이 작품은 ww 수의학 대학 (WSU) 시작 기금에 의해 지원 됩니다. 저자는이 논문의 중요 한 독서에 대 한 시에라 올 슨 (WSU) 감사합니다.

모든 동물 및 절차가이 연구에 사용 된은 WSU 승인 동물 프로토콜 #4702 # 4735과 워싱턴 주립 대학 (WSU) 동물 관리 및 사용 위원회 지침에 따라 처리 합니다.
1입니다. 마우스
<ol><li>
사용 하 여 표준 C57BL/6J 성인 남성 쥐 또는 관심의 다른 긴장. 물과 음식 광고 libitum 액세스와 온도 및 습도 제어 환경에서 동물을 유지 한다.
	<ol>
<li>8 주 정도에서 10 개월에 이르기까지 남성 브리 더를 사용 합니다. 실험에서 입증 된 종만을 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
재생산 지역 스 트로 겐 수용 체 α ( Esr1 유전자 인코딩)의 조직 선택적 삭제와 성인 여성 쥐를 사용 하 여 상피 세포10 (Wnt7aCre / +; Esr1f/f, 녹아웃 또는 "코" 라고)이이 연구에서 littermates (Esr1f/f, "CTRL" 라는) 제어.
	<ol>
<li>8 주 된 여성을 사용 합니다. 여성의 연령대의 실험에 따라 다양합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>아침 08시 h에 estrous 사이클의 단계를 결정 합니다. 주기의 발 정기 단계에서 여성만을 사용 합니다. 질 번짐 및 cytological 분석의 자세한 방법에 대 한 이전 게시 절차11를 참조 하십시오.</li>
</ol>2. 짝짓기와 Copulatory 플러그를 평가
<ol><li>발 정기 (16시 h) 일에서 남자의 감 금 소에 여성을 집.</li>
	<li>다음날 아침 (08시 h), 남성 마우스에서 여성을 구분 합니다.</li>
	<li>짝짓기의 표시로 질 또는 copulatory 플러그의 유무를 이전에 게시 방법12 의 적응을 사용 합니다.</li>
	<li>짧게 뒷 다리 사지를 들어 꼬리의 기지에서 여성 마우스를 잡아.</li>
	<li>이쑤시개를 사용 하 여 질 오프닝에서 하얀 정액 coagulum의 존재에 의해 copulatory 플러그를 찾아. 있으면 copulatory 플러그, 이쑤시개 질 운하에 삽입할 수 없습니다.</li>
</ol>3입니다. 조직 컬렉션 전에 준비
<ol><li>10 mL Leibovitz의 L-15 미디어, 보충 1% 태아 둔감 한 혈 청의 준비 (라고 L15 미디어 + 1 %FBS) 15 mL 튜브에. waterbath에 15 분 동안 37 ° C에서 미디어를 품 어.</li>
	<li>조직 및 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 정자의 생존을 위해, 미리 데워 진 L15 미디어 + 1%의 aliquot 2 mL 2 mL microcentrifuge에서 FBS 조직 컬렉션에 대 한 관.</li>
	<li>37 ° c.에 stereomicroscope의 단계를 따뜻한 37 ° C로 열 블록을 설정 하 고 블록에는 빈 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 배치.</li>
	<li>다운스트림 응용 프로그램에서는 정자의 운동 성, 따뜻한의 37 ° c 유리 슬라이드 이미징 하는 경우</li>
</ol>4. 조직 컬렉션
<ol><li>조직 컬렉션 영역에 미리 따뜻하게 L15 미디어 + 1 %FBS 약 수를가지고.</li>
	<li>여성 안락사 (~ 08:30 h) 자 궁 경관 탈 구 다음 이산화탄소 질 식을 사용 하 여. 참고: 이것은 대략 8 h 짝짓기 후 가정 자정에 일어난 짝짓기입니다.</li>
	<li>복 부 영역을 노출 하는 부정사 위치에 동물을 놓습니다.</li>
	<li>복 부 뒷 다리 사지 근처에 70% 알코올을 스프레이.</li>
	<li>낮은 복 부의 피부에 작은 상처 (~ 1 cm)을 해가 위를 사용 합니다.</li>
	<li>지배적인 손을 꼬리 (및 필요한 경우 뒷 다리 사지)를 사용 하 여 비 지배적인 손을 당긴 다 피부 (머리)를 향해 반대 방향으로 복 부 근육을 노출 하는 동안. 이 메서드는 내장 장기에 머리 오염의 최소화 하는 데 사용 됩니다.</li>
	<li>V-모양에 인접 한 질, 복 부의 기지에서 내장 장기를 노출 하는 복 부 근육을 잘라.</li>
	<li>내장 및 복 부 지방 노출 재생산 지역 쪽으로 이동 합니다.</li>
	<li>방광과 질 영역 위에 다른 조직에서 트림.</li>
	<li>음모 관절 질 조직에 대 한 액세스를 얻기 위해 떨어져 잘라.</li>
	<li>질에 질 직물 들어올린 직장 조직에서 질 운하를 분리 하는 위를 사용 하 여.</li>
	<li>신중 하 게 봄이 위를 사용 하 여 자 궁의 양쪽에서 mesenteric 지방에서 트림. 주의: 자 궁 안에 정액 매우 깨지기 쉬운입니다. 자 궁을 찔린 하지 않도록 주의 하십시오 또는 다른 정액 손실 됩니다.</li>
	<li>더 낮은 재생산 지역 들어올리고 양쪽의 난소 지방 패드를 잘라 합니다.</li>
	<li>미리 따뜻하게 Leibovitz L-15 미디어 + 1%의 관에는 전체 생식 기관 전송 FBS.</li>
</ol>5. 자 궁 콘텐츠 컬렉션에서 정액 액 화 (점도)의 측정
<ol><li>stereomicroscope의 열띤된 무대에서 35mm 무 균 조직 문화 접시에 조직 3.5 mL 가득 전송 사전 예 열 L-15 미디어 + 1 %FBS 혈액과 다른 오염 물질의 조직 청소. 주의: 세척, 동안 지방, 아니라 자 궁 조직을 잡아. 정액이 시점에서 예상 되는 자 궁 안에 그대로 수.</li>
	<li>실험실 물티슈를 사용 하 여 초과 미디어의 조직 오 점.</li>
	<li>미리가 열된 microcentrifuge 관에서 난소 끝을 배치 하면서 조직 질 끝에 잡으십시오. 질 끝을 잡고, 자 궁, 자 궁 뿔 microcentrifuge 튜브에 빠지게 할 수 있도록의 기지에서 자 궁 뿔을 잘라.</li>
	<li>정액 하 게 튜브에 자 궁 뿔에서 흐름. 한적한 포 셉을 사용 하 여 부드럽게 질 끝, 남은 정액 밖으로 추방 하는 난소에서 자 궁 뿔을 짠 다.</li>
	<li>생물 학적 가방에서 티슈를 삭제 하 고 소 각.</li>
	<li>짧게는 minicentrifuge에 정액 아래로 회전 (1 ~ 2 s).</li>
	<li>튜브, 열띤된 무대에 평행 하다-정액 밖으로 유출 하지 않습니다.</li>
	<li>타이머를 준비 하 고 '을 계산 하 는'로 설정.</li>
	<li>(튜브 벽에 평행) 180 ° 각도로 정액 샘플으로 25 µ L 모 세관 튜브를 삽입 합니다. 이것은 다른 각도에서 모 세관 튜브를 잡고 각 조사 사이 가변성을 최소화 하는 것입니다.</li>
	<li>모 세관 튜브 게 타이머를 누르면 정액과 접촉.</li>
	<li>정액 25 µ L 라인에 도달 하는 데 걸리는 시간 (s)를 기록 합니다.</li>
	<li>측정 완료 되 면 바로 추가 기능 분석, 정자 운동 성의 비디오 영상 등을 위해 건조 열 블록에 다시 정액을 포함 하는 튜브를 넣어.</li>
	<li>20 분 동안 10% 표 백제 솔루션에서 튜브를 immersing 하 여 정액을 포함 하는 모 세관 튜브를 소독 하 고 세관 sharps 컨테이너에서 삭제.</li>
</ol>6. 비디오 이미징 정자 운동 성의
<ol><li>현미경 및 비디오 이미징 소프트웨어 설정.</li>
	<li>유리 슬라이드 온수 스테이지에 배치 하는 동안 미리 데워 진된 유리 슬라이드에 남은 정액의 20 µ L를 플라스틱.</li>
	<li>유리 coverslip 커버.</li>
	<li>현미경 슬라이드 coverslip 측면을 내려 놓습니다.</li>
	<li>20 X 렌즈를 사용 하 여 관심 영역을 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>100 X 객관적 렌즈 비디오 영상에 대 한 변경 합니다.</li>
	<li>30 12 프레임/s (fps)에서 비디오 s.</li>
	<li>임의로 동물 당 적어도 3 개의 다른 영역에 동영상을 기록 합니다.</li>
	<li>이미징 수행 신속 하 고 정자의 운동 성 및 생존 능력을 유지 하기 위해 슬라이드에 빛 노출을 최소화. 참고:이 이미징 절차는 2-3 분 내에서 행해져야 한다.</li>
	<li>앞에서 설명한8ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 데이터 분석을 수행 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Suarez, S. S., Pacey, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+transport+in+the+female+reproductive+tract.">Sperm transport in the female reproductive tract.</a> Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).</li><li>Bedford, J. M., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+sperm+motility+after+mating+in+the+rat+and+hamster.">Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster.</a> J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).</li><li>Lilja, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+semenogelin.">Cell biology of semenogelin.</a> Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).</li><li>Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semenogelin,+the+predominant+protein+in+human+semen.+Primary+structure+and+identification+of+closely+related+proteins+in+the+male+accessory+sex+glands+and+on+the+spermatozoa.">Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa.</a> J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).</li><li>Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seminal+fluid+characterization+for+male+fertility+and+prostate+cancer:+kallikrein-related+serine+proteases+and+whole+proteome+approaches.">Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches.</a> Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).</li><li>Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+role+of+human+KLK14+in+seminal+clot+liquefaction.">Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction.</a> J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).</li><li>Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+kallikrein+on+sperm+motility,+capillary+tube+test,+and+pregnancy+rate+in+an+AIH+program.">Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program.</a> Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).</li><li>Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+estrogen+for+the+mammalian+female+in+regulating+semen+coagulation+and+liquefaction+in+vivo.">Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (4), e1006743 (2017).</li><li>Elia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+semen+hyperviscosity:+prevalence,+pathogenesis+and+therapeutic+aspects.">Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects.</a> Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).</li><li>Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+epithelial+estrogen+receptor+alpha+is+dispensable+for+proliferation+but+essential+for+complete+biological+and+biochemical+responses.">Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).</li><li>McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performing+vaginal+lavage,+crystal+violet+staining,+and+vaginal+cytological+evaluation+for+mouse+estrous+cycle+staging+identification.">Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification.</a> J Vis Exp. (67), e4389 (2012).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab+Animal+Research.+Fundamentals+of+Breeding+and+Weaning.">Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning.</a> JoVE. , (2017).</li><li>Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unleashing+the+therapeutic+potential+of+human+kallikrein-related+serine+proteases.">Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).</li><li>Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putative+functions+of+tissue+kallikrein-related+peptidases+in+vaginal+fluid.">Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid.</a> Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

같이 전 수 정액 및 여성 재생산 지역. 에서 분 비 물 간의 생리 적인 상호 작용 정액 분석에서 생체 외에서 이점을 제공할 수 있습니다 마우스 uteri에서 정액을 수집 이 연구에서 제시 하는 기술 연구원 정액 품질과 정자 생존으로 이상적인 생리 조건에서 운동 성을 확인 하 수 있습니다. 또한, 정액은 uteri에서 수집 된를 사용 하 여 수행할 수 있는 다양 한 다운스트림 분석, 예를 들어 ...

여성 재생산 지역 상위 및 하위 책자의 구성 됩니다. 위 재생산 지역에는 나 팔 관, 자 궁 그리고 endocervix는 포함 되어 있습니다. 낮은 재생산 지역에는 ectocervix 및 질 포함 됩니다. 인간에서는, ejaculated 정액 ectocervix1에 인접 한 질 앞쪽 벽에 입금 됩니다. 그러나 쥐,, 정액은 휩 쓸 자 궁으로2짝짓기 후 분 이내.
정액 침투 수를 정자를 일으키는 루의 초 이내에 경화 되 고3움직일 정액 젤을 포함 합니다. 액 화 물 일관성에 젤 같은에서 정액을 변경 하 여 고정된 정자를 해제 합니다. 이 과정은 정자의 운동 성 및 포유류 복제에 대 한 필수적입니다. 정액 액 화의 지식은 주로 어디 정액 문화 접시에 액 화 된다 생체 외에서 연구 기반으로 합니다. 인간에서는, 전립선 특정 항 원 또는 PSA (일컬어 kallikrein 관련 peptidase 3 또는 KLK3)의 효소 활동은 semenogelins (젤 형성 단백질 정액에 존재)4 의 가수분해를 통해 액 화에 대 한 주요 기여자 ,56. Semenogelins의 정자 이동성 증가 정액 coagulum에서 정자를 줘 라. 계란을 기름 지 게 나 팔 관으로 정자 수영을 해제. 액 화 (또는 정액 점도) 테스트는 불 임 클리닉 남성 불 임7평가에서 정액 분석을 위한 표준 초기 검 진 중 하나.
최근에 출판 된 기사를 정액 액체 여성 마우스 생식 관 후 짝짓기에서 수집 된의 분석 이후에 다 산 결함8를 일으킬 수 있는 액 화 결핍을 설명 하기 위해 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 결함이 액 정액 hyperviscosity 같은 남자9, 일반 액 화는 포유류 복제를 위한 불가결 제안에 불 임 사례의 11.8 32.3%에 기여 한다. 그러나, 연구 및 치료 액 결함의 남성7에 독점적으로 집중 했다. 여성 재생산 지역 정액 액 화에서 역할을 담당 하는 가능성은 탐구 하지. 따라서, 정액 수집 및 액 화 시간 측정 방법 연구 액 관심의 모델 생물에서 불 임의 원인 중 하나 될 수 있는지 여부를 결정 하는 새로운 진단 도구를 제공 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="571">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Toothpick</td>
			<td style="width:71px;">Diamond</td>
			<td style="width:119px;">750-Flat</td>
			<td style="width:167px;">Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-940</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Spring scissors</td>
			<td style="width:71px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-5600</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Fine forceps</td>
			<td style="width:71px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-5045</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">25-&#956;L glass capillary tube</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">53432-761</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Leibovitz&#8217;s L-15 media</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11415064</td>
			<td style="width:167px;">Supplement with 1% FBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:71px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:119px;">100-106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1.5-mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:71px;">Axygen</td>
			<td style="width:119px;">MCT-150-C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">2-mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:71px;">Axygen</td>
			<td style="width:119px;">MCT-200-A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:215px;">Digital dry block heater</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">13259-052</td>
			<td style="width:167px;">For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Minicentrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">LSE 6765</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">35-mm culture dish</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10861-656</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">15-mL polypropylene centrifuge tube</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">10025-686</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Waterbath</td>
			<td style="width:71px;">Precision</td>
			<td style="width:119px;">TSGP05</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Heated stage stereomicroscope</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;">MZ10F</td>
			<td style="width:167px;">To keep the tissue warm prior to semen collection</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Brightfield microscope</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;">DMi8</td>
			<td style="width:167px;">Optional. For video imaging of the sperm motility</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Camera</td>
			<td style="width:71px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;">DMC2900</td>
			<td style="width:167px;">Optional. For video imaging of the sperm motility</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Glass slides</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-552-3</td>
			<td style="width:167px;">Optional. For video imaging of the sperm motility</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Coverslip</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48393-059</td>
			<td style="width:167px;">Optional. For video imaging of the sperm motility</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:215px;">Bleach</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Dilute in dH2O to 10% concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of post-mating semen from the female reproductive tract and measurement of semen liquefaction in mice

마우스에 ejaculated 정액은 자 궁에 입금 됩니다. 사정 후 정액에서 젤 같은 일관성을 변경 물, 프로세스 라는 액 화. 이 연구에서 우리는 마우스 모델에서 여성 재생산 지역에서 후 ejaculated 정액을 수집 하는 방법을 보여줍니다. 첫째, 성인 여성 쥐 발 정기 단계에서 남자의 감 금 소에 하룻밤 보관 되어 있었다. 다음날 아침, 결합 질에 copulatory 플러그의 존재에 의해 확인 됐다. 여성 쥐 copulatory 플러그와 안락사 했다 고 각 생식 관 (질, 자 궁, oviducts, 난소), 전체적으로 수집 된 정액을 포함 하는 닫힌된 시스템을 보장. 튜브에 정액을 풀어 질 렸와 생식로 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 배치 되었다. 분석에 대 한 최대 정액 볼륨을 보장 하기 위해, 한적한 집게는 나머지 정액을 추방 하는 질 끝에 난소에서 자 궁 뿔을 집어넣은 사용 되었다. 전체 생식 관은 다음 삭제 됩니다. 정액에 포함 된 튜브는 잠시 내려 냈 지. 25 μ 모 세관 피 펫 (튜브 벽에 평행) 180 ° 각도로 튜브에 배치 했다. 25 μ 라인에 모 세관 튜브를 작성 하는 데 사용 하는 시간을 기록 했다. 검증 된 남성 종 축에서 정액은 일반적으로 25 μ 모 세관 튜브를 채우기 위해 약 60-180 s를 걸립니다. 이 정액 컬렉션 기술은 또한 정자 이미징 및 운동 성 분석 등 다른 다운스트림 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다.

정액은 비옥한 CTRL 남성과 짝짓기 후 ctrl 키와 코 여성 약 8 h에서 수집 되었다. 액 화 (또는 정액 점도) 정액 25 μ 모 세관 튜브를 작성 하는 데 걸린 시간에 의해 정량 이다. 정액에서 CTRL uteri 수집 했다 2.06 ±0.12 분 (mean±S.E.M, n = 5) 모 세관 튜브 (그림 1)을 채우기 위해. 그러나, 정액 코 uteri에서 수집 했다 60 분 이상 (60.0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) 실험 시간. 이러한 데이?...

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Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

후에 쥐에 있는 정액 액의 측정 및 여성 재생산 지역에서 정액 짝짓기의 컬렉션

정액 액 화는 정액 젤에서 해방 될 정자에 대 한 필요 합니다. 이 연구는 여성 재생산 지역 포스트 성교에서 정액을 수집 하 고 정액 액 화 시간을 측정 하기 위한 절차를 제공 합니다.

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

16.3K 조회수.  Washington State University. 정액 액 화는 정액 젤에서 해방 될 정자에 대 한 필요 합니다. 이 연구는 여성 재생산 지역 포스트 성교에서 정액을 수집 하 고 정액 액 화 시간을 측정 하기 위한 절차를 제공 합니다.

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In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

생체 외에서 마우스 시뮬레이션된 Microgravity에서 Preantral 모 낭의 성장

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

연구

발생학

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Orthotopic Ovarian Transplantation Procedures to Investigate the Life- and Health-span Influence of Ovarian Senescence in Female Mice

Ovarian transplantation was first conducted at Utah State University in 1963. In more recent work, heterochronic transplantation of mammalian ovaries is being used to investigate the health-protective effects of young ovaries in young females. The current procedures employ an orthotopic transplantation method, where allogenic ovaries are transplanted back to their original position in the ovarian bursa. This is in contrast to the more commonly used heterotopic transplantation of ovaries/ovarian tissue subcutaneously or under the kidney capsule. All three locations provide efficient revascularization of the transplanted tissues. However, orthotopic transplantation provides the ovary with the most natural signaling environment and is the only procedure that provides the opportunity for the animal to reproduce naturally post-operatively. One must take care to remove all endogenous ovarian tissue during the ovariectomy procedure. If any endogenous tissue remains or if only one ovary is removed, the transplanted tissue will remain dormant until the existing tissue becomes senescent. While revascularization of the transplanted ovaries occurs very quickly, the transplant recipient can take a considerable amount of time to adapt to a new hypothalamic/pituitary/gonadal/adrenal (HPG/A) axis signaling regime associated with the transplanted tissue. This normally takes about 100 days in the mouse. Therefore, transplantation experiments should be designed to accommodate this adaptation period. Typical results with ovarian transplantation will include changes in the health of the recipient that reflect the age of the transplanted ovary, rather than the chronological age of the recipient.

Described here are orthotopic ovarian transplantation protocols for modifying ovarian influence on the physiology of the recipient mouse. This surgical procedure is used to expose female mice to various types of ovarian influence and may include heterochronic transplantations and transplantation of ovaries that have undergone various ex vivo treatments.

여성 쥐에서 난소 노화의 수명 및 건강 영향 조사를 Orthotopic 난소 이식 절차

Ovarian transplantation was first conducted at Utah State University in 1963. In more recent work, heterochronic transplantation of mammalian ovaries is ...

Combinational Treatment of Trichostatin A and Vitamin C Improves the Efficiency of Cloning Mice by Somatic Cell Nuclear Transfer

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) provides a unique opportunity to directly produce a cloned animal from a donor cell, and it requires the use of skillful techniques. Additionally, the efficiencies of cloning have remained low since the successful production of cloned animals, especially mice. There have been many attempts to improve the cloning efficiency, and trichostatin A (TSA), a histone deacetylase inhibitor, has been widely used to enhance the efficiency of cloning. Here, we report a dramatically improved cloning method in mice. This somatic cell nuclear transfer method involves usage of Hemagglutinating virus of Japan Envelope (HVJ-E), which enables easy manipulation. Moreover, the treatment using two small molecules, TSA and vitamin C (VC), with deionized bovine serum albumin (dBSA), is highly effective for embryonic development. This approach requires neither additional injection nor genetic manipulation, and thus presents a simple, suitable method for practical use. This method could become a technically feasible approach for researchers to produce genetically modified animals from cultured cells. Furthermore, it might be a useful way for the rescue of endangered animals via cloning.

We describe a dramatically improved method for mouse cloning using trichostatin A, vitamin C, and deionized bovine serum albumin. We show a simplified, reproducible protocol that supports efficient development of cloned embryos. Hence, this method could become a standardized procedure for mouse cloning.

Trichostatin A와 비타민 C의 조합 치료 체세포 핵 이식에 의해 생쥐 복제의 효율성 향상

Somatic cell nuclear transfer (SCNT) provides a unique opportunity to directly produce a cloned animal from a donor cell, and it requires the use of ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for embryo implantation into the uterine lining of the maternal womb. Improper decidualization has been established as a root cause for implantation failure and subsequent early embryo miscarriage. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying decidualization is advantageous to improving the rate of successful births. In vivo based studies of artificial decidualization are often limiting due to ethical dilemmas associated with human research, as well as translational complications within animal models. As a result, in vitro assays through primary cell culture are often utilized to explore the modulation of decidualization via hormones. This study provides a detailed protocol for the isolation of HESC and subsequent artificial decidualization via the supplementation of hormones to the culturing medium. Further, this study provides a well-designed method to knockdown any gene of interest by utilizing lipid-based siRNA transfections. This protocol permits the optimization of culture purity as well as product yield, thereby maximizing the ability to utilize this model as a reliable method to understand the molecular mechanisms underlying decidualization, and the subsequent quantification of secreted agents by decidualized endometrial stromal cells.

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a validated and optimized procedure for the isolation and culture of human endometrial stromal cells to conduct in vitro decidualization assay. Further, this study provides a detailed method to efficiently knockdown a specific gene using siRNAs in human endometrial stromal cells.

생체 외에서 Decidualization에 대 한 인간의 자궁내 막 기질 세포의 고립

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

Vivo에서 하는 방법 마우스 혈액 고환 방 벽 완전성을 공부

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

마이그레이션, 침공, 불멸 하 게 인간의 첫 번째 임신 Trophoblast 셀 라인의 확산을 평가를 생체 외 분석 실험에서

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

정자 지도 및 운동 성 아닌 간 남녀 양성 생식 기관에서 측정

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that during the reproductive life span only about 1% of the oocytes in an ovary mature and ovulate, several techniques have been developed to increase the exploitation of the ovarian reserve to the growing population of non-ovulatory follicles. Such technologies have allowed interventions of fertility preservation, selection programs in livestock, and conservation of endangered species. However, the vast potential of the ovarian reserve is still largely unexploited. In cows, for instance, some attempts have been made to support in vitro culture of oocytes at specific developmental stages, but efficient and reliable protocols have not yet been developed. Here we describe a culture system that reproduce the physiological conditions of the corresponding follicular stage, defined to develop in vitro growing oocytes collected from bovine early antral follicles to the fully-grown stage, corresponding to the medium antral follicle in vivo. A combination of hormones and a phosphodiesterase 3 inhibitor was used to prevent untimely meiotic resumption and to guide oocyte&#39;s differentiation.

We describe the procedures for isolation of growing oocytes from ovarian follicles at early stages of development, as well as the setup of an in vitro culture system which can support the growth and differentiation up to the fully-grown stage. &#160;

가축의 초기 개국 여포에서 온수에 대한 생체 외 문화 전략

The limited reserve of mature, fertilizable oocytes represents a major barrier for the success of assisted reproduction in mammals. Considering that ...

Transuterine Fetal Tracheal Occlusion Model in Mice

Fetal tracheal occlusion (TO), an established treatment modality, promotes fetal lung growth and survival in severe congenital diaphragmatic hernia (CDH). Following TO, retention of the secreted epithelial fluid increases luminal pressure and induces lung growth. Various animal models have been defined to understand the pathophysiology of CDH and TO. All have their own advantages and disadvantages such as the difficulty of the technique, the size of the animal, cost, high mortality rates, and the availability of genetic tools. Herein, a novel transuterine model of murine fetal TO is described. Pregnant mice were anesthetized, and the uterus exposed via a midline laparotomy. The trachea of selected fetuses were ligated with a single transuterine suture placed behind the trachea, one carotid artery, and one jugular vein. The dam was closed and allowed to recover. Fetuses were collected just before parturition. Lung to body weight ratio in TO fetuses was higher than that in control fetuses. This model provides researchers with a new tool to study the impact of both TO and increased luminal pressure on lung development.

Various animal models of congenital diaphragmatic hernia and fetal tracheal occlusion present advantages and disadvantages regarding ethical issues, cost, surgical difficulty, size, survival rates, and availability of genetic tools. This model provides a new tool to study the impact of both tracheal occlusion and increased luminal pressure on lung development.

쥐의 트랜스테린 태아 기관 폐색 모델

Fetal tracheal occlusion (TO), an established treatment modality, promotes fetal lung growth and survival in severe congenital diaphragmatic hernia (CDH). ...