Yazarlar tarafından NIH RHC için fon sponsorluk kabul vermek #' s: AI095382, EB021230, CA198880, Ulusal Enstitüsü gıda ve tarım gibi Finlandiya ayırt edici Profesör programı.

1. HEVNP üretim böcek hücrelerinde
Not: Tüm aşağıdaki adımları bir hücre kültür mahallede gerçekleştirilmesi gerekiyor. Bizim önceki yayın için daha ayrıntılı HEVNP üretim işlemleri11bakın.
<ol><li>Kültür Sf9 böcek hücrelerinde ( Tablo malzemelerigörmek) Medya 50-%75 izdiham içinde 6-şey plakaları için hücre.</li>
	<li>Böcek hücre transfection reaktifler göre üreticinin iletişim kurallarını kullanarak, rekombinant baculovirus üretmek için Bacmids HEVNP - 573C ORF2 Sf99 hücrelere içeren transfect. 27 ° C'de transfected hücreleri hücre canlılığı bağlı olarak 3-6 gün kuluçkaya.</li>
	<li>(Transfected hücre baculovirus enfeksiyon nedeniyle lysed sonra), 3-6 gün sonrası enfeksiyon süpernatant P0 baculovirus stok olarak toplamak.</li>
	<li>Kültür orta % 50-75 Konfluent Sf9 hücrelerde bir 25 cm2 monolayer şişesi 200 µL P0 stokunun uygulamadan önce kaldırın. Şişeye her 15dk inoculum tam kapsama sağlamak için rock. 4 kez, toplamda 60 dk için yineleyin.</li>
	<li>Böcek hücre kültür orta 2 mL şişe için ekleyin ve canlılığı hücre baculovirus için daha yüksek bir titresi yükseltmek için bağlı olarak 3-6 gün için 27 ° C'de tutun.</li>
	<li>12okuma baculovirus titresi elde etmek için plak deneyleri taşımak.</li>
	<li>Böcek cep orta 250 mL şişe 100 mL ile askıya alınmış Tn5 böcek hücreleri (Tablo reçetesi) kültür ve 150 devirde titresi 0.5 x 10 için 27 ° C'de sallamak5 - aşılama için 1 x 106 .</li>
	<li>Baculovirus enfeksiyonu (MOI) çokluğu, 5-10-100 mL Tn5 hücrelerinin bir 250 mL şişe ekleyin. Aşı sonra 150 rpm'de 27 ° C'de 5-7 gün için salla.</li>
	<li>Bir kez en hücreleri veziküller sahip gibi görünmesine ve hücrelerin % 70-90 optik mikroskop gözlem altında ölü, Tn5 hücreleri toplamak ve 33 mL ultracentrifuge tüpler içine aktarmak. 10.000 x g için 25 ° C'de 90 dk de kova rotor, denge ve hücre artıkları ve rekombinant baculoviruses aşağı spin sallanan içinde yer ultracentrifuge tüpler</li>
	<li>Daha fazla arıtma 4 ° C'de yayımlanan HEVNPs içeren süpernatant tutun. Baculovirus süpernatant genişletilmiş depolama için proteaz inhibitörleri ekleyin.</li>
</ol>2. HEVNP arıtma
<ol><li>Cips ve sezyum klorür (CsCl) degrade ayrımı yöntemi kullanılarak HEVNPs izole:<ol>
<li>Toplanan süpernatant nakletmek (adımından 1,10) ve % 20 eklemek NP-%40 0,5 son bir konsantrasyon yapmak her tüpün içine geri kalan herhangi bir hücresel membran çözülmeye NP-40. Yavaşça pipetting tarafından mix ve en az 30 dk. 25 ° C'de için kuluçkaya</li>
		<li>Ultracentrifuge HEVNPs süpernatant üzerinden aşağı cips için kova rotorlar için 2 h 4 ° C'de sallanan içinde 112,400 x g de HEVNPs. Süpernatant Santrifüjü sonra atmak ve yavaşça ham Pelet 200 µL her tüp gecede 10 mM MES tampon pH 6.2 (O/N) 4 ° C'de yeniden askıya yılında SDS-52 kDa grup olarak ham Pelet içinde HEVNP ORF2 varlığını doğrulamak için sayfayı (Adım 3.1) çalıştırın.</li>
		<li>% 38.5 (w/v) CsCl degrade karıştırma 1.96 g CsCl, yeniden askıya alınmış ham Pelet ve ~ 4 mL 5 mL ultracentrifuge tüp içinde 0.01 M MES pH 6.2 hazırlayın. Tüpler dengelemek ve sallanan bir kova rotor yerleştirin. Ultracentrifuge 147000 x g 4 ° C'de 16 h için de</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kesirler CsCl degrade sonra toplamak:<ol>
<li>Öncelikle hafif hücre zarı enkaz olan en iyi 500 µL kesir, atın. Tüp, en baştan başlayarak 500 µL kesirleri toplamak ve ipuçları her kesir arasında değiştirin. Her kesir numaralı/etiketli 1,5 mL tüpler içine yerleştirin. Not: Varlığı HEVNP ORF2 kesirler degrade jelleri CsCl yüksek konsantrasyon nedeniyle SDS sayfa çalıştırarak tespit edilemez CsCl ayrılmış. CsCl her kesir kaldırılabilir veya CsCl temizlik yordamı izleyerek seyreltilmiş. Alternatif olarak, CsCl gradyan CsCl arta kalan önlemek için bir 10-%40 Sükroz degrade13 tarafından değiştirilebilir.</li>
		<li>5 mL ultracentrifuge tüp her kesir aktarmak ve CsCl ile 4.5 mL 10 mm MES, pH 6.2 oranında seyreltin. Tüpler dengelemek ve sallanan bir kova rotor yerleştirin. Ultracentrifuge 147000 x g 4 ° C'de HEVNPs cips için 2 h için de.</li>
		<li>Süpernatant atın ve yavaşça HEVNPs 10 mM MES pH 6.2 her tüp 100 µL yeniden askıya. Tüpler buharlaşma önlemek ve O/N 4 ° C'de kuluçkaya kapak</li>
		<li>A280 okuma ve A260/A280 nm oranı bir Spektrofotometre kullanarak kaydedin. ORF2 yaklaşık konsantrasyonu belirlemek: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57020/57020eq1.jpg"> Her ORF2 1 Cys ve kimyasal konjugasyon için 1 Lys siteleri içerir. Not: 1.019 mg/mL × A280 eşdeğer olan 60,280, HEVNP ORF2 molar tükenme katsayısı dür. 1:1 yakın bu böyledir bu HEVNPs konsantrasyon (mg/mL içinde) A280 ve bu nedenle, ORF2 konsantrasyon yukarıdaki denklem tarafından yaklaşık. Örneğin, bir HEVNP bir A280 okuma 1 ile 1 mg/mL, 18.8 µM için eşdeğeri olan bir konsantrasyon olacaktır ORF2.</li>
		<li>SDS-sayfa hazırlamak. Her kesir 6 µL örnekten 53,3 kDa HEVNP ORF2 protein (Adım 3.1) içeren kesirleri belirlemek için kullanın. HEVNPs kesirler 3-5, yoğunluklu olarak ~1.25 g/mL bulundu.</li>
		<li>Varlığı ve HEVNPs saflık TEM gözlem tarafından onaylayın. Hazırlamak veya HEVNP örnekleri için 0.5 - 2.0 mg/mL TEM için sulandırmak. HEVNPs boş icosahedral proteinleri olarak ~ 27 TEM içinde görünür nm çapında (Şekil 2). Bazı protein kirletici kesirler içinde kalabilir ve TEM (Adım 3.2) altında gözlenir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yabancı maddelerin TEM altında mevcut durumda 2.1.3 - 2.2.6 daha iyi HEVNPs saflığı için adımları yineleyin. Not: Ekstra arıtma CsCl gradyan ile HEVNPs verim kaybına neden olabilir. Alternatif olarak, CsCl degrade arıtma arta kalan CsCl13önlemek için % 10-40 Sükroz degrade tarafından değiştirilebilir.</li>
</ol>3. HEVNP karakterizasyonu
<ol><li>SDS sayfa 4-%12 Bis-Tris Protein jelleri, 1.0 mm, kullanıcının el ile14göre 17-wells ( Tablo malzemelerigörmek) hazırlayın:<ol>
<li>4 x 6 µL protein örneği arabelleğe yükleme 2 µL ekleyin. Örnek karışımı bir ısı blok 100 ° C'de protein denatüre için 10 dakika içinde kuluçkaya. Protein örnekleri jel üzerine yükleyin.</li>
		<li>SDS-sayfa 100 V 10 dk, 1 cm alt jel yukarıda örneklerini çalıştırma kadar 45 dk sonra 150 V DC güç kaynağı ayarlayarak çalıştırın.</li>
		<li>Leke SDS sayfa jel Coomassie mavi (% 0.25 (w/v) Coomassie parlak mavi R250, %30 (v/v) metanol, % 10 (v/v) Asetik asit), 1 h için.</li>
		<li>Sonra boyama yordam Coomassie mavi leke kaldırmak ve uygulamak için protein jel üzerine de-boyama arabellek (%30 (v/v) metanol, % 10 (v/v) Asetik asit) > oda sıcaklığında 12 h.</li>
		<li>Jel 52 kDa band, HEVNP ORF2 varlığını doğrulamak için beyaz ışık altında belge.</li>
	</ol>
</li>
	<li>TEM kullanarak HEVNPs gözlemlemek.<ol>
<li>Hazırlamak veya HEVNP örnekleri için 0.5 - 2 mg/mL ile TEM görüntüleme için 10 mM MES pH 6.2 oranında seyreltin.</li>
		<li>40 mA kızdırma deşarj için 30 ile karbon kaplı Izgaralar iyonize hidrofilik karbon yüzey üretmek için s. Kızdırma boşaltma ekipmanları Malzemeleri tabloaçıklanmıştır. Not: Kılavuzlar hidrofilik karbon yüzeyinde sadece son 30 dakika sonra parlaklık için tedavi akıntı.</li>
		<li>Cımbız içinde tutun ve HEVNP örnek 2 µL tasarım kılavuzuna ekleyin, 15-30 s için bekleyin ve filtre kağıdı ile leke.</li>
		<li>Hemen GKD20 kılavuzla ve leke filtre kağıdı ile yıkayın.</li>
		<li>Hemen kılavuz, bekle 15 s sonra leke filtre kağıdı ile 2 µL % 2 uranyl asetat ekleyin. Kuru bir elektronik koyarak onları örnek Izgaralar kuru kabine O/n için Ceketinizi</li>
		<li>Izgarayı TEM ve resim 10-80 k büyütmede içine aktarın. HEVNPs ~ 27 çoğu boş icosahedral proteinleri olarak TEM içinde görünür nm çapında, viral RNA yokluğu nedeniyle.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. kimyasal konjugasyon Biotin, kanser hedefleme Ligand ve Fluorophores ile HEVNPs
<ol><li>HEVNPs ve maleimide bağlı biotin bir adım konjugasyon gerçekleştirin.<ol>
<li>Tampon Değiştir: HEVNPs mini diyaliz birimlerinde uygulamak ve 0.01 M PBS pH 7.4 üreticinin iletişim kuralı (Tablo reçetesi) göre 1 h için oda sıcaklığında karşı diyaliz. HEVNPs 1.5 mL tüpler için aktarmak ve protein konsantrasyonu 280 ölçmek bir Spektrofotometre kullanarak nm.</li>
		<li>(Bkz. Adım 2.2.4 ayrıntılarda) Cys tepki siteleri, maleimide-biotin (100 µM) 1:5 molar oranı yapmak için 0,01 M PBS, pH 7.4, eşit miktarda 18.8 µM eşdeğeri olan 1 mg/ml HEVNP karıştırın; O/N 4 ° C'de tepki İlişkisiz maleimide-biotin üreticinin iletişim kuralı (Tablo reçetesi) göre 40 K MWCO Spin Desalting sütun yordamı ile kaldırın.</li>
		<li>SDS-sayfa (Adım 3.1) küçültme bir standart ile örnekleri analiz.</li>
		<li>Standart prosedürler kullanarak, HRP bağlantılı Streptavidin kullanarak leke, chemiluminescent bir Western hazırlayın. Chemiluminescent sinyal tarafından X ray film (Şekil 2) yakalama.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İki adım LXY30 konjugasyon yüzey maruz sistein HEV NPs (şekil 5) gerçekleştirin.<ol>
<li>Arabellek Satım: HEVNPs mini diyaliz birimlerinde uygulamak ve 0.01 M PBS pH 7.4 oda sıcaklığında 1 h. 1,5 mL tüpler HEVNPs aktarmak için karşı diyaliz ve ölçmek protein konsantrasyonu 280 nm bir Spektrofotometre kullanarak.</li>
		<li>0,01 M PBS pH 7.4 200 µM CuSO4 ve 1 mM askorbik maleimide bağlı LXY30 oluşturmak için asit ile 650 µM maleimide-azid ve 650 µM ALKİN-LXY3010 ekleyin (Mal-LXY30) kuluçkaya 650 µM. 4 ° C'de karışımı O/n için</li>
		<li>Cys tepki sitesi 18.8 µM için eşdeğeri olan 1 mg/ml HEVNP mix (bkz. Adım 2.2.4 ayrıntılarda) yaklaşık % 10 ile Mal-LXY30 hacmi (650 µM) 1:3 molar oranı; yapmak için 0,01 M PBS pH 7.4, içinde O/N 4 ° C'de tepki Not: Mal-LXY30 nispeten yüksek konsantrasyon nedeniyle, 10 kat, onların zarar HEVNPs görmesini önlemek için karıştırma sonra Reaktanları CuSO4gibi son konsantrasyonları azaltılır. Başka bir seçenek Cu-Alerjik konjugasyon yöntemi15' tir.</li>
		<li>Kaldır bağlantısı çözülmüş maleimide-tıklayın-LXY30 bir sütunla 40 K MWCO Spin Desalting üreticinin protokolüne göre ( Tablo malzemelerigörmek). 4 ° C'de LXY30 bağlı HEVNPs (LXY30-HEVNPs) tutmak</li>
	</ol>
</li>
	<li>LXY30-HEVNPs ve Cy5.5 NHS ester (NHS-Cy5.5) bir adım konjugasyon gerçekleştirmek<ol>
<li>Cys tepki sitesi 18.8 µM için eşdeğeri olan 1 mg/ml LXY30 bağlı HEVNPs (LXY30-HEVNPs) mix (bkz. Adım 2.2.4 ayrıntılarda) NHS-Cy5.5 eşit hacmi ile (100 µM) 0.01 M PBS pH 7.4 1:5 molar oranı; yapmak içinde O/N 4 ° C'de tepki</li>
		<li>Kaldır bağlantısı çözülmüş Cy5.5-NHS bir 40K Spin MWCO Desalting sütun yordamını üreticinin protokolüne göre ( Tablo malzemelerigörmek). LXY30, Cy5.5 bağlı HEVNPs 4 ° C'de (LXY30-HEVNP-Cy5.5) tutmak</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. HEVNP bağlama ve MDA-MB231 meme kanseri hücrelerinin içselleştirilmesi
<ol><li>Tohum MDA-MB231 meme kanseri hücrelerinin içine bir 35 mm cam alt yemekleri (5 x 104 tabak başı) O/N kabine bir memeli hücre kültüründe.</li>
	<li>Hücre bağlama deneme için LXY30-HEVNP-Cy5.5 tarafından aşağıdaki adımları 4.2-4.3 hazırlayın. LXY30-HEVNP-Cy5.5 HEVNP ORF2 0,188 µM için eşdeğerdir 0.01 mg/ml seyreltik (2.2.4 adıma bakın), 0 - 250 µL içinde % 1 FBS/DMEM.<ol>
<li>Negatif kontrol örneği 0.01 mg/mL HEVNP-Cy5.5 adımı uygulayarak 4.3 konjuge NHS-Cy5.5 boya sadece, (HEV-Cy5.5) ama'hazırlayın. HEVNP-Cy5.5 HEVNP ORF2 0,188 µM için eşdeğerdir 0.01 mg/ml seyreltik (2.2.4 adıma bakın), %250 10 µL içinde FBS DMEM ile desteklenmiştir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreleri bir kez 1 M PBS tamponunun pH 7.4 250 µL uygulayarak yıkayın. Hücre kültür tabak içinde bazı arabellek tutarken yıkama sonra PBS arabellek kaldırın.</li>
	<li>LXY30-HEVNP-Cy5.5 250 µL % 10 FBS FBS kültürlü MDA-MB231 meme kanseri hücreleri için DMEM ile birlikte % 10 DMEM veya HEVNP-Cy5.5 ile desteklenmiş uygulanır. Kalkan hücre ışık alüminyum folyo ile gelen yemekler kültürlü.</li>
	<li>Kültürlü hücre yemekleri bir 37 ° C hücre kültüründe içselleştirilmesi için 1 h için kabine tutun.</li>
	<li>Buz kültürlü hücrelerdeyse 3 kez, yıkama, 1 M PBS, pH 7.4 250 µL ile başına 5 dk yıkayın.</li>
	<li>% 4 hücreleri tamir PFA 1 M PBS, pH 7.4 20 min ve o zaman yıkama için 1 M PBS, pH 7.4 250 µL hemen ile içinde. Not: Hücreleri tarafından confocal mikroskop yansıması hazırsınız. Temsilcisi veri şekil 5' te gösterilmektedir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ludwig, C., Wagner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-like+particles-universal+molecular+toolboxes.">Virus-like particles-universal molecular toolboxes.</a> Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).</li><li>Galaway, F. A., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS2+viruslike+particles:+a+robust,+semisynthetic+targeted+drug+delivery+platform.">MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform.</a> Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).</li><li>Ma, Y., Nolte, R. J., Cornelissen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-based+nanocarriers+for+drug+delivery.">Virus-based nanocarriers for drug delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 64 (9), 811-825 (2012).</li><li>Chen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+activatable+viral+capsid+functionalized+for+cancer+targeting.">Chemically activatable viral capsid functionalized for cancer targeting.</a> Nanomedicine (Lond). 11 (4), 377-390 (2016).</li><li>Jariyapong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+hepatitis+E+virus-like+particle+as+a+carrier+for+oral-delivery.">Chimeric hepatitis E virus-like particle as a carrier for oral-delivery.</a> Vaccine. 31 (2), 417-424 (2013).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+hepatitis+E+capsid+protein+self-assembles+into+a+dual-domain+T+=+1+particle+presenting+native+virus+epitopes.">Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes.</a> Virology. 265 (1), 35-45 (1999).</li><li>Li, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+elements+of+the+capsid+protein+for+self-assembly+into+empty+virus-like+particles+of+hepatitis+E+virus.">Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus.</a> J Virol. 79 (20), 12999-13006 (2005).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+hepatitis+E+virion-sized+particle+reveals+an+RNA-dependent+viral+assembly+pathway.">Structure of hepatitis E virion-sized particle reveals an RNA-dependent viral assembly pathway.</a> J Biol Chem. 285 (43), 33175-33183 (2010).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+configuration+of+hepatitis+E+virus+antigenic+domain.">Spatial configuration of hepatitis E virus antigenic domain.</a> J Virol. 85 (2), 1117-1124 (2011).</li><li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+characterization+of+a+high-affinity+and+high-specificity+peptide+ligand+LXY30+for+in+vivo+targeting+of+&#945;3+integrin-expressing+human+tumors.">Discovery and characterization of a high-affinity and high-specificity peptide ligand LXY30 for in vivo targeting of &#945;3 integrin-expressing human tumors.</a> EJNMMI research. 6 (1), (2016).</li><li>Li, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+self-assembly+of+empty+virus-like+particles+of+hepatitis+E+virus.">Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus.</a> J Virol. 71 (10), 7207-7213 (1997).</li><li>Peyret, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+gentle+purification+of+virus-like+particles+produced+in+plants.">A protocol for the gentle purification of virus-like particles produced in plants.</a> J Virol Methods. 225, 59-63 (2015).</li><li>Technologies, N. b. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vol. MAN0007891 1-2. , (2013).</li><li>Baskin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-free+click+chemistry+for+dynamic+in+vivo+imaging.">Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (43), 16793-16797 (2007).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip bildirin.

Genellikle hafta sürer, zaman alıcı genetik mühendisliği yordamı aksine burada biz basit iki adım ve ligand hedefleme kanser ekleme 3 gün içinde tamamlanabilir tek adımlı kimyasal konjugasyon yordamlar göstermek ve/veya Floresans algılama boya HEVNPs Cys/Lys sitelerine. Teknik-ebilmek var olmak kullanılmış için en iyi ligand hedef ekran aday havuzu ve böylece mevcut peptit/küçük molekül sentezi Hizmetleri makul maliyet ve teslimat teker yararlanır.
Geleneksel genetik hangi yalnızca polipeptitler faiz proteinlerin ekleyebilirsiniz, Mühendisliği, polipeptitler, küçük kimyasal moleküller ve nano-parçacıklar yüzeyinin gibi çeşitli malzemelerin kimyasal konjugasyon bağlanabilir protein ilgi, reaktif site olarak kullanılmak üzere Cys veya Lys bir kalıntı olarak uzun. Kimyasal konjugasyon sitesinde böyle bir kalıntı ise, kimyasal olarak alınabilen önceki araştırma4' te gösterildiği gibi kazanmak için faiz protein üzerinde basit Cys/Lys değiştirme genetik olarak değiştirilebilir.
Bunu kontrol etmeyi kimyasal oluşun sadece eşlenik molekül ve iyice intramolecular reaktivite önlemek için belirlenmesi için konjuge ihtiyaç için protein yapısını seçmeli reaksiyon sitelerinde oluşur. Peptid LXY3010hedefleme meme kanseri ile burada gösterildiği gibi bir kritik disülfür bağ döngüsel ligand conformation stabilize. Maleimide, doğrudan maleimide-functionalization LXY30 ligandlar, thiol reaktivite olacak büyük olasılıkla neden intramolecular reaktivite göz önüne alındığında. Bunun yerine, iki adım konjugasyon (Adım 4.2) ALKİN bağlı LXY30 aracılığıyla tıklayın kimya reaksiyon ile maleimide bağlı azid tepki tarafından gerçekleştirildi. Ancak, tıklama kimya reaksiyon ve reaksiyon thiol tarafından seçilen dizisi LXY30-HEVNPs (şekil 4) konformasyon intactness için önemlidir. CuSO katalize4 tıklayın-kimya reaksiyon LXY30 dolaylı olarak MaI-LXY30 inşa etmek için maleimide belliydi. Daha sonra MaI-LXY30 Birleşik C-HEVNP - 573 böyle kurulan LXY30 HEVNPs yerli icosahedral yapılarını (şekil 4) koruyabilirsiniz.

Nano ölçekli vektörel çizimler nanotheranostics bilinen tedavi ve teşhis teslimat gelişimi çok hedeflenen teslimat1doğru Genelleştirilmiş tedaviler uzak Biyomedikal alanının kaymıştır. Hedeflenen nanotheranostic teslim stabil bir belirli hastalıklı doku ya da biyokimyasal yol2,3,4 theranostic moleküller doğrudan theranostic molekülleri ile nano ölçekli vektörel çizimler (nano tanecikleri) entegre . Çünkü en iyi şekilde ölçekli nano tanecikleri kapasite theranostic molekülleri ise stabilize ve seçmeli olarak hedef hücre yüzey molekülleri hastalıklı dokuları üzerinde sunulan Nanomedicine hedeflenen teslimat ön plana geldi. Birçok nanotheranostic platformlar hala pasif hücre alımı, ön-olgun bozulması, toksisite ve yetersiz Derneği theranostic molekülleri ile muzdarip. VIP birçok hedeflenen teslimat bu engelleri aşmak. Bunlar nanocarriers yabancı epitopları görüntülemek ve/veya küçük moleküller teslim için kullanılmıştır: birçok hastalıkları1mücadele için kullanılan bir rejimi. Bu uygulama ağırlıklı olarak mülkiyeti üzerinde dayanır kendinden montajlı yanı sıra verilen VIP için tasarlanmış uygulama yerine getirmek için genetik değişiklikler kolaylığı. Genetik mühendisliği için karşılaştırıldığında, VIP için yabancı peptidler kimyasal konjugasyon varlıklar, peptidler veya VIP yüzeyine içinde bir modüle Birleşik oligosakkaritler, gibi çok çeşitli izin verdiği için önemli bir avantaj görüntüler ve esnek şekilde VIP derleme değişiklik olmadan.
HEVNPs, rekombinant HEV kapsid protein, 2nd açık türetilen çerçeve (ORF2) okuma, bulaşıcı olmayan, kendi kendine capsids giriş ve hücre-bağlama verebilir montaj. HEV Mukozal iletimi için evrim çünkü monte kapsid protein proteolitik ve asidik Mukozal koşulları5' te aynı şekilde stabil. HEVNPs içi boş, T şeklinde depolama ve hem de sert fizyolojik koşulları son derece kararlı işleme oluşan 60 aynı birim6,7 , ORF2, / 1 icosahedral kapsid, =. Herhangi bir virüs genetik öğe eksik, verimli, yüksek verim üretim baculovirus ifade sistem böcek hücrelerinde yoluyla elde edilir. Onların proteolitik istikrar nedeniyle, kendi kendine monte HEVNPs çıkarılan ve süpernatant cep gerekli arıtma adımları önemli ölçüde azaltarak saf. Ayrıca, HEVNPs kararlı bir icosahedral üs için esnek bir menteşe ile bağlı bir yüzey maruz çıkıntı etki (P) sahip. Esnek menteşe, önemli temel icosahedral yapısı ödün vermeden P etki alanı değiştirmek olanak verir iken yüzey maruz sivri icosahedral Bankası üstüne P etki alanı oluşturur. 60 tekrarlanan birimleri ile kimyasal modülasyon için 60 simetrik siteleri tek siteye özgü değişiklik sonuçlanır. Son zamanlarda, bir nano-platform önerilen kimyasal ligandlar veya theranostic uygulamalar için küçük moleküller eşlenik HEVNP kullanarak. Bu tek bir amino asit ile sistein HEV-VIP çıkıntı etki tepki site maleimide bağlı peptidler veya molekül ile değiştirerek sağlanır. HEV-VIP ve iyi okudu immünojenik epitopları8,9önceki yapısal çözümleme bağlı olarak, aşağıdaki beş HEV-VIP amino asitler olarak potansiyel adaylar sistein ile değiştirildi: Y485C, T489C, S533C, N573C ve T586C ( Şekil 1). İfade ve arıtma böcek hücrelerden sonra onların VIP oluşumları transmisyon elektron mikroskobu (TEM) gözlem (Şekil 2) tarafından teyit edildi ve maruz sistein siteleri Western tarafından analiz edildi leke maleimide bağlı biotin sonra fiil (Şekil 2). Beş mutantlar arasında HEVNP - 573C maleimide-biotin konjugasyon (Şekil 2) en güçlü sinyal göstermek ve nanocarrier meme kanser hücresi4 (şekil 3) hedefleme için gücümüzü izleme için kullanıldı.
Bu iletişim kuralı tümör hedefleme molekülleri HEVNPs için yüzey sistein konjugasyon eklemek için kimyasal konjugasyon yöntemleri gösterilmektedir. Rekombinant HEVNPs içeren N573 adlı bir sistein ile tümör hedefleme ve algılama molekülleri'tümör dır konjugasyon detay (HEVNP - 573C). Peptid, forma LXY30-HEVNP (şekil 4) LXY3010 HEVNPs için hedefleme meme kanser tümörü bağlamak için bir tıklama kimya konjugasyon işlemdir üzerinde duruldu. Daha sonra N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 LXY30-HEVNP-Cy5.5 floresan algılama için her iki vitro (şekil 5) oluşturmak için HEVNPs ayrı Lys ücreti için Birleşik ve içinde vivo4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="984">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:391px;">MINI Dialysis Units, 10K MWCO</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:265px;">69572</td>
			<td style="width:167px;">mini dialysis unit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Five Cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B85502</td>
			<td>Tn5 cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SF9 Cells&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11496015</td>
			<td>Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11101, A11100</td>
			<td>Baculovirus expression system</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024</td>
			<td>Bacmid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ESF921 Insect Cell Media</td>
			<td>Expression Systems LLC</td>
			<td>96-001-01</td>
			<td>insect cell media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cy5.5 NHS ester, 5mg</td>
			<td>Lumiprobe Corp</td>
			<td>27020</td>
			<td>Cy5.5 NHS ester</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>87766</td>
			<td>spin desalting column</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemical Co</td>
			<td>M8250-250G</td>
			<td>MES</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc</td>
			<td>Depends on Rotor</td>
			<td>ultracentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NPO321BOX</td>
			<td>SDS protein gel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellfectin II Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10362100</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:391px;">EMS Glow Discharger</td>
			<td style="width:161px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td>glow discharger</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface functionalization of hepatitis e virus nanoparticles using chemical conjugation methods

Virüs gibi parçacıklar (VIP) nanocarriers yabancı epitopları görüntülemek ve/veya algılama ve çeşitli hastalıkların tedavisinde küçük moleküller teslim etmek için kullanılmaktadır. Bu uygulama üzerinde genetik değişiklik, kendinden montajlı dayanır ve sistein konjügasyon, rekombinant VIP'ler. tümör hedefleme uygulama yerine getirmek ile genetik karşılaştırıldığında yabancı peptidler VIP'ler için değişiklik yalnız, kimyasal konjugasyon sunar bir önemli avantaj varlıkları, sentetik peptidler veya oligosakkaritler VIP yüzeye bir modüle edilmiş ve esnek şekilde VIP derleme değişiklik olmadan Birleşik, gibi çeşitli sağlar çünkü.
Burada, biz nasıl hepatit E virüs nanopartikül (HEVNP), bir modularized theranostic kapsülü, bir çok fonksiyonlu teslim taşıyıcı olarak kullanıldığını göstermektedir. HEVNPs fonksiyonlar doku hedefleme, görüntüleme ve tedavi teslim. HEVNP köklü yapısal araştırmaya dayalı, yapısal olarak bağımsız ve yüzey Günese maruz kalan artıkları sistein yerine konjugasyon siteleri maleimide bağlı kimyasal gruplar thiol seçici bağlantıları üzerinden için seçildi. Belirli bir sistein-modified HEVNP (573, asparagine Cys yerine aa (HEVNP - 573C)) için bir meme kanseri hücre özgü ligand, LXY30 Birleşik ve tümör hedefli işleme yakın kızılötesi (Nur) floresan boya ile (Cy5.5), etiketli Etkili tanı kapsül (LXY30-HEVNP-Cy5.5) olarak HEVNPs. Benzer mühendislik stratejileri tanınmış atomik yapıları ile diğer makromoleküllerin kompleksleri ile theranostic teslim potansiyel uygulamalar keşfetmek için istihdam edilebilir.

HEV-VIP, benzer tüm Cys oluşan HEVNPs çözünür icosahedral capsids değiştirilebilir ve çözümde üretim veya arıtma sırasında toplam değil. Önce ve sonra tek adım maleimide-biotin konjügasyon, her biri Cys modifiye HEVNPs HEV-VIP negatif leke EM (Şekil 2) içinde ayırdedilemez. Maleimide-biotin konjugasyon verimliliği Cys değiştirilmiş HEVNPs ilk Batı chemiluminescent streptavidin bağlama yoluyla kurutma ile test edildi. Maleimide-biotin oluşun Cys görüntülenen HEVNPs streptavidin bağlama sinyalleri (Şekil 2) değiştiren.
Etkili iki aşamalı sistein konjugasyon içinde konjugasyon yürütülen sipariş etkilendi. Α3β1 integrin çünkü overexpressed meme kanseri tümör hücrelerinde, sentetik bir ligand, LXY30, α3β1 için belirli benzeşimli10, seçildi bir tümör hedefleme eşlenik molekül. Çünkü LXY30 cyclized bir cins disülfür bağ üzerinden doğrudan maleimide (MaI) functionalization LXY30, mümkün değildi; Bu nedenle, self-reactivity için bir endişe oldu. Bunun yerine, LXY30 bir ALKİN grupla birlikte functionalized ve maleimide-azid tıklayın kimya reaksiyon ile bağlı. Ne zaman HEV - 573 C NPs ilk maleimide-azid için bağlı idi, LXY30-ALKİN, bir tıklama kimya tepki ardından HEV - 573C NPs TEM gözlem (şekil 4 c) altında sökmeye ortaya çıktı. Ancak, ilk tıklama kimya reaksiyon LXY30-ALKİN ve maleimide-azid arasında forma MaI-LXY30, MaI LXY30 konjugasyon tarafından Cys-modified HEVNPs (LXY30-Mal-Cy5.5) takip yapısı (şekil 4B) etkilemedi. Şekil 4 tümör hücre hedefleme için LXY30-functionalization HEVNPs, bir şeması gösterilmektedir.
Ligand, LXY30 hedefleyen meme kanseri Birleşik HEVNPs (LXY30-HEVNPs) bağlı ve kültürlü meme kanseri hücrelerinin içselleştirilmiş. Floresan algılama, LXY30-HEVNPs ve ilişkisiz HEVNP-573Cs ile olarak etiketlenmiş için NHS aracılığıyla lizin HEVNP üzerinde birincil Amin kaplin Cy5.5 floresan boya (NHS-Cy5.5) functionalized-573Cs. LXY30-HEVNP-Cy5.5 ve HEVNP-Cy5.5 için kültürlü uygulandı meme kanseri (MDA-MB-231) hücreleri ve confocal mikroskobu tarafından görülmektedir. NIR Floresans görüntüleri confocal mikroskop ile LXY30-HEVNP-Cy5.5 için ilgi ve artan içselleştirilmesi MDA-MB-231 meme kanseri hücreleri (şekil 5) HEVNP-Cy5.5 ile karşılaştırıldığında daha yüksek bağlama vardı gösterir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57020/57020fig1.jpg"> Şekil 1: hepatit E virüs nanopartikül yüzey çıkıntı etki alanındaki sistein yerine. Sistein mutasyonlar artıkları Y485, T489, S533, N573 ve T586 esnek bobin bölge, rahatsızlık HEV ORF2 ikincil yapısına en aza indirmek için için evlenme teklif(a). Sistein mutasyon için seçili artıkları çıkıntı (P) etki alanı yüzeyde bulunan (gri; diğer etki alanları olan kabuk (S) - etki alanında mavi ve orta (M) - pembe etki alanı), Y485 (camgöbeği), T489 (sarı), T586 (turuncu) dıştaki üzerinde kalıntı ile yüzey ve kalıntı S533 (macenta) ve N573 (kırmızı) HEVNP (B) kat ekseninin bakan tarafında. Rakam Chen vd. 20164 izni ile değiştirildi. <a href="/files/ftp_upload/57020/57020fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57020/57020fig2.jpg"> Resim 2: bir örnek için tüm Cys HEVNPs değiştirilmiş olarak N573C taşıyan HEVNP karakterizasyonu. HEVNP - 573C küresel tahminler üzerinde elektron Filmler(a)olarak ortaya çıktı ve Mal-biotinylating fiil (B) sonra sağlam tanecik olarak kaldı. Cys-modified HEVNPs fiil ve epitope pozlama temsilcisi sonuçları. Onlar maleimide-biotin için sistein-maleimide bağlantı üzerinden bağlı ve daha sonra Western blot streptavidin bağlama için aracılığıyla denetlesinler. Sistein mutasyon N573, verimli biotinylation karşılaştırıldığında diğer mutasyon siteleri, Yani, Y485, T489, S533 ve T586 için HEVNP için izin (C). Eşittir 100 nm Bar. <a href="/files/ftp_upload/57020/57020fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57020/57020fig3.jpg"> Şekil 3: özellikle Cy5.5 etiketli LXY30-HEVNPs ile (LXY30-HEVNP-Cy5.5) hedef meme kanser hücrelerinin şematik. LXY30-HEVNP-Cy5.5 seçmeli olarak bağlamak meme kanseri hücreleri (macenta) α3β1, LXY30'ın belirli benzeşimi nedeniyle aşırı ifade bir integrin meme kanseri hücre zarı üzerinde olduğu. <a href="/files/ftp_upload/57020/57020fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57020/57020fig4.jpg"> Şekil 4: bir şematik thiol seçmeli reaksiyon ve bakır katalize azid ALKİN cycloaddition ya da LXY30-HEVNPs oluşturmak için bir tepki 'kimya tıklayın' de dahil olmak üzere iki aşamalı kimyasal konjugasyon süreçlerin. İki yöntem test ettik. Yöntem 1: bakır katalize azid ALKİN cycloaddition reaksiyon Mal-azid ve ALKİN-LXY30 arasında forma Mal bağlı LXY30 (Mal-LXY30) ilk gerçekleştirildi. O zaman Mal LXY30 HEV - 573 C NPs(a)Cys sitesiyle tepki için eklendi. LXY30 ve Cy5.5 HEV - 573 C sonuçta sağlam kaldı NPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) bu kimyasal konjugasyon işlemler (B) dekore edilmiştir. Yöntem 2: konjugasyon işlem Mal bağlantılı azid (Mal-azid) etiketleme tarafından HEV - 573 C NPs Cys sitesinde azid bağlı HEVNPs (azid-HEVNPs), LXY30-ALKİN, askorbik asit ve CuSO4 ekleyerek takip kurmak thiol seçici bir tepki ile başlar LXY30 bağlı HEVNPs (LXY30-HEVNPs) (A) oluşturmak için. Ancak, çoğu LXY30-HEVNPs zarar görmüş veya azid, askorbik asit ve CuSO4 (C) gibi reaktif reaktif tarafından kaynaklanabilir konjugasyon süreçleri demonte. Mal: Maleimide. Bu rakam Chen vd. 20164 izni ile değiştirildi. <a href="/files/ftp_upload/57020/57020fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57020/57020fig5.jpg"> Şekil 5: hücre bağlama ve içselleştirilmesi temsilcisi sonuçlarını fluorescently etiketli LXY30-HEVNPs, hangi MDA-MB-231 meme kanseri hücreleri için bağlar. LXY30-HEVNP-Cy5.5 MDA-MB-231 hücrelere hedefleme Floresans görüntüleri NIR. DAPI tarafından (mavi) lekeli, çekirdeği sinyal ve Cy5.5 (kırmızı) sinyal confocal floresan mikroskop kullanarak elde. Bu rakam Chen vd. 20164 izni ile değiştirildi. <a href="/files/ftp_upload/57020/57020fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods at JoVE.com

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Hepatit E virüs nano tanecikleri kimyasal konjugasyon yöntemlerle yüzey Functionalization

Biz-si mühendislik hepatit E virüs kapsid protein theranostic nanopartikül (HEVNP). HEVNP icosahedral istikrarlı Mukozal teslim kafese kendi kendine monte edilerek üretilir. Burada, HEVNPs değiştirilmesi yüzey Günese maruz kalan kalıntıları özellikle tümör hücreleri bağlamak sentetik ligandlar çekimlerine katıldı diziyi değiştirerek hedefleme tümör için açıklamak.

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

surface-functionalization-hepatitis-e-virus-nanoparticles-using

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.8K Görüntüleme.  University of California Davis. Biz-si mühendislik hepatit E virüs kapsid protein theranostic nanopartikül (HEVNP). HEVNP icosahedral istikrarlı Mukozal teslim kafese kendi kendine monte edilerek üretilir. Burada, HEVNPs değiştirilmesi yüzey Günese maruz kalan kalıntıları özellikle tümör hücreleri bağlamak sentetik ligandlar çekimlerine katıldı diziyi değiştirerek hedefleme tümör için açıklamak.

Video: Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Soft Lithographic Functionalization and Patterning Oxide-free Silicon and Germanium

The development of hybrid electronic devices relies in large part on the integration of (bio)organic materials and inorganic semiconductors through a stable interface that permits efficient electron transport and protects underlying substrates from oxidative degradation. Group IV semiconductors can be effectively protected with highly-ordered self-assembled monolayers (SAMs) composed of simple alkyl chains that act as impervious barriers to both organic and aqueous solutions. Simple alkyl SAMs, however, are inert and not amenable to traditional patterning techniques. The motivation for immobilizing organic molecular systems on semiconductors is to impart new functionality to the surface that can provide optical, electronic, and mechanical function, as well as chemical and biological activity. 
Microcontact printing (&mu;CP) is a soft-lithographic technique for patterning SAMs on myriad surfaces.1-9 Despite its simplicity and versatility, the approach has been largely limited to noble metal surfaces and has not been well developed for pattern transfer to technologically important substrates such as oxide-free silicon and germanium. Furthermore, because this technique relies on the ink diffusion to transfer pattern from the elastomer to substrate, the resolution of such traditional printing is essentially limited to near 1 &mu;m.10-16
In contrast to traditional printing, inkless &mu;CP patterning relies on a specific reaction between a surface-immobilized substrate and a stamp-bound catalyst. Because the technique does not rely on diffusive SAM formation, it significantly expands the diversity of patternable surfaces. In addition, the inkless technique obviates the feature size limitations imposed by molecular diffusion, facilitating replication of very small (&lt;200 nm) features.17-23 However, up till now, inkless &mu;CP has been mainly used for patterning relatively disordered molecular systems, which do not protect underlying surfaces from degradation.
Here, we report a simple, reliable high-throughput method for patterning passivated silicon and germanium with reactive organic monolayers and demonstrate selective functionalization of the patterned substrates with both small molecules and proteins. The technique utilizes a preformed NHS-reactive bilayered system on oxide-free silicon and germanium. The NHS moiety is hydrolyzed in a pattern-specific manner with a sulfonic acid-modified acrylate stamp to produce chemically distinct patterns of NHS-activated and free carboxylic acids. A significant limitation to the resolution of many &mu;CP techniques is the use of PDMS material which lacks the mechanical rigidity necessary for high fidelity transfer. To alleviate this limitation we utilized a polyurethane acrylate polymer, a relatively rigid material that can be easily functionalized with different organic moieties. Our patterning approach completely protects both silicon and germanium from chemical oxidation, provides precise control over the shape and size of the patterned features, and gives ready access to chemically discriminated patterns that can be further functionalized with both organic and biological molecules. The approach is general and applicable to other technologically-relevant surfaces.

Here we describe a simple method for patterning oxide-free silicon and germanium with reactive organic monolayers and demonstrate functionalization of the patterned substrates with small molecules and proteins. The approach completely protects surfaces from chemical oxidation, provides precise control over feature morphology, and provides ready access to chemically discriminated patterns.

Yumuşak Litografik işlevsellik ve Desenlendirme Oksit Silisyum ve germanyum

The development of hybrid electronic devices relies in large part on the integration of (bio)organic materials and inorganic semiconductors through a ...

Biyomühendislik

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Polianhidrid Nanopartiküller Bağlı Mürin Alveoler Makrofajlar Hasat ve Değerlendirme Hücresel Etkinleştirme

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

Polianhidrid Nanopartiküller Yüksek throughput Karbonhidrat sentezi ve işlevsel

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular choice for drug delivery applications, particularly since it is already FDA-approved for use in humans in the form of resorbable sutures. Hydrophobic and hydrophilic drugs are encapsulated in PLGA particles via single- or double-emulsion. Briefly, the drug is dissolved with polymer or emulsified with polymer in an organic phase that is then emulsified with the aqueous phase. After the solvent has evaporated, particles are washed and collected via centrifugation for lyophilization and long term storage. PLGA degrades slowly via hydrolysis in aqueous environments, and encapsulated agents are released over a period of weeks to months. Although PLGA is a material that possesses many advantages for drug delivery, reproducible formation of nanoparticles can be challenging; considerable variability is introduced by the use of different equipment, reagents batch, and precise method of emulsification. Here, we describe in great detail the formation and characterization of microparticles and nanoparticles formed by single- or double-emulsion using the emulsifying agent vitamin E-TPGS. Particle morphology and size are determined with scanning electron microscopy (SEM). We provide representative SEM images for nanoparticles produced with varying emulsifier concentration, as well as examples of imaging artifacts and failed emulsifications. This protocol can be readily adapted to use alternative emulsifiers (e.g. poly(vinyl alcohol), PVA) or solvents (e.g.&#160;dichloromethane, DCM).

We describe the production and characterization of nanoparticles and microparticles composed of poly(lactic-co-glycolic acid) using vitamin E-TPGS as an emulsifier. By varying formulation parameters such as the concentration of emulsifier, it is possible to produce nanoparticles with mean diameters ranging from 220 nm to&#160;1.98 &#181;m.

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, genetic programmability, and biodegradability. While they&#39;re highly amenable to bioconjugation reactions for adding synthetic ligands onto their surface, the range in bioconjugation methodologies on these aqueous born capsids is relatively limited. To facilitate the direction of functional biomaterials research, non-traditional bioconjugation reactions must be considered. The reaction described in this protocol uses dibromomaleimides to introduce new functionality in the solvent exposed disulfide bonds of a VLP based upon Bacteriophage Q&#946;. Furthermore, the final product is fluorescent, which has the added benefit of generating a trackable in vitro probe using a commercially available filter set.

Here, we present a procedure to fluorescently functionalize the disulfides on Q&#946; VLP with dibromomaleimide. We describe Q&#946; expression and purification, the synthesis of dibromomaleimide-functionalized molecules, and the conjugation reaction between dibromomaleimide and Q&#946;. The resulting yellow fluorescent conjugated particle can be used as a fluorescence probe inside cells.

Konjugasyon kaynaklı floresan pegile virüs benzeri moleküller tarafından Dibromomaleimide-disülfür Kimya yapma

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Hidrofobik ve hidrofilik bileşikler polimer nano tanecikleri Kapsülleme için NanoPrecipitation flash

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical success for treating previously &#8216;undruggable&#8217; hepatic disease targets with siRNA has been achieved. However, efficient tumor siRNA delivery necessitates additional pharmacokinetic design considerations, including long circulation time, evasion of clearance organs (e.g., liver and kidneys), and tumor penetration and retention. Here, we describe the preparation and in vitro physicochemical/biological characterization of polymeric nanoparticles designed for efficient siRNA delivery, particularly to non-hepatic tissues such as tumors. The siRNA nanoparticles are prepared by electrostatic complexation of siRNA and the diblock copolymer poly(ethylene glycol-b-[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate-co-butyl methacrylate]) (PEG-DB) to form polyion complexes (polyplexes) where siRNA is sequestered within the polyplex core and PEG forms a hydrophilic, neutrally-charged corona. Moreover, the DB block becomes membrane-lytic as vesicles of the endolysosomal pathway acidify (&#60; pH 6.8), triggering endosomal escape and cytosolic delivery of siRNA. Methods to characterize the physicochemical characteristics of siRNA nanoparticles such as size, surface charge, particle morphology, and siRNA loading are described. Bioactivity of siRNA nanoparticles is measured using luciferase as a model gene in a rapid and high-throughput gene silencing assay. Designs which pass these initial tests (such as PEG-DB-based polyplexes) are considered appropriate for translation to preclinical animal studies assessing the delivery of siRNA to tumors or other sites of pathology.

Methods to prepare and characterize the physicochemical properties and bioactivity of neutrally-charged, pH-responsive siRNA nanoparticles are presented. Criteria for successful siRNA nanomedicines such as size, morphology, surface charge, siRNA loading, and gene silencing are discussed.

Sitosolik siRNA teslim için Nötrsel olarak şarj edilmiş, pH duyarlı polimerik nanopartiküller hazırlanması

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical ...

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different infectious diseases. In this article we demonstrate a method to produce a SAPN core containing a six-helix bundle (SHB) assembly that is capable of presenting antigens in a trimeric conformation. We describe the expression of the SHB-SAPN in an E. coli system, as well as the necessary protein purification steps. We included an isopropanol wash step to reduce the residual bacterial lipopolysaccharide. As an indication of the protein identity and purity, the protein reacted with known monoclonal antibodies in Western blot analyses. After refolding, the size of the particles fell in the expected range (20 to 100 nm), which was confirmed by dynamic light scattering, nanoparticle tracking analysis, and transmission electron microscopy. The methodology described here is optimized for the SHB-SAPN, however, with only slight modifications it can be applied to other SAPN constructs. This method is also easily transferable to large scale production for GMP manufacturing for human vaccines.

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

A detailed method is provided here describing the purification, refolding, and characterization of self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) for use in vaccine development.

Trimerik Epitop Sunumu Gerektiren Aşılar için E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nano tanecikleri Üretimi

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high encapsulation efficiency. Use of lipid nanoparticles (LNPs) to encapsulate nucleic acids is advantageous to protect the RNA or DNA from degradation, while also promoting cellular uptake. LNPs often contain multiple lipid components including an ionizable lipid, helper lipid, cholesterol, and polyethylene glycol (PEG) conjugated lipid. LNPs can readily encapsulate nucleic acids due to the ionizable lipid presence, which at low pH is cationic and allows for complexation with negatively charged RNA or DNA. Here LNPs are formed by encapsulating messenger RNA (mRNA) or plasmid DNA (pDNA) using rapid mixing of the lipid components in an organic phase and the nucleic acid component in an aqueous phase. This mixing is performed using a precise microfluidic mixing platform, allowing for nanoparticle self-assembly while maintaining laminar flow. The hydrodynamic size and polydispersity are measured using dynamic light scattering (DLS). The effective surface charge on the LNP is determined by measuring the zeta potential. The encapsulation efficiency is characterized using a fluorescent dye to quantify entrapped nucleic acid. Representative results demonstrate the reproducibility of this method and the influence that different formulation and process parameters have on the developed LNPs.

Lipid nanoparticles are developed using a microfluidic mixing platform approach for mRNA and DNA encapsulation.

Mikroakışkan Karıştırma Platformu Kullanarak Gen Teslimatı için Lipid Nanopartiküllerinin Formülei ve Karakterizasyonsu

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...