저자 인정 NIH에 의해 RHC를 자금 후원 # 부여 ' s AI095382, EB021230, CA198880, 국립 연구소의 식품 및 농업, 뿐만 아니라 핀란드 존경 하는 교수 프로그램:.

1. HEVNP 곤충 세포에서 생산
참고: 다음 단계를 모두 셀 문화 후드에서 수행 되어야 합니다. 더 자세한 HEVNP 생산 절차11에 대 한 우리의 이전 게시를 참조 하십시오.
<ol><li>곤충 세포 미디어 ( 재료의 표참조) 50-75% 합류 6 잘 플레이트에서 Sf9 셀 문화.</li>
	<li>곤충 세포 transfection 시 약 제조업체의 프로토콜에 따라 사용 하 여, transfect 재조합 잠재 생산 HEVNP-573 C ORF2 Sf99 셀에 포함 된 Bacmids. 세포의 생존 능력에 따라 3-6 일 동안 27 ° C에서 transfected 세포를 품 어.</li>
	<li>P0 잠재 주식으로 감염 된 후 3-6 일에 상쾌한 (후 transfected 세포는 잠재 감염 lysed)를 수집 합니다.</li>
	<li>50-75% confluent Sf9 셀 25 cm2 단층 플라스 크에 P0 재고의 200 µ L를 적용 하기 전에 문화 매체를 제거 합니다. inoculum의 전체 범위를 보장 하기 위해 플라스 크 매 15 분을 바위. 60 분 총 4 회를 반복 한다.</li>
	<li>플라스 크에 곤충 세포 배양 매체의 2 개 mL를 추가 하 고 증폭 높은 titer에 잠재 하는 세포의 생존 능력에 따라 3-6 일, 27 ° C에서 유지.</li>
	<li>읽기12잠재 titer를 패 분석 실험을 실시 합니다.</li>
	<li>250 mL 플라스 크에 곤충 세포 매체의 100 mL와 함께 정지 Tn5 곤충 세포 (자료 테이블) 문화 및 0.5 x 10의 titer 150 rpm에서 27 ° C에서 흔들어5 -1 x 106 접종에 대 한.</li>
	<li>250 mL 플라스 크에 5-10 ~ 100 mL Tn5 셀의 잠재 감염 (MOI)의 다양성에 추가 합니다. 접종, 후 5-7 일 동안 150 rpm에서 27 ° C에서 흔들어.</li>
	<li>일단 대부분 셀 소포를 나타나고 셀의 70-90%는 광학 현미경 관찰에서 죽은, Tn5 세포를 수집 하 고 33 mL ultracentrifuge 튜브로 전송. 장소는 ultracentrifuge 25 ° c.에 90 분 10000 x g에서 양동이 터, 균형, 그리고 세포 파편과 재조합 baculoviruses 아래로 회전 스윙에 관</li>
	<li>더 정화 4 ° C에서 출시 된 HEVNPs를 포함 하는 상쾌한을 유지. 표면에 뜨는 잠재의 확장된 스토리지에 대 한 protease 억제제를 추가 합니다.</li>
</ol>2. HEVNP 정화
<ol><li>펠 렛 및 세 슘 염화 물 (CsCl) 그라데이션 분리를 사용 하 여 HEVNPs를 분리:<ol>
<li>(1.10 단계)에서 수집 된 상쾌한을 전송 하 고 20% 추가 0.5%의 최종 농도 만들기 위해 각 관으로 NP-40 모든 나머지 세포 막 분해 NP-40. 부드럽게 pipetting으로 혼합 및 25 ° c.에 적어도 30 분 동안 품 어</li>
		<li>Ultracentrifuge는 상쾌한에서 HEVNPs 아래로 작은 하 4 ° C에서 2 시간에 대 한 양동이 터 스윙에 112,400 x g에서 HEVNPs. 원심 분리 후에 상쾌한을 삭제 하 고 부드럽게 200 µ L 10 mM MES 버퍼 pH 6.2 하룻밤 각 튜브의 (O/N) 4 ° c.에에서 다시 원유 펠 릿을 일시 중단 SDS 페이지 (3.1 단계) 52 kDa 밴드로 원유 펠 릿에 HEVNP ORF2의 존재 확인을 실행 합니다.</li>
		<li>혼합 1.96 g CsCl 38.5% (w/v) CsCl 그라데이션, 다시 일시 중단 된 원유 펠 릿과 5 mL ultracentrifuge 튜브에 0.01 M MES pH 6.2 ~ 4 mL를 준비 합니다. 튜브를 균형과 진동 물통 회전자에 놓습니다. 4 ° c.에 16 h x g 147,000 ultracentrifuge</li>
	</ol>
</li>
	<li>CsCl 그라데이션 후 분수를 수집:<ol>
<li>최고 500 µ L 분수는 주로 경량 세포 막 파편을 삭제 합니다. 튜브의 상단에서 시작 하는 500 µ L 분수를 수집 하 고 각 분수 사이 팁을 변경. 번호 표시 1.5 mL 튜브에 각 분수를 놓습니다. 참고: 존재의 HEVNP ORF2 분수 CsCl 그라데이션 젤 CsCl의 높은 농도 때문에 SDS 페이지를 실행 하 여 검출 될 수 없다에서 분리에. 각 분수에서 CsCl 제거 하거나 CsCl 정리 절차에 따라 희석 될 수 있습니다. 또는, CsCl 그라디언트는 10-40% 자당 그라데이션13 CsCl 잔류 방지를 교체할 수 있습니다.</li>
		<li>5 mL ultracentrifuge 관에 각 분수를 전송 및 10mm MES, pH 6.2 4.5 mL와 CsCl 희석. 튜브를 균형과 진동 물통 회전자에 놓습니다. Ultracentrifuge는 HEVNPs 아래 작은 하 4 ° C에서 2 h 147,000 x g에서.</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 부드럽게 다시 각 관에서 10 mM MES pH 6.2의 100 µ L에는 HEVNPs를 일시 중단. 증발을 방지 하 고 O/N 4 ° c.에 품 어 튜브 커버</li>
		<li>A280 읽기 및 A260/A280 nm 비율을 분 광 광도 계를 사용 하 여 기록 합니다. 로 ORF2의 대략적인 농도를 결정 합니다. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57020/57020eq1.jpg"> 각 ORF2 1 Cys 사이트 및 화학 활용에 대 한 1 리스 사이트 포함 됩니다. 참고: HEVNP ORF2의 어 금 니 소멸 계수는 60,280, 1.019 mg/mL × A280에 해당. 이것이 정말 1: 1에 가까운 HEVNPs의 농도 (mg/mL)에서 A280, 그리고 그러므로, 위의 방정식으로 ORF2의 농도 의해 접근 될 수 있는. 예를 들어 1 A280 읽기와 HEVNP의 18.8 µ M에 1 mg/mL 농도 해야한다 ORF2.</li>
		<li>SDS 페이지를 준비 합니다. 각 부분에서 6 µ L 샘플을 사용 하 여 53.3 HEVNP ORF2 kDa 단백질 (3.1 단계)를 포함 하는 분수 결정. HEVNPs ~1.25 g/mL의 조밀도 가진 3-5, 분수에서 찾을 수 합니다.</li>
		<li>존재와 가장 관찰에 의해 HEVNPs의 순도 확인 합니다. 준비 또는 0.5-2.0 mg/mL 가장에 대 한 HEVNP 샘플을 희석. HEVNPs 가장 빈 icosahedral 단백질, ~ 27로 표시 nm 직경 (그림 2). 일부 단백질 오염 물질 분수에 남아 있을 수 있습니다 그리고 가장 (3.2 단계)에서 관찰 될 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가장 아래 불순물 있는지 경우에 단계 2.1.3-2.2.6는 HEVNPs의 더 나은 순수성에 대 한 반복 합니다. 참고: 추가 정화 CsCl 그라디언트를 통해 HEVNPs의 수확량 손실을 발생할 수 있습니다. 또는, CsCl 그라데이션 정화를 피하기 위해 잔여 CsCl1310-40% 자당 그라데이션 하 여 교체할 수 있습니다.</li>
</ol>3. HEVNP 특성
<ol><li>SDS 페이지 4-12% 두번째-트리 스 단백질 젤, 1.0 m m, 17-웰 스 ( 재료의 표참조)에 따라 사용자의 수동14준비:<ol>
<li>6 µ L의 단백질 견본 버퍼를 로드 x 4의 2 µ L를 추가 합니다. 단백질 변성을 100 ° C에서 10 분 동안 열 블록에 샘플 혼합물을 품 어. 젤에 단백질 샘플을 로드 합니다.</li>
		<li>100 V 10 분, 45 분 샘플 젤의 바닥 위에 약 1 cm 실행 될 때까지 다음 150 V DC 전원 공급 장치를 설정 하 여 SDS 페이지를 실행 합니다.</li>
		<li>얼룩 Coomassie 파란 (0.25% (w/v) Coomassie 화려한 블루 R250, 30% (v/v) 메탄올, 10% (v/v) 초 산), 1 시간에 대 한 SDS 페이지 젤.</li>
		<li>얼룩 절차 후 Coomassie 파란 얼룩을 제거 하 고 적용에 대 한 단백질 젤 드 얼룩 버퍼 (30% (v/v) 메탄올, 10% (v/v) 초 산) > 실 온에서 12 h.</li>
		<li>52 kDa 밴드에서 HEVNP ORF2의 존재를 확인 하는 하얀 빛 아래에서 젤을 문서화 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가장을 사용 하 여 HEVNPs를 관찰 합니다.<ol>
<li>준비 또는 0.5-10 m m MES ph 6.2 편 영상 2 mg/mL HEVNP 샘플을 희석.</li>
		<li>탄소 코팅 그리드 30 40 mA 글로우 방전으로 이온화 친수성 탄소 표면 생산 하는 s. 글로우 방전 장비 재료의 테이블에에서 설명 되어 있습니다. 참고: 격자의 친수성 탄소 표면 수 마지막만 놀 후 30 분 동안 방전 처리.</li>
		<li>족집게에 및 HEVNP 샘플의 2 µ L를 눈금에 추가, 15-30 s 때까지 기다리는 누른 필터 종이 되 리.</li>
		<li>즉시 씻어 ddH20 그리드와 필터 종이 오.</li>
		<li>바로 그리드, 대기 15 s, 다음 필터 종이 오 2 %uranyl 아세테이트의 2 µ L를 추가 합니다. 건조는 전자에 의해 샘플 격자 습기 없애십시오 건조 캐비닛을 O/북 아 일에 대 한</li>
		<li>가장 및 10-80 k 확대 이미지에 그리드를 전송 합니다. HEVNPs ~ 27은 빈 icosahedral 단백질으로 가장에 나타납니다 nm 직경, 바이러스 성 RNA의 부재 때문에.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 화학 활용 Biotin, 암 타겟팅 Ligand와 Fluorophores HEVNPs
<ol><li>HEVNPs 및 maleimide 연결 biotin의 한 단계 활용을 수행 합니다.<ol>
<li>버퍼링 변경: 미니 투 석 단위에 HEVNPs를 적용 하 고 제조 업체의 프로토콜 (자료 테이블)에 따라 1 시간에 대 한 실 온에서 0.01 M PBS pH 7.4에 대 한 dialyze. 1.5 mL 튜브에는 HEVNPs를 전송 하 고 280에서 단백질 농도 측정 nm는 분 광 광도 계를 사용 하 여.</li>
		<li>1 mg/ml, Cys 반응 (단계 2.2.4 세부 정보 참조), 사이트 maleimide-비타민 b 복합체 (100 µ M)에서 0.01 M PBS, pH 7.4, 어 금 니 비율 1:5; 수 있도록 동일한 금액의 18.8 µ M에 HEVNP를 혼합 O/N 4 ° c.에 반응 제조 업체의 프로토콜 (자료 테이블)에 따라 40 K MWCO 스핀 Desalting 열 절차와 언바운드 maleimide biotin을 제거 합니다.</li>
		<li>SDS 페이지 (3.1 단계) 감소 표준 통해 샘플을 분석 합니다.</li>
		<li>표준 절차를 사용 하 여 한 chemiluminescent 서쪽 오 점 Streptavidin HRP 연결을 사용 하 여 준비 합니다. X 레이 필름 (그림 2)에 의해 chemiluminescent 신호를 캡처.</li>
	</ol>
</li>
	<li>HEV NPs (그림 5)에 표면 노출 시스테인을 LXY30 활용 2 단계를 수행 합니다.<ol>
<li>교환 버퍼: 미니 투 석 단위에 HEVNPs를 적용 하 고 1 h. 1.5 mL 튜브에는 HEVNPs 전송에 대 한 실 온에서 0.01 M PBS pH 7.4에 대 한 dialyze 280에서 단백질 농도 측정 nm는 분 광 광도 계를 사용 하 여.</li>
		<li>200 µ M CuSO4 와 1mm ascorbic 산 maleimide에 연결 된 LXY30를 0.01 M PBS pH 7.4에에서 650 µ M maleimide-아 지 드와 650 µ M alkyne LXY3010 추가 (말-LXY30) 650 µ M. O/북 아 일에 대 한 4 ° C에 혼합물을 품 어</li>
		<li>1 mg/ml, Cys 반응 사이트의 18.8 µ M에 HEVNP 혼합 (단계 2.2.4 세부 정보 참조), 약 10% 말 LXY30의 볼륨 (650 µ M) 0.01 M PBS ph 7.4, 어 금 니 비율 1:3; 수 있도록 O/N 4 ° c.에 반응 참고: 말-LXY30의 상대적으로 높은 농도 때문 CuSO4, 같은 반응의 최종 농도 HEVNPs 그들의 손상을 방지 하려면 혼합 후 약 10 배를 감소 된다. 또 다른 옵션은 Cu 무료 활용 방법15.</li>
		<li>제거 언바운드 maleimide-클릭-LXY30 제조 업체의 프로토콜에 따라 40 K MWCO 스핀 담 열 ( 재료의 표참조). 4 ° c.에 LXY30 연결 HEVNPs (LXY30-HEVNPs)를 유지</li>
	</ol>
</li>
	<li>LXY30-HEVNPs 및 에스테 르 Cy5.5 보 건국 (NHS-Cy5.5)의 한 단계 활용 수행<ol>
<li>1 mg/ml, Cys 반응 사이트의 18.8 µ M에 LXY30 연결 HEVNPs (LXY30-HEVNPs)을 혼합 (단계 2.2.4 세부 정보 참조), 보 건국 Cy5.5의 동등한 양으로 (100 µ M) 0.01 M PBS ph 7.4 1:5 어 금 니 비율; O/N 4 ° c.에 반응</li>
		<li>제거는 제조 업체의 프로토콜에 따라 40 K MWCO 스핀 담 열 절차 Cy5.5 NHS 언바운드 ( 재료의 표참조). LXY30, HEVNPs Cy5.5 연결을 4 ° c.에 (LXY30-HEVNP-Cy5.5) 유지</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. HEVNP에 바인딩 및 MDA MB231 유방암 세포에 국제화
<ol><li>시드 MDA MB231 유방암 세포는 35 m m 유리로 요리 (5 x 104 접시 당) 바닥 캐비닛 포유류 세포 배양에 O/N.</li>
	<li>셀 바인딩 실험에 대 한 다음 단계 4.2-4.3에 의해 LXY30-HEVNP-Cy5.5를 준비 합니다. 0.01 mg/ml, HEVNP ORF2의 0.188 µ M에 LXY30 HEVNP Cy5.5 희석 (2.2.4 단계로 참조), 0-250 µ L에 1 %FBS / DMEM.<ol>
<li>0.01 mg/mL HEVNP Cy5.5 다음 단계 4.3 하지만 NHS Cy5.5 염료만, (HEV Cy5.5)와 활용에 부정적인 컨트롤 샘플을 준비 합니다. 0.01 mg/ml, HEVNP ORF2의 0.188 µ M에 HEVNP Cy5.5 희석 (2.2.4 단계로 참조), 10%의 250 µ L에서 FBS DMEM 보충.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 M PBS 버퍼, pH 7.4의 250 µ L을 적용 하 여 셀을 한 번 씻어. 세포 배양 접시에 몇 가지 버퍼를 유지 하면서 세척 후 PBS 버퍼를 제거 합니다.</li>
	<li>10% FBS DMEM 또는 HEVNP Cy5.5 10% FBS DMEM 배양된 MDA-MB231 유 방 암 세포를 보충에 보충에 LXY30-HEVNP-Cy5.5의 250 µ L를 적용 합니다. 방패는 셀 교양 알루미늄 호 일 빛에서 요리.</li>
	<li>국제화에 대 한 1 시간에 대 한 캐비닛 37 ° C 세포 배양에서 세포 배양 접시를 유지.</li>
	<li>씻어 얼음에 경작된 한 세포 3 번, 세척, 1 M PBS, pH 7.4의 250 µ L 당 5 분.</li>
	<li>4%에서 셀을 수정 PFA 1 M PBS, pH 7.4 20 분 및 다음 씻어 1 M PBS, pH 7.4의 250 µ L 한번에. 참고: 셀 준비가 이제 confocal 현미경에 의해 수행해입니다. 대표적인 데이터는 그림 5에 나와 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ludwig, C., Wagner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-like+particles-universal+molecular+toolboxes.">Virus-like particles-universal molecular toolboxes.</a> Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).</li><li>Galaway, F. A., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS2+viruslike+particles:+a+robust,+semisynthetic+targeted+drug+delivery+platform.">MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform.</a> Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).</li><li>Ma, Y., Nolte, R. J., Cornelissen, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-free+click+chemistry+for+dynamic+in+vivo+imaging.">Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (43), 16793-16797 (2007).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.

시간이 걸리는 유전 공학 절차는 일반적으로 주, 달리 여기 설명 간단한 2 단계 및 암 ligand를 대상으로 추가의 3 일 안에 완료 될 수 있는 한 단계 화학 활용 절차 및 HEVNPs의 Cys/리스 사이트의 형광 탐지 염료 기술을 사용할 수 있습니다 후보자, 수영장 그리고 따라서 합리적인 비용 및 배달 시 사용할 수 있는 펩 티 드/작은 분자 합성 서비스의 활용에서 최고의 ligand 대상에 대 한 화면으로.
관심사의 단백질에는 polypeptides를 삽입할 수 있습니다만, 전통적인 유전자 공학, 달리 화학 활용 polypeptides, 작은 화학 분자의 표면에 나노 입자 등 다양 한 자료를 연결할 수 있는 관심, Cys 또는 리스 잔류물 반응 사이트로 사용 하는 만큼의 단백질. 화학 활용 사이트에서 같은 잔류물 경우 간단한 Cys/리스 교체 이전 연구4에서 같이 화학적으로 활성화 있도록 관심사의 단백질에 유전으로 수정할 수 있습니다.
제어를 화학 활용만 선택적 반응 사이트, 어원이 분자 활용된 필요 intramolecular 반응성을 피하기 위해 철저 하 게 공부 될 단백질의 구조에서 발생 합니다. 같이 본 펩 티 드 LXY3010를 대상으로 하는 유방암, 중요 한 이황화 결합 주기적 리간드 구조를 안정화. Maleimide의 thiol 반응성, 주어진 maleimide-기능화 LXY30 ligands는 가능성이 결과의 intramolecular 반응에 직접. 대신, 2 단계 활용 (4.2 단계) 클릭 화학 반응을 통해 alkyne 연결 된 LXY30와 maleimide에 연결 된 아 지 드 반응에 의해 수행 되었다. 그러나, 클릭 화학 반응과 thiol 선택 반응 순서는 LXY30-HEVNPs (그림 4)의 구조적 intactness에 대 한 중요 한. CuSO4 촉매 클릭 화학 반응을 통해 LXY30 직접 바인딩 되었습니다 하지 maleimide 하 마이-LXY30 구축. 그 후, 마이-LXY30는 형성된 LXY30 HEVNPs 그들의 네이티브 icosahedral 구조 (그림 4)를 유지할 수는 HEVNP-573 C에 활용 된.

치료 및 진단 배달, nanotheranostics로 알려진에 나노 크기의 벡터의 개발 타겟된 배달1쪽으로 일반적인된 치료에서 생명 의학 분야의 대부분을 이동 했다. 안정적으로 특정 병에 걸리는 직물 또는 생 화 확 적인 통로2,3,4 theranostic 분자를 직접 theranostic 분자와 나노 크기의 벡터 (나노)를 통합 하는 타겟된 nanotheranostic 납품 . 때문에 최적으로 크기의 나노 입자 theranostic 분자의 순환을 안정 한 선택적으로 세포 표면 분자 병 조직에 용량 Nanomedicine 타겟된 배달의 최전선에 왔다. 많은 nanotheranostic 플랫폼은 여전히 수동 셀 이해, 사전 성숙한 저하, 독성, 그리고 theranostic 분자와 부족 한 협회에서 고통. VLPs 많은 타겟된 배달에 이러한 장애물을 극복. 그들은 외국 epitopes를 표시 및/또는 작은 분자를 제공 nanocarriers로 사용 되었습니다: 처방 많은 질병1전투 하는 데 사용할 수 있습니다. 이 응용 프로그램의 속성에 주로 의존 자기 집합의 주어진된 VLP에 대 한 설계 된 응용 프로그램을 수행 하기 위해 유전 수정 용이성 뿐만 아니라. 유전 공학에 비해, VLP에 외국 펩 티 드의 화학 활용 표시 됩니다 중요 한 이점은 다양 한 엔터티, 펩 티 드 등 oligosaccharides, VLPs의 표면에 변조 활용을 허용 하기 때문에 고 VLP 어셈블리의 변경 없이 유연한 방식으로.
HEVNPs, 재조합 형 HEV capsid 단백질, 2nd 오픈에서 파생 된 프레임 (ORF2)를 읽고, 비 전염 성, 자기 조립 capsids 셀 바인딩 및 입장 가능. HEV 점 막 전송에 대 한 진화, 때문에 조립된 capsid 단백질 분해와 산 성 점 막 조건5마찬가지로 안정적입니다. HEVNPs 양식 빈, T = 1 icosahedral capsid, 60 동일한 단위6,7 ORF2의 구성 된 렌더링 매우 안정적인 스토리지 및 가혹한 생리 적인 조건에서. 어떤 바이러스 성 유전자 요소 부족, 효율, 높은 수율 생산 곤충 세포에서 잠재 식 시스템을 통해 이루어집니다. 그들의 분해 안정성 때문에 자기 조립된 HEVNPs 추출 하 고 실질적으로 필요한 정화 단계를 줄여 셀 상쾌한에서 정화. 또한, HEVNPs는 표면 노출된 돌출 도메인 (P) 안정적인 icosahedral 기반에 유연한 힌지 (hinge)를 통해 연결 된 소유. 유연한 힌지는 크게 기본 icosahedral 구조를 타협 하지 않고 P 도메인을 수정 가능 하 게 하는 동안 P 도메인 icosahedral 기지 꼭대기 표면 노출 스파이크를 형성 한다. 60 반복 단위, 단일 사이트 수정 화학 변조 60 대칭 사이트에서 발생합니다. 최근에, 우리는 나노 플랫폼 제안 ligands 또는 theranostic 응용 프로그램에 대 한 작은 분자 화학적 켤레 수 HEVNP를 사용 하 여. 이 maleimide에 연결 된 펩 티 드 또는 분자 반응 사이트로 단일 아미노산 시스테인 HEV VLP의 돌출 도메인에 대체 하 여 달성 되었다. HEV VLP 고 잘 공부 면역성 epitopes8,9의 이전 구조 분석을 바탕으로, 다음 5 HEV VLP 아미노산 잠재적인 후보자로 시스테인으로 교환 되었다: Y485C, T489C, S533C, N573C, 및 T586C ( 그림 1). 식 곤충 세포에서 정화 후에, 그들의 VLP 대형 전송 전자 현미경 (TEM) 관찰 (그림 2)에 의해 확인 되었다 고 노출된 시스테인 사이트 서쪽에 의해 분석 되었다 maleimide 연결 biotin 후 오 점 활용 (그림 2)입니다. 5 명의 돌연변이 중 C HEVNP-573 maleimide biotin 활용 (그림 2)의 강한 신호를 표시 하 고 후속4 (그림 3)를 대상으로 유 방 암 세포에 대 한 nanocarrier로 데모를 위해 사용 되었다.
이 프로토콜은 표면 시스테인 활용을 통해 종양을 대상으로 분자 HEVNPs에 연결할 화학 활용 방법을 묘사 한다. 우리 N573에 시스테인을 포함 하는 재조합 HEVNPs와 종양 대상 및 검출 분자 종양 배달의 활용을 자세히 (HEVNP-573 C). 우리는 펩 티 드, LXY3010 HEVNPs 양식 LXY30-HEVNP (그림 4)를 대상으로 유 방 암 종양을 바인딩할 2 단계 클릭 화학 활용 과정에 집중 했다. 그 후, N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 HEVNPs LXY30-HEVNP-Cy5.5 형광 탐지를 위한 모두 구축 생체 외에서 (그림 5)에 별도 리스 사이트에 활용 했다 고 vivo에서4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="984">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:391px;">MINI Dialysis Units, 10K MWCO</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:265px;">69572</td>
			<td style="width:167px;">mini dialysis unit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Five Cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B85502</td>
			<td>Tn5 cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SF9 Cells&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11496015</td>
			<td>Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11101, A11100</td>
			<td>Baculovirus expression system</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024</td>
			<td>Bacmid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ESF921 Insect Cell Media</td>
			<td>Expression Systems LLC</td>
			<td>96-001-01</td>
			<td>insect cell media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cy5.5 NHS ester, 5mg</td>
			<td>Lumiprobe Corp</td>
			<td>27020</td>
			<td>Cy5.5 NHS ester</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>87766</td>
			<td>spin desalting column</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemical Co</td>
			<td>M8250-250G</td>
			<td>MES</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc</td>
			<td>Depends on Rotor</td>
			<td>ultracentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NPO321BOX</td>
			<td>SDS protein gel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellfectin II Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10362100</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:391px;">EMS Glow Discharger</td>
			<td style="width:161px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td>glow discharger</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface functionalization of hepatitis e virus nanoparticles using chemical conjugation methods

바이러스 같은 입자 (VLPs) 외국 epitopes를 표시 및/또는 검색 및 다양 한 질병의 치료에 작은 분자를 제공 nanocarriers로 사용 되었습니다. 이 응용 프로그램 자기 조립, 유전 수정에 의존 하 고 재조합 VLPs. 종양을 대상으로 하는 응용 프로그램을 수행 하기 위해 시스테인 활용 유전자와 비교 제공 하는 VLPs에 외국 펩 티 드의 수정 혼자, 화학 활용 한 중요 한 다양 한 엔터티, 합성 펩 티 드 등 oligosaccharides, VLP 어셈블리의 변경 없이 변조 하 고 유연한 방식으로 VLPs의 표면에 활용 될 수 있기 때문에 이점.
여기, 다기능 배달 캐리어로 간염 E 바이러스 나노 (HEVNP), 모듈화 된 theranostic 캡슐을 사용 하는 방법을 보여 줍니다. HEVNPs의 기능 조직 대상으로, 이미징, 및 치료 배달 포함 됩니다. HEVNP의 잘 설립 구조 연구에 따라, 구조적으로 독립적이 고 표면 노출 잔류물 thiol 선택적 연계를 통해 화학 그룹 maleimide 연결에 대 한 활용 사이트 시스테인 교체에 대 한 선정 됐다. 하나의 특정 시스테인 수정 HEVNP (573에 아스파라긴의 Cys 교체 aa (HEVNP-573 C)) 유 방 암 세포 특정 리간드, LXY30에 활용 되었고, 근처-적외선 (NIR) 형광 염료 (Cy5.5), 종양 대상 렌더링으로 표시 효과적인 진단 캡슐 (LXY30-HEVNP-Cy5.5)로 HEVNPs. 비슷한 엔지니어링 전략 theranostic 배달에 잠재적인 응용 프로그램을 탐험 잘 알려진 원자 구조와 다른 고분자 단지와 함께 사용할 수 있습니다.

HEV-VLPs, 유사 모든 Cys HEVNPs 형성 성 icosahedral capsids 수정 하 고 생산 또는 정화 하는 동안 솔루션에 집계 되지 않았다. 전과 Cys의 각 단일 단계 maleimide-biotin 활용 수정 후 HEVNPs 부정적인 얼룩 EM (그림 2)에서 HEV-VLPs에서 구별할 수 없었다. Cys 수정된 HEVNPs chemiluminescent streptavidin 바인딩을 통해 서 부 럽으로 처음 테스트에 Maleimide biotin 활용 효율성. Maleimide-비타민 b 복합체 활용, 다음 Cys 수정 표시 HEVNPs streptavidin 바인딩 신호 (그림 2).
효과적인 2 단계 시스테인 활용 활용 밖으로 실시 됐다 하는 순서에 의해 영향을 받았습니다. 때문에 α3β1 integrin은 overexpressed에서 유방암 종양 세포, 합성 리간드, LXY30, α3β1에 특정 선호도10로 선정 되었습니다 종양을 대상으로 어원이 분자. LXY30 intermolecular 이황화 결합; 통해 cyclized 때문에 LXY30의 직접 maleimide (마이) 기능화 실현 되지 않았습니다. 따라서, self-reactivity에 대 한 관심사가 있었다. 대신, LXY30 alkyne 그룹과 공업화 되었고 클릭 화학 반응을 통해 maleimide-아 지 드에 바인딩된. HEV-573 C NPs는 먼저 maleimide-아 지 드에 바운스 되었다 때 가장 관찰 (그림 4C) 분해 HEV-573 C NPs 나타났다 LXY30-alkyne를 클릭 화학 반응에 의해 따라. 그러나, 형태로 마이-LXY30, 마이-LXY30 활용 Cys 수정 HEVNPs (LXY30-말-Cy5.5) 다음 LXY30 alkyne와 maleimide-아 지 드 초기 클릭 화학 반응의 구조 (그림 4B) 영향을 주지 않았다. 그림 4 는 종양 세포를 대상으로 HEVNPs의 LXY30 기능화의 회로도 묘사 한다.
Ligand, LXY30을 대상으로 유방암을 활용 하는 HEVNPs (LXY30-HEVNPs) 고 교양된 유방암 세포에는 내 면화 했다. 형광 탐지, LXY30 HEVNPs 및 언바운드 HEVNP-573Cs와 함께 표시 했다에 대 한 보 건국 기능성 HEVNP에 신의 1 차 아민 커플링을 통해 Cy5.5 형광 염료 (NHS-Cy5.5)-573Cs. LXY30-HEVNP-Cy5.5 및 HEVNP Cy5.5 경작에 적용 했다 유방암 세포 (MDA-MB-231), 그리고 confocal 현미경 검사 법에 의해 관찰. Confocal 현미경으로 NIR 형광 이미지는 LXY30-HEVNP-Cy5.5 높은 대 한 선호도 MDA-MB-231 유방암 세포 HEVNP-Cy5.5 (그림 5)에 비해 증가 국제화를 바인딩 했다 나타냅니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57020/57020fig1.jpg"> 그림 1: 간염 E 바이러스 나노 입자의 표면 돌출 도메인에 시스테인 교체. 시스테인 돌연변이 잔류물 ORF2 HEV의 이차 구조에 방해를 최소화 하기 위해 Y485, T489, S533, N573, 그리고 유연한 코일 지역에서 T586에 대 한 제안 했다 (A). 시스테인 돌연변이 대 한 모든 선택 된 잔류물 돌출 (P) 도메인의 표면에 위치 하 고 있습니다 (회색; 다른 도메인은 쉘 (S)-도메인 블루와 중간 (M)-핑크에서 도메인), 찌 꺼 기는 가장 바깥쪽에 (오렌지) Y485 (사이안), T489 (노란색), T586와 함께 표면, 및 잔류물 S533 (마젠타색) 및 N573 (레드) HEVNP (B)의 배 축에 직면 하는 측에. 그림 첸 외 에서 20164 권한이 수정 되었습니다. <a href="/files/ftp_upload/57020/57020fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57020/57020fig2.jpg"> 그림 2: HEVNP 모든 Cys 예 수정 HEVNPs N573C를 나르는. HEVNP-573 C 둥근 돌출부 전자 현미경 사진 (A)에 등장 하 고 말-biotinylating 활용 (B) 후 그대로 입자로 남아 있었다. Cys 수정 HEVNPs의 활용 및 epitope 노출의 대표적인 결과. 그들은 시스테인-maleimide 커플링을 통해 maleimide biotin에 바인딩된 되었고 이후 통해 streptavidin 바인딩에 대 한 서쪽 오 점 분석. N573에서 시스테인 돌연변이 허용 되는 다른 돌연변이 사이트, 즉, Y485, T489, S533, 및 T586에 비해 HEVNP에 효율적인 biotinylation (C). Equals 100 nm 바. <a href="/files/ftp_upload/57020/57020fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57020/57020fig3.jpg"> 그림 3: 특별히 Cy5.5 분류 LXY30-HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5)와 대상으로 유방암 세포의 도식. LXY30-HEVNP-Cy5.5 선택적으로 유 방 암 세포 막에 지나치게 표현된 integrin은 α3β1, LXY30의 특정 선호도 때문에 유방암 세포 (마젠타)에 바인딩합니다. <a href="/files/ftp_upload/57020/57020fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57020/57020fig4.jpg"> 그림 4: thiol 선택적 반응 및 구리 촉매 아 지 드 alkyne cycloaddition 또는 LXY30-HEVNPs 구축 '화학 클릭' 반응을 포함 하 여 2 단계 화학 활용 프로세스의 도식. 두 가지 방법은 테스트 되었습니다. 방법 1: 구리 촉매 아 지 드 alkyne cycloaddition 말-아 지 드와 alkyne-LXY30 사이 반응 양식 말 연결 LXY30 (말-LXY30)은 먼저 수행 되었다. 다음 말 LXY30 Cys 사이트 HEV-573 C NPs (A)의 반응에 추가 되었습니다. LXY30와 Cy5.5 장식 HEV-573 C NPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) 결국 온전 하 게 남아이 화학 활용 과정 (B). 방법 2: 아 지 드 연결 HEVNPs (아 지 드-HEVNPs), LXY30-alkyne, ascorbic 산 및 CuSO4 추가 하 여 다음을 구축 thiol 선택적 반응을 통해 HEV-573 C NPs의 Cys 사이트에서 말 연결 아 지 드 (말-아 지 드)의 라벨 활용 과정 시작 을 LXY30에 연결 된 HEVNPs (LXY30-HEVNPs) (A)를 형성. 그러나, 대부분 LXY30-HEVNPs는 손상 되거나 반응 시 약, 아 지 드, CuSO4 (C), 의약품, 등으로 발생할 수 있는 활용 프로세스에서 분해 했다. 말: Maleimide. 이 그림 동의 20164 첸 외 에서 수정 되었습니다. <a href="/files/ftp_upload/57020/57020fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57020/57020fig5.jpg"> 그림 5: 셀 바인딩 및 국제화의의 대표적인 결과 붙일 표시 된 LXY30-HEVNPs는 MDA-MB-231 유방암 세포에 바인딩합니다. LXY30-HEVNP-Cy5.5 MDA-MB-231 셀에 대상의 NIR 형광 이미지. 했다 스테인드 DAPI에서 (파란색), 핵의 신호 및 Cy5.5 (빨간색)의 신호는 confocal 형광 현미경을 사용 하 여 인수 했다. 이 그림 동의 20164 첸 외 에서 수정 되었습니다. <a href="/files/ftp_upload/57020/57020fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

간염 E 바이러스 나노 화학 활용 방법을 사용 하 여의 표면 기능화

우리 theranostic 나노 (HEVNP)으로 간염 E 바이러스 capsid 단백질을 설계 했습니다. HEVNP 자동으로 안정 된 icosahedral 점 막 배달에 조립. 여기, 시스테인, 특히 종양 세포를 묶는 합성 ligands 켤레를 표면 노출 잔류물을 변경 하 여 대상으로 하는 종양에 대 한 HEVNPs의 수정을 설명 합니다.

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

surface-functionalization-hepatitis-e-virus-nanoparticles-using

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.8K 조회수.  University of California Davis. 우리 theranostic 나노 (HEVNP)으로 간염 E 바이러스 capsid 단백질을 설계 했습니다. HEVNP 자동으로 안정 된 icosahedral 점 막 배달에 조립. 여기, 시스테인, 특히 종양 세포를 묶는 합성 ligands 켤레를 표면 노출 잔류물을 변경 하 여 대상으로 하는 종양에 대 한 HEVNPs의 수정을 설명 합니다.

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Soft Lithographic Functionalization and Patterning Oxide-free Silicon and Germanium

The development of hybrid electronic devices relies in large part on the integration of (bio)organic materials and inorganic semiconductors through a stable interface that permits efficient electron transport and protects underlying substrates from oxidative degradation. Group IV semiconductors can be effectively protected with highly-ordered self-assembled monolayers (SAMs) composed of simple alkyl chains that act as impervious barriers to both organic and aqueous solutions. Simple alkyl SAMs, however, are inert and not amenable to traditional patterning techniques. The motivation for immobilizing organic molecular systems on semiconductors is to impart new functionality to the surface that can provide optical, electronic, and mechanical function, as well as chemical and biological activity. 
Microcontact printing (&mu;CP) is a soft-lithographic technique for patterning SAMs on myriad surfaces.1-9 Despite its simplicity and versatility, the approach has been largely limited to noble metal surfaces and has not been well developed for pattern transfer to technologically important substrates such as oxide-free silicon and germanium. Furthermore, because this technique relies on the ink diffusion to transfer pattern from the elastomer to substrate, the resolution of such traditional printing is essentially limited to near 1 &mu;m.10-16
In contrast to traditional printing, inkless &mu;CP patterning relies on a specific reaction between a surface-immobilized substrate and a stamp-bound catalyst. Because the technique does not rely on diffusive SAM formation, it significantly expands the diversity of patternable surfaces. In addition, the inkless technique obviates the feature size limitations imposed by molecular diffusion, facilitating replication of very small (&lt;200 nm) features.17-23 However, up till now, inkless &mu;CP has been mainly used for patterning relatively disordered molecular systems, which do not protect underlying surfaces from degradation.
Here, we report a simple, reliable high-throughput method for patterning passivated silicon and germanium with reactive organic monolayers and demonstrate selective functionalization of the patterned substrates with both small molecules and proteins. The technique utilizes a preformed NHS-reactive bilayered system on oxide-free silicon and germanium. The NHS moiety is hydrolyzed in a pattern-specific manner with a sulfonic acid-modified acrylate stamp to produce chemically distinct patterns of NHS-activated and free carboxylic acids. A significant limitation to the resolution of many &mu;CP techniques is the use of PDMS material which lacks the mechanical rigidity necessary for high fidelity transfer. To alleviate this limitation we utilized a polyurethane acrylate polymer, a relatively rigid material that can be easily functionalized with different organic moieties. Our patterning approach completely protects both silicon and germanium from chemical oxidation, provides precise control over the shape and size of the patterned features, and gives ready access to chemically discriminated patterns that can be further functionalized with both organic and biological molecules. The approach is general and applicable to other technologically-relevant surfaces.

Here we describe a simple method for patterning oxide-free silicon and germanium with reactive organic monolayers and demonstrate functionalization of the patterned substrates with small molecules and proteins. The approach completely protects surfaces from chemical oxidation, provides precise control over feature morphology, and provides ready access to chemically discriminated patterns.

소프트 리소그래피 작용화 및 Patterning 산화물없는 실리콘과 게르마늄

The development of hybrid electronic devices relies in large part on the integration of (bio)organic materials and inorganic semiconductors through a ...

연구

생체공학

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Polyanhydride의 Nanoparticles에 의해 유도된 Murine Macrophages 폐포 수확 및 평가 세포 활성화

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

Polyanhydride의 Nanoparticles의 높은 처리량 탄수화물의 합성과 작용화

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular choice for drug delivery applications, particularly since it is already FDA-approved for use in humans in the form of resorbable sutures. Hydrophobic and hydrophilic drugs are encapsulated in PLGA particles via single- or double-emulsion. Briefly, the drug is dissolved with polymer or emulsified with polymer in an organic phase that is then emulsified with the aqueous phase. After the solvent has evaporated, particles are washed and collected via centrifugation for lyophilization and long term storage. PLGA degrades slowly via hydrolysis in aqueous environments, and encapsulated agents are released over a period of weeks to months. Although PLGA is a material that possesses many advantages for drug delivery, reproducible formation of nanoparticles can be challenging; considerable variability is introduced by the use of different equipment, reagents batch, and precise method of emulsification. Here, we describe in great detail the formation and characterization of microparticles and nanoparticles formed by single- or double-emulsion using the emulsifying agent vitamin E-TPGS. Particle morphology and size are determined with scanning electron microscopy (SEM). We provide representative SEM images for nanoparticles produced with varying emulsifier concentration, as well as examples of imaging artifacts and failed emulsifications. This protocol can be readily adapted to use alternative emulsifiers (e.g. poly(vinyl alcohol), PVA) or solvents (e.g.&#160;dichloromethane, DCM).

We describe the production and characterization of nanoparticles and microparticles composed of poly(lactic-co-glycolic acid) using vitamin E-TPGS as an emulsifier. By varying formulation parameters such as the concentration of emulsifier, it is possible to produce nanoparticles with mean diameters ranging from 220 nm to&#160;1.98 &#181;m.

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, genetic programmability, and biodegradability. While they&#39;re highly amenable to bioconjugation reactions for adding synthetic ligands onto their surface, the range in bioconjugation methodologies on these aqueous born capsids is relatively limited. To facilitate the direction of functional biomaterials research, non-traditional bioconjugation reactions must be considered. The reaction described in this protocol uses dibromomaleimides to introduce new functionality in the solvent exposed disulfide bonds of a VLP based upon Bacteriophage Q&#946;. Furthermore, the final product is fluorescent, which has the added benefit of generating a trackable in vitro probe using a commercially available filter set.

Here, we present a procedure to fluorescently functionalize the disulfides on Q&#946; VLP with dibromomaleimide. We describe Q&#946; expression and purification, the synthesis of dibromomaleimide-functionalized molecules, and the conjugation reaction between dibromomaleimide and Q&#946;. The resulting yellow fluorescent conjugated particle can be used as a fluorescence probe inside cells.

Dibromomaleimide-아 황산 화학에 의해 형광 PEGylated 바이러스 같은 입자 활용 유도 만들기

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

고분자 나노 입자에 소수 성 및 친수성 화합물의 캡슐화에 대 한 NanoPrecipitation 플래시

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical success for treating previously &#8216;undruggable&#8217; hepatic disease targets with siRNA has been achieved. However, efficient tumor siRNA delivery necessitates additional pharmacokinetic design considerations, including long circulation time, evasion of clearance organs (e.g., liver and kidneys), and tumor penetration and retention. Here, we describe the preparation and in vitro physicochemical/biological characterization of polymeric nanoparticles designed for efficient siRNA delivery, particularly to non-hepatic tissues such as tumors. The siRNA nanoparticles are prepared by electrostatic complexation of siRNA and the diblock copolymer poly(ethylene glycol-b-[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate-co-butyl methacrylate]) (PEG-DB) to form polyion complexes (polyplexes) where siRNA is sequestered within the polyplex core and PEG forms a hydrophilic, neutrally-charged corona. Moreover, the DB block becomes membrane-lytic as vesicles of the endolysosomal pathway acidify (&#60; pH 6.8), triggering endosomal escape and cytosolic delivery of siRNA. Methods to characterize the physicochemical characteristics of siRNA nanoparticles such as size, surface charge, particle morphology, and siRNA loading are described. Bioactivity of siRNA nanoparticles is measured using luciferase as a model gene in a rapid and high-throughput gene silencing assay. Designs which pass these initial tests (such as PEG-DB-based polyplexes) are considered appropriate for translation to preclinical animal studies assessing the delivery of siRNA to tumors or other sites of pathology.

Methods to prepare and characterize the physicochemical properties and bioactivity of neutrally-charged, pH-responsive siRNA nanoparticles are presented. Criteria for successful siRNA nanomedicines such as size, morphology, surface charge, siRNA loading, and gene silencing are discussed.

사이토 솔 릭 siRNA 전달을 위한 중성 충전, pH 반응 형 고분자 나노 입자의 제조

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical ...

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different infectious diseases. In this article we demonstrate a method to produce a SAPN core containing a six-helix bundle (SHB) assembly that is capable of presenting antigens in a trimeric conformation. We describe the expression of the SHB-SAPN in an E. coli system, as well as the necessary protein purification steps. We included an isopropanol wash step to reduce the residual bacterial lipopolysaccharide. As an indication of the protein identity and purity, the protein reacted with known monoclonal antibodies in Western blot analyses. After refolding, the size of the particles fell in the expected range (20 to 100 nm), which was confirmed by dynamic light scattering, nanoparticle tracking analysis, and transmission electron microscopy. The methodology described here is optimized for the SHB-SAPN, however, with only slight modifications it can be applied to other SAPN constructs. This method is also easily transferable to large scale production for GMP manufacturing for human vaccines.

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

A detailed method is provided here describing the purification, refolding, and characterization of self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) for use in vaccine development.

삼중 에피토프 프리젠 테이션을 필요로하는 백신을위한 대장균- 발현 자가 조립 단백질 나노 입자의 생산

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high encapsulation efficiency. Use of lipid nanoparticles (LNPs) to encapsulate nucleic acids is advantageous to protect the RNA or DNA from degradation, while also promoting cellular uptake. LNPs often contain multiple lipid components including an ionizable lipid, helper lipid, cholesterol, and polyethylene glycol (PEG) conjugated lipid. LNPs can readily encapsulate nucleic acids due to the ionizable lipid presence, which at low pH is cationic and allows for complexation with negatively charged RNA or DNA. Here LNPs are formed by encapsulating messenger RNA (mRNA) or plasmid DNA (pDNA) using rapid mixing of the lipid components in an organic phase and the nucleic acid component in an aqueous phase. This mixing is performed using a precise microfluidic mixing platform, allowing for nanoparticle self-assembly while maintaining laminar flow. The hydrodynamic size and polydispersity are measured using dynamic light scattering (DLS). The effective surface charge on the LNP is determined by measuring the zeta potential. The encapsulation efficiency is characterized using a fluorescent dye to quantify entrapped nucleic acid. Representative results demonstrate the reproducibility of this method and the influence that different formulation and process parameters have on the developed LNPs.

Lipid nanoparticles are developed using a microfluidic mixing platform approach for mRNA and DNA encapsulation.

미세 유체 혼합 플랫폼을 사용하여 유전자 전달을 위한 지질 나노 입자 제조 및 특성화

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...