Name: collection of post-mating semen from the female reproductive tract and measurement of semen liquefaction in mice
Uploaded: 2017-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice at JoVE.com

Bu eser WW veteriner tıp Koleji (WSU) başlangıç fon tarafından desteklenmektedir. Yazarlar Sierra Olsen (WSU) bu el yazması eleştirel okuma için teşekkür ederiz.

Tüm hayvanlar ve bu çalışmada kullanılan yordamlar Washington State Üniversitesi (WSU) hayvan bakım ve kullanım Komitesi esaslarına göre ve WSU onaylı hayvan iletişim kuralları #4702 ve #4735 uygun olarak ele.
1. fareler
<ol><li>
Standart C57BL/6J yetişkin erkek fareler veya ilgi diğer suşların kullanın. Hayvanlar altında ad libitum erişim su ve gıda ile sıcaklık ve nem kontrollü bir ortam sağlamak.
	<ol>
<li>8 hafta eski 10 aylık arasında değişen erkek doğurmak kullanabilirsiniz. Sadece kanıtlanmış doğurmak deneylerde kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Üreme yolu östrojen reseptör α ( Esr1 gen tarafından kodlanmış) bir doku seçici silme ile yetişkin dişi fareler içinde epitel hücreleri10 kullanın (Wnt7aCre / +; Esr1nakavt veya "KO" adı verilenf/f,) ve kontrol littermates ("CTRL" denilenEsr1f/f,) Bu çalışmada.
	<ol>
<li>8 hafta-yaşlı kadın kullanın. Yaş kadın faiz deney bağlı olarak çeşitli.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sabah saat 08:00 h estrous döngüsünün aşamaları belirlemek. Sadece kadın döngüsünün estrus aşamasında kullanın. Vajinal bulaşması ve saytolojik analiz ayrıntılı yöntemleri için daha önce yayımlanmış yordamlar11' e bakın.</li>
</ol>2. çiftleşme ve çiftleşme tıkacı değerlendirilmesi
<ol><li>Kadın bir erkeğin kafes içinde estrus (16:00 h) gün ev.</li>
	<li>Ertesi sabah (08:00 h), dişi erkek fare ayırın.</li>
	<li>Daha önce yayımlanmış yöntemi12 bir uyarlaması varlığı ya da yokluğu bir vajinal veya çiftleşme fiş çiftleşme bir göstergesi olarak erişmek için kullanın.</li>
	<li>Kısa bir süre arka bacaklarda kaldırmak için kuyruk tabanından kadın fareyi tutun.</li>
	<li>Çiftleşme Tak bir kürdan kullanarak vajinal açılışında bir off-beyaz seminal coagulum varlığı bulun. Çiftleşme fiş varsa, kürdan vajinal kanala eklenecek mümkün olmayacaktır.</li>
</ol>3. doku toplama öncesi hazırlık
<ol><li>10 mL % 1 fetal sığır serum ile desteklenmiş iyi'nın L-15 medyanın hazırlamak (denilen L15 medya + % 1 FBS) 15 mL tüp içinde. Bir waterbath içinde 15 dakika 37 ° C'de medya kuluçkaya.</li>
	<li>Doku ve aşağı akım uygulamaları için sperm canlılığı korumak için Önceden ısıtılmış L15 medya + % 1 aliquot 2 mL 2 mL microcentrifuge FBS dokusu toplamalarında tüp.</li>
	<li>37 ° c stereomicroscope sahne sıcak 37 ° C ısı-taş ayarla ve bir boş 1.5 mL microcentrifuge tüp bloğunda yer.</li>
	<li>Aşağı akım uygulamaları sperm motilitesi görüntüleme gerektiriyorsa, cam slayt 37 ° c sıcak</li>
</ol>4. doku koleksiyonu
<ol><li>Önceden ısıtılmış L15 medya + % 1 FBS aliquot doku toplama alanına getirin.</li>
	<li>Dişi ötenazi (~ 08: 30h) karbon dioksit boğulma kullanarak takip tarafından servikal çıkığı. Not: varsayarak çiftleşme gerçekleşir gece yarısı yaklaşık 8 h çiftleşme sonra bu.</li>
	<li>Hayvanın karın bölgesi ortaya çıkarmak için sırtüstü pozisyonda yerleştirin.</li>
	<li>% 70 alkol karın arka bacaklarda yakınındaki sprey.</li>
	<li>Diseksiyon makası alt karın cilt üzerinde küçük bir kesim (~ 1 cm) yapmak için kullanın.</li>
	<li>Dominant el kuyruk (ve arka bacaklarda gerekirse) çekmek için kullanın sigara dominant el cilt (doğru kafa) ters yönde karın kas ortaya çıkarmak için çeker iken. Bu yöntem saç kirlenme visseral organlara en aza indirmek için kullanılır.</li>
	<li>Karın kas bir V-viseral organlar ortaya çıkarmak için şekil içinde karın, vajina için bitişik temelini kesti.</li>
	<li>Bağırsak ve karın yağ üreme yolu ortaya çıkarmak için kenara çek.</li>
	<li>Mesane ve diğer dokular vajinal bölgede yukarıda kapalı döşeme.</li>
	<li>Kasık symphysis vajinal doku erişmek için ayrı kesti.</li>
	<li>Vajinal doku vajinal açılışında kaldırın ve vajinal kanal rektal dokusundan ayırmak için makas kullanarak.</li>
	<li>Dikkatle bahar makas kullanırken rahim her iki taraftan Mezenterik yağı kırpın. Dikkat: Rahim içinde sperm ile çok kırılgandır. Rahim delik değil dikkatli olun yoksa meni kaybolacak.</li>
	<li>Alt üreme sistem kaldırın ve her iki kapalı yumurtalık yağ yastığı kesti.</li>
	<li>Önceden ısıtılmış iyi'nın L-15 medya + % 1 tüp içine tüm üreme yolu aktarım FBS.</li>
</ol>5. rahim içerik koleksiyonundan meni الرسالة (viskozite) ölçümü
<ol><li>Stereomicroscope ısıtmalı sahnede bir 35 mm steril doku kültürü çanak içine belgili tanımlık doku dolu ile 3,5 mL transfer önceden sıcak L-15 medya + % 1 FBS dokuların kan ve diğer kirleri temizlemek için. Dikkat: yıkama sırasında dokuların yağ tarafından değil rahim al. Bu noktada, meni bekleniyor rahim içinde sağlam olmalı.</li>
	<li>Laboratuvar mendil kullanarak aşırı medya dokuların leke.</li>
	<li>Doku vajinal sonunda Önceden ısıtılmış microcentrifuge tüpte yumurtalık biter yerleştirerek süre tutun. Vajinal sonuna tutarken, temelini microcentrifuge tüp içine düşmek rahim boynuzları sağlayan rahim, rahim boynuzları kesti.</li>
	<li>Meni izin tüp içine rahim boynuzları dışarı akışı. Dişsiz forseps yavaşça kalan meni kovma vajinal sonuna yumurtalık sonundan itibaren boynuzları rahim sıkmak için kullanın.</li>
	<li>Biohazard çanta ve dokularda atın ve yakıp kül.</li>
	<li>Kısaca bir minicentrifuge meni aşağı spin (~ 1-2 s).</li>
	<li>Tüp, ısıtmalı sahneye paralel lay - meni dışarı dökülecek değil.</li>
	<li>Hazır çekim var ve 'saymak için ' set.</li>
	<li>Meni örneği (tüp duvara paralel) 180 ° açıyla bir 25 µL kılcal tüp takın. Kılcal tüp farklı açılarda holding üzerinden her araştırmacı arasında değişkenlik en aza indirmek için bu.</li>
	<li>Kılcal Boru yapar zamanlayıcıyı basın meni ile temas.</li>
	<li>Meni 25 µL çizgisine ulaşmak gereken süreyi (s) kaydedin.</li>
	<li>Ölçüm bittiğinde hemen geri daha fazla fonksiyonel analiz, sperm motilitesi video görüntüleme gibi kuru sıcak blok meni içeren tüp koymak.</li>
	<li>20 dk için % 10 çamaşır suyu çözüm tüpte çeker tarafından meni içeren kılcal tüp dezenfekte ve kılcal tüp "Sharps" kap içinde atın.</li>
</ol>6. Sperm motilitesi video görüntüleme
<ol><li>Mikroskop ve video görüntüleme yazılımını açın.</li>
	<li>Sahne Alanı'nda ısıtmalı cam slayt yerleştirilir iken, Önceden ısıtılmış cam slayt üzerine kalan meni 20 µL pipet.</li>
	<li>Bir cam coverslip ile kapak.</li>
	<li>Slayt coverslip yan mikroskobunun yerleştirin.</li>
	<li>20 X objektif lens ilgi alanı bulmak için kullanın.</li>
	<li>100 X objektif lens için video görüntüleme için değiştirin.</li>
	<li>Video: 12 kare/s (fps) 30 kayıt s.</li>
	<li>Rastgele videolar hayvan başına en az 3 farklı alanlarda kaydedin.</li>
	<li>Görüntüleme gerçekleştirmek hızlı bir şekilde ve sperm motilitesi ve canlılığı korumak için slayda ışık pozlandırmayı en aza indirmek. Not: Görüntüleme bu yordamı 2-3 dakika içinde yapılmalıdır.</li>
	<li>ImageJ yazılım yukarıda açıklanan8olarak kullanarak veri çözümlemesi gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Suarez, S. S., Pacey, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+transport+in+the+female+reproductive+tract.">Sperm transport in the female reproductive tract.</a> Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).</li><li>Bedford, J. M., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+sperm+motility+after+mating+in+the+rat+and+hamster.">Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster.</a> J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).</li><li>Lilja, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+semenogelin.">Cell biology of semenogelin.</a> Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).</li><li>Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semenogelin,+the+predominant+protein+in+human+semen.+Primary+structure+and+identification+of+closely+related+proteins+in+the+male+accessory+sex+glands+and+on+the+spermatozoa.">Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa.</a> J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).</li><li>Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seminal+fluid+characterization+for+male+fertility+and+prostate+cancer:+kallikrein-related+serine+proteases+and+whole+proteome+approaches.">Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches.</a> Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).</li><li>Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+role+of+human+KLK14+in+seminal+clot+liquefaction.">Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction.</a> J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).</li><li>Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+kallikrein+on+sperm+motility,+capillary+tube+test,+and+pregnancy+rate+in+an+AIH+program.">Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program.</a> Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).</li><li>Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+estrogen+for+the+mammalian+female+in+regulating+semen+coagulation+and+liquefaction+in+vivo.">Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (4), e1006743 (2017).</li><li>Elia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+semen+hyperviscosity:+prevalence,+pathogenesis+and+therapeutic+aspects.">Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects.</a> Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).</li><li>Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+epithelial+estrogen+receptor+alpha+is+dispensable+for+proliferation+but+essential+for+complete+biological+and+biochemical+responses.">Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).</li><li>McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performing+vaginal+lavage,+crystal+violet+staining,+and+vaginal+cytological+evaluation+for+mouse+estrous+cycle+staging+identification.">Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification.</a> J Vis Exp. (67), e4389 (2012).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab+Animal+Research.+Fundamentals+of+Breeding+and+Weaning.">Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning.</a> JoVE. , (2017).</li><li>Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unleashing+the+therapeutic+potential+of+human+kallikrein-related+serine+proteases.">Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).</li><li>Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putative+functions+of+tissue+kallikrein-related+peptidases+in+vaginal+fluid.">Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid.</a> Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Meni ve kadın üreme yolu. salgılar arasındaki fizyolojik etkileşimler eski gösterdiği gibi fare uteri sperm toplama semen analizi vitro avantajları sağlayabilir Bu çalışmada sunulan teknikleri araştırmacılar sperm kalitesi hem de sperm canlılığı ve motilite ideal fizyolojik koşullarda belirlemek için izin verir. Ayrıca, uteri toplanan sperm kullanılarak gerçekleştirilen çeşitli aşağı akım analizleri, örneğin, sperm rahim ve sperm girme gerçek sperm sayısı ayrıca hare...

Kadın üreme yolu alt ve üst yolları oluşur. Üst üreme yolu fallop tüpleri, rahim ve endocerviks içerir. Alt üreme sistem ectocervix ve vajina içerir. İnsanlarda, vajina, ectocervix1' e komşu ön duvara ejaculated meni yatırılır. Farelerde, ancak, sperm rahim içine2çiftleşme sonra dakika içinde süpürüldü.
Sperm boşalma, sperm entrapped neden zarfında katılaşmış ve3immobilize seminal jel içerir. الرسالة immobilize sperm meni bir jel gibi sulu bir tutarlılık değiştirerek serbest bırakır. Sperm motilitesi ve memeli üreme için gerekli bir süreçtir. Meni الرسالة bilgisine nerede meni bir kültür tabak içinde sıvılaştırılmış olur vitro çalışmalar çoğunlukla dayanmaktadır. İnsanlarda, enzimatik aktivite Prostat spesifik antijen veya PSA (olarak da bilinen kallikrein ilgili peptidaz 3 veya KLK3) semenogelins (meni mevcut proteinler jel şekillendirme)4 hidroliz ile الرسالة için büyük katkıda bulunuyor. ,5,6. Semenogelins bozulma sperm sperm hareketliliği artan seminal coagulum, dan özgür kılar. Sperm yüzmek fallop tüpü yumurtayı döllemek için doğru serbest. الرسالة (ya da meni viskozite) bir erkek üreme7değerlendirmek için doğurganlık klinikleri semen analizi için standart ilk gösterimleri testlerdir.
Kısa bir süre önce bir makale dişi fare üreme yolu sonrası çiftleşme üzerinden toplanan meni analizi daha sonra doğurganlık kusurları8neden olabilir الرسالة bir eksikliği göstermek için kullanılabileceğini gösterir. Meni hiperviskozite gibi arızalı الرسالة infertil erkek9normal الرسالة memeli üreme için vazgeçilmez olduğunu düşündüren, durumlarda 11,8 32.3 oranında katkıda bulunur. Ancak, çalışmalar ve الرسالة kusur tedavisinde sadece erkek7üzerinde odaklanmıştır. Kadın üreme sistemi meni الرسالة içinde bir rol oynar olasılığını araştırdı değil. Bu nedenle, sperm toplama ve الرسالة zaman ölçme yöntemleri araştırmacılar الرسالة ilgi model organizma olarak infertilite nedenlerinden biri olabilir olup olmadığını belirlemek için yeni bir tanı aracı sağlar.

<table><tbody><tr><td>Toothpick</td><td>Diamond</td><td>750-Flat</td><td>Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended</td></tr><tr><td>Dissecting scissors</td><td>Fisher</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5600</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>25-&amp;mu;L glass capillary tube</td><td>VWR</td><td>53432-761</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;rsquo;s L-15 media</td><td>Life Technologies</td><td>11415064</td><td>Supplement with 1% FBS</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>1.5-mL microcentrifuge tube</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>2-mL microcentrifuge tube</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-A</td><td></td></tr><tr><td>Digital dry block heater</td><td>VWR</td><td>13259-052</td><td>For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection</td></tr><tr><td>Minicentrifuge</td><td>Corning</td><td>LSE 6765</td><td></td></tr><tr><td>35-mm culture dish</td><td>VWR</td><td>10861-656</td><td></td></tr><tr><td>15-mL polypropylene centrifuge tube</td><td>VWR</td><td>10025-686</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Precision</td><td>TSGP05</td><td></td></tr><tr><td>Heated stage stereomicroscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ10F</td><td>To keep the tissue warm prior to semen collection</td></tr><tr><td>Brightfield microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMi8</td><td>Optional. For video imaging of the sperm motility</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMC2900</td><td>Optional. For video imaging of the sperm motility</td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Fisher</td><td>12-552-3</td><td>Optional. For video imaging of the sperm motility</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>VWR</td><td>48393-059</td><td>Optional. For video imaging of the sperm motility</td></tr><tr><td>Bleach</td><td></td><td></td><td>Dilute in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 10% concentration</td></tr></tbody></table>

collection of post-mating semen from the female reproductive tract and measurement of semen liquefaction in mice

Farelerde, boşalmış sperm rahim içinde yatırılır. Boşalma sonra meni değiştirir tutarlılık jel benzeri için sulu, adı verilen işlem الرسالة. Bu çalışmada, kadın üreme sistemi bir fare modeli sonrası ejaculated meni toplamak için nasıl gösterir. İlk, yetişkin dişi fareler içinde estrus sahne bir erkeğin kafeste gecede yer. Ertesi sabah, birleşme vajinal açılışında çiftleşme fiş varlığı tarafından doğrulandı. Çiftleşme tıkacı ile dişi fareler euthanized ve üreme her yolu (vajina, rahim, oviducts, yumurtalık), bir bütün olarak toplanan meni içerecek şekilde kapalı bir sistem sağlamak. Vajina meni tüpün içine serbest bırakmak için kesilmiş ve üreme yolu bir 1.5 mL microcentrifuge tüp yerleştirildi. En fazla sperm cilt analizi için emin olmak için dişsiz forseps vajinal sona kalan meni kovma yumurtalık ucundan boynuzları rahim sıkmak için kullanılmıştır. Tüm üreme yolu sonra atıldı. Meni içeren tüp kısaca aşağı bükülmüş. 25 μL kapiller pipet 180 ° açıyla (tüp duvara paralel) tüp içine yerleştirilmiştir. Kılcal Boru 25 μL hattına doldurmak için kullanılan süreyi kaydedildi. Meni--dan a kanıtlanmış erkek doğurmak genellikle yaklaşık 60-180 s 25 μL kılcal tüp doldurmak için alır. Bu sperm toplama tekniği de sperm görüntüleme ve motilite analizi gibi aşağı akım diğer uygulamalarda kullanılabilir.

Meni ile verimli CTRL erkek çiftleşme sonra CTRL ve KO kadın yaklaşık 8 h dan toplanmıştır. 25 μL kılcal tüp meni ile doldurmak için geçen süre tarafından الرسالة (ya da meni viskozite) sayılabilir. CTRL uteri toplanan meni aldı 2.06 ±0.12 min (mean±S.E.M, n = 5) kılcal tüp (şekil 1) doldurmak için. Ancak, KO uteri toplanan meni 60 dk uzun sürdü (60,0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) deneysel zaman. Bu veriler meni önemli ölçüde daha fazla dize...

Watch this Scientific Journal Video about Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice at JoVE.com

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

Meni kadın üreme sistemi ve meni الرسالة farelerde ölçümü sonrası çiftleşme koleksiyonu

Meni الرسالة sperm seminal jel--dan özgür olmak için gereklidir. Bu çalışma yordamları kadın üreme sistemi sonrası cinsel birleşme sperm toplama ve meni الرسالة Süre ölçümünü sağlar.

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

collection-post-mating-semen-from-female-reproductive-tract

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

16.4K Görüntüleme.  Washington State University. Meni الرسالة sperm seminal jel--dan özgür olmak için gereklidir. Bu çalışma yordamları kadın üreme sistemi sonrası cinsel birleşme sperm toplama ve meni الرسالة Süre ölçümünü sağlar.

Video: Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of otherwise healthy women during their reproductive years18,32-34. Predisposing factors include antibiotic usage, uncontrolled diabetes and disturbance in reproductive hormone levels due to pregnancy, oral contraceptives or hormone replacement therapies33,34. Recurrent VVC (RVVC), defined as three or more episodes per year, affects a separate 5 to 8% of women with no predisposing factors33.
An experimental mouse model of VVC has been established and used to study the pathogenesis and mucosal host response to Candida3,4,11,16,17,19,21,25,37. This model has also been employed to test potential antifungal therapies in vivo13,24. The model requires that the animals be maintained in a state of pseudoestrus for optimal Candida colonization/infection6,14,23. Under such conditions, inoculated animals will have detectable vaginal fungal burden for weeks to months. Past studies show an extremely high parallel between the animal model and human infection relative to immunological and physiological properties3,16,21. Differences, however, include a lack of Candida as normal vaginal flora and a neutral vaginal pH in the mice.
Here, we demonstrate a series of key methods in the mouse vaginitis model that include vaginal inoculation, rapid collection of vaginal specimens, assessment of vaginal fungal burden, and tissue preparations for cellular extraction/isolation. This is followed by representative results for constituents of vaginal lavage fluid, fungal burden, and draining lymph node leukocyte yields. With the use of anesthetics, lavage samples can be collected at multiple time points on the same mice for longitudinal evaluation of infection/colonization. Furthermore, this model requires no immunosuppressive agents to initiate infection, allowing immunological studies under defined host conditions. Finally, the model and each technique introduced here could potentially give rise to use of the methodologies to examine other infectious diseases of the lower female genital tract (bacterial, parasitic, viral) and respective local or systemic host defenses.

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Key techniques to be used in the evaluation of Candida vaginitis in an experimental animal model are described. The methods will allow rapid collection of vaginal specimens and lymphocytes from draining lumbar lymph nodes. These techniques could give rise to mouse models of other diseases in the female lower genital tract.

Deneysel Fare Modeli Vajinal Aşılama ve Örnek Toplama Protokolleri Candida Vajinit

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Assessment of Sexual Behavior of Male Mice

Sexual behavior is highly species-specific. Although rodents have slightly different sexual behaviors, mice and rats have a similar sexual behavioral pattern. The purpose of this article is to describe the hormone-induced estrus ovariectomized female model and the experimental procedure for the assessment of sexual behavior of male mice. The most important sexual behavioral elements are demonstrated in the video and illustrations. The critical steps, advantages, and limitations of the sexual behavior test are explained as well. Finally, the behavior parameters are presented, and mounting, intromission, and ejaculation processes in mating are distinguished. Behavioral parameters are assessed in terms of the occurred duration and counts during the test period.

This article describes how to perform sexual behavior tests in male mice.

Erkek Farelerin Cinsel Davranışlarının Değerlendirilmesi

Sexual behavior is highly species-specific. Although rodents have slightly different sexual behaviors, mice and rats have a similar sexual behavioral ...

Davranış

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

B Grubu bir murin modelinde<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vajinal Kolonizasyon

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Biaxial Basal Tone and Passive Testing of the Murine Reproductive System Using a Pressure Myograph

The female reproductive organs, specifically the vagina and cervix, are composed of various cellular components and a unique extracellular matrix (ECM). Smooth muscle cells exhibit a contractile function within the vaginal and cervical walls. Depending on the biochemical environment and the mechanical distension of the organ walls, the smooth muscle cells alter the contractile conditions. The contribution of the smooth muscle cells under baseline physiological conditions is classified as a basal tone. More specifically, a basal tone is the baseline partial constriction of smooth muscle cells in the absence of hormonal and neural stimulation. Furthermore, the ECM provides structural support for the organ walls and functions as a reservoir for biochemical cues. These biochemical cues are vital to various organ functions, such as inciting growth and maintaining homeostasis. The ECM of each organ is composed primarily of collagen fibers (mostly collagen types I, III, and V), elastic fibers, and glycosaminoglycans/proteoglycans. The composition and organization of the ECM dictate the mechanical properties of each organ. A change in ECM composition may lead to the development of reproductive pathologies, such as pelvic organ prolapse or premature cervical remodeling. Furthermore, changes in ECM microstructure and stiffness may alter smooth muscle cell activity and phenotype, thus resulting in the loss of the contractile force.
In this work, the reported protocols are used to assess the basal tone and passive mechanical properties of the nonpregnant murine vagina and cervix at 4-6 months of age in estrus. The organs were mounted in a commercially available pressure myograph and both pressure-diameter and force-length tests were performed. Sample data and data analysis techniques for the mechanical characterization of the reproductive organs are included. Such information may be useful for constructing mathematical models and rationally designing therapeutic interventions for women&#8217;s health pathologies.

This protocol utilized a commercially available pressure myograph system to perform pressure myograph testing on the murine vagina and cervix. Utilizing media with and without calcium, the contributions of the smooth muscle cells (SMC) basal tone and passive extracellular matrix (ECM) were isolated for the organs under estimated physiological conditions.

Biaksiyel Bazal Tonu ve Basınç Miyografkullanarak Mürin üreme sisteminin pasif testi

The female reproductive organs, specifically the vagina and cervix, are composed of various cellular components and a unique extracellular matrix (ECM). ...

Biyomühendislik

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.

Fare Östrus Döngüsü Evreleme Tanımlaması Vajinal Lavaj, Kristal Violet Boyama ve Vajinal Sitolojik Değerlendirilmesi Sahne

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

Biyoloji

Determination of Reproductive Competence by Confirming Pubertal Onset and Performing a Fertility Assay in Mice and Rats

Assessment of reproductive competence is critical for understanding the impact of a treatment or genetic manipulation on the reproductive axis, also termed the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. The reproductive axis is a key integrator of environmental and internal input adapting fertility to favorable conditions for reproduction. Prior to embarking upon a fertility study in mice and rats, sexual maturity is evaluated to exclude the possibility that the observed reproductive phenotypes are caused by delayed or absent pubertal onset. This protocol describes a non-invasive approach to assess pubertal onset in males through the determination of preputial separation, and in females through vaginal opening and first estrus. After the confirmation of the completion of puberty and the achievement of sexual maturity, a fertility study can be initiated. The procedure describes the optimal breeding conditions for mice and rats, how to set up a fertility study, and what parameters to evaluate and determine if the treatment or gene deletion has an impact on fertility.

Many treatments and genetic mutations impact the timing of sexual maturity and fertility. This protocol describes a non-invasive method to evaluate pubertal onset in mice and rats prior to setting up a fertility study in sexually mature animals.

Pubertal başlangıçlı teyit ve doğurganlık tahlil fare ve sıçanlar üreme yetkinlik belirlenmesi

Assessment of reproductive competence is critical for understanding the impact of a treatment or genetic manipulation on the reproductive axis, also ...

Ex Vivo Method for Assessing the Mouse Reproductive Tract Spontaneous Motility and a MATLAB-based Uterus Motion Tracking Algorithm for Data Analysis

Dysmenorrhea, or painful cramping, is the most common symptom associated with menses in females and its severity can hinder women&#39;s everyday lives. Here, we present an easy and inexpensive method that would be instrumental for testing new drugs decreasing uterine contractility. This method utilizes the unique ability of the entire mouse reproductive tract to exhibit spontaneous motility when maintained ex vivo in a Petri dish containing oxygenated Krebs buffer. This spontaneous motility resembles the wave-like myometrial activity of the human uterus, referred to as endometrial waves. To demonstrate the effectiveness of the method, we employed a well-known uterine relaxant drug, epinephrine. We demonstrate that the spontaneous motility of the entire mouse reproductive tract can be quickly and reversibly inhibited by 1 &#181;M epinephrine in this Petri dish model. Documenting the changes of uterine motility can be easily done using an ordinary smart phone or a sophisticated digital camera. We developed a MATLAB-based algorithm allowing motion tracking to quantify spontaneous uterine motility changes by measuring the rate of uterine horn movements. A major advantage of this ex vivo approach is that the reproductive tract remains intact throughout the entire experiment, preserving all intrinsic intrauterine cellular interactions. The major limitation of this approach is that up to 10-20% of uteri may exhibit no spontaneous motility. Thus far, this is the first quantitative ex vivo method for assessing spontaneous uterine motility in a Petri dish model.

Uterine contractions are important for the well-being of females. However, pathologically increased contractility may result in dysmenorrhea, especially in younger females. Here, we describe a simple ex vivo preparation allowing quick assessment of the efficacy of smooth muscle relaxants that may be used for treating dysmenorrhea.

Fare Üreme Yolu Spontan Hareketliliği Değerlendirmek için Ex Vivo Yöntemi ve Veri Analizi için MATLAB tabanlı Rahim Hareket Takip Algoritması

Dysmenorrhea, or painful cramping, is the most common symptom associated with menses in females and its severity can hinder women&#39;s everyday lives. ...

Development of a Novel Endometrioma-Simulating Mouse Model

Establishment of an Experimental Mouse Model of Endometrioma to Study its Related Infertility

Endometrioma (OMA), a subtype of endometriosis characterized by the formation of endometriotic cysts in the ovaries, affects 17-44% of individuals diagnosed with endometriosis. Women with OMA often experience compromised fertility, yet the exact mechanisms underlying OMA-associated infertility remain unclear. Notably, existing animal models simulate superficial peritoneal endometriosis (SUP) and deep infiltrating endometriosis (DIE), leaving a notable gap in research focused on OMA. In response to the gap of knowledge, this paper introduces a pioneering OMA-simulating mouse model and provides a comprehensive description of the techniques and procedures employed in the model. With a high success rate of 83% and ovarian lesion specificity, this model holds significant promise for advancing our understanding of OMA, particularly in the context of infertility. It offers a valuable platform for conducting targeted research into OMA-associated fertility challenges, potentially paving the way for improved diagnostic and therapeutic strategies in the field of reproductive medicine.

This study introduces a novel mouse model specifically designed to simulate endometrioma, a clinically significant subtype of endometriosis. By utilizing C57BL/6J mice, the model aims to elucidate the pathophysiological mechanisms underlying endometrioma-related infertility, offering a refined tool to bridge the current knowledge gap in reproductive medicine.

Endometrioma (OMA), a subtype of endometriosis characterized by the formation of endometriotic cysts in the ovaries, affects 17-44% of individuals ...

Tıp

Yardımlı üreme için farelerde servikal manipülasyona bağlı yalancı gebelik

Inducing Pseudopregnancy in Female Mice Without the Need for Vasectomized Males Prior to Non-Surgical Embryo Transfer or Artificial Insemination

For successfully maintaining pregnancy with embryo transfer or artificial insemination,&#160;female recipient mice must be induced into a pseudopregnant state. Female mice are traditionally paired overnight with vasectomized males, and the following morning, the presence of a copulation plug is assessed. To increase the efficiency of producing pseudopregnant females, a cervical manipulation technique has been standardized to be used in combination with non-surgical embryo transfer or artificial insemination techniques in mice. The blunt end of a small plastic rod is inserted vaginally to contact the cervix and is vibrated for 30 s by contact with a trimmer. The procedure is quick and does not require anesthesia or analgesia. This technique increases the reliability and predictability of producing pseudopregnant females and entirely eliminates the requirement for vasectomized males. For CD1 mice, the efficiency of pseudopregnancy induction using cervical manipulation was 83% for females in estrus (N = 76) but only 38% of females in estrus were plugged by vasectomized males (N = 24). Artificial insemination in CD1 mice was performed by estrus synchronization with hormones, cervical manipulation, and the uterine transfer of sperm. Artificial insemination recipients receiving cervical manipulation (N = 76) had a pregnancy rate of 72% and an average litter size of 8.3 pups. This method can also be used to produce pseudopregnant females for non-surgical embryo transfer. Therefore, inducing pseudopregnancy by cervical manipulation is a convenient and efficient alternative to mating with a vasectomized male when performing non-surgical assisted reproduction techniques. Using cervical manipulation provides 3Rs (replacement, reduction, and refinement) benefits for assisted reproduction techniques by reducing the number of animals required and eliminating the necessity for surgically altered males.

Yazar Spot Işığı: Cerrahi Olmayan Embriyo Transferi veya Suni Tohumlamadan Önce Vazektomize Erkeklere İhtiyaç Duymadan Dişi Farelerde Yalancı Gebeliğin İndüklenmesi  

The cervical manipulation method presented can induce pseudopregnancy in mice without the need for breeding females with vasectomized males. The induction of pseudopregnancy is required for the success of non-surgical embryo transfer and non-surgical artificial insemination, both of which are also presented.

Cerrahi olmayan embriyo transferi veya suni tohumlamadan önce vazektomize erkeklere ihtiyaç duymadan dişi farelerde yalancı gebeliğin indüklenmesi

For successfully maintaining pregnancy with embryo transfer or artificial insemination,&#160;female recipient mice must be induced into a pseudopregnant ...

Meni kadın üreme sistemi ve meni الرسالة farelerde ölçümü sonrası çiftleşme koleksiyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Deneysel Fare Modeli Vajinal Aşılama ve Örnek Toplama Protokolleri Candida Vajinit

Erkek Farelerin Cinsel Davranışlarının Değerlendirilmesi

B Grubu bir murin modelinde

Biaksiyel Bazal Tonu ve Basınç Miyografkullanarak Mürin üreme sisteminin pasif testi

Fare Östrus Döngüsü Evreleme Tanımlaması Vajinal Lavaj, Kristal Violet Boyama ve Vajinal Sitolojik Değerlendirilmesi Sahne

Pubertal başlangıçlı teyit ve doğurganlık tahlil fare ve sıçanlar üreme yetkinlik belirlenmesi

Fare Üreme Yolu Spontan Hareketliliği Değerlendirmek için Ex Vivo Yöntemi ve Veri Analizi için MATLAB tabanlı Rahim Hareket Takip Algoritması

Establishment of an Experimental Mouse Model of Endometrioma to Study its Related Infertility

Cerrahi olmayan embriyo transferi veya suni tohumlamadan önce vazektomize erkeklere ihtiyaç duymadan dişi farelerde yalancı gebeliğin indüklenmesi

Cerrahi olmayan embriyo transferi veya suni tohumlamadan önce vazektomize erkeklere ihtiyaç duymadan dişi farelerde yalancı gebeliğin indüklenmesi