteri suşları için kolayca adapte edilebilir dikkati çekiyor.
Hedef özel boyalar bakteri hücreleri hücre döngüsü olayları detaylı karakterizasyonu sağlamak için değerli bir araç kullanmaktır. Burada, peptid...

Bakteriyel hücre döngüsü boyunca ilerleme membran ve hücre duvarı sentezi, DNA ikileşmesi ve segregasyon ve hücre bölünmesi gibi birçok işlemi koordinasyon gerektirir. Tamamen bakteriyel hücre biyolojisi karmaşıklığını anlamak için bu temel olayları incelemek gereklidir; Başlıca bileşenleri bu yollar, mutagenized zaman hücre canlılığı tehlikeye beri Ancak, bu önemsiz bir görevdir. Hedef özel boyalar ile birleştiğinde Epifluorescence mikroskopi wildtype ve mutant bakteri suşları temel bu işlemlerde soruşturma için güçlü bir yaklaşımdır.
Peptidoglikan özel boyalar floresan antibiyotik (Vankomisin-FL, bocillin-FL) ve floresan d amino asitler (örneğin, 7-Hidroksikumarin-3-karboksilik asit-3-amino-d-alanin, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanin içerir , NADA; tetramethylrhodamine-3-amino-d-alanin; TADA). Gram-pozitif bakterilerde peptidoglikan biyosentezi sitelerin soruşturma için floresan antibiyotik analogları sublethal konsantrasyonları kullanımı peptidoglikan ekleme desenleri1,2ortaya çıkarmak için etkili bir strateji olmuştur, 3,4. Floresan Vankomisin etiketleme ekleme desenleri sabit Ayagin Gram-negatif bakteri5peptidoglikan anlayışlar kazanmak için kullanılmıştır, dış membran genellikle floresan kullanımını engelleyen bir geçirgenliği bariyer sağlar antibiyotik olarak bir sonda peptidoglikan canlı hücreleri içinde biyosentezi için. Buna ek olarak, floresan-d-amino asit veya biorthogonal fonksiyonel gruplar ile d-amino asitler ve kısa darbeleri kovalent bölgelerinde yaşayan bakteri hücreleri6,7geniş bir alanda son peptidoglikan ekleme etiketleyin. Sentetik d amino asitler ile gözlenen desenleri peptidoglikan ekleme punctate ve septal içerir (Escherichia coli ve Bacillus subtilis), kutup ve septal (Agrobacterium tumefaciens ve Listeria Monositogenez), septal tek (Staphylococcus aureus) ve apikal (Streptomyces venezuelae)6,7. Bu gözlemler bakteri hücre duvarı dipnotlar farklı desenler sergi ve sentetik d amino asitler olarak büyüme desenlendirme incelenmesi için sonda kullanımı birçok bakteri içinde değerli bir stratejidir gösterir.
Bakteriyel kromozomlar etiket boya dahil deoksiribonükleik asit (DNA) belirli küçük groove cilt (4,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) ve yüksek afinite siyanür boyalar (yeşil ve turuncu malzeme listesini görmek;). Canlı hücrelerin DAPI boyama bakteriyel canlılığı9belirtmek için kullanılır, ancak sabit hücrelerin DAPI boyama numaralandırma çevre örnekleri8, bakterilerin yardımcı olur. Buna ek olarak, Sigara-hücrelerin9numaralandırmak için membran impermeant "ölü" hücre lekeleri gibi turuncu ve yeşil sık açıklandığı gibi siyanür boyuyor. Bu reaktifler hücre büyümesi sırasında bakteriyel çevrili morfolojisi soruşturma için kullanıldığında, dikkat çekici, DAPI, turuncu ve yeşil tüm membran permeant ve canlı hücreleri10etiketleme kabil olmak gösterilmiştir. E. coli hücreleri canlı, DAPI DNA'sı boyama sitoplazma auto-floresan nedeniyle yaygın görünür ve ultraviyole (UV) ışık için hücre DAPI lekeli tekrarlanan Etkilenmeler perturbs çevrili yapısı10. Bu boya membran permeant olup uzun süreli Floresans bağlama üzerine canlı hücrelerdeki DNA hücre büyümesi, DNA ikileşmesi veya Kromozom ayrımı10 etkilemeden sağlar boyama E. coli ya da B. subtilis ile portakal ortaya çıkarır . Bu gözlemler siyanür DNA boyalar nucleoids Morfoloji çoğu bakterinin hücre büyüme sırasında izlemek için kullanılabilir öneririz.
Phospholipid-Specific stryl boya N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) fenil gibi) hexatrienyl) pyridinium dibromide (4-64; bkz: malzeme listesi) Katyonik bileşiklerdir ve tercihen olumsuz ücret ilişkilendirmek fosfolipitler gibi cardiolipin ve phosphatidylglycerol11. 4-64 farklı bakteri membran etiketlemek için kullanıldığında farklı desenler gözlenir. Escherichia coli, 4-64 yan duvar boyunca bantlarında Polonyalılar zenginleştirilmiş ve bölünme siteler geç pre-divisional12hücreleri. Bacillus subtilisiçinde 4-64 etiketleme lipid spiraller13görselleştirme sağlar. Agrobacterium tumefaciens, 4-64 dış membran etiketleri ve karakteristik "nal" desen büyüme Kutbu14,15etiketleme yoksun olduğu görülmektedir. Bu gözlemler Bu bakterilerin varlığı nedeniyle heterojen lipid dağıtımları için hücresel asimetri katkıda lipid etki alanlarının sergi gösteriyor. Diffüz etiketleme varlığını gibi 4-64 etiketleme şekillerindeki değişiklikleri, blebs veya veziküller, invaginations veya membran büzülme dağıtım veya lipidler biyosentezi etkisi mutantlar karakterize bilgilendirici olabilir.
Hücre boyama ötesinde, proteinlerin temel süreçlerine katılan işlevi belirlenmesi gereklidir. Gerekli genler silmek ve fenotipik sonuçları çalışma mümkün değildir çünkü temel proteinler karakterizasyonu teknik olarak zordur. Böylece, protein tüketen alternatif yaklaşımlar ortaya çıkmıştır. Örneğin, temel bir gen bir indüklenebilir organizatörü tercihan--dan onun yerel organizatörü kontrolü altında konabilir. İndüklenebilir rehberleri gibi küçük moleküllere duyarlı vardır; 16, izopropil β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21, arabinoz22, vanillate17,23çinko, ve ksiloz23, böylece hedef gen transkripsiyonu sona erer ve uyarıcı kaldırıldığında faiz protein tükenmiştir. Küçük molekül RNA etkileşimleri hedef genlerin transkripsiyon CRISPR girişim25,26 engellemek için kullanılan sentetik riboswitches24 ilgi temel protein tüketen Alternatif yaklaşımları içerir hedef genlerin ve tarafından ClpXP proteaz bozulmayı peptid Etiketler hedef proteinler için kullandığı indüklenebilir protein yıkımı27,28 blok transkripsiyon için. Hücrelerin canlılık kaybetmeden tükenmesi suşları karakterizasyonu için sadece kısa bir süre sağlarsanız, bu nedenle, hücrelerin mikroskobik görüntüleme protein tüketimi sırasında zamanla karakterizasyonu için güçlü bir yaklaşım. Nitekim, mikroskobu canlı bakteri hücre hücre şekil bakım, salgı ve Bölünebilme29mekanizmaları da dahil olmak üzere temel biyolojik süreçlerin anlayışlar kazanmak araştırmacılar sağladı.
A. tumefaciens bir bakteriyel bitki patojeni30 ve doğal genetik mühendisi31,32olduğunu. Böylece, mekanizmalar patojen için ilgili ana bilgisayar-patojen etkileşimleri33,34,35, salgı36ve ana bilgisayar dönüşüm30,31, gibi 37 kapsamlı bir şekilde araştırıldı. A. tumefaciens aracılı hastalığı önlemek ya da bitki dönüşüm geliştirmek stratejiler tasarlamak için A. tumefaciens hayatta kalmak için gerekli işlemleri daha iyi anlaşılması gerekir. Hedef özel boya kullanımı ve son gelişmeler A. tumefaciens18 için bir protein tükenmesi stratejinin temel süreçleri araştırmak için bir yol sağlar.
Burada, A. tumefaciens wildtype, mutant ve protein tükenmesi suşları mikroskobik analizi için detaylı protokoller sağlanır. İlk iki protokol, hücreleri hazırlamak ve onları hedef özel boyalar ile etiket açıklanmıştır. Üçüncü protokol için özel yastıkları (şekil 1) hazırlama ve bakteri hücreleri (Şekil 2, şekil 3, şekil 4) görüntüleme hakkında adım adım yönergeler sağlar. Bu protokoller de farklı ortam koşulları, büyüme oranları, oksijen gereksinimleri ve hücre yapıları için hesabınıza ek uyarlamalar ile diğer bakteriler için uygun olabilir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Bacterial Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt; C58</td><td>ATCC</td><td>33970</td><td>Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of &lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt;. J Bacteriol 123:255-264.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt; C58&amp;Delta;tetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-&lt;em&gt;ctrA &amp;Delta;ctrA&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen &lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt;. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Media Components&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATGN Minimal Medium</td><td></td><td></td><td>To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 &amp;deg;C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose.</td></tr><tr><td>20X AT Buffer</td><td></td><td></td><td>Add 214 g/L KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave.</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP359</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Chemical</td><td>P288</td><td></td></tr><tr><td>20X AT Salts</td><td></td><td></td><td>Add 40 g/L (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 3.2 g/L MgSO4&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.2 g/L CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, and 0.024 g/L MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to water. Autoclave.</td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Chemical</td><td>A701</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP213</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP510</td><td></td></tr><tr><td>MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Chemical</td><td>M114</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16</td><td>Prepare 40% stock in water. Filter sterilize.</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1423</td><td>Add 15 g to 1 L of water when preparing plates.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Optional Media Additives&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>GoldBio</td><td>K-120</td><td>Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 &amp;micro;g/ml.</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>GoldBio</td><td>I2481C5</td><td>Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopy Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550D</td><td>25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner.</td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisherbrand</td><td>12-541-B</td><td>22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner.</td></tr><tr><td>Sparkle Glass Cleaner</td><td>Home Depot</td><td>203261385</td><td>Ammonia and alcohol free.</td></tr><tr><td>Ultra Pure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-100</td><td>Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP399500</td><td>10X solution to be diluted to 1X with sterile water.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-999</td><td>Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation.</td></tr><tr><td>VALAP</td><td></td><td></td><td>Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 &amp;deg;C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten.</td></tr><tr><td>Lanolin Butter</td><td>SAAQIN</td><td>SQ-LAB-R1</td><td></td></tr><tr><td>Petroleum Jelly</td><td>Target Corp.</td><td>06-17644</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin Wax</td><td>Crafty Candles</td><td>263012</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Target-specific dyes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-1</td><td>Use to dilute stock solutions of dyes as needed.</td></tr><tr><td>FDAAs (NADA, HADA,TADA)</td><td></td><td></td><td>FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62247</td><td>Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 &amp;micro;g/ml.</td></tr><tr><td>SYTOX Orange Nucleic Acid Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S11368</td><td>Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 &amp;micro;M.</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T3166</td><td>Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 &amp;micro;g/ml.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry bath</td><td>Sheldon Manufacturing, Inc.</td><td>52120-200</td><td></td></tr><tr><td>Metallic thermal beads</td><td>Lab Armor</td><td>42370-002</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera</td><td></td><td></td><td>Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work.</td></tr></tbody></table>

live cell fluorescence microscopy to observe essential processes during microbial cell growth

Temel hücresel süreçleri DNA ikileşmesi ve segregasyon, protein sentezi, hücre duvarı sentezi ve hücre bölünmesi gibi bakteriyel hayatta kalmak için gerekli proteinlerin işlevi güveniyor. Bu işlemler probları daha iyi anlamak gibi bir dizi hedef özel boyalar kullanılabilir. Lipofilik boyalar ile boyama membran yapısı gözlenmesi, lipid microdomains görselleştirme ve membran blebs olarak algılanmasını sağlar. Floresan-d-amino asitler (FDAAs) peptidoglikan biyosentezi sitelerin soruşturma için kullanımı hücre duvarı Dipnotlar veya hücre büyüme desenlendirme potansiyel kusurları işaret ediyor olabilir. Son olarak, nükleik asit lekeleri DNA çoğaltma veya Kromozom segregasyon olası hataları işaret ediyor olabilir. Siyanür DNA hücre yaşayan etiket lekeleri ve hızlandırılmış mikroskobu çevrili Morfoloji gerçek zamanlı gözlemleri sırasında hücre büyümesini etkinleştirme için uygundur. Hücre etiketleme için protokol protein tükenmesi mutantlar membran yapısı, hücre duvarı Biyogenez ya da kromozom segregasyon tanımlamak için uygulanabilir. Ayrıca, hızlandırılmış mikroskobu gibi gerekli bir protein kaldırılır ve ek protein işlevi kazandırabileceğini morfolojik değişiklikleri izlemek için kullanılabilir. Örneğin, hücre büyüme proteinler tükenmesi hücre daha kısa veya yuvarlak haline neden olabilir, ancak temel hücre bölünmesi proteinler tükenmesi filamentation veya dallanma, sonuçları. Burada, hücre büyümesi, hedef özel etiketleme ve hızlandırılmış mikroskobu protokollerde bakteriyel bitki patojeni Agrobacterium tumefacienssağlanır. Birlikte, hedef özel boyalar ve hızlandırılmış mikroskobu temel süreçleri karakterizasyonu etkinleştirmek A. tumefaciens. Son olarak, sağlanan iletişim kuralları diğer bakterilerde temel işlemleri soruşturma için kolayca değiştirilebilir.

Hedef özgü wildtype etiketleme A. tumefaciens hücreleri Bu hücre morfolojisi göstermek için yıkama adımları veya (hangi floresan boyalar sulandırmak için kullanılır) % 1 DMSO ile tedavi etkilenmez, hücreleri doğrudan kültür (şekil 2A, sol paneli), hücreler tarafından yıkadıktan sonra yansıma 1.2 (şekil 2A, sol panelde) veya % 1 DMSO 10 min iç...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth at JoVE.com

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Bakterilerde temel süreçleri işlevini anlamak zordur. Floresans mikroskobu hedef özel boyalar ile mikrobiyal hücre büyüme ve hücre döngüsü ilerleme içine anahtar anlayışlar sağlayabilir. Burada, Agrobacterium tumefaciens yöntemleri canlı hücre görüntüleme için gerekli işlemleri karakterizasyonu için vurgulamak için bir model bakteri kullanılmaktadır.

Temel işlemler sırasında mikrobiyal hücre büyümesini gözlemlemek için hücre Floresans mikroskobu canlı

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

live-cell-fluorescence-microscopy-to-observe-essential-processes

Research

JoVE Journal

Biology

15.7K Görüntüleme.  University of Missouri. Bakterilerde temel süreçleri işlevini anlamak zordur. Floresans mikroskobu hedef özel boyalar ile mikrobiyal hücre büyüme ve hücre döngüsü ilerleme içine anahtar anlayışlar sağlayabilir. Burada, Agrobacterium tumefaciens yöntemleri canlı hücre görüntüleme için gerekli işlemleri karakterizasyonu için vurgulamak için bir model bakteri kullanılmaktadır.

Video: Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Canlı Hücre Görüntüleme Bacillus subtilis Ve Streptococcus pneumoniae Otomatik Zaman atlamalı Mikroskopi

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over the past decade, new and innovative technologies have greatly enhanced the practicality of live-cell imaging. Cells can now be kept in focus and continuously imaged over several days while maintained under 37 &#176;C and 5% CO2 cell culture conditions. Moreover, multiple fields of view representing different experimental conditions can be acquired simultaneously, thus providing high-throughput experimental data. Live-cell imaging provides a significant advantage over fixed-cell imaging by allowing for the direct visualization and temporal quantitation of dynamic cellular events. Live-cell imaging can also identify variation in the behavior of single cells that would otherwise have been missed using population-based assays. Here, we describe live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel. We demonstrate methods to visualize whether mitotically arrested cells die directly from mitosis or slip back into interphase. We also describe how the fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system can be used to assess the fraction of interphase cells born from mitotic slippage that are capable of re-entering the cell cycle. Finally, we describe a live-cell imaging method to identify nuclear envelope rupture events.

Live-cell imaging provides a wealth of information on single cells or whole populations that is unattainable by fixed cell imaging alone. Here, live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel are described.

Uzun vadeli canlı hücre kader Paklitaksel karşılık olarak değerlendirmek için Imaging hücreli

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Kanser Araştırmaları

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes underlying central cell cycle events. However, imaging of these molecules in slow-growing bacteria represents a challenge due to photobleaching of fluorophores and phototoxicity during image acquisition. Here, we describe a simple protocol to circumvent these limitations in the case of Myxococcus xanthus (which has a generation time of 4 - 6 h). To this end, M. xanthus cells are grown on a thick nutrient-containing agar pad in a temperature-controlled humid environment. Under these conditions, we determine the doubling time of individual cells by following the growth of single cells. Moreover, key cellular processes such as chromosome segregation and cell division can be imaged by fluorescence live-cell imaging of cells containing relevant fluorescently labeled marker proteins such as ParB-YFP, FtsZ-GFP, and mCherry-PomX over multiple cell cycles. Subsequently, the acquired images are processed to generate montages and/or movies.

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Bacterial cells are spatially highly organized. To follow this organization over time in slow growing Myxococcus xanthus cells, a set-up for fluorescence live-cell imaging with high spatiotemporal resolution over several generations was developed. Using this method, spatiotemporal dynamics of important proteins for chromosome segregation and cell division could be determined.

Floresans Live-hücre görüntüleme, tam bitkisel hücre döngüsü yavaş büyüyen sosyal bakteri Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

Biyokimya

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols to address these questions include colony count assays, gentamicin protection assays, and electron microscopy. Colony count and gentamicin protection assays only assess the viability of the entire bacterial population and are unable to determine individual bacterial viability. Electron microscopy can be used to determine the viability of individual bacteria and provide information regarding their localization in host cells. However, bacteria often display a range of electron densities, making assessment of viability difficult. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells. These assays were developed originally to assess survival of Neisseria gonorrhoeae in primary human neutrophils, but should be applicable to any bacterium-host cell interaction. These protocols combine membrane-permeable fluorescent dyes (SYTO9 and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), which stain all bacteria, with membrane-impermeable fluorescent dyes (propidium iodide and SYTOX Green), which are only accessible to nonviable bacteria. Prior to eukaryotic cell permeabilization, an antibody or fluorescent reagent is added to identify extracellular bacteria. Thus these assays discriminate the viability of bacteria adherent to and inside eukaryotic cells. A protocol is also provided for using the viability dyes in combination with fluorescent antibodies to eukaryotic cell markers, in order to determine the subcellular localization of individual bacteria. The bacterial viability dyes discussed in this article are a sensitive complement and/or alternative to traditional microbiology techniques to evaluate the viability of individual bacteria and provide information regarding where bacteria survive in host cells.

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells.

Memeli Hücreleri ile Derneği&#39;nin Bakterilerin Canlılık belirlenmesi için Floresan Mikroskopi Yöntemleri

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Biyoloji

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence microscopy as observations made at a population level may not truly reflect what occurs at a single cell level. Live-cell timelapse microscopy allows investigators to monitor the changes in cell division or cell morphology which provide valuable insights regarding subcellular localization of proteins and timing of gene expression, as it happens, to potentially aid in answering important biological questions. Here, we describe our protocol to monitor phenotypic changes in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus using a high-resolution deconvolution microscope. The objective of this report is to provide a simple and clear protocol that can be adopted by other investigators interested in conducting fluorescence microscopy experiments to study different biological processes in bacteria as well as other organisms.

This article provides a step-by-step guide to investigate protein subcellular localization dynamics and to monitor morphological changes using high-resolution fluorescence microscopy in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus.

Bakterilerde Hücre Altı Protein Lokalizasyonu ve Hücre Morfolojisi Değişikliklerini Araştırmak Için Canlı Hücre Floresan Mikroskobu

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method has been developed for observing interspecies interactions between two bacterial pathogens. The use of this method to interrogate interactions between a motile Gram-negative pathogen, Pseudomonas aeruginosa and a non-motile Gram-positive pathogen, Staphylococcus aureus is demonstrated here. This protocol consists of co-inoculating each species between a coverslip and an agarose pad, which maintains the cells in a single plane and allows for visualization of bacterial behaviors in both space and time.
Furthermore, the time-lapse microscopy demonstrated here is ideal for visualizing the early interactions that take place between two or more bacterial species, including changes in bacterial species motility in monoculture and in coculture with other species. Due to the nature of the limited sample space in the microscopy setup, this protocol is less applicable for studying later interactions between bacterial species once cell populations are too high. However, there are several different applications of the protocol which include the use of staining for imaging live and dead bacterial cells, quantification of gene or protein expression through fluorescent reporters, and tracking bacterial cell movement in both single species and multispecies experiments.

This live-bacterial cell imaging protocol allows for visualization of interactions between multiple bacterial species at the single-cell level over time. Time-lapse imaging allows for observation of each bacterial species in monoculture or coculture to interrogate interspecies interactions in multispecies bacterial communities, including individual cell motility and viability.

Tek Hücreli Türler Arası Bakteri Etkileşimlerinin Kinetik Görselleştirilmesi

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Erken Otofaji Etkinlikler Hücre Görüntüleme Canlı: Omegasomes ve Ötesi

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation. 
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisi&#230;, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.

Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

Elektroporasyon yoluyla Yaşam Mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve Floresan biyomoleküllerin Gözlem

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...