Bu protokol, aday bir anti HBV bileşiğinin özellikle NTCP bağlanmasını bloke ederek viral girişi inhibe edip etmediğini doğrulamak için tasarlanmıştır. Bu teknik, HBV girişinin veya enfeksiyonun ilk adımının herhangi bir aday bileşik tarafından kesintiye uğrayıp uğramayacağını araştırmak için tasarlanmıştır. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir PSP öğrencisi olan Piyanoot Thongsri olacak.
Sodyum taurokolat birlikte taşınan polipeptit veya NTCP'nin ölçümüne başlamak için, olgun hepatositleri sekiz değirmen veya daha fazla etilendiamintetraasetik asit veya EDTA ile 15 dakika boyunca inkübe edin. Hücre peletlerini toplayın ve 15 dakika boyunca PBS'ye 300 mikrolitre% 3.7 paraformaldehit ekleyerek hepatositleri sabitleyin. Daha sonra hücre süspansiyonunu 10 dakika boyunca 300 G ve 25 santigrat derecede santrifüj yapmak için 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Daha önce açıklandığı gibi% 1 fetal sığır serumu veya FBS içeren 700 mikrolitre PBS kullanarak santrifüjde 10 dakika boyunca hücreleri iki kez yıkayın. Daha sonra hücreleri PBS'de 300 mikrolitre% 0.05 Triton X 100 ile oda sıcaklığında 20 dakika geçirgenleştirin. Santrifüjlemeden sonra,% 1 FBS içeren 700 mikrolitre PBS kullanarak her biri bir dakikalık üç yıkama yapın.
Hücreleri dört santigrat derecede 30 dakika boyunca NTCP'ye karşı birincil antikor ile bir ila 100 oranında inkübe edin, ardından perm yıkama tamponu ile üç yıkama ve santrifüjleme yapın. Alexa Fluor 488'e konjuge edilmiş ikincil bir antikoru olan hücreleri dört santigrat derecede 30 dakika boyunca sabitleyin ve her biri bir dakika boyunca üç kez perma yıkama tamponu yıkamasını tekrarlayın. 300 G'de santrifüjlemeden sonra, hücre peletini% 1 FBS içeren 200 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın.
Yazılımda, FSC, SSC, FITC veya PE dahil olmak üzere akış sitometrik analizi için ölçüm parametrelerini seçin. Otomatik kompanzasyon ayarını ayarlayın ve makalede açıklandığı gibi kompanzasyon kontrollerini dahil edin. Ardından, lekesiz numuneyi dakikada 60 mikrolitrelik orta akışkan akış hızıyla çalıştırın. İlgilenilen hücre popülasyonunu kapsayana kadar ileri saçılma ve yan saçılma eşiğini ayarlayın.
Bu alandaki kapı bölgesini işaretleyin ve tüm ücret kontrollerine uygulayın. Lekesiz kontrolü kullanarak fotoğraf çarpan tüpünü veya PMT floresansını ayarlayın ve negatif kadrandaki FITC veya PE'nin PMT voltajını ayarlayın. Pozitif lekeli numuneyi çalıştırın ve pozitif kadran ölçeğinde FITC veya PE'yi ayarlayın.
Lekesiz, FITC lekeli veya PE kontrollerini çalıştırın, telafiyi hesaplayın ve örnek ayarlara uygulayın. Ardından, NTCP seviyesini ölçmek için hepatosit örneğini çalıştırın. Ardından, BD FACSuite pencerelerinde, kontrol tüpünde ve ardından veri kaynakları sekmesinde seri olarak seçerek lekeli hepatositleri analiz etmeye başlayın.
Ham verilerin görünmesini bekleyin. Ardından, sağ taraftaki çalışma sayfası sekmesinde elips kapısı düğmesine tıklayın, fare imlecini kullanarak hücre popülasyonunu ve SSC'yi ve FSC nokta grafiğini seçin. Ardından P1 çemberinin görünmesini bekleyin.
Aralık kapısı düğmesine tıklayın ve floresein izotiyosiyanat lekeli histogramdaki bölgeyi işaretleyin. En yüksek floresan yoğunluk değerinden başlayarak sağ tarafa kadar. Ekranda P2 çizgisi görünür.
Deneme tüpüne tıklayın ve çalışma sayfası sekmesindeki verilerin değiştiğini gözlemleyin. İstatistikler düğmesine ve ardından boş alana ve çalışma sayfasına tıklayın. Daha sonra, sodyum taurokolat birlikte taşınan polipeptit popülasyonunun istatistiksel değerlerini gözlemleyin.
Ortamı% 100 akıcı MHC kuyu plakalarından aspire edin ve iki saat boyunca William'ın E Medium ile seyreltilmiş dört mikromolar siklosporin A ekleyin. Daha sonra, aday hepatit B virüsü giriş inhibitörünü aspire ederek %4 polietilen glikol içeren bir mililitre Williams E Medium ile değiştirin. Daha sonra, kültür ortamını hepatit B virüsü parçacıkları ile 37 santigrat derecede 18 saat boyunca kuyu başına 100 enfeksiyon çokluğunda inkübe edin.
Daha sonra, süpernatantı iki mililitre soğuk PBS'ye atın ve eski ortamı bağlanmamış hepatit B virüsü ile durulamak için hafifçe döndürün. Hücreleri yedi gün boyunca iki mililitre tam William E Medium ile kültüre ettikten sonra, hücreleri PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 3.7 paraform aldehit ve PBS ile sabitleyin. Enfekte olmuş hücreleri, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca IF bloke edici çözelti ile sıralı olarak, birincil antikorda, bloke edici çözeltide bir ila 200 seyreltmede, gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında bir saat boyunca bir ila 500 seyreltmede ikincil antikor ile inkübe etmeden önce yıkama çözeltisi kullanarak her biri bir dakikalık üç yıkama yapın. Üç kez yıkadıktan sonra, numuneyi DAPI ile solmaya karşı bir montaj ortamı ile monte edin ve bir cam kapak kayması ile örtün. DAPI ve PE filtrelerine sahip bir floresan mikroskobu kullanarak, aday bileşiklerin anti HBV giriş aktivitesini belirlemek için floresan sinyalini 20 x objektif lens ile algılar.
Hücre bağlama testi için, hücreleri daha önce gösterildiği gibi hazırlayın ve iki saat boyunca dört santigrat derecede hepatit B virüsü parçacıkları ile inkübe edin. Ortamı attıktan sonra, hücreleri iki mililitre soğuk PBS ile yumuşak bir girdap ile durulayın. Daha sonra enfekte olmuş hücreleri bir hücre kazıyıcı kullanarak toplayın ve hücreleri lizis tamponu ile bozun.
Makalede açıklanan sıcaklık koşullarını kullanarak polimeraz zincir reaksiyonu ile toplam DNA'yı çıkarmak için hücre lizatını bir toplama tüpüne aktarın. Hücreleri daha önce gösterildiği gibi hazırladıktan sonra, hepatositleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca sodyum taurokolik asit çözeltisi ile inkübe edin, çözeltiyi aspire edin ve hücreleri soğuk HEPES ile üç kez yıkayın. Daha sonra, hücreleri buz üzerinde hücre kazıyıcılarla hasat etmek için 300 ila 500 mikrolitre soğuk HEPES ekleyin.
20 saniye boyunca 20 kilohertz'de ultrasonikasyon ile hücreleri homojenize edin ve beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. 10.000 G'de santrifüjlemeden sonra, süpernatantı toplayın ve bir taurokolik asit ELISA tahlil kiti kullanarak hücre içi taurokolik asit konsantrasyonunu değerlendirin. İzotermal titrasyon kalorimetrisinde veya ITC cihazında hücreleri ve şırıngayı yıkamak için ITC yazılımını başlatın.
Denemeyi çalıştır vurgulama sekmesinin altında, 19 enjeksiyon noktası ITCM için mikro cal yöntemini seçin ve aç'ı tıklayın. Yeni bir pencere açıldığında, temizle sekmesine tıklayın ve temizleme yöntemi penceresinde hücre temizleme yöntemi için yıkama düğmesini ve şırınga temizleme yöntemi için durulama düğmesini seçin. İleri'ye tıklayın ve ekrandaki talimatları izleyin.
Örneği ITC'ye yükledikten sonra, denemeyi çalıştır sekmesinin altında bulunan yükle düğmesine tıklayın. Ardından İleri'ye tıklayın ve bu yükleme adımı tamamlanana kadar video talimatlarını izleyin. Bir şırınga kullanarak, referans hücreyi numune hücresindeki çözelti tamponu ile tamponda 15 mikromolar NTCP ile doldurun.
Fazla çözeltiyi çıkarın, ardından şırıngayı hava kabarcıklarından kaçınarak 150 Mikromolar Kurkumin Ligand çözeltisi ile doldurun. Denemeyi çalıştır sekmesinin altındaki çalıştır düğmesine tıklayarak örneği çalıştırın. Deneysel bilgiler ve ayarlar sol tarafta görüntülenecektir.
Ligand proteini konsantrasyonlarını ve sıcaklık ayrıntılarını girin. Enjeksiyon işlemini gerçekleştirmek için Başlat'a tıklayın. Protein ligand etkileşiminin tamamlanması için 1.4 saat bekleyin.
Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, analiz yazılımını kullanarak ham verileri analiz etmek için vurgulanan analiz düğmesini seçin. Ardından, ham verileri görüntülemek için genel bakış'a tıklayın ve uygun modeli bir bağlama sitesi kümesi olarak seçin. Özellikle MHK'nın diferansiye evresinde, binüklee hücreler ve poligonal şekilli morfoloji dahil olmak üzere hepatik olgunlaşma özellikleri gözlenmiştir.
Diferansiye HepaRG ve diferansiye MHC'de NTCP ekspresyonunda büyük bir artış gözlendi. NTCP'nin yüksek glikozile formu, diferansiye MHC'de diferansiye HepaRG'ye göre daha fazla tespit edildi. NTCP düzeyleri farklılaşmış MHC hücrelerinde farklılaşmamış hücrelere göre daha yüksekti.
Virüs immünofloresan boyaması, enfeksiyon sonrası yedinci günde anti HBV giriş aktivitelerini değerlendirdi ve hücre yüzey reseptörü üzerindeki virüs bağlanma seviyesi gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile değerlendirildi. Taurokolik asit alım analizi, aday bileşiklerin cezalandırıcı inhibitör aktivitesinin NTCP yoluyla Hepatit B virüsü bağlanmasını azalttığını göstermiştir. Kolorimetrik değişiklik, numune hücresine sürekli enjeksiyonlarla tespit edildi.
Standart bir doğrusal olmayan en küçük kareler regresyonu, verilere iyi oturmuş bir bağlama bölgesine dayanarak çizildi. Katı çizgi, SBB bağlanmasının deneysel değerlerine en uygun olanı ve hücrelerin ve hepatit B viral parçacığının dört santigrat derecede inkübe edildiğini gösterdi. Torokolik asit güncellemesi radyoaktif teknik kullanılarak değerlendirilebilir.
Radyoaktif taurokolik asit seviyesi bir sıvı simülasyon sayacı kullanılarak ölçülebilir. Bu teknik, enfeksiyonu veya yeniden enfeksiyonu önlemeye yardımcı olacak herhangi bir antiviral rejimin araştırma aktivitesinde viral giriş taraması için basit ve hızlıdır.
