Name: 3d mitochondrial ultrastructure of drosophila indirect flight muscle revealed by serial-section electron tomography
Uploaded: 2017-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography at JoVE.com

Çalışmalar cep Enstitüsü ve Organismic Biyoloji EM özünde ve Academia Sinica, Taipei, Tayvan cryo-EM özünü yapıldı. İş Academia Sinica ve çoğu tarafından desteklenmiştir.

1. bölüm Drosophila dokular bir titreşimli Blade Microtome kullanarak
<ol>
	<li>Drosophila buzda anestezi ve her tek sinek % 4 düşük erime özel fosfat tampon 1 mL içinde bırakın. Buzda kuvvetlendirmek özel izin. Genellikle, 4-6 sinekler işlendi.</li>
	<li>Titreşimli blade microtome özel jel içine katıştırılmış Drosophila 100 µm kalınlık ile dilim bölüm ve 0.1 M fosfat tampon % 2.5 oxazolidin içeren sabitleştirici çözüm bırakın için kullanın. Not: doku mimari diğer yöntemlerine göre daha sağlam kalır çünkü Vibratome kesit tercih edilir. Alternatif olarak, 0.1 M fosfat tampon % 2.5 oxazolidin içeren sabitleştirici çözüm içine IFM incelemek için cımbız dissekan kullanılabilir.</li>
</ol>
2. yüksek basınç donma ve donma ikame (HPF/FS) yöntemi tarafından EM numuneler hazırlayın
<ol>
	<li>3 damla (~ 150 µL) doku bölümlerde fosfat tampon, fosfat tampon % 20 BSA ile 2 damla (~ 100 µL) tarafından takip yıkayın. O zaman altın taşıyıcıları için arabellek ve % 20 BSA ile dolu HPF bölümleri yerleştirin.</li>
	<li>Kullanıcı kılavuzuna göre yüksek basınçlı bir dondurucu içine taşıyıcıları içeren örnek yükleyin.</li>
	<li>Dondurma sonra sıvı azot altında sahibinden taşıyıcıları serbest bırakmak ve -140 ° C'ye soğutmalı donma-ikame aygıta transfer</li>
	<li>Tablo 1, % 2'oxazolidin, % 2 Osmiyum tetroxide ve % 0.1 uranyl asetat aseton içeren kokteyl FS ile gösterildiği gibi freeze-ikame Protokolü gerçekleştirin.</li>
	<li>Dikkatle numune taşıyıcıları bir iğne ile kaldırın ve reçine oda sıcaklığında örnekler embed. 16 h için 65 ° C'de reçine polimerize. Not: FS iletişim kuralları örnekleri diğer türleri hazırlamak için değiştirilmesi gerekir. HPF/FS ultrastructure korumak ve hücresel içeriği kaybını en aza indirmek için tercih edilir.<ol>
		<li>Alternatif olarak, bir kimyasal fiksasyonu protokole uygulanır. Numuneler ile % 2.5 oxazolidin gecede düzeltmek, arabellekleri ile yıkayın ve % 1 Osmiyum tetroxide için 2 h. yıkama ile düzeltmek ve etanol konsantrasyonları artan ile kurutmak ve sonra sızmak ve 16 65 ° C'de polymerizing önce Spurr'ın reçine örnekler embed h.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. seri-bölümlerde örneklerin elektron tomografi için hazırlayın
<ol>
	<li>Doku içeren istediğiniz blok yüzü ortaya çıkarmak için numune blok döşeme.</li>
	<li>Altın parçacıkları pretreat (10 nm çapında) ile % 1 BSA 30 dk. yıkama ve altın parçacıkları PBS arabellekte askıya alma. Altın parçacıkları indirgeme işaretleri oluşturmak için karbon film ile kaplı bakır yuvası Izgaralar üzerinde yerleşimi.</li>
	<li>TEM altında yeterli indirgeme işaretleri (en az 5-10 işaretleri) için tomografi edinme görüş alanı içinde kontrol edin.</li>
	<li>Seri kesitler, 200-250 nm kalınlıkta bir ultramicrotome kullanarak, kes.</li>
	<li>Mükemmel bir döngü için ince bölümleri kullanarak yuvası Izgaralar üzerinde seri bölümler toplamak.</li>
	<li>Reynold kurşun sitrat 10 dk bölümlerle leke.</li>
	<li>Bölümleri üst indirgeme altın parçacıkları ikinci tabakası kaplar.</li>
</ol>
4. çift-tilt elektron tomografi toplamak
<ol>
	<li>Kılavuz bir çift eksenli tomografi tutucu üzerine yük ve 200'de işletim transmisyon elektron mikroskobu takabilirsiniz kV.</li>
	<li>Eucentric odak vasıl mikroskop hizalayın.</li>
	<li>Otomatik veri toplama yazılımı kurar. Ayarlamak ve çoklu ölçek görüntüleme ayarı, elektron ışını hizalayın. İşlem detay10 (Şekil 2) için kullanıcı el kitabına başvurun.</li>
	<li>Karbon film tomografi koleksiyonu ayarı altında olmaksızın boş bir alan kamera karanlık ve aydınlık referanslar elde etmek.</li>
	<li>Bir kılavuz atlas düşük büyütmede toplamak. Mitokondri seri bölümlerinde tomografi koleksiyonu için hedef olarak seçin.</li>
	<li>-60 ° ila + 60 ° 2 ° artışlarla bir tilt serisinden elde eksen-A her hedef için. Not: Tilt açıları mekanik olarak numune tutucu tasarım tarafından kısıtlı olacak. Sahibi yüksek tilt açılarda ışın engeller.</li>
	<li>İkinci tilt serisi toplamak için numune tutucu 90 ° döndürün. Yeni bir atlas elde etmek. Karşılık gelen pozisyonlar seçin ve tilt serisi eksen-b her hedef için kazanmak. Not: SerialEM ve Xplore3D, gibi diğer yazılım paketlerini otomatik veri toplama için kullanılabilir.</li>
</ol>
5. yeniden 3D Tomograms ve Segment alt birimleri kullanma bilgisayar yazılımı
<ol>
	<li>Tomograms but yazılım11kullanarak çift eksenli tilt görüntülerin yeniden.
	<ol>
		<li>İşlem detay için kullanıcı el kitabına başvurun.</li>
		<li>Bireysel tilt serisi tarafından altın indirgeme işaretleri pozisyonların hizalayın. Tomograms geri projeksiyon yöntemi veya eşzamanlı yinelemeli imar tekniği (SIRT) yöntemi için her iki eksen-A yeniden ve eksen-B, sırasıyla (şekil 3).</li>
		<li>Tomograms eksen-a birleştirmek ve azaltılmış eksik kama yapı ile bir çift-tilt tomogram oluşturmak için eksen-B.</li>
		<li>Çift-tilt tomograms seri bölümlerin tüm mitokondri Birim kapsayan rekonstrüksiyonlar elde etmek için bir araya. But program tarafından seri bölümler arasındaki boşluklar modeli.</li>
		<li>Birleştirilmiş tomograms ve birimin bölümleme için istenen boyuta Kutusu'na kırpın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3D yazılım kullanarak birleştirilen seri tomograms analiz.
	<ol>
		<li>İşlem detay için kullanıcı el kitabına başvurun.</li>
		<li>Kontrast özellikleri, arka plan yoğunluğunu azaltmak için bir Gauss filtre (veya diğer yöntemi) ile tomograms filtre.</li>
		<li>Mitokondri ultrastructure el ile veya otomatik olarak kesiminde.</li>
		<li>Muayene 3D izin vermek için segmentasyon modelleri görüntülemek.</li>
		<li>Filmler 3D araçları kullanarak oluşturun.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dahl, R., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+freezing+for+the+preservation+of+biological+structure:+theory+and+practice.">High-pressure freezing for the preservation of biological structure: theory and practice.</a> J Electron Microsc Tech. 13 (3), 165-174 (1989).</li><li>Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemistry+and+electron+microscopy.+The+preservation+of+cellular+ultrastructure+and+enzymatic+activity+by+aldehyde+fixation.">Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation.</a> J Cell Biol. 17, 19-58 (1963).</li><li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromachining+tools+and+correlative+approaches+for+cellular+cryo-electron+tomography.">Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 172 (2), 169-179 (2010).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).</li><li>Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+by+electron+tomography:+from+cells+to+molecules.">Structural studies by electron tomography: from cells to molecules.</a> Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).</li><li>Soto, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+electron+tomography:+a+method+for+three-dimensional+reconstruction+of+large+structures.">Serial section electron tomography: a method for three-dimensional reconstruction of large structures.</a> Neuroimage. 1 (3), 230-243 (1994).</li><li>Jiang, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomographic+analysis+reveals+ultrastructural+features+of+mitochondrial+cristae+architecture+which+reflect+energetic+state+and+aging.">Electron tomographic analysis reveals ultrastructural features of mitochondrial cristae architecture which reflect energetic state and aging.</a> SciRep. 7, 45474 (2017).</li><li>Cogliati, S., Enriquez, J. A., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Cristae:+Where+Beauty+Meets+Functionality.">Mitochondrial Cristae: Where Beauty Meets Functionality.</a> TrendsBiochemSci. 41 (3), 261-273 (2016).</li><li>Friedman, J. R., Nunnari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+form+and+function.">Mitochondrial form and function.</a> Nature. 505 (7483), 335-343 (2014).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated,+sequential+tilt-series+acquisition+with+Leginon.">Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon.</a> J Struct Biol. 167 (1), 11-18 (2009).</li><li>Mastronarde, D. N., Held, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tilt+series+alignment+and+tomographic+reconstruction+in+IMOD.">Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD.</a> J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Bu protokol için 3D mitokondriyal ultrastructure Drosophila dolaylı uçuş kas eğitim için seri-bölüm elektron tomografi uygulamak için en iyi duruma getirilmiş bir iş akışını açıklar. Ultrastructure örnek korunması için bu tür bir çözümleme birincil teknik mücadeledir. En iyi ultrastructure iki metodolojik korumak için adımlar dahil edildi. İlk olarak, doku doku mimari mümkün olduğunca korumak için bıçak microtome titreşimli ile kesit tarafından örnek. İkinci olarak, bir HPF/FS protokol organel ultrastructure katıştırılmış numune blokları hazırlanması sırasında korumak için optimize edildi. Numuneler suyun donma noktası düşürür ve ultrastructure1zarar buz kristalleri oluşumu azaltır, yüksek basınç altında dondurulmuştu. Örnek 0,1 mm kalınlığında anında Vitrifiye ve sonra EM analiz için numune blok oluşturmak için ikame dondurmak için tabi. Kimyasal fiksasyonu yöntemlerine göre zaman ultrastructure HPF/FS tarafından geliştirilmiş korunması belirtilmişti. Bu dizi adımı numune hazırlama için kullanarak, mitokondrial Çift Kişilik membranlar ve cristae membran korunması önemli ölçüde geliştirildi.
Seri bölümlerini numune alma yönteminin en zor adımdır. Elektron ışını penetrasyon gücü sınırlı olan bölümü kalınlığı ya 250 ile sınırlı olduğu nm veya 500 nm 200'de çalışan bir TEM kullanarak kV veya 300 kV, anılan sıraya göre. Bir mitokondri kalınlığı 2'den fazla µm olduğu için seri bölümler tam birim rekonstrüksiyonlar elde etmek için gereklidir. Ancak, tüm bir organel span için seri bölümleri yeterli sayıda kurtarma teknik bir sorundur. Yamuk bazlar arasındaki mümkün olduğunca düz olmak blok yüz kırpma daha fazla bölümleri yer sağlamak ve böylece daha büyük birimleri kapak bir yuvası ızgara izin verebilirsiniz. Ayrıca, mükemmel bir döngü için ince bölümleri kullanarak seri bölümler kılavuza aktarma başarı oranı artar.
Seri-bölüm elektron tomografi standart EM temel ekipman ile gerçekleştirilebilir. Ancak, yöntem teknik kısıtlamalar ortaya kaçınılmaz bazı sınırlamalar vardır. Biri malzeme kaçınılmaz olarak birleştirilen imar boşluklar bırakarak seri bölümler arasında kaybolur. İkinci olarak ulaşılabilir sınırlı tilt açıları nedeniyle ortaya çıkar eksik kama artifakı olduğunu. Bu kısıtlama örnek sahibi tam bir rotasyon elektron ışını engelleme olmadan açılamaz oluşur. Bu sınırlamaları rağmen seri-bölüm elektron tomografi 3D cep ve organel ultrastructure ortaya çıkarmak için yeterli çözüm sağlanır.
Daha küçük ölçekli görüntüleme için cryo-elektron tomografi makromoleküllerin kompleksleri ve derlemeler in situ alt tomografik ile birlikte nm veya alt angstrom çözünürlükte yapısını elde etmek için kullanılan bir gelişmekte olan bir teknolojidir yeniden yapılanma3. Bu uygulamada, hücreleri kesit veya altında sıvı azot freze odaklı iyon demeti inceltilerek. Tomograms nerede moleküler yapıları yerli devlet kimyasal fiksasyonu, dehidratasyon veya gömme olmadan yakın korunur cryo-koşullar altında toplanır. Belirli araç4gerektirir ölçek diğer ucunda, çözünürlük, pahasına büyük doku birimleri çözümlemek için seri blok-yüz tarama elektron mikroskobu çekici bir modalite olsa bile.

Elektron mikroskobu hücre altı derlemeler ve hücresel süreçler yerine organelleri yapısal bağlamında incelemek için değerli bir araçtır. Yöntemleri ultrastructure doku ve hücreler tarafından aldehitler ile kimyasal fiksasyonu korumak için geliştirilmiştir ya tarafından yüksek basınçlı (HPF) ardından dondurma dondurma ikame (FS)1,2. Katıştırılmış numune blok sonra saat kesitli, lekeli ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile görülmektedir. HPF numune de cryo-koşul altında gibi soguk kesit veya freze ve cryo-EM3,4tarafından gözlenen odaklı iyon ışını (yalan) işleme.
İnce kesit EM bilgilendirici morfolojik anlayışlar sağlasa da, elde edilen 2D görüntüleri yalnızca belirli bir kesit ultrastructure ortaya çıkarabilir. Ultrastructure bir 3B cilt düzenlenme gizli kalır. Üç boyutlu hücresel ultrastructure görselleştirmek için nerede dizi tilt resmi satın aldı ve geri bir tomografik imar5 (şekil 1) oluşturmak için öngörülen bir elektron tomografi yöntem geliştirilmiştir. Bir çift tilt serisi örnek 90 ° döner ve ikinci bir tilt dizi edinme toplanabilir. Bu sınırlı örnekleme açılardan neden olur ve tomogram çözümlenmesi geliştirmek eksik-kama yapıların en aza indirmek olacaktır.
Burada, Drosophila dolaylı uçuş kas (IFM)6,7,8,9 mitokondriyal ultrastructure çalışmaya seri-bölüm elektron tomografi uygulanması açıklamak . 3D rekonstrüksiyonlar kapsayan tüm mitokondri (yaklaşık 2.5 µm kalınlığında) elde etmek için seri bölümler Drosophila IFM doku bloklardan elde edilmiştir. Tomograms her bölümün otomatik veri toplama yazılımı kullanarak tek tek toplanmıştır. Tomografik rekonstrüksiyonlar oluşturulan ve seri tomograms tüm bir mitokondri yeniden oluşturulan hacmi elde etmek için but paketiyle katıldı. Birleştirilmiş tomograms 3D yazılım tarafından analiz edildi. Mitokondriyal cristae yoğunlukları organizasyon üç boyutlu olarak ortaya bir segment oluşturma modeli oluşturmak için parçalara.

<table><tbody><tr><td>vibrating blade microtome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td>Tissue sectioning</td></tr><tr><td>high-pressure freezer</td><td>Leica</td><td>EM HPM100</td><td>Specimen preparation</td></tr><tr><td>freeze-substitution device</td><td>Leica</td><td>EM AFS2</td><td>Specimen preparation</td></tr><tr><td>ultramicrotome</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td>Ultra-thin sectioning</td></tr><tr><td>dual-axis tomography holder</td><td>Fischione</td><td>Model 2040</td><td>tomography collection</td></tr><tr><td>transmission electron microscope</td><td>FEI</td><td>Tecnai F20</td><td>tomography collection</td></tr><tr><td>CCD</td><td>Gatan</td><td>UltraScan 1000</td><td>tomography collection</td></tr><tr><td>Leginon</td><td>NRAMM/AMI</td><td>tomography collection</td><td></td></tr><tr><td>IMOD</td><td>Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells</td><td>Tomography reconstruction&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Avizo 3D</td><td>FEI</td><td></td><td>Tomography analysis</td></tr></tbody></table>

3d mitochondrial ultrastructure of drosophila indirect flight muscle revealed by serial-section electron tomography

Mitokondri ATP, yağlar, metabolitleri üretmek ve yanı sıra kalsiyum homeostazı ve hücre ölümü düzenleyen hücresel güçlüdür vardır. Bu organel benzersiz cristae zengini çift cidarlı ultrastructure zarif biomolecules bölümleme tarafından birden çok işlevlerini gerçekleştirecek için ayarlandı. Mitokondriyal ultrastructure çeşitli fonksiyonları ile yakından bağlantılıdır; Ancak, bu yapı-fonksiyon ilişkileri ince detaylar tarif edilebilir sadece başlıyor. Burada, mitokondrial Drosophila dolaylı uçuş kas yapısında aydınlatmak için seri-bölüm elektron tomografi uygulanması gösterilmektedir. Seri-bölüm elektron tomografi herhangi bir hücresel yapısı üç boyutlu olarak çalışmaya adapte olabilir.

Biz onun enerjik devlet ve yaşlanma yansıtır mitokondriyal cristae yapısal özelliklerini analiz etmek için seri-bölüm elektron tomografi uygulanır. Drosophila IFM mitokondri entegre bir formu gösterdi cristae ve matris ağ 3D (şekil 4)7. Buna ek olarak, mitokondriyal DNA çoğaltma kusur ve bir hızlandırılmış yaşlanma fenotip mutant sinekli soğan gibi dönen çekirdek (şekil 5)7alt bölümleri bulunan mitokondri birikmiş.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig1.jpg"> 
Şekil 1: Elektron tomografi imar tilt Series Illustration. Nesne için çeşitli derece hareket ettirildiğinde deneyde, bir elektron ışını 3D nesnesi üzerinden geçirilir. Her tilt koşul için bir 2D projeksiyon oluşturulur ve bir kamera ile çekilen. 2D projeksiyonlar sonra geri Merkezi dilim teoremi üzerinde tabanlı 3D nesne yeniden oluşturmak için tahmin ediliyor. Örnekte, aynı işlemi çeşitli tilt açıları altında tek bir boyut içine yansıtılır orijinal 2D görüntü için gösterilir. 1D yansımalar daha sonra 2B görüntü yeniden oluşturmak için kullanılır. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig2.jpg"> 
Şekil 2: otomatik veri toplama. Bir resim görüntüleyici görüntüleme yazılımı seri bölümler içeren bir yuvası kılavuz Atlası gösterilen mitokondri hedefleme ve elde çok ölçekli görüntüler eğ. Ölçek çubuğu = 500 µm (sol üst panel), 100 µm (sol alt paneli), 1 µm (doğru kapı aynası). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig3.jpg"> 
Şekil 3: Seri-bölüm elektron tomografi, Drosophila dolaylı uçuş kas tek bir mitokondri. 2D Filmler(a)ve (B) 3D tomograms seri bölümlerden bir mitokondri tüm birimi kapsayan. (C) birleştirilen seri-bölüm tomograms ile z ekseni dikey olarak gösterilen boyuna bir bölüm oluşturmak için tahmin ediliyor. Özellikle, doku kesit kaybetme-in malzeme, birleştirilen tomograms arasında boşluklar bırakarak yol açtı. Ölçek çubuğu = 500 nm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig4.jpg"> 
Şekil 4: entegre Intra-mitokondri cristae ve 3D ortaya matris ağ. (A)dilim mitokondrial elektron tomografik rekonstrüksiyonlar gösterilen z ekseni boyunca lamel membranlar arasında geçiş yapar. Hemen teslim ve/veya sol elle spiraller şekillerinin geçiş gözlenen cristae (B) resimler. (C) tomografik segmentasyon desenleri değiştirme 3D (D) Cristae solak bir spiral gösteren analiz ve segmentasyon modelinde (E, F) renk olarak işlenen. Yanal matris confluency (karanlık yoğunluğunu, kırmızı işaretli) cristae membranlar (beyaz yoğunlukları) arasında gösterilen tomografik dilim. (G) bölümleme model yanal matris confluency (kırmızı) gösterilen tomogram (E) ve (içinde gri) temsilcisi cristae. Ölçek çubuğu = 50 nm (A), 200 nm (C) ve 300 nm (D, E, F, G). Reprint gelen Jiang ve ark. idi 7 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig5.jpg"> 
Şekil 5: mitokondri soğan gibi dönen çekirdek ile yaşlanma sırasında mitokondrial DNA çoğaltma hataları sinekli içinde birikmiş. Temsilcisi tomografik dilimleri ve kesit görünümü (üst) ve dönen bir çekirdek boyuna kesit görünümü (alt) gösterilen ilgili segmentasyon (doğru kapı aynası). Birim segmentasyon dönen çekirdek vurgulamak için rasgele renk işleme tarafından belirtilir. Ölçek çubuğu: 200 nm. Reprint gelen Jiang ve ark. idi 7 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adım</td>
			<td colspan="2">Temp</td>
			<td colspan="2">Zaman</td>
			<td colspan="2">Çözüm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">-140 ° C-9 0 ° C</td>
			<td colspan="2">30 dk</td>
			<td colspan="2">Sıvı azot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="2">-90 ° C</td>
			<td colspan="2">96 saat</td>
			<td colspan="2">FS kokteyl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="2">-90 ° C-60 ° C</td>
			<td colspan="2">6 saat (5 ° C/hr)</td>
			<td colspan="2">FS kokteyl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">-60 ° C</td>
			<td colspan="2">12 hr</td>
			<td colspan="2">FS kokteyl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="2">--25 ° c 60 ° C</td>
			<td colspan="2">7 SA (5 ° C/hr)</td>
			<td colspan="2">FS kokteyl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">-25 ° C</td>
			<td colspan="2">12 hr</td>
			<td colspan="2">FS kokteyl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td colspan="2">-25 ° C ila 0 ° C</td>
			<td colspan="2">5 saat (5 ° C/hr)</td>
			<td colspan="2">FS kokteyl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td colspan="2">0 ° C</td>
			<td colspan="2">1 hr x 3 kez</td>
			<td colspan="2">Aseton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td colspan="2">Oda sıcaklığında</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">Reçine infiltrasyon</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: Freeze-ikame protokolü.

Watch this Scientific Journal Video about 3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography at JoVE.com

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D mitokondriyal Ultrastructure Drosophila dolaylı uçuş kas seri-bölüm elektron tomografi tarafından ortaya

Bu protokol için seri-bölüm elektron tomografi uygulanması mitokondrial Drosophila dolaylı uçuş kas yapısında aydınlatmak için göstermektedir.

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

3d-mitochondrial-ultrastructure-drosophila-indirect-flight-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

8.5K Görüntüleme.  National Taiwan University. Bu protokol için seri-bölüm elektron tomografi uygulanması mitokondrial Drosophila dolaylı uçuş kas yapısında aydınlatmak için göstermektedir.

Video: 3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

Omics Yaklaşımlar için Drosophila melanogaster Uçuş Kasları Diseksiyon

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Genetik

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

Vivo Kas-tendon morfogenez Drosophila pupa içinde görüntüleme

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Gelişim Biyolojisi

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

Mikro bilgisayarlı Tomografi kullanılarak Drosophila melanogaster'ın Tüm Hayvan Görüntülemesi

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Biyoloji

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Elektron Cryo-tomografi ile Mitokondri ATP Sintazı dimerlerini Görselleştirme

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at the Drosophila NMJ enables researchers to acquire synaptic information, encompassing both quantitative data on synapse abundance and detailed insights into their morphology. However, the diffuse distribution and limited visual range of the TEM present challenges for the ultrastructural analysis. This study introduces an innovative and efficient sample preparation method that surpasses the conventional approach. The procedure begins by placing a metal mesh at the base of a flat-bottomed bottle or test tube, followed by positioning fixed larvae samples onto the mesh. An additional mesh is placed over the samples, ensuring that they are positioned between the two meshes. The fixed samples are thoroughly dehydrated and infiltrated before proceeding with the embedding procedure. Then embedding of the samples in epoxy resin is performed in a flat sheet manner, which allows for the preparation of muscles for positioning and sectioning. Benefiting from these steps, all the muscles of Drosophila larvae can be visualized under light microscopy, therey facilitating subsequent positioning and sectioning. Excess resin is removed after locating the 6th and 7th muscles of body segments A2 and A3. Serial ultra-thin sectioning of the 6th or 7th muscle is performed.

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

This report provides a new sample preparation procedure for visualizing neuromuscular junctions in Drosophila Larvae. This method is more effective in preventing the curling of the samples compared to the traditional method and is particularly useful for Drosophila neuromuscular junction ultrastructural analysis.

Drosophila larvalarında nöromüsküler kavşakların transmisyon elektron mikroskobu için numune hazırlama sürecinin optimize edilmesi

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at ...

Nörobilim

Drosophila Nöromüsküler Kavşaklarda ve Kas Hücrelerinde Mikrotübül Ağlarının Görüntülenmesi

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Yazar Spotlight: Drosophila nöromüsküler kavşaklarında mikrotübül ağını anlamak 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Mikrotübül Ağını Görselleştirmek için Drosophila Larva Nöromüsküler Kavşak ve Kas Hücrelerini Kullanma

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Mitokondriyal Yapısı ve İşlevi incelenmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurtalıklar

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

3D mitokondriyal Ultrastructure Drosophila dolaylı uçuş kas seri-bölüm elektron tomografi tarafından ortaya

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Omics Yaklaşımlar için Drosophila melanogaster Uçuş Kasları Diseksiyon

Vivo Kas-tendon morfogenez Drosophila pupa içinde görüntüleme

Mikro bilgisayarlı Tomografi kullanılarak Drosophila melanogaster'ın Tüm Hayvan Görüntülemesi

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

Elektron Cryo-tomografi ile Mitokondri ATP Sintazı dimerlerini Görselleştirme

Drosophila larvalarında nöromüsküler kavşakların transmisyon elektron mikroskobu için numune hazırlama sürecinin optimize edilmesi

Mikrotübül Ağını Görselleştirmek için Drosophila Larva Nöromüsküler Kavşak ve Kas Hücrelerini Kullanma

Mikrotübül Ağını Görselleştirmek için Drosophila Larva Nöromüsküler Kavşak ve Kas Hücrelerini Kullanma

Mikrotübül Ağını Görselleştirmek için Drosophila Larva Nöromüsküler Kavşak ve Kas Hücrelerini Kullanma

Mitokondriyal Yapısı ve İşlevi incelenmesi