Çekirdek Hi-C protokolleri, kromatin döngülerinin, etki alanlarının ve genomu düzenleyen bölmenin karakterizasyonu için kromozomal onayın farklı çözünürlükte araştırılmasına izin verir. Bu protokol, genomik etkileşimlerin farklı ölçeklerde yüksek çözünürlüklü profillenerek, daha az teknik gürültü ile tüm genomik mesafeler ve veriler arasında daha tutarlı bir kapsama alanı sağlar. Bu protokolü genetik düzenleme ile birleştirmek, genetik elementlerin yapısal işlevini test etmek için güçlü bir stratejidir.
Hastalığa yol açan yapısal varyasyonların karakterizasyonuna da uygulanabilir. Çekirdek Hi-C protokolü, herhangi bir ökaryotik genomun genom organizasyonunu araştırmak için uygulanabilir. SDS ve Triton tedavisi yapmak, agregalar enzymatic reaksiyon verimliliğini kesintiye uğrattığından ve sıralamadan önce uygun kalite kontrolleri ölçüsünü gerçekleştirdiğinden emin olarak pipetleme ile herhangi bir nükleer kümeyi ayırır.
17,5 mililitre Schneider ortamındaki yedi Schneider's Line 2 Plus Drosophila hücresine bir kere 10'a metanol içermeyen formaldehit ekleyerek başlayın% 2'lik son konsantrasyona% 10 FBS ile desteklenmiş hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca her 60 saniyede bir veya dönen bir tekerlek üzerinde karıştırın, ve karıştırma ile 0.125 azı dişi son konsantrasyona glisin ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika ve buzda 15 dakika sonra, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti 25 mililitre soğuk PBS'de dikkatlice yeniden depolayın ve hücreleri başka bir santrifüjleme ile toplayın. Santrifüjlemenin sonunda, hücreleri saymak için bir mililitre buz soğuk liziz tamponunda yeniden depolayın ve hücreleri mililitre konsantrasyonu başına altı hücreye bir kez 10'a ayarlayın.
Hücreleri buz üzerinde 30 dakika kuluçkaya yatırarak, hücreleri başka bir santrifüjle karıştırmak ve toplamak için her iki dakikada bir tüpü ters çevirin. Peletin bir mililitre taze buz gibi soğuk liziz tamponunda yeniden depolansın. Santrifüjlemeden sonra, lisatı bir mililitre 1.25X kısıtlama tamponu ile yıkayın.
Lisat toplamak için tekrar santrifüj. Peletin 360 mikrolitre taze kısıtlama tamponunda ve %10 SDS'nin 11 mikrolitresinde dikkatli pipetleme ile yeniden süzülün ve 37 santigrat derecede 45 dakika ve zaman zaman pipetleme ile dakikada 7 ila 950 devir inkübe edin. Kuluçkanın sonunda, 75 mikrolitre iyonik olmayan yüzey aktif madde ile permeabilizasyonu durdurun ve tüpü zaman zaman pipetleme ile dakikada 950 devirde sallanarak 45 dakika daha inkübatöre geri verin.
Kromatin sindirimi için, dönüş ile 37 santigrat derecede dört ila 16 saatlik bir inkübasyon için tüpe 200 ünite Mbo1 ekleyin. Kuluçkanın sonunda, enzimi 60 santigrat derecede 20 dakikalık inkübasyonla inaktive edin. Kısıtlama parçası çıkıntılarını doldurmak ve DNA uçlarını biotin ile etiketlemek, 10 milimoler dCTP, dGTP, dTTP, 20 mikrolitre 0,4 milimoler biotin dATP, 17,5 mikrolitre tris düşük EDTA tamponu ve 10 mikrolitre DNA polimeraz başına beş üniteden oluşan 10 mikrolitreyi dikkatli bir karıştırma ile tüpe ekleyin.
Reaksiyonun 75 dakikasını 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve 30 saniye boyunca her 10 saniyede bir dakikada 700 devirde sallayın. Kuluçkanın sonunda, ligasyon karışımını kromatin'e ekleyin ve bir mililitre son reaksiyon hacmine iyice yumuşak karıştırma ile ayarlayın ve 16 santigrat derecede bir gecede kuluçkaya yatırın. Örnek proteinleri bozmak için, 37 santigrat derecede iki saatlik bir inkübasyon için tüpe mililitre proteinaz K başına 10 miligram 50 mikrolitre ekleyin.
Kuluçkanın sonunda, numuneyi çapraz bağlamayı tersine çevirmek için sıcaklığı bir gecede 65 santigrat dereceye çıkarın. Ertesi sabah, mililitre RNAse A.'da mililitre başına 10 miligramlık 10 mikrolitre ile RNA'yı düşürün. DNA'yı standart protokollere göre çökelendirdikten sonra, üreticinin talimatlarına göre SEÇICI olarak DNA'ya ve florometreye bağlanan florojenik bir boya kullanarak DNA'yı ölçün.
DNA'yı sindirilmemiş ve sindirilmiş aliquotlardan arındırmak için, 100 nanogram sindirilmemiş, sindirilmiş ve lige edilmiş numuneyi%1,5 agarose jel üzerine yükleyin ve sindirilmiş örnekte yaklaşık 500 baz çifti ortalanmış bir smear ve ligated örnek için yüksek moleküler ağırlık bandı arayın. Bilinen bir etkileşimin amplifikasyonu ve sindirimi ile Hi-C işaretleme ve ligasyon verimliliğini doğrulamak için, PCR'den sonra, ürünleri Mbo1, Cla1 veya her ikisiyle de sindirin ve örnekleri 3C ve Hi-C ligasyon bağlantılarının göreli sayısının tahmin edilmesine izin vermek için yeni bir % 1,5 ila% 2 jel üzerinde çalıştırın. 200 ila 500 baz çifti DNA parçası elde etmek için numuneyi sonicating sonra, Her örnekten beş mikrogram DNA içeren 130 mikrolitreyi 10X ligasyon tamponunun 16 mikrolitresini, 10 milimolar dATP'nin iki mikrolitresini, beş mikrolitre T4 DNA polimerazını ve 20 santigrat derecede 30 dakikalık bir inkübasyon için yedi mikrolitre çift damıtılmış su içeren yeni mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
Kuluçkanın sonunda, 10 milimoler dNTP'den beş mikrolitre, 10X ligasyon tamponunun dört mikrolitresi, beş mikrolitre T4 polinükleotid kinaz, bir mikrolitre DNA polimeraz bir büyük parça ve 20 santigrat derecede ikinci bir 30 dakikalık inkübasyon için tüplere 25 mikrolitre çift damıtılmış su ekleyin. Parçaları çoğunlukla 250 ila 550 baz çift boyut aralığında seçmek için, 0,6X ile sıralı katı faz geri dönüşümlü ve mobilizasyon boyutu seçimi, ardından üreticinin talimatlarına göre 0,9X gerçekleştirin ve DNA'yı 100 mikrolitre tris düşük EDTA ile elüte edin. Her kütüphane için biotin çekme için, Streptavidin bağlantılı manyetik boncukların 150 mikrolitresini 400 mikrolitre 1X Ara tamponu ile iki kez yıkayın ve numuneleri dönen bir tekerlek üzerinde üç dakika döndürün.
Kuluçkanın sonunda, boncukları 300 mikrolitre 2X ara tamponda yeniden ıslatın ve dönen bir tekerlek üzerinde 30 dakikalık bir dönüş için 300 mikrolitre Hi-C malzemesi ile karıştırın. Kuluçkanın sonunda, boncukları 400 mikrolitre 0,5X Ara tamponu ile 55 santigrat derecede üç dakikalık bir inkübasyon ve dakikada 750 devir için yıkayın, ardından yıkama başına 200 mikrolitre 1X kısıtlama tamponunda iki yıkama. İkinci yıkamadan sonra, boncukları 37 santigrat derecede 30 dakikalık bir inkübasyon için 100 mikrolitre dATP kuyruk karışımında yeniden ıslatın.
Kuluçkanın sonunda, boncukları 50 mikrolitre 1X ligasyon tamponunda yeniden ıslatın ve süspansiyonu dört mikrolitre önceden tavlanmış eşleştirilmiş uç adaptörü ve iki mikrolitre T4 ligase içeren yeni bir tüpe aktarın. Oda sıcaklığında iki saat sonra, süpernatantı çıkarın ve boncukları 400 mikrolitre Ara tamponu ile iki kez yıkayın, ardından boncukları 1X kısıtlama tamponunun 40 mikrolitresinde yeniden askıya almadan önce 200 mikrolitre ara tamponu ile bir kez ve bir kez de 100 mikrolitre kısıtlama tamponu ile yıkayın. Mbo1 ile kısıtlama başarılı olduğunda 200 ila 1.000 baz çifti smear görülür.
Ligasyon başarılı olursa, jelin üst kısmında yüksek moleküler ağırlık bandı görülür. Sindirim verimliliği nicel PCR ile de doğrulanabilir. Kabul edilebilir bir sindirim verimliliği% 80 veya daha yüksektir.
Gösterildiği gibi, Hi-C ligasyon ürünlerinde bilinen bir orta menzilli etkileşimin amplifikasyonu, amplifikasyonda geri kazanılan PCR ürününün sindirimi ile tahmin edilebilir. Sıralamadan sonra kütüphaneler için yararlı olmayan okumaların büyük bir oranına sahip olmamak için% 70'ten fazla bir sindirim verimliliği önerilir. Son amplifikasyon için PCR döngülerinin sayısı, smear'ın görünür olduğu döngü sayısından bir döngü daha az olmalıdır.
Kitaplığın sindirim düzeyi, geçerli Hi-C çiftlerinin bolluğunu gösterir ve kütüphaneden elde edilecek yararlı okumaların oranını yansıtır. Benzersiz geçerli Hi-C çiftleri kullanılarak, çift dağılımının temel analizi yapılabilir. Bu temsili örnekte de görüldüğü gibi, NOTCH gen lokusu, lokus boyunca mimari proteinler, etki alanları bir ve iki ve histon değişiklikleri ile birlikte görülebilir.
Hem CTCF hem de M1BP DNA bağlama bölgelerini içeren bölgenin silinmesiyle kromatin kontaklarında çarpıcı bir değişiklik gözlenebilir. Hi-C deneyinden sonra, örneğin organizatör bölgelerinden belirli bir kişi kümesine ulaşmak için bir gerçekleştirilebilir. Bu özellikle büyük genomları değerlendirirken yararlıdır.
Gösterildiği gibi, Hi-C protokolünü genetik ekleme ile birleştirmek, genomik elementlerin yapısal ve düzenleyici işlevini değerlendirmek için kullanılabilir.
