그림 2 , 그림 4에서 사용 하는 FDAAs의 선물에 감사 마이클 VanNieuwenhze (인디애나 대학) 하 고. 우리는이 원고 준비 중 피드백에 대 한 갈색 연구소의 회원을 감사합니다. A. tumefaciens 세포 성장 및 부문에 갈색 랩에서 연구는 국립 과학 재단 (IOS1557806)에 의해 지원 됩니다.

1. A. tumefaciens 긴장의 성장
<ol><li>
A. tumefaciens 종자를 배양
	<ol>
<li>메 마른 나무 지팡이 또는 피펫으로 팁을 사용 하 여 원하는 긴장의 단일 식민지와 ATGN 성장 매체 (제조 법에 대 한 자료 목록 참조)의 1 mL를 접종. 참고: A. tumefaciens 고갈 변종에 대 한 ATGN는 필수 단백질의 생 합성을 유지 하기 위해 유도로 1mm IPTG를 포함 해야 합니다.</li>
		<li>A. tumefaciens 긴장 하룻밤 225 rpm에서 떨고와 28 ° C에 ATGN에서에서 성장.</li>
		<li>600에서 세포의 광학 밀도 측정 nm (OD600)는 분 광 광도 계를 사용 하 여. OD600 세포 배양 희석600 세 성장을 계속 하 고 ~0.2 = = ~0.6에 도달. 고갈 변종, 유도 OD600 까지 성장 계속 = ~0.6에 도달.</li>
		<li>OD600 의 A. tumefaciens wildtype 및 돌연변이 체 긴장을 사용 하 여 특정 대상 얼룩 및 시간 경과 현미경 (섹션 2와 3.1 참조) ~0.6 =. 고갈 변종에 대 한 세척 유도 (섹션 1.2 참조.)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
A. tumefaciens 단백질 소모 종자의 특성에 대 한 유도의 제거
	<ol>
<li>작은 문화 지 수의 1 mL (OD600 = ~0.4-0.6) 실 온에서 데스크톱 원심 분리기에서 5 분 7000 x g에서 원심 분리에 의해.</li>
		<li>세척, 상쾌한 제거 하 고 신선한 미디어 유도 없이 펠 릿 resuspend (1.2.1) 위에서 설명한 대로 셀을 펠 렛. 워시 셀 신선한 미디어에 3 회 총.</li>
		<li>신선한 미디어에 마지막 펠 릿을 resuspend 하 고 OD600 세포 집중 대상 특정 염료 (섹션 2와 그림 4B-D) 또는 시간 경과 현미경 (섹션 3.2 및 그림 4A) 즉시 얼룩에 대 한 ~0.8 = . 또는, 사전 고갈 셀 원하는 시간 동안 미디어 얼룩 및 셀의 이미징 이전 유도 없이 셀을 성장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 특정 대상 A. tumefaciens 셀의 얼룩
<ol><li>
형광 d 아미노 산 성 세포 벽 라벨 참고: FDAAs는 비 독성 형광 d-아미노산 A. tumefaciens peptidoglycan에 쉽게 통합 됩니다. 이 간단한 라벨링 절차 프로브 성장 라이브 셀6패턴화 합니다. 4 개의 FDAAs의 합성에 대 한 프로토콜은 사용할 수38입니다.<ol>
<li>문화 지 수의 500 µ L를 펠 렛 (OD600 = ~0.4-0.6) 데스크톱 원심 분리기에서 5 분 7000 x g에서 원심 분리에 의해. 신선한 미디어의 100 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>5mm를 FDAA 세포를 집중 고 어둠 속에서 2 분 동안 품 어 씻어 5 µ L를 추가 합니다. 참고: 제한 빛을 FDAA 노출. 보육 시간 긴장의 성장 속도 따라 달라 집니다. 일반적으로, 부 화 번 배로 시간6의 5-10% 이어야 한다.</li>
		<li>원심 분리에 의해 세포를 작은 고 씻어 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 펠 릿 셀 세 번.</li>
		<li>~ 50 µ L PBS에 펠 릿을 resuspend. 참고: 볼륨 PBS 사용 물의 resuspension의 펠 릿 크기에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
		<li>0.8-1 적용 agarose 패드 및 epifluorescence 현미경 즉시 (참조 섹션 3.1 및 3.2)를 사용 하 여 이미지 셀의 µ L.<ol>
<li>또는, 더 차가운 70% 에탄올과 셀을 고정 하 여 레이블 설립을 중지 합니다. 얼음 처럼 차가운 70% 에탄올의 1 mL에 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 15 분 동안 얼음에 품 어.</li>
			<li>원심 분리에 의해 세포를 수집 하 고 나중에 영상에 대 한 PBS의 작은 볼륨에서 resuspend. 48 시간 이내에 4 ° C와 이미지 셀 정지를 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DNA DAPI 또는 주황색 얼룩 얼룩 참고: DNA 관찰 하 구조, 세포 DAPI 또는 오렌지 (죽은 세포 얼룩)로 표시 됩니다. 고전적인 "죽은 세포 얼룩"로 설명, 오렌지는 permeant, photostable,10이미징 라이브 세포 DNA를 사용 하는 세균성 세포의 성장에 영향을 미치지 않습니다. A. tumefaciens, 오렌지 라벨 작품 살아있는 세포에서 잘 하 고 시간 경과 현미경 (그림 3)에 적합. 대조적으로, 이미징 DAPI 스테인드 세포에 필요한 자외선 (UV) 빛 노출 phototoxic (그림 3) 이며 따라서 DAPI 얼룩 얼룩 즉시 이미징 또는 고정된 세포를 얼룩이 지기에 대 한 라이브 셀에 대 한 가장 적합 하다.<ol>
<li>DAPI 셀의 얼룩<ol>
<li>작은 문화 지 수의 1 mL (OD600 = ~0.4-0.6) 데스크톱 원심 분리기에서 5 분 7000 x g에서 원심 분리에 의해.</li>
			<li>필요한 경우 해결 하려면 염색 전에 셀, 70% 얼음 에탄올의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 10-15 분으로 원심 분리에 의해 셀 2.2.1.1에 설명 된 수집에 대 한 얼음에 품 어.</li>
			<li>1 ml의 PBS DAPI 재고 솔루션 (1 mg/mL; 참조 자료 테이블)의 1 µ L을 포함 하는 셀 펠 릿 resuspend. Pipetting으로 부드럽게 혼합 하 고 어둠 속에서 5 분 동안 품 어.</li>
			<li>5 분 동안 7000 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 작은 고 초과 DAPI를 제거 하는 PBS의 1 mL에 resuspend. 셀을 두 번 더 세척 하 고 50 µ L PBS 또는 미디어에 펠 릿을 resuspend.</li>
			<li>0.8-1 적용 agarose 패드 및 즉시 epifluorescence 현미경 검사 법을 사용 하 여 이미지 셀의 µ L. 3.1 및 3.2 섹션을 참조 하십시오. 참고:이 프로토콜은 시간 경과 현미경 관찰 염색체 역학 (그림 3)에 대 한 최적의. 주황색 얼룩 (2.2.2 섹션 참조) 대신 사용 하십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>라이브 셀의 오렌지 얼룩</li>
		<li>작은 문화 지 수의 1 mL (OD600 = ~0.4-0.6) 데스크톱 원심 분리기에서 5 분 7000 x g에서 원심 분리에 의해. 오렌지 재고 솔루션의 1 µ L을 포함 하는 PBS의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend (자료 목록 참조). Pipetting으로 부드럽게 혼합 하 고 어둠 속에서 5 분 동안 품 어.</li>
		<li>원심 분리에 의해 세포를 작은 고 초과 오렌지를 제거 하는 PBS의 1 mL에 resuspend. 셀을 두 번 더 세척 하 고 50 µ L PBS에 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>0.8-1 적용 agarose 패드 및 즉시 epifluorescence 현미경 검사 법을 사용 하 여 이미지 셀의 µ L. 3.1 및 3.2 섹션을 참조 하십시오. 참고:이 프로토콜 라이브 세포에서 잘 작동 하 고 염색체 역학 (그림 3) 관찰 시간 경과 현미경에 적합. 그것은 바로 이미지를 편리 하 게, 셀 차가운 70% 에탄올 (참조 섹션 2.2.1.2)에서 수정 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
막 라벨 참고: 닥터지 styryl 형광 염료 4-64 사용 되었습니다 광범위 하 게 세균 세포의 막을 관찰 하. 많은 박테리아와 달리 4-64 A. tumefaciens 셀 표시 균일 하 게, 레이블을 하지 않습니다 하지만 오히려 자주 "편 자" 패턴14,15전시. 놀랍게도, 반면 오래 된 극 하지 표시 달아 얼룩 없는 거의 성장 극이 이다. 따라서, 4-64 A. tumefaciens에 막 구조와 세포 성장 패턴의 시각화 수 있습니다.<ol>
<li>지 수 단계 세포 배양의 1ml에 8 µ g/mL의 최종 농도에 FM 4-64를 추가 하 고 어둠 속에서 5 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>탁상용 원심 분리기에 5 분 동안 7000 x g에서 원심 분리 하 여 레이블이 지정 된 셀을 작은 고 1 mL의 PBS에 셀 펠 릿 resuspend. 워시 셀 과잉 염료를 제거 하는 데 세 번의 총.</li>
		<li>PBS의 및 즉시 이미지를 agarose 패드에 자리 작은 볼륨에서 셀 resuspend (섹션 3.1 및 3.2 참조) 주의: 셀 해야 합니다 수 몇 군데 즉시 특성 라벨 패턴을 관찰 하는 것.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. A. tumefaciens 셀의 이미징
<ol><li>
Agarose 패드 준비 참고: 그림 1 에 이미지 시퀀스 (패널 A)과 시간 경과 현미경 검사 법에 대 한 준비는 전형적인 agarose 패드의 회로도 (패널 B)가 포함 되어 있습니다. Agarose 패드는 일반적으로 필요에 따라 준비 됩니다.<ol>
<li>3.1.1. 가이드와 컷은 22 m m x 22 m m 실험실의 광장 가장자리 주위 메스를 실행 하 여 (자료 목록 참조) 영화는 coverslip를 사용 합니다.</li>
		<li>~ 2-5를 떠나 실험실 영화 센터 잘라 사각형 agarose 패드에 대 한 가스 켓으로 m m 테두리. 센터 컷아웃을 삭제 합니다.</li>
		<li>영화 가스 켓 (자료 목록 참조)는 암모니아 및 알코올 무료 청소기 청소 유리 슬라이드 (75 m m x 25 m m)에 배치 하 고 영화는 약간 유리 ( 그림 1A에서 상단 이미지)에 녹을 때까지 열. 녹기 연구소 영화, 70 ° C로 열 블록 설정의 가장자리를 사용 하 여 또는 프레임 가볍게 녹아.</li>
		<li>Agarose 솔루션 ~0.075 g agarose를 혼합 하 여 준비 (자료 목록 참조) 작은 플라스 크에서 미디어의 5 ml에서. 열 믹스는 agarose 해산 때까지 솔루션을 주기적으로 소용돌이 함께 전자 레인지에서 솔루션은 분명 하다. Agarose 솔루션 55-70 ° C에서 유지 하 고 48 시간 안에 여러 agarose 패드의 건설에 대 한 사용.</li>
		<li>피 펫 미디어는 가스 켓의 중심으로 1.2-1.5 %agarose 포함. 참고: 미디어의 볼륨은 일반적으로 50-60 µ L 하지만 가스 켓 크기에 따라 달라 집니다. 추가 미디어 감기 슬라이드를 너무 빨리 응고 agarose를 발생할 수 있습니다, 따라서 슬라이드 보관 해야 따뜻한 표면에. 열 블록의 가장자리 설정 70 ° C 작동 잘 합니다. 물 agarose 또는 버퍼링된 agarose 솔루션 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) agarose는 지속적인된 세포 성장 필요 하지 않습니다 응용 프로그램 포함 된 미디어 대신 사용할 수 있습니다. 고갈 긴장 이미징, 유도 될 수 있습니다 제시 또는 미디어에서 결 석. 반면 유도의 부재는 소모 형을 발표할 예정 이다 유도의 존재는 컨트롤로 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>장소는 coverslip 균일 하 게 배포는 agarose 가스 켓.</li>
		<li>Agarose 패드에 세포 현 탁 액 표면에 적용 될 때의 풀링 주름된 표면에 발생이 ~ 2 분 피 agarose 패드의 overdrying에 대 한 응고에 멋진, 레벨 표면에 슬라이드를 놓습니다.</li>
		<li>Agarose 패드에서 coverslip 조심 스럽게 미십시오. 주의:이 단계를 돌진 하지 마십시오. Agarose 패드 쉽게 찢을 수 있다 그리고 고르지 못한 agarose 패드 어려운 이미지를 만들 수 있습니다.</li>
		<li>허용 공기 agarose 패드 1-2 분에 대 한 건조 실 온에서 패드의 표면 건조가 나타날 때까지. Agarose 만드는 공기 주머니 (중간 이미지, 그림 1A);의 작은 스트립을 제거 메스를 사용 하 여 공기 주머니 일반적으로 ~ 2 m m x 7-10 m m 이며 A. tumefaciens 셀 공기 주머니 (그림 1C) 근처 최고의 성장 하는 경향이 있다. 참고: 이미징 고정 셀 또는 성장 모니터링 되지 않습니다 조건, 공기 주머니는 필요 하지 않습니다.</li>
		<li>자리 0.8-1 µ L agarose 패드와 새로운 coverslip 커버에 셀의. 부드럽게 agarose 패드의 표면에 세포를 분산을 agarose 패드 위에 coverslip 장소.</li>
		<li>녹 인된 VALAP를 사용 하 여 하는 coverslip의 가장자리를 밀봉 (제조 법; 자료 표 참조 그림 1A, 하단 이미지). 모든 가장자리와 모서리는 coverslip의 인감을 실패 이미징 동안 셀의 표류로 이어질 것입니다 agarose 패드의 건조를 일으킬 수 있습니다. 참고:는 coverslip의 씰링만 장기 시간 경과 영상에 대 한 필요 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56497/56497fig1.jpg"> 그림 1: Agarose 패드 준비. (A) agarose 패드 준비 프로토콜의 순서를 이미지. 이미지 1 실험실 영화 가스 켓과 슬라이드입니다. 이미지 2, agarose 패드와 공기 주머니 시각화 됩니다. 마지막으로 이미지 3 전체 agarose 패드는 coverglass 아래 셀으로 표시 하 고 VALAP 봉인. 시간 경과입니다 agarose 패드의 (B) 회로도 제공 됩니다. Agarose 패드의 주요 특징은 회로도에 표시 되어 있습니다. (C) 공기 주머니 agarose 패드에 A. tumefaciens 성장의 승진. 20 시간 동안 agarose 패드에 성장 wildtype A. tumefaciens 셀의 이미지 표시 됩니다. 이미지는 점점 공기 주머니에서 먼 위치에 촬영 했다. 이미지의 가장 가까운 가장자리에서 거리 공기 주머니를 각 이미지 위에 표시 됩니다. 눈금 막대 = 10 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56497/56497fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="2"><li>
이미징 참고: 미분 간섭 명암, 위상 대조 및 epifluorescence 이미징 하드웨어 기반 autofocusing, 자동화 된 단계, 표준 필터, LED 광원, 60 X 기름 침수 거꾸로 현미경으로 수행 됩니다. 단계 대조 또는 차동 간섭 콘트라스트 (DIC), 목표 (1.4 없음) 고 1 K 전자 멀티 충전-결합-장치 (EMCCD) 카메라. 현미경은 온도 제어 룸에 배치 되어야 합니다. 또는 따뜻한 무대 또는 챔버 이미징 동안 일관 된 온도 유지 하기 위해 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>Epifluorescence 현미경 검사 법 참고: 라이브 셀의 형광 이미징, 그것은 이미지 취득의 수를 제한 하 고 photobleaching 및 phototoxicity을 최소화 하기 위해 노출 시간을 최적화 하는 데 필요한. 각 염료의 이미지에 대 한 충분 한 형광 탐지를 제공 하지만 photobleaching 또는 phototoxicity로 이어질 하지 않는 최적의 노출 시간을 찾을 수는 것이 좋습니다. 그림 2-4, 200 ms의 노출 시간 모든 형광 이미지 사용 되었다. 그림 3에 표시 된 시간 시퀀스에 대 한 이미지 3 시간 마다 10 분을 인수 했다.<ol>
<li>원하는 목표에 침수 기름을 놓고 거꾸로 슬라이드 슬라이드 홀더에 스테이지에 배치 합니다. 초점 조절 손잡이 사용 하 여 초점으로 셀을가지고.</li>
			<li>취득 단계 (DIC)에 이미지와 원하는 형광 필터. 참고: 그림 2, 그림 3및 그림 4 에서 사용 하는 얼룩에 대 한 최대한의 여기 및 방출 파장은 다음과 같습니다: HADA (405/460), 나 (450/555) 다, 타다 (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), 오렌지 (547/570).</li>
		</ol>
</li>
		<li>시간 경과 현미경 참고: 시간 경과 현미경 검사 법 중 다음 특징은 컴퓨터 제어: x, y, 및 z 위치, 셔터, 및 형광 필터. 하드웨어 기반 자동 초점 시스템은 시간 경과 영상 동안 초점을 유지 하기 위해 최적의. 또한, 소프트웨어 기반 자동 초점 루프를 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>원하는 목표에 침수 기름을 놓고 거꾸로 슬라이드 슬라이드 홀더에 스테이지에 배치 합니다. 초점 조절 손잡이 사용 하 여 초점으로 셀을가지고.</li>
			<li>필요한 경우: 취득 여러 (x, y) 위치. 임의로 agarose 패드의 공기 주머니에 가까운 근접에서 셀의 10 필드를 선택 합니다.</li>
			<li>시간 순서 인수 이미지 단계 또는 DIC에 원하는 시간 간격 설정 했다. 참고: 그림 4에 표시 된 시간 시퀀스에 대 한 DIC 이미지 30 ms 노출 14 h에 대 한 모든 10 분 인수 했다. 시간 경과 현미경 중 형광 이미징 사용 하 여, photobleaching 및 phototoxicity을 최소화 하기 위해 수집 간격 및 노출 시간을 조정 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에는 A. tumefaciens wildtype, 돌연변이, 그리고 소모 긴장의 조사에 대 한 절차의 일련을 포함 되어 있습니다. 그것은 프로토콜 섹션에 나열 된 절차의 모든 성장 매체, 온도, 및 성장 속도 대 한 계정에 추가 수정 다른 세균성 긴장에 쉽게 적용할 수 있습니다 지적 가치가 있다.
대상 특정 염료를 사용 하 여 세균성 세포에서 세포 주기 이벤트의 상세한 묘사를 제?...

세균성 세포 주기 진행, 막과 세포 벽 생 합성, 분리, DNA 복제와 세포 분열을 포함 하 여 많은 프로세스의 필요 합니다. 완벽 하 게 이해 하려면 세균성 세포 생물학의 복잡성, 그것은 이러한 필수 이벤트; 공부 하는 데 필요한 그러나이 통로의 주요 구성 요소는 mutagenized 때 세포 생존 능력은 손상 이후,이 아닌-사소한 작업입니다. 대상 특정 염료와 결합 하는 Epifluorescence 현미경 wildtype 및 돌연변이 세균성 긴장에 필수적인 프로세스를 조사 하는 강력한 접근 이다.
Peptidoglycan 특정 염료 등 형광-d-아미노산 (예를 들어 7-hydroxycoumarin-3-carboxylic 산-3-아미노-d-알라닌, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-알라닌이 형광 항생제 (vancomycin-플로리다, bocillin-FL) 나 다; tetramethylrhodamine-3-아미노-d-알라닌; 여 깄 어 요)입니다. 그람 양성 세균에 peptidoglycan 생 합성의 사이트를 조사 하에 형광 항생제 아날로그의 sublethal 농도 사용 하 여 공개 peptidoglycan 삽입 패턴1,2, 효과적인 전략 되었습니다. 3,4. 형광 vancomycin 라벨 삽입 패턴 고정 된 그람 음성 박테리아5는 peptidoglycan에 통찰력을 얻을 하는 데 사용 되었습니다, 하는 동안 외부 막 일반적으로 형광의 사용을 방지 하는 침투성 방 벽을 제공 라이브 셀에 peptidoglycan 생 합성에 대 한 조사로 항생제. 반면, 형광-d-아미노산 또는 d-아미노산 biorthogonal 기능 그룹의 짧은 펄스 covalently 살아있는 세균성 세포6,7의 넓은 범위에 최근 peptidoglycan 삽입의 레이블. 합성 d-아미노산으로 관찰 된 peptidoglycan 삽입의 패턴 등이 punctate septal (대장균 및 새 균의 subtilis), 극 지와 septal (Agrobacterium tumefaciens 및 Listeria monocytogenes), septal만 (황색 포도상구균), 그리고 꼭대기 (Streptomyces venezuelae)6,7. 이러한 관측 나타냅니다 박테리아 세포 벽 속의 다양 한 패턴을 전시 하 고 합성 d-아미노산 성장 패턴을 조사 하기 위한 조사로의 사용은 많은 박테리아에 귀중 한 전략 이다.
세균 염색체 분류 염료 포함 deoxyribonucleic 산 (DNA) 특정 작은 강 저 바인더 (4, 6-diamidino-2-phenylindole; DAPI)와 높은 선호도 cyanine 염료 (녹색 및 오렌지; 자료 목록 참조). 고정된 셀의 얼룩 DAPI DAPI 라이브 셀의 얼룩은 세균 생존9를 나타내는 데 사용 하는 반면 환경 샘플8, 박테리아의 열거 지원 합니다. 반면, cyanine 염료와 같은 오렌지와 녹색 자주 설명으로 막 impermeant "죽은" 셀 비 가능한 셀9열거 하 얼룩. 놀랍게도, 이러한 시 약은 세포 성장 하는 동안 세균의 핵양체의 형태를 조사 하는 데 사용 됩니다, DAPI, 주황색과 녹색 했다 모든 표시 막 permeant 고 라이브 셀10라벨의 것. 대장균 세포 살고, DAPI DNA의 얼룩 때문에 자동 형광 확산 세포질에서 나타나고 DAPI 스테인드 셀의 자외선 (UV)에 반복된 노출 perturbs 핵양체 구조10. 얼룩 대장균 또는 오렌지와 B. subtilis 밝혀이 염료 permeant 막 이며, 세포 성장, DNA 복제, 또는 염색체 분리10 영향을 주지 않고 라이브 세포에서 dna 바인딩 시 오랫동안 형광을 제공 . 이러한 관측 cyanine DNA 염료 많은 박테리아의 세포 성장 하는 동안 nucleoids의 형태를 모니터링 하는 데 사용 될 수 있다는 것이 좋습니다.
Phospholipid-specific stryl N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) 페 닐 등 염료) hexatrienyl) pyridinium dibromide (4-64; 참조 자료 목록) 양이온 화합물 및 부정 청구와 우선적으로 연결 인지질 cardiolipin 및 phosphatidylglycerol11등. 독특한 패턴 4-64 다른 박테리아의 멤브레인을 사용 하는 경우 관찰 된다. 대장균, 4-64 측면 벽을 따라 밴드에 폴란드에서 농축 하 고 부서 사이트의 pre-divisional에서12세포. 새 균의 subtilis에서 4-64 라벨 지질 나선13의 시각화 수 있습니다. Agrobacterium tumefaciens, 4-64 레이블 외부 막 하 고 있는 성장 극은14,15라벨 없는 특성 "편 자" 패턴에서 관찰 됩니다. 이러한 관찰이이 박테리아 세포 비대칭을 지질 도메인의 존재로 인해 다른 유형의 지질 배포판을 나타납니다. 4-64 확산 라벨의 존재와 같은 표시 패턴의 변화, blebs 또는 소포, invaginations, 또는 막 수축 수 있습니다 배포 또는 지질 생 합성에 영향을 주는 돌연변이 특성화에 유익.
세포를 얼룩이 지기, 넘어 필수 프로세스에 참여 하는 단백질의 기능을 결정은 필요 합니다. 필수 단백질의 특성은 필수 유전자를 삭제 하는 phenotypic 결과 공부 불가능 하기 때문에 기술적으로 도전적 이다. 따라서, 단백질을 고갈 다른 방법 등장 했습니다. 예를 들어 필수 유전자의 네이티브 발기인 보다는 유도할 수 있는 발기인의 컨트롤 아래 놓일 수 있다. 유도할 수 있는 발기인은 반응 작은 분자와 같은; 16, 이소프로필 β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)17,,1819,20,21, arabinose22,23, vanillate17,아연 xylose23, 따라서 대상 유전자의 녹음 방송을 중단 하 고 관심사의 단백질은 유도 제거 될 때 고갈. 필수 단백질의 고갈에 대 한 대체 방법이 포함 합성 riboswitches24 CRISPR 간섭25,26 대상 유전자의 전사를 방해 작은 분자 RNA 상호 작용을 사용 하 대상 유전자의 유도할 수 있는 단백질 저하27,28 ClpXP 효소에 의해 저하에 대 한 대상 단백질을 펩 티 드 태그를 사용 하 여 블록 전사 하. 따라서, 단백질 소모 하는 동안 시간이 지남에 세포의 현미경 이미징 특성에 대 한 강력한 접근은, 세포 생존 능력을 잃기 전에 고갈 긴장 특성화에 대 한 짧은 시간을 제공 합니다. 실제로, 살아있는 세균성 세포의 현미경 연구원 세포 모양 유지 보수, 분 비, 및 구획29의 메커니즘을 포함 하 여 기본적인 생물 학적 과정에 대 한 통찰력을 얻을 수 있게 되었습니다.
A. tumefaciens 는 세균성 식물 병원 체30 자연 유전자 엔지니어31,32입니다. 따라서, 메커니즘 관련 pathogenicity를 포함 한 호스트 병원 체 상호 작용33,,3435, 분 비36및 호스트 변환30,31, 37 광범위 하 게 조사. A. tumefaciens 중재 질병을 방지 하거나 공장 변환 향상 전략, 디자인에 A. tumefaciens 생존을 위한 필수 프로세스 더 나은 이해를 해야 합니다. 대상 특정 염료를 사용 하 여 A. tumefaciens18 단백질 소모 전략의 최근 개발 필수 프로세스를 조사 하는 수단을 제공 합니다.
여기, A. tumefaciens 의 wildtype, 돌연변이, 그리고 단백질 소모 긴장의 미세한 분석에 대 한 상세한 프로토콜 제공 됩니다. 처음 두 개의 프로토콜 셀을 준비 하 고 특정 대상 염료로 레이블을 지정 하는 방법을 설명 합니다. 세 번째 프로토콜 agarose 패드 (그림 1)를 준비 하 고 (그림 2, , 그림 3 그림 4) 세균성 세포 이미징에 대 한 단계별 지침을 제공 합니다. 이러한 프로토콜은 다양 한 미디어 조건, 성장 속도, 산소 요구 사항 및 셀 구조에 대 한 계정에 추가 적응으로 다른 박테리아에 대 한 적합 한 수도 있습니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Bacterial Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt; C58</td><td>ATCC</td><td>33970</td><td>Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of &lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt;. J Bacteriol 123:255-264.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt; C58&amp;Delta;tetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-&lt;em&gt;ctrA &amp;Delta;ctrA&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen &lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens&lt;/em&gt;. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Media Components&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATGN Minimal Medium</td><td></td><td></td><td>To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 &amp;deg;C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose.</td></tr><tr><td>20X AT Buffer</td><td></td><td></td><td>Add 214 g/L KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave.</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP359</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Chemical</td><td>P288</td><td></td></tr><tr><td>20X AT Salts</td><td></td><td></td><td>Add 40 g/L (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 3.2 g/L MgSO4&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.2 g/L CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, and 0.024 g/L MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to water. Autoclave.</td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Chemical</td><td>A701</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP213</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP510</td><td></td></tr><tr><td>MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Chemical</td><td>M114</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16</td><td>Prepare 40% stock in water. Filter sterilize.</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1423</td><td>Add 15 g to 1 L of water when preparing plates.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Optional Media Additives&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>GoldBio</td><td>K-120</td><td>Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 &amp;micro;g/ml.</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>GoldBio</td><td>I2481C5</td><td>Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopy Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550D</td><td>25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner.</td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisherbrand</td><td>12-541-B</td><td>22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner.</td></tr><tr><td>Sparkle Glass Cleaner</td><td>Home Depot</td><td>203261385</td><td>Ammonia and alcohol free.</td></tr><tr><td>Ultra Pure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-100</td><td>Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 - 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP399500</td><td>10X solution to be diluted to 1X with sterile water.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-999</td><td>Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation.</td></tr><tr><td>VALAP</td><td></td><td></td><td>Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 &amp;deg;C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten.</td></tr><tr><td>Lanolin Butter</td><td>SAAQIN</td><td>SQ-LAB-R1</td><td></td></tr><tr><td>Petroleum Jelly</td><td>Target Corp.</td><td>06-17644</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin Wax</td><td>Crafty Candles</td><td>263012</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Target-specific dyes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-1</td><td>Use to dilute stock solutions of dyes as needed.</td></tr><tr><td>FDAAs (NADA, HADA,TADA)</td><td></td><td></td><td>FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62247</td><td>Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 &amp;micro;g/ml.</td></tr><tr><td>SYTOX Orange Nucleic Acid Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S11368</td><td>Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 &amp;micro;M.</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>T3166</td><td>Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 &amp;micro;g/ml.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry bath</td><td>Sheldon Manufacturing, Inc.</td><td>52120-200</td><td></td></tr><tr><td>Metallic thermal beads</td><td>Lab Armor</td><td>42370-002</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera</td><td></td><td></td><td>Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work.</td></tr></tbody></table>

live cell fluorescence microscopy to observe essential processes during microbial cell growth

세균의 생존에 필수적인 단백질의 기능에 의존 하는 DNA 복제 및 분리, 단백질 합성, 세포 벽 생 합성 및 세포 분열 등의 핵심 세포 프로세스. 이러한 프로세스를 이해 하는 더 나은 프로브로 대상 특정 염료의 시리즈를 사용할 수 있습니다. 닥터지 염료와 염색 법 막 구조 관찰, 지질 microdomains의 시각화 및 막 blebs의 감지 수 있습니다. 형광-d-아미노산 생 합성 peptidoglycan의 사이트를 조사 하는 (FDAAs)의 사용은 세포 벽 속 또는 셀 성장 패턴에 잠재적인 결함을 나타낼 수 있습니다. 마지막으로, 핵 산 얼룩 DNA 복제 또는 염색체 분리 가능한 결함을 나타낼 수 있습니다. Cyanine DNA 레이블 셀 생활 얼룩 되며 시간 경과 현미경 세포 성장 동안 핵양체 형태학의 실시간 관측을 사용에 적합 합니다. 막 구조, 세포 벽 속, 또는 염색체 분리에 결함을 식별 하기 위해 단백질 소모 돌연변이에 셀 라벨에 대 한 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 또한, 시간 경과 현미경 모니터 형태학 상 변화는 필수적인 단백질 제거 되 고 단백질 기능에 대 한 추가적인 통찰력을 제공할 수 있습니다 사용할 수 있습니다. 예를 들어 필수 세포 분열 단백질의 고갈 결과 filamentation 또는 분기, 반면 세포 성장 단백질의 고갈 짧은 또는 둥글게 되는 셀을 발생할 수 있습니다. 여기, 세포 성장, 특정 대상 레이블 및 시간 경과 현미경 검사 법 프로토콜 Agrobacterium tumefaciens세균성 식물 병원 체에 대 한 제공 됩니다. 대상 특정 염료 및 시간 경과 현미경에 필수적인 프로세스의 특성을 사용 하는 함께, A. tumefaciens. 마지막으로, 제공 하는 프로토콜 프로브 다른 박테리아에 필수적인 프로세스를 쉽게 수정할 수 있습니다.

대상별 wildtype의 라벨 A. tumefaciens 셀 그 셀 형태를 설명 하기 위해 영향을 받지 않습니다 세척 단계 또는 (는 형광 염료를 희석 하는 데 사용 됩니다) 1 %DMSO 치료, 세포로 세포 세척 후 문화 (그림 2A, 맨 왼쪽된 패널)에서 직접 몇 군데 있었다 원심 분리 1.2 (그림 2A, 왼쪽된 패널), 또?...

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth at JoVE.com

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

박테리아에 필수적인 프로세스의 기능을 이해은 도전 이다. 대상 특정 염료 형광 현미경 검사 법은 미생물 세포 성장과 세포 주기 진행에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기, Agrobacterium tumefaciens 모델 박테리아로 필수 프로세스의 특성에 대 한 라이브 셀 이미징에 대 한 방법을 강조 하는 데 사용 됩니다.

라이브 세포 형광 현미경 검사 법 미생물 세포 성장 하는 동안 필수 과정을 관찰 하

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

live-cell-fluorescence-microscopy-to-observe-essential-processes

Research

JoVE Journal

Biology

15.7K 조회수.  University of Missouri. 박테리아에 필수적인 프로세스의 기능을 이해은 도전 이다. 대상 특정 염료 형광 현미경 검사 법은 미생물 세포 성장과 세포 주기 진행에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기, Agrobacterium tumefaciens 모델 박테리아로 필수 프로세스의 특성에 대 한 라이브 셀 이미징에 대 한 방법을 강조 하는 데 사용 됩니다.

비디오: Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

라이브 셀 이미징 바실러스 subtilis과 연쇄상 구균 pneumoniae 자동 시간 저속 현미경을 사용하여

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

연구

면역학 및 감염병학

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over the past decade, new and innovative technologies have greatly enhanced the practicality of live-cell imaging. Cells can now be kept in focus and continuously imaged over several days while maintained under 37 &#176;C and 5% CO2 cell culture conditions. Moreover, multiple fields of view representing different experimental conditions can be acquired simultaneously, thus providing high-throughput experimental data. Live-cell imaging provides a significant advantage over fixed-cell imaging by allowing for the direct visualization and temporal quantitation of dynamic cellular events. Live-cell imaging can also identify variation in the behavior of single cells that would otherwise have been missed using population-based assays. Here, we describe live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel. We demonstrate methods to visualize whether mitotically arrested cells die directly from mitosis or slip back into interphase. We also describe how the fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system can be used to assess the fraction of interphase cells born from mitotic slippage that are capable of re-entering the cell cycle. Finally, we describe a live-cell imaging method to identify nuclear envelope rupture events.

Live-cell imaging provides a wealth of information on single cells or whole populations that is unattainable by fixed cell imaging alone. Here, live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel are described.

장기 라이브 셀 이미징 셀 운명 Paclitaxel에 대 한 응답에서을 평가 하

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

암 연구학

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes underlying central cell cycle events. However, imaging of these molecules in slow-growing bacteria represents a challenge due to photobleaching of fluorophores and phototoxicity during image acquisition. Here, we describe a simple protocol to circumvent these limitations in the case of Myxococcus xanthus (which has a generation time of 4 - 6 h). To this end, M. xanthus cells are grown on a thick nutrient-containing agar pad in a temperature-controlled humid environment. Under these conditions, we determine the doubling time of individual cells by following the growth of single cells. Moreover, key cellular processes such as chromosome segregation and cell division can be imaged by fluorescence live-cell imaging of cells containing relevant fluorescently labeled marker proteins such as ParB-YFP, FtsZ-GFP, and mCherry-PomX over multiple cell cycles. Subsequently, the acquired images are processed to generate montages and/or movies.

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Bacterial cells are spatially highly organized. To follow this organization over time in slow growing Myxococcus xanthus cells, a set-up for fluorescence live-cell imaging with high spatiotemporal resolution over several generations was developed. Using this method, spatiotemporal dynamics of important proteins for chromosome segregation and cell division could be determined.

형광 라이브 셀 이미징의 완전 한 식물 세포의 주기 느린 성장 사회 박테리아 Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

생화학

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols to address these questions include colony count assays, gentamicin protection assays, and electron microscopy. Colony count and gentamicin protection assays only assess the viability of the entire bacterial population and are unable to determine individual bacterial viability. Electron microscopy can be used to determine the viability of individual bacteria and provide information regarding their localization in host cells. However, bacteria often display a range of electron densities, making assessment of viability difficult. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells. These assays were developed originally to assess survival of Neisseria gonorrhoeae in primary human neutrophils, but should be applicable to any bacterium-host cell interaction. These protocols combine membrane-permeable fluorescent dyes (SYTO9 and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), which stain all bacteria, with membrane-impermeable fluorescent dyes (propidium iodide and SYTOX Green), which are only accessible to nonviable bacteria. Prior to eukaryotic cell permeabilization, an antibody or fluorescent reagent is added to identify extracellular bacteria. Thus these assays discriminate the viability of bacteria adherent to and inside eukaryotic cells. A protocol is also provided for using the viability dyes in combination with fluorescent antibodies to eukaryotic cell markers, in order to determine the subcellular localization of individual bacteria. The bacterial viability dyes discussed in this article are a sensitive complement and/or alternative to traditional microbiology techniques to evaluate the viability of individual bacteria and provide information regarding where bacteria survive in host cells.

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells.

포유 동물 세포와 관련있는 박테리아의 생존을 확인하는 방법에 대한 형광 현미경 방법

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

생물학

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence microscopy as observations made at a population level may not truly reflect what occurs at a single cell level. Live-cell timelapse microscopy allows investigators to monitor the changes in cell division or cell morphology which provide valuable insights regarding subcellular localization of proteins and timing of gene expression, as it happens, to potentially aid in answering important biological questions. Here, we describe our protocol to monitor phenotypic changes in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus using a high-resolution deconvolution microscope. The objective of this report is to provide a simple and clear protocol that can be adopted by other investigators interested in conducting fluorescence microscopy experiments to study different biological processes in bacteria as well as other organisms.

This article provides a step-by-step guide to investigate protein subcellular localization dynamics and to monitor morphological changes using high-resolution fluorescence microscopy in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus.

박테리아의 세포 외 단백질 국소화 및 세포 형태 변화를 조사하는 살아있는 세포 형광 현미경 검사법

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method has been developed for observing interspecies interactions between two bacterial pathogens. The use of this method to interrogate interactions between a motile Gram-negative pathogen, Pseudomonas aeruginosa and a non-motile Gram-positive pathogen, Staphylococcus aureus is demonstrated here. This protocol consists of co-inoculating each species between a coverslip and an agarose pad, which maintains the cells in a single plane and allows for visualization of bacterial behaviors in both space and time.
Furthermore, the time-lapse microscopy demonstrated here is ideal for visualizing the early interactions that take place between two or more bacterial species, including changes in bacterial species motility in monoculture and in coculture with other species. Due to the nature of the limited sample space in the microscopy setup, this protocol is less applicable for studying later interactions between bacterial species once cell populations are too high. However, there are several different applications of the protocol which include the use of staining for imaging live and dead bacterial cells, quantification of gene or protein expression through fluorescent reporters, and tracking bacterial cell movement in both single species and multispecies experiments.

This live-bacterial cell imaging protocol allows for visualization of interactions between multiple bacterial species at the single-cell level over time. Time-lapse imaging allows for observation of each bacterial species in monoculture or coculture to interrogate interspecies interactions in multispecies bacterial communities, including individual cell motility and viability.

단세포 종 간 세균성 상호 작용의 운동 시각화

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

초기 자식 작용 이벤트의 셀 이미징 라이브 : Omegasomes을 넘어

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation. 
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisi&#230;, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.

Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...