Lindsey W. Plasschaert ve Justin Sui'ye bu protokolün erken gelişimine yaptıkları önemli katkılar için teşekkür ederiz. Yazarlar, sinek topluluğuna reaktiflerle cömertlikleri için ve özellikle Ruth Lehmann ve Benjamin Lin'e, yayınlanmadan önce no.5'-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' hattını hediye ettikleri için minnettardır. Bu çalışmada Bloomington Drosophila Stok Merkezi'nden (NIH P40OD018537) elde edilen stoklar kullanılmıştır. Bu çalışma NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 ve R35GM136270 (S.D) ve eğitim hibeleri T32GM007229 (B.W.) ve F32GM125123 (L.A.) tarafından desteklenmiştir.

1. Diseksiyondan bir gün önce hazırlık
<ol><li>Elektrolitik olarak bir tungsten iğnesini24 keskinleştirin, böylece elde edilen çap yaklaşık 0.03 mm olur. Verilen voltajı yaklaşık 14 V'a ayarlayın ve 3,3 M NaOH kullanın. Keskinleştirme 1 veya 2 dakikadan fazla sürmemelidir. DİKKAT: NaOH oldukça aşındırıcıdır ve ciltle temas ettiğinde yanıklara neden olur. Kullanırken eldiven ve gözlük takın ve bir duman başlığının içinde çalışın. NOT: Kullandıktan sonra, NaOH'yi bir polipropilen Falcon tüpünde saklayın.</li>
	<li>Hazırlanan görüntüleme ortamını yapın. 15 mL'lik bir konik tüpte, 4.25 mL Schneider ortamını 750 μL Fetal Sığır Serumu (FBS,% 15 nihai konsantrasyon) ve 27.5 μL Penisilin-Streptomisin (0.05 U / μL Penisilin, 0.05 μg / μL nihai konsantrasyon) ile birleştirin. Hazırlanan bu görüntüleme ortamını 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Heptan-tutkal çözeltisi yapın. Yaklaşık 20 cm çift taraflı bantla doldurulmuş 20 mL sızdırmaz şişeye yaklaşık 0,5 mL heptan ekleyin. Bir nutatörde yaklaşık bir saat boyunca sallayın veya su ve gliserol arasında bir tutarlılık elde edilene kadar bir pipet ucuyla karıştırın. Bu çözünmüş tutkal çözeltisi, heptan buharlaşmadan önce birkaç gün sürecektir. Çözeltiyi tazelemek için, ilave bir 0,5 mL heptan ve kaya ekleyin. NOT: Etkili bir heptan-yapıştırıcı çözeltisi, çeşitli heptan-bant oranları ve ayrıca değişen sallanma / karıştırma süreleri kullanılarak hazırlanabilir. Yukarıdaki spesifikasyonlar sadece böyle bir yeterli çözeltinin hazırlanması veya tazelenmesi için önerilerdir.</li>
</ol>2. Embriyo toplama – diseksiyondan 15-17 saat önce
<ol><li>Bir elma suyu agar tabağı25'e taze maya ezmesi ekleyin. Küçük deliklerle delikli boş bir gıda şişesine yetişkin sinekler (10 günden az) ekleyerek bir embriyo toplama kafesi kurun26. Mayalı agar plakasını kullanarak toplama kafesini kapatın, şişeye bantlayın ve kafesi plaka tarafı aşağı olacak şekilde 25 ° C'lik karanlık bir inkübatöre 1 saat boyunca yerleştirin. NOT: Sinekler, gonadı floresan olarak işaretleyecek bir transgeni ifade etmelidir, örneğin, six4-eGFP::Moesin20, çünkü embriyoların diseksiyonu stereo-floresan mikroskop altında gerçekleşecektir. Gonadı işaretlemek için kullanılan genotiplerin listesi için Malzeme Tablosu'na bakınız.</li>
	<li>Kafesi inkübatörden çıkarın ve bu ilk koleksiyonu atın. Taze mayalanmış bir agar plakası ile değiştirin ve kafesi 2 saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin. NOT: İlk embriyo koleksiyonu, döllenmiş, gelişmekte olan embriyoların dişilerini temizlemek, sıkı bir şekilde zamanlanmış ikinci bir embriyo koleksiyonu elde etmek için kullanılır.</li>
	<li>Agar plakasını kafesten çıkarın ve (mayalı tarafı yukarı bakacak şekilde) kapatılabilir plastik bir kabın içindeki nemli bir kağıt havluya yerleştirin. Embriyoları 14.5 saat yaşlandırmak için bu nemli odayı 25 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin (son yaşlar, yumurtlamadan sonra 14.5-16.5 saat). NOT: Adım 2.4'e başlamadan hemen önce, adım 3.1 ve 3.2'yi tamamlayın.</li>
	<li>Agar plakasını inkübatörden çıkarın ve bir fışkırtma şişesi kullanarak, bir boya fırçasıyla hafifçe fırçalayarak maya macununu çözmek için agar plakasına yeterli su ekleyin. Embriyoları ve çözünmüş mayayı bir tartım teknesinin içinde oturan küçük bir ağ elek sepetinde durulayın. Sepette, çoğu maya macunu ağdan süzülene kadar su fışkırtma şişesiyle durulayın.</li>
	<li>Tartım teknesindeki suyu çıkarın ve sepeti tekrar içine yerleştirin. Embriyoları, bir fışkırtma şişesi kullanarak% 50'lik bir ağartıcı çözeltisine batırarak dekoryonlayın. Ağartıcı çözeltisi 3-5 mm derinliğe sahip olmalıdır. Embriyoları ara sıra dönerek ~ 2 dakika boyunca çamaşır suyuna batırılmış halde tutun. DİKKAT: Çamaşır suyu aşındırıcıdır ve gözleri ve solunum yollarını tahriş edebilir veya zarar verebilir. Çamaşır suyunu kullanırken eldiven ve gözlük takın. NOT: Bu süre zarfında, adım 3.3'ü mümkün olduğunca tamamlayın. Dekoryonasyon ilerlemesi, sepeti stereo mikroskop altına yerleştirerek ve dorsal uzantıların yokluğunu kontrol ederek kontrol edilebilir. Gerekirse embriyoları ek süre için ağartıcı çözeltisine batırın.</li>
	<li>Ağartıcıyı atın ve sepetin içindeki embriyoları bir fışkırtma şişesinden suyla iyice durulayın (~ 3 s için, ağ sepetini kağıt havlularla lekeleyin; 2-3 kez tekrarlayın).</li>
</ol>3. Diseksiyon hazırlık günü
<ol><li>1.5 mL'lik bir Eppendorf tüpüne (0.2 mg/mL nihai konsantrasyon) 1.500 μL hazırlanmış görüntüleme ortamına (bkz. adım 1.2) 30 μL insülin (10 mg/mL) ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığına dengelemek için tüpü tezgahın üzerinde bırakın.</li>
	<li>Tutkalla kaplanmış kapak kayma şeritleri hazırlayın.<ol>
<li>22 mm x 22 mm'lik bir kapak kaymasını eşit büyüklükte dört şerit halinde kesmek için elmas uçlu bir bıçak kullanın (Şekil 1A).</li>
		<li>Bir şeridi almak için forseps kullanın ve şeridin her iki tarafına toplam yaklaşık 30 μL heptan-yapıştırıcı çözeltisi yayın (Şekil 1B). Eşit bir tutkal kalıntısı tabakası elde etmek için, heptan buharlaşırken şeridi çeşitli açılarda eğin.</li>
		<li>Tutkal kaplı şeridi bir kapaklı kutunun boş bir yuvasında saklayın; yapışkanlığını korumak için, şeridi eğimli, ancak dik bir konumda, kutu yüzeyleriyle teması en aza indirmek için kutunun kenarlarına yaslanmış olarak yerleştirin (Şekil 1C). Kutuyu kapatın, böylece havadaki partiküller yapıştırıcıyı kaplamaz ve yapışkanlığını azaltır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tezgahın üstüne şu öğeleri yerleştirin: 6 inç cam Pasteur pipet, mikroskop slaytı, uygun pipet uçlarına sahip bir P200 ve bir P1000 pipetçi, Ringer çözeltisi27 (NaOH ile pH 7,3'e ayarlanır) ve açık, Poli-D-Lizin kaplı 35 mm görüntüleme kabı.</li>
	<li>Embriyoları ağ elek sepetinden 500-750 μL heptan ile doldurulmuş küçük bir saat camına aktarın.<ol>
<li>Sepetin kenarlarını ve altını bir mendil mendiliyle kurulayın. Hepattaki bir boya fırçasını nemlendirin, boya fırçasını embriyolara dokunun (hidrofobik vitelin zar kıllara yapışmalıdır) ve boya fırçasını saat camındaki heptana geri daldırın (embriyolar dibe batmalıdır). NOT: Embriyoların kurumasını önlemek için sonraki adımlar mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirilmelidir. Embriyolar 20 saniyeden fazla havaya maruz bırakılmamalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Embriyoları bir Pasteur pipeti kullanarak mikroskop slaytına aktarın (Şekil 1D). Embriyoları yavaşça pipete çekin ve pipetin dar kısmıyla sınırlayın. Pipet embriyoları yavaşça slaytın üzerine dökülür, böylece kızağa akmadan önce pipetin ucunun hemen içinde toplanırlar. Bir mendil mendilinin köşesini ince bir uca çevirin ve heptanı slayttaki embriyolardan uzaklaştırın. Daha küçük bir alanı toplayacak ve kaplayacaklar, böylece bir sonraki adımda tutkal kaplı bir şeritte yakalanmalarını kolaylaştıracaklar.</li>
	<li>Forsepsle, tutkal kaplı bir şerit alın ve embriyolara hafifçe dokunun (Şekil 1E). Şeridi görüntüleme kabına, embriyoyu yana doğru ve Poli-D-Lizin kaplı merkezin hemen dışına yerleştirin. Yerine sabitlendiğinden emin olmak için forseps kullanarak şeridi tabağa bastırın. Çanağı hemen 2–3,5 mL Ringer çözeltisi ile doldurun; kurumasını önlemek için embriyoları önce suya batırın (Şekil 1F).</li>
</ol>4. Diseksiyon
NOT: Bu adımlar stereo-floresan mikroskop altında gerçekleştirilmelidir.
<ol><li>10-15 embriyoyu devitellinize edin. NOT: Bu, yeni başlayanlar için iki embriyodan, uzmanlar için on beş embriyoya kadar değişebilir.<ol>
<li>Bağırsak morfolojisine göre Evre 16 embriyolarını seçin (Şekil 2). Bu aşamada, embriyolar dört yığılmış bağırsak segmenti oluşturan üç bağırsak daralmasına sahiptir (Şekil 2 B, B'). Devitelinizasyona başlamak için, seçilen embriyoyu bir uçta, tercihen ön tarafta, tungsten iğnesi ile delin. Embriyo vitelin zarından dışarı çıkabilir, ancak değilse, zarı embriyodan soyun. NOT: Diseksiyon için çok genç olan embriyolar bölgeselleşmemiş bağırsaklara sahiptir (Şekil 2C). Evre 17 embriyolarının diseksiyonu mümkündür, ancak Aşama 16 embriyolarının diseksiyonundan daha zordur, çünkü kütikül bu aşamada gelişmeye başlamaktadır. Erken Evre 17 embriyoları, birbirlerine göre kaydırılmış dört bağırsak segmenti ile birlikte bulunur (Şekil 2 D, D').</li>
		<li>İğneyi embriyo boyunca gonadlardan uzak bir bölgeye bağlayın. Kancalı embriyoyu çanağın Polilizin kaplı bölgesine aktarın (buradan itibaren basitçe "kapak kayması" olarak adlandırılır) ve yapışana kadar tabana doğru sürükleyin. Bu adımları tekrarlayın ve devitelinize embriyoları Polilizin kaplı kapak kaymasının üst kısmı boyunca üst üste yerleştirin (Şekil 3A), daha fazla diseksiyon için aşağıda bol miktarda alan bırakın. NOT: Gonadlar, kullanılan spesifik işaretleyiciye ve transgen kopya numarasına bağlı olarak parlak bir şekilde flüoresan olması gereken küçük küresel hücre agregaları olarak görünür. Bu aşamada, gonadlar lateral olarak A5 segmentinde, anteriordan embriyo uzunluğunun yaklaşık% 70-80'inde bulunur. Diseksiyon protokolü boyunca, doku iğneye yapışabilir. Enkazın iğnesinden kurtulmak için, Ringer çözeltisinin yüzeyinin hemen üzerine kaldırın. Devitellinizasyon, gonad uygun mümkün olduğunca az bozulduğu sürece düzensiz olabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Gonadları embriyodan çıkarıp kabın üzerine yerleştirin (Şekil 3C,D).<ol>
<li>İlk olarak, embriyoyu içini açığa çıkarmak için törpülayın (Şekil 3C). Embriyoyu merkezinden dilimleyin, iğneyi arkadan, gonadlar arasında hareket ettirin. Bazı iç dokuları kızdırın, çünkü bu yemeğe dış kütikülden çok daha iyi yapışacaktır. Dokunun yapışkanlığı, bir sonraki manipülasyonların gonadı ortaya çıkarmasını ve kapak kaymasına yapışmasını sağlayacaktır. NOT: Doku çanağa yapışmıyorsa, kaplanmış kapak kaymasının kirlenmemiş bir bölgesine koaksiyel hale getirmeyi deneyin; kapak kaymasının dış bölgeleri özellikle yapışkan olacaktır. Adım 4.1.2'de belirtildiği gibi, diseksiyon manipülasyonlarının, gonadlar zarar görmediği sürece, parçalanmış bir embriyo karkası ile sonuçlanması önemli değildir.</li>
		<li>İğneyi, gonad da dahil olmak üzere bir doku parçası kalan karkastan ayrılana kadar bir gonadın etrafında dilimlemek için kullanın. İğne ile, bu dokuyu taze bir kaplanmış örtü kayması bölgesine çekin ve tabağa yapışana kadar tabana doğru koaksiyel hale getirin. NOT: En iyi görüntüleme, gonadın kendisinin üstteki doku yoluyla dolaylı olarak bağlanması yerine, doğrudan kapak kaymasına bağlandığı durumlarda elde edilecektir. Bu nedenle, doku karkastan uzağa yönlendirildikçe, gonadın yabancı doku yerine önce kapak kaymasına dokunmasını sağlayın.</li>
		<li>Yapışkan dokuyu iğne ile gonaddan nazikçe sürükleyerek gonaddan mümkün olduğunca fazla çevre dokusunu çıkarın (Şekil 3D). Gonada doğrudan dokunmaktan kaçının, bu da ona zarar verir (Şekil 4E). Gondanın çanağa yeterince yapışmasını sağlamak için, iğneyi gonadın etrafında yumuşak bir dairesel hareketle hareket ettirin - eğer hareket ederse, iğneyi kalan yapışkan dokuya dokunun ve gonadı taze bir yapışkan örtü kayması bölgesine yönlendirin. Gonadın tespit edilebilir bir hareketi kalmayana kadar bu işlemi tekrarlayın.</li>
		<li>Embriyo karkasına geri dönün ve ikinci gonadı diseke edin. Bu işlemi mümkün olduğunca çok sayıda embriyo üzerinde tekrarlayın, ancak 25 dakikayı geçmeyin. Doku canlılığı, ~ 40-45 dakikadan fazla bir süre sonra Ringer'ın çözeltisinde tehlikeye girecektir.</li>
	</ol></li>
	<li>Diseksiyonlar tamamlandıktan sonra, diseksiyon sırasında yönünü kaydetmek üzere görüntüleme kabının dış kenarına kayıt işaretleri eklemek için silinmez bir işaretleyici kullanın.</li>
	<li>Tutkal kaplı şeridi tabaktan çıkarın.<ol>
<li>Bir çift forsederin alt çatalını şeridin altına yavaşça yerleştirin, yapışmış gonadların bozulmasını en aza indirmek için Zil çözeltisinin mümkün olduğunca az dökülmesiyle çanaktan kurtarmak için şeridi yavaşça yukarı doğru eğin ve yavaşça yukarı doğru eğin. NOT: Şerit, disseke edilmiş gonadlardan uzağa eğilmelidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Çanağı, Ringer çözeltisinin dökülmesini önleyecek şekilde yavaşça görüntüleme mikroskobuna taşıyın.</li>
</ol>5. Görüntüleme
<ol><li>Görüntüleme kabını, tabağı diseksiyon sırasında olduğu gibi yaklaşık yönde yerleştirmek için işaret işaretlerini kullanarak sahne tutucusuna yerleştirin. Parlak alan mikroskobu ve düşük güçlü (~ 10x) bir hedef kullanarak, kapak kaymasına yapışmış herhangi bir doku parçasını tanımlayın ve odaklayın. Floresanı ortaya çıkarmak için göz merceği ayarlarını değiştirin ve dürbün göz merceklerini kullanarak, görüntüleme yazılımı içindeki her bir gonadın konumunu işaretleyerek çanağı sistematik olarak tarayın (bkz. NOT: Konumları işaretlemeden önce gonadların görüş alanında ortalandığından emin olun.</li>
	<li>Tüm sahne tutucu tertibatını, görüntüleme kabı tutucusunda olacak şekilde yavaşça çıkarın ve tertibatı çalışma tezgahına yerleştirin.</li>
	<li>Ringer çözeltisini insülin içeren hazırlanmış görüntüleme ortamıyla değiştirin (bkz. adım 1.2 ve 3.1).<ol>
<li>Tüm Ringer solüsyonunu görüntüleme kabının iç üst çıkıntısından çıkarmak için bir P1000 kullanın (Ringer'ları merkezi kapak kayma bölgesinden pipet yapmayın). Ardından, bir P200'e geçin ve ucunu merkezi bölgede kalan Ringer'ın yüzeyinin hemen altına yerleştirin. 50-100 μL Ringer'ı dikkatlice çıkarın; çözümün tamamını ÇIKARMAYIN.</li>
		<li>~200 μL görüntüleme ortamı hazırlayın ve P200 ucunu kalan Ringer'ın yüzeyinin hemen altına yerleştirerek yavaşça bu görüntüleme ortamını ekleyin. Ardından, kalan görüntüleme ortamını (~ 1.300 μL) üst çıkıntının en dış kenarından başlayarak çanağa ekleyin. Pipetleme sırasında, sıvının orta kubbesine doğru ilerleyin ve sonunda pipet ucunu her ikisinin de üzerinden fırçalayarak ikisini birleştirin. Kapağı tabağın üzerine yerleştirin. NOT: Görüntüleme ortamı, buharlaşmayı önlemek için çanağın tüm iç çapını yaklaşık 2 mm derinlikte kapsamalıdır (Şekil 4D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikroskobu daha yüksek bir güç hedefine (63x, 1.2 NA) geçirin, kullanılan hedefe göre uygun daldırma sıvısını uygulayın (hedefin gerektirdiği daldırma sıvısı tipi ve kırılma indisi) ve ardından sahne tutucu tertibatını değiştirin. Görüntüleme kabının dibine yapıştırılmış dokuya odaklanmak için parlak alan mikroskobu kullanın. NOT: Aşama hareket ettirilmemişse, hedef odaklandıktan sonra son gonad görünmelidir.</li>
	<li>İşaretli her gonad pozisyonunda adım adım ilerleyin ve bu pozisyonu gerektiği gibi ayarlayın. Görüntü netliğine, gonad cinsiyetine vb. bağlı olarak hangi gonadların görüntüleneceğini seçin. Görüntüleme ayarlarını özelleştirin (çok kanallı, pozlama süreleri, lazer yoğunlukları, Z serisi artışlar, uygun aralıklarla hızlandırılmış çekim vb.). Görüntülemeye başlayın. NOT: Erkek gonadlar, hem bir nişin hem de gonadın karşı ucunda, erkeğe özgü somatik gonadal öncüller (msSGP'ler) adı verilen küçük, oldukça dairesel somatik hücrelerden oluşan bir kümenin varlığı ile tanımlanabilir. Six4-eGFP::moesin floresan işaretleyici kullanılırsa, niş hücreler gonaddaki en parlak ikinci hücrelerdir, en parlak olanı msSGP'lerdir. Bu aşamada, dişi gonadların ne bir nişi ne de msSGP'leri vardır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+of+asymmetric+stem+cell+division+by+the+APC+tumor+suppressor+and+centrosome.">Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome.</a> Science. 301, 1547-1550 (2003).</li><li>Inaba, M., Yuan, H., Salzmann, V., Fuller, M. T., Yamashita, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-Cadherin+is+required+for+centrosome+and+spindle+orientation+in+Drosophila+male+germline+stem+cells.">E-Cadherin is required for centrosome and spindle orientation in Drosophila male germline stem cells.</a> PLoS One. 5, 1-7 (2010).</li><li>Lenhart, K. F., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cell+encystment+promotes+abscission+in+germline+stem+cells+following+a+regulated+block+in+cytokinesis.">Somatic cell encystment promotes abscission in germline stem cells following a regulated block in cytokinesis.</a> Developmental Cell. 34, 192-205 (2015).</li><li>Hardy, R. W., Tokuyasu, K. T., Lindsley, D. L., Garavito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Germinal+Proliferation+Center+in+the+Testis+of+Drosophila+melanogaster.">The Germinal Proliferation Center in the Testis of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Ultrastructure Research. 69, 180-190 (1979).</li><li>Fuller, M. T., Bate, M., Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis.">Spermatogenesis.</a> The Development of Drosophila Melanogaster. , 71-147 (1993).</li><li>Lin, H., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+group+of+pumilio+mutations+affects+the+asymmetric+division+of+germline+stem+cells+in+the+Drosophila+ovary.">A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary.</a> Development. 124, 2463-2476 (1997).</li><li>Emilie, Q., Amit, A., Kai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+piRNA+pathway+is+developmentally+regulated+during+spermatogenesis+in+Drosophila.">The piRNA pathway is developmentally regulated during spermatogenesis in Drosophila.</a> RNA. 22, 1044-1054 (2016).</li><li>Marie, P. P., Ronsseray, S., Boivin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+embryo+to+adult:+PiRNA-mediated+silencing+throughout+germline+development+in+Drosophila.">From embryo to adult: PiRNA-mediated silencing throughout germline development in Drosophila.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7, 505-516 (2017).</li><li>Michel, M., Raabe, I., Kupinski, A. P., P&#233;rez-Palencia, R., B&#246;kel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+BMP+receptor+activation+at+adherens+junctions+in+the+Drosophila+germline+stem+cell+niche.">Local BMP receptor activation at adherens junctions in the Drosophila germline stem cell niche.</a> Nature Communications. 2, (2011).</li><li>Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotubes+mediate+niche-stem-cell+signalling+in+the+Drosophila+testis.">Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis.</a> Nature. 523, 329-332 (2015).</li><li>Leatherman, J. L., Dinardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zfh-1+controls+somatic+stem+cell+self-renewal+in+the+Drosophila+testis+and+nonautonomously+influences+germline+stem+cell+self-renewal.">Zfh-1 controls somatic stem cell self-renewal in the Drosophila testis and nonautonomously influences germline stem cell self-renewal.</a> Cell Stem Cell. 3, 44-54 (2008).</li><li>Leatherman, J. L., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+self-renewal+requires+cyst+stem+cells,+while+stat+regulates+niche+adhesion+in+Drosophila+testes.">Germline self-renewal requires cyst stem cells, while stat regulates niche adhesion in Drosophila testes.</a> Nature Cell Biology. 12, (2010).</li><li>Tulina, N., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+stem+cell+self-renewal+in+Drosophila+Spermatogenesis+by+JAK-STAT+signaling.">Control of stem cell self-renewal in Drosophila Spermatogenesis by JAK-STAT signaling.</a> Science. 294, 2546-2549 (2001).</li><li>Gonczy, P., Viswanathan, S., Dinardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+spermatogenesis+in+Drosophila+with+P-element+enhancer+detectors.">Probing spermatogenesis in Drosophila with P-element enhancer detectors.</a> Development. 114, 89-98 (1992).</li><li>Le Bras, S., Van Doren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+male+germline+stem+cell+niche+in+Drosophila.">Development of the male germline stem cell niche in Drosophila.</a> Developmental Biology. 294, 92-103 (2006).</li><li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+live+imaging+of+stem+cells+in+drosophila+testis.">Time-lapse live imaging of stem cells in drosophila testis.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 0331, 1-9 (2009).</li><li>Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+reveals+hub+cell+assembly+and+compaction+dynamics+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+testis+niche.">Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche.</a> Developmental Biology. 446, 102-118 (2019).</li><li>Rebecca Sheng, X., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+the+Drosophila+spermatogonial+stem+cell+niche+reveals+novel+mechanisms+regulating+germline+stem+cell+output.">Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output.</a> Development. 138, 3367-3376 (2011).</li><li>Aboim, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developpement+embryonnaire+et+post-embryonnaire+des+gonades+normales+et+agametiques+de+Drosophila+melanogaster.">Developpement embryonnaire et post-embryonnaire des gonades normales et agametiques de Drosophila melanogaster.</a> Revue Suisse De Zoologie. 52, 53 (1945).</li><li>Sano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+actin+regulator+ENABLED+regulates+cell+shape+and+orientation+during+gonad+morphogenesis.">The Drosophila actin regulator ENABLED regulates cell shape and orientation during gonad morphogenesis.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Clark, I. B. N., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+gonad+formation+reveals+roles+for+Six4+in+regulating+germline+and+somatic+cell+migration.">Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration.</a> BMC Devlopmental Biology. 7, 1-9 (2007).</li><li>Sheng, X. R., Brawley, C. M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiating+spermatogonia+outcompete+somatic+stem+cells+for+niche+occupancy+in+the+Drosophila+testis.">Dedifferentiating spermatogonia outcompete somatic stem cells for niche occupancy in the Drosophila testis.</a> Cell Stem Cell. 5, 191-203 (2009).</li><li>Tanentzapf, G., Devenport, D., Godt, D., Brown, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Europe+PMC+Funders+Group+integrin-dependent+anchoring+of+a+stem+cell+niche.">Europe PMC Funders Group integrin-dependent anchoring of a stem cell niche.</a> Nature Cell Biology. 9, 1413-1418 (2007).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically+a+motorized+molluscicide+dispenser.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically a motorized molluscicide dispenser.</a> Bulletin of the World Health Organization. , 105-106 (1960).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).</li><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+and+Larva+Harvesting+and+Preparation.">Embryo and Larva Harvesting and Preparation.</a> JoVE Science Education Database. , (2020).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ringer's+solution+for+Drosophila.">Ringer's solution for Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2011).</li><li>Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+Drosophila+CID/CENP-A+and+CENP-C+into+Centromeres+during+Early+Embryonic+Anaphase.">Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into Centromeres during Early Embryonic Anaphase.</a> Current Biology. 17, 237-243 (2007).</li><li>Lin, B., Luo, J., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collectively+stabilizing+and+orienting+posterior+migratory+forces+disperses+cell+clusters+in+vivo.">Collectively stabilizing and orienting posterior migratory forces disperses cell clusters in vivo.</a> Nature Communications. 11, 1-16 (2020).</li><li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+culturing+drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging.">A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).</li><li>Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deregulation+of+dorsoventral+patterning+by+FGF+confers+trilineage+differentiation+capacity+on+CNS+stem+cells+in+vitro.">Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro.</a> Neuron. 40, 485-499 (2003).</li><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification.">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Gonadogenez sırasında, embriyonik gonad ve özellikle erkek gonad15 içindeki kök hücre nişi hızlı morfolojik değişikliklere uğrar. Bu dinamik değişikliklerin altında yatan gelişimsel mekanizmalar en iyi canlı görüntüleme teknikleriyle anlaşılır. Bununla birlikte, embriyonik Aşama 17'de, gonadın in vivo görüntülenmesi, büyük ölçekli kas kasılmalarının başlamasıyla imkansız hale getirilir17. Bu protokolle başarılı bir alternati...

Drosophila melanogaster testis, birçok dinamik hücresel süreci anlamamız için bir paradigma olarak hizmet etmiştir. Bu modelin çalışmaları, kök hücre bölünme regülasyonu 1,2,3, germ hücresi gelişimi 4,5, piRNA biyolojisi 6,7,8 ve niş-kök hücre sinyal olayları9,10,11,12,13'e ışık tutmuştur. Bu model avantajlıdır çünkü genetik olarak izlenebilir 14,15'tir ve kök hücreleri doğal ortamlarında yaşayabileceğimiz birkaç yerden biridir 3,16,17,18. Bununla birlikte, bu modelin canlı görüntülemesi yetişkin doku ve erken embriyonik aşamalarla sınırlandırılmıştır, bu da geç embriyodaki gonadal dinamikler hakkındaki bilgimizde bir boşluk bırakarak, nişin ilk oluştuğu ve işlev görmeye başladığı kesin aşamadır.
Geç evre embriyonik gonad, anteriordaki somatik niş hücrelerden ve daha arka bölgeler boyunca somatik gonadal hücreler tarafından ensiklopedik germ hücrelerinden oluşan bir küredir19. Bu organ, erken embriyonik Aşama 17 17,20,21'e kadar in vivo olarak canlı olarak görüntülenebilir. Büyük ölçekli kas kasılmalarının başlaması nedeniyle daha fazla görüntüleme engellenir. Bu kasılmalar o kadar şiddetlidir ki, gonadı görüntüleme çerçevesinin dışına iter ve bu tür hareketler görüntüleme yazılımı ile düzeltilemez. Laboratuvarımız, canlı görüntüleme için bu zor dönemde meydana gelen niş oluşum mekanizmalarını ortaya çıkarmakla ilgilenmektedir. Bu nedenle, embriyonik Aşama 16'dan başlayarak gonadın canlı görüntüsüne ex vivo bir yaklaşım ürettik ve gonad gelişiminin bu önemli döneminde hücre dinamiklerinin incelenmesini kolaylaştırdık. Laboratuvarımızdan önceki çalışmalar, bu ex vivo görüntülemenin in vivo gonad gelişimi17'yi sadık bir şekilde özetlediğini göstermektedir. Bu teknik, Drosophila embriyonik gonadı için türünün ilk ve tek örneğidir.
Burada, geç embriyonik evrelerde gonadın ex vivo canlı görüntülenmesi için gerekli diseksiyon protokolü sunulmuştur. Bu protokol, farmakolojik tedavilerle veya gonad içindeki spesifik hücre soylarının transgenik manipülasyonu ile birleştirilebilir. Bu tekniği kullanarak, kök hücre niş oluşumunun adımlarını başarıyla görüntüledik17. Bu görüntüleme yaklaşımı, kök hücre biyolojisi alanı için etkilidir, çünkü niş oluşumunun ilk aşamalarının doğal ortamında gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlayacaktır15,17. Bu yöntem kök hücre biyolojisi alanı için faydalı olsa da, hücresel yeniden düzenlemeler 22,hücre yapışması 2,12,23 ve hücre göçü 23 dahil olmak üzere bu gelişimsel zaman noktasında gonadda meydana gelen dinamik süreçleri görselleştirmek için de uygulanabilir. Bu diseksiyon protokolü böylece birçok temel hücre biyolojik süreci hakkındaki anlayışımızı geliştirecektir.

<table><tbody><tr><td>Alfa Aesar Tungsten wire</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA10408G6</td><td>0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;D. melanogaster:&lt;/em&gt; His2Av::mRFP1</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC)</td><td>FBtp0056035</td><td>Schuh, Lehner, &amp;amp; Heidmann, Current Biology, 2007</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;D. melanogaster: nos&lt;/em&gt;-lifeact::tdtomato</td><td>Gift from Ruth Lehmann Lab</td><td></td><td>Lin, Luo, &amp;amp; Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5&#039;- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3&#039;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin&lt;/em&gt;</td><td></td><td>FBtp0083398</td><td>Sano et al., PLoS One, 2012</td></tr><tr><td>Diamond-tipped knife</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Double-sided tape</td><td>Scotch</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GIBCO</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Imaging dish</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0</td></tr><tr><td>Insulin, bovine</td><td>Sigma</td><td>l0516</td><td>Store aliquots at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-955</td><td></td></tr><tr><td>Nytex basket</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Ringer&#039;s solution</td><td></td><td></td><td>2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe&amp;rsquo;s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved</td></tr><tr><td>Schneider&#039;s Insect Media</td><td>GIBCO</td><td>21720-024</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and live-imaging of the late embryonic drosophila gonad

Drosophila melanogaster erkek embriyonik gonad, germ hücresi gelişimi, piRNA biyolojisi ve niş oluşumu dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere gelişim biyolojisinin çeşitli yönlerini incelemek için avantajlı bir modeldir. Burada, in vivo canlı görüntülemenin oldukça etkisiz olduğu bir dönemde gonad ex vivo'yu canlı olarak görüntülemek için bir diseksiyon tekniği sunuyoruz. Bu protokol, embriyoların bir görüntüleme kabına nasıl aktarılacağını, uygun şekilde evrelenmiş erkek embriyoların nasıl seçileceğini ve yapısal bütünlüğünü korurken gonadın çevresindeki dokudan nasıl diseke edileceğini özetlemektedir. Diseksiyonu takiben, gonadlar dinamik hücresel süreçleri görselleştirmek için konfokal mikroskop kullanılarak görüntülenebilir. Diseksiyon prosedürü kesin zamanlama ve el becerisi gerektirir, ancak yaygın hataların nasıl önleneceği ve bu zorlukların nasıl üstesinden gelineceği konusunda fikir veriyoruz. Bildiğimiz kadarıyla bu, Drosophila embriyonik gonad için ilk diseksiyon protokolüdür ve aksi takdirde erişilemeyen bir zaman penceresinde canlı görüntülemeye izin verecektir. Bu teknik, doğal gonadal ortamlarında hücrelerin içinde veya arasında meydana gelen dinamik süreçleri incelemek için farmakolojik veya hücre tipine özgü transgenik manipülasyonlarla birleştirilebilir.

Görüntüleme kabının hazırlanışını Şekil 1'de, "Diseksiyon günü hazırlığı" nda açıklandığı gibi gösteriyoruz. Bu yöntemler nihayetinde, geçici olarak çanağın dibine sabitlenen ve Ringer'ın çözeltisine batırılmış bir kapak kayma şeridine yapıştırılmış iyi nemlendirilmiş embriyolarla sonuçlanmalıdır (Şekil 1F). Elmas uçlu bir bıçak, 22 x 22 mm'lik bir kapak kaymasını üç ila dört küçük şerit halinde temiz bi...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad at JoVE.com

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Burada, geç embriyonik Drosophila erkek gonadını canlı olarak görüntülemek için gerekli bir diseksiyon protokolü sunuyoruz. Bu protokol, normal koşullar altında veya transgenik veya farmakolojik manipülasyondan sonra dinamik hücresel süreçlerin gözlemlenmesine izin verecektir.

Geç Embriyonik Drosophila Gonad'ın Diseksiyonu ve Canlı Görüntülemesi

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

dissection-and-live-imaging-of-the-late-embryonic-drosophila-gonad

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

3.2K Görüntüleme.  University of Pennsylvania. Burada, geç embriyonik Drosophila erkek gonadını canlı olarak görüntülemek için gerekli bir diseksiyon protokolü sunuyoruz. Bu protokol, normal koşullar altında veya transgenik veya farmakolojik manipülasyondan sonra dinamik hücresel süreçlerin gözlemlenmesine izin verecektir.

Video: Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Canlı-görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Gelişim Biyolojisi

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz Disk

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Drosophila Göz hayali Disk Glial Hücre Göç Canlı Görüntüleme

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Biyoloji

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations. In these preparations, the central nervous system runs down the middle, and is flanked by the body walls. Many different phenotypes have been examined using such preparations. In most cases, the fillets were generated by dissection of antibody-stained fixed whole-mount embryos. These "fixed dissections" have some disadvantages, however. They are time-consuming to execute, and it is difficult to sort mutant (GFP-negative) embryos from stocks in which mutations are maintained over GFP balancer chromosomes. Since 2002, our group has been conducting deficiency and ectopic expression screens to identify ligands for orphan receptors. In order to do this, we developed streamlined protocols for live embryo dissection and antibody staining of collections containing hundreds of balanced lines. We have concluded that it is considerably more efficient to examine phenotypes in large collections of stocks by live dissection than by fixed dissection. Using the protocol described here, a single trained individual can screen up to 10 lines per day for phenotypes, examining 4-7 mutant embryos from each line under a compound microscope. This allows the identification of mutations conferring subtle, low-penetrance phenotypes, since up to 70 hemisegments per line are scored at high magnification with a 40X water-immersion lens.

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

We describe a streamlined protocol for generating "fillet" preparations of Drosophila embryos of specific genotypes. This protocol allows efficient execution of a variety of genetic screens. It also allows excellent visualization of structures in the late embryo.

VE Canlı Diseksiyon Drosophila Embriyolar: Aerodinamik Antikor Boyama Mutant Koleksiyonlar Eleme Yöntemleri

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Pupal Evrelerinde Gelişen Drosophila Epitelinde Doku Oryantasyonu ve Büyüme Dinamiğinin Görüntülenmesi ve Analizi

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larvalarından Canlı Beyin Eksplantlarının Görüntülenmesi

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Yazar Gündemi: Asimetrik Hücre Bölünmesi Dinamiğinin Araştırılması: Drosophila Larva Beyin Eksplantlarının Canlı Görüntülenmesi İçin Bir Protokol 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Geç Embriyonik Drosophila Gonad'ın Diseksiyonu ve Canlı Görüntülemesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Canlı-görüntüleme

Uzun süreli Canlı Görüntüleme

Drosophila Göz hayali Disk Glial Hücre Göç Canlı Görüntüleme

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila

VE Canlı Diseksiyon Drosophila Embriyolar: Aerodinamik Antikor Boyama Mutant Koleksiyonlar Eleme Yöntemleri

Pupal Evrelerinde Gelişen Drosophila Epitelinde Doku Oryantasyonu ve Büyüme Dinamiğinin Görüntülenmesi ve Analizi

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches