Biz Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura ve Kana Kişida kritik yorum ve teknik destek verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen tarzı için ulusal üniversite reformu teşvik için Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji programı tarafından finanse edildi; Bilim (16H 02593) tanıtım, Asada Bilim Vakfı ve Takeda Bilim Vakfı'na tw Japonya Derneği Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.

Bu çalışma Kılavuzu'nda bulunan öneriler için bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Yamanashi Üniversitesi ile sıkı uygun olarak gerçekleştirildi. Protokol ve Yamanashi Üniversitesi hayvan deneyleri Etik Komitesi tarafından kabul edildi (izin numarası: A24-50). Tüm ameliyat tribromoethanol anestezi altında gerçekleştirilen ve tüm çabaları acı en aza indirmek için yapılmıştır. Yordamlar ve saatleri resimli bir bakış gösterilir Şekil 1 ve Tablo 1, anılan sıraya göre.
1. mesajcı RNA (mRNA eGFP-H2B,In Vitro transkripsiyonu) hazırlık
<ol><li>Şablon DNA pTOPO-eGFP-H2B3,7 5 µg ile 30 U değil / linearize ben 37 ° C'de 50 µL gecede.</li>
	<li>Onay sindirilir DNA'ın 1.5 µL olup olmadığını tamamen Elektroforez tarafından sindirilmiş toplamak.<ol>
<li>1,5 µL ve 3-5 µL sindirilmemiş DNA boya de %2 özel jel, sırasıyla yükleme ile ve Elektroforez tabi geçerlidir. Not: Eğer tamamen sindirilmiş, tek bir bant (yaklaşık 5 kb) görülmektedir. Sindirilmemiş DNA farklı bir konumda görünür bir denetim olarak kullanılır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>GKD2O 151.5 µL ekleyip 200 µL kalan için fenol/kloroform/izoamil alkol (25:24:1) DNA sindirilir.<ol>
<li>Gönderen vortex kuvvetle karıştırın.</li>
		<li>15 dakika maksimum hızda santrifüj kapasitesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Süpernatant kurtarmak ve kloroform 200 µL ekleyin.<ol>
<li>Gönderen vortex kuvvetle karıştırın.</li>
		<li>15 dakika maksimum hızda santrifüj kapasitesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Süpernatant yeniden elde etmek ve daha sonra 20 µL 3 M sodyum asetat ve ethachinmate 1,5 µL ekleyin.<ol>
<li>Gönderen vortex kuvvetle karıştırın.</li>
		<li>550 µL % 100 etanol ekleyin ve sonra girdap tarafından kuvvetle karıştırın.</li>
		<li>15 dakika maksimum hızda santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant atın ve Öyleyse Pelet % 70 etanol ile yıkayın.</li>
		<li>Pelet buharlaşma için 5-10 dk tarafından kuru.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çöktürülmüş plazmid DNA nükleaz ücretsiz su 8 µL'geçiyoruz.</li>
	<li>Plazmid konsantrasyon değerlendirmek (beklenen konsantrasyonu olduğunu hakkında 300-500 ng/µL) üretici öğretim takip ederek nanodrop ile.</li>
	<li>Vitro transkripsiyon mRNA üreticinin yönergelerini izleyerek eGFP-H2B ile 1 µg saf DNA'ın bir şablonu olarak toplam reaksiyon hacminin 20 µL kodlama için gerçekleştirin.<ol>
<li>Vitro transkripsiyon sonra 36 μL su ekleyin sonra 1,5 µL analiz için sentezlenmiş mRNA 56 µL Elektroforez tarafından (olmadan poli gibi A) olarak kurtarılır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Poli A takip 100 µL tepki birimindeki sentezlenmiş mRNA için üreticinin yönergelerini izleyerek gerçekleştirin.</li>
	<li>Lityum klorür yağış çözüm 60 µL poly eGFP-H2B kuyruklu bir mRNA ekleyin ve sonra kuvvetle karıştırın.<ol>
<li>-30 ° c 30 dk için serin.</li>
		<li>15 dakika maksimum hızda santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant atın ve Öyleyse Pelet % 70 etanol ile yıkayın.</li>
		<li>Pelet buharlaşma için 5-10 dk tarafından kuru.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isıtma için 30 dk 55 ° C'de tarafından 20 µL nükleaz ücretsiz su ile Pelet geçiyoruz.</li>
	<li>Nanodrop ile zarlarını mRNA konsantrasyonu değerlendirmek. İçin 500 ng/µL nükleaz ücretsiz su ve mağaza-80 ° c kadar kullanmak oranında seyreltin.</li>
	<li>Tercih edilen mRNA üretim onaylamak; 1 µL/olmadan mRNA (1.8.1 ve 1.12 adımları sırasıyla elde) konu poli 0.1 mg/mL arasında etidyum bromür 1,5 µL ve Elektroforez analiz için örnek yükleme boya 3 µL ile karışık bir kuyruk. Uygulanan birim 5.5 µL yapıldı. Not: Poli A takip başarılı olursa, ötelenen grubun mRNA poli bir takip olmadan göre (Şekil 2A) dikkat edilmelidir.</li>
</ol>2. Vasectomized erkek fareler hazırlanması
<ol><li>ICR erkek fareler 8-12 ayda bir ağırlık ölçeği kullanarak tartın.</li>
	<li>İntraperitoneally erkek fareler 0.7 - 0.9 mL % 1.2 tribromoethanol anestezi ile enjekte et. Not: Anestezi fare boyutuna bağlıdır. Örneğin, 40 gr ağırlığında bir fare tribromoethanol anestezi ile 0.8 mL enjekte edilir.</li>
	<li>Berry % 70 etanol ile ıslak.</li>
	<li>Bir küçük berry (3-5 mm) kesilmiş ve sonra bir makas yardımı ile kas duvardaki bir kesi yapmak olun. Not: Makas ve forseps % 70 etanol ile ameliyat başlamadan önce temizlenmelidir.</li>
	<li>Forseps ile yağ yastığı kavrama ve yavaşça çekin. Daha sonra testis ve vas deferens görünür. Not: Vas deferens U şeklinde bir tüp olduğunu ve bir kırmızı kan damarı ile.</li>
	<li>Cerrahi sütür ile iki puan, vas deferens bağlayın ve sonra bağlı nokta arasındaki orta kısmını kesti.</li>
	<li>Yavaşça geri yağ yastığı ve testis berry itin.<ol>
<li>Kalan testisin ameliyatla yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kas Duvar ile cerrahi sütür ile iki dikiş dikmek.</li>
</ol>3. TÜP BEBEK
<ol><li>8 - 10 - hafta eski kadın B6D2F1 enjekte 7.5 IU at koryonik gonadotropin (EKG) ve 46-50 h aralığında insan korionik gonadotropin (hCG) ile intraperitoneally (BDF1) fareler.</li>
	<li>Capacitation ve döllenme 1 gün 30 mm çanak IVF öncesine damla 300 µL insan tubal sıvı (HTF)8 ortam hazırlamak, bu damlalar laboratuvar tezgah üzerinde mineral yağ ile kapak ve bir kuluçka makinesine bir gecede preincubate.</li>
	<li>Olgunlaştı erkek ICR fareler tarafından servikal çıkığı kurban. Kauda epididim 27-G iğne ile incelemek ve spermatozoon toplamak. Onları 1-2 h 38 ° C'de HTF medyasının 300 µL içinde capacitation için kültür</li>
	<li>hCG enjeksiyonu sonra 16 h tarafından servikal çıkık dişi fareler süper ovulated kurban. Mineral yağ HTF medya yanında içine ovidukt ampulla transfer ve kümülüs hücreleri ve yumurta karmaşık bu ovidukt ampulla tarafından 30-G iğne preincubated döllenme-HTF orta çizin. Not: Kadın bazı fareler genellikle yumurtlama süper yumurtlama tedaviye rağmen gösterme. Genişlemiş ovidukt ampulla yumurtlama belirtisidir.</li>
	<li>Capacitation sonra 2-3 µL capacitated spermatozoon, hangi ovulated yumurta toplanmıştır tohumlama HTF medya içine aktarın.</li>
	<li>1 h tohumlama sonra döllenmiş zigotları toplamak ve onları 100 µg/mL CZB9 medya 10 dk, hyaluronidase ile tedavi. Not: Döllenme düzgün gerçekleştirildiğinde, tohumlama sonra 1 h 2nd kutup beden ile döllenmiş zigotları gözlenir. Daha az veya düşük kaliteli sperm kullandıysanız, yalnızca küçük zigotları 2nd kutup beden ile gözlenir. Ayrıca, birçok spermlerinin döllenme için kullanılması halinde, polyspermy oluşur. Uygun döllenme zigotları ile erkek ve dişi pronuclei yol açar. Bu ölçütleri kullanarak, tohumlama iyi ya da değil bitmiş bulmak mümkündür.<ol>
<li>CZB medya yıkandıktan sonra ikinci bir kutup gövdeli zigotları mikroenjeksiyon ile eGFP-H2B mRNA tabi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Oda ve mikroenjeksiyon pipetler hazırlanması
<ol><li>EGFP-H2B nükleaz ücretsiz su 250 ng/µL bir konsantrasyon elde etmek için kullanarak kodlama RNA sulandırmak.</li>
	<li>2-3 damla PVP-HTF hazırlamak ve eGFP-H2B mRNA damla ve CZB (H-CZB) damla 60 mm çanak üzerinde 5-6 damla Hepes arabelleğe alınmış. Bu damla mineral yağ ile kapak. Not: Bu hazırlıklar laboratuvar tezgah üzerinde gerçekleştirilebilir. Laminer hava akımı kabine kullanmak için bir gereksinim vardır.</li>
	<li>Çek borosilikat cam micropipette çektirme ile (Örneğin, P = 500, ısı 825, çekme = = 30, vel = 120 ve saat = 200)</li>
	<li>Pipet Ucu kırdıktan sonra çekti cam mikroenjeksiyon pipet ucu (geri −300 µm) yakın bir microforge kullanarak yaklaşık 30 ° eğil.</li>
</ol>5. mikroenjeksiyon
<ol><li>Tabak ısıtıcı bir piezo ile zigotları öldürülmesi mRNA enjeksiyon sırasında önlemek için micromanipulator aşamasında açın.</li>
	<li>Yıkama ve enjeksiyon iğneler HEPES tampon HTF iç kat % 10 içeren PVP (PVP-HTF).</li>
	<li>2nd kutup beden (Şekil 2B) ile döllenmiş zigotları toplamak ve 20-25 zigotları odası ile bir micromanipulator bağlı mikroskop sahne alanı'nın üzerine aktarın.</li>
	<li>Seyreltilmiş eGFP-H2B mRNA borosilikat cam kılcal ipuçları içine doldurun.</li>
	<li>Zigot holding pipet ile tutun ve sonra zona pelusida ve piezo sürücü ile sitozolik membran bölün.</li>
	<li>Yaklaşık 10 enjekte pL mRNA zigotları sitoplazma içine. MRNA-enjeksiyon uzun kuluçka makinesi dışında zigotları kültür tarafından hasarları önlemek için 10 dakika içinde bitirmek. Not: Enjeksiyon hacmi 2nd kutup gövde metni olarak büyük olması gerekir. MRNA enjekte miktarı çok büyük ise, mobil kesir etkileyebilir ücretsiz eGFP-H2B kesir neden mümkündür.</li>
	<li>10 dakika sonra mikroenjeksiyon, en az 3 damla yıkama ve zFRAP analiz kadar 38 ° C'de CZB içinde zigotları enjekte kültür.</li>
</ol>6. zFRAP Analizi
<ol><li>Lazer ve confocal mikroskop sahne alanı'na bağlı Isıtma levhası 1s zFRAP Analizi önce açın. Sıcaklığı 38 ° C'de ayarlamak</li>
	<li>6-10 µL HEPES tampon CZB medya 60 mm cam alt çanak üzerinde mineral yağ ile kaplıdır ve sıcak ısıtıcısını zigot koleksiyonu kadar koymak.</li>
	<li>8 - 12 h tohumlama sonra toplamak 5-10 eGFP H2B ifade zigotları ve transfer içine 6-10 µL HEPES tampon CZB orta damla önceden ısındı. Not: uzun inkübatör dışında kültür önlemek için 5-10 eGFP H2B ifade zigotları her Analizi kullanılmıştır. 5-10 zigotları için 1s içinde analiz edilebilir.</li>
	<li>Ağartma ve görüntüleme koşulları üreticinin talimatlarına göre ayarlayın. Durumda confocal bir lazer mikroskop (Tablo reçetesi) tarama aşağıda gösterilmiştir:<ol>
<li>Kullanım 60 X Petrol mercek (60 X 60 X / 1,35 petrol). Not: Lensler daha yüksek büyütme (daha yüksek sayısal diyafram) gösteri daha yüksek hassasiyet ile.</li>
		<li>Tarama hızı 4.0 µs/piksel ve boyut "512" "Satın alma ayarı" (Tamamlayıcı Şekil 1) olarak ayarlayın.</li>
		<li>Dijital zoom "5" (Tamamlayıcı Şekil 1) artırın. Not: Daha yüksek zoom odak kayması ya da değil oluşur tanımak için gereklidir.</li>
		<li>Boya listesi (ek Şekil 1) ve sonra seçti "EGFP" açın. Set gözlem zaman 1.6 s (aralığı "ücretsiz Çalıştır" ayarı olarak ayarlanır) (Tamamlayıcı Şekil 1) Not: Daha fazla gözlem noktaları daha ayrıntılı veri neden olabilir, ancak aynı zamanda fototoksisite neden olabilir. ZFRAP analizde, 1.6 s gözlem vakit kromatin gevşekliği ebeveyn asimetri algılamak için yeterli gibi görünüyor.</li>
		<li>Fotoğraf sayısı 12 toplam (Tamamlayıcı Şekil 1) olarak ayarlayın.</li>
		<li>Start "Uyarıcı ayarı" paneli ve "Ana" UseScanner'ı tıklatın. Tarama hızı 10.0 µs/piksel olarak ayarlayın. "Harekete geçirmek içinde" serisini ve PreActivation "5 sn" (Tamamlayıcı Şekil 1) "3 kare" ve harekete geçirmek zaman ayarlayın.</li>
		<li>"Odak x 2" tıklayın ve odağı ayarlayın ve sonra "Dur".</li>
		<li>Ağartma ve lazer güç görüntüleme ayarla (477 nm) 110 ve 15 µW at, sırasıyla, tarafından ayarlama "gage güç lazer" (Tamamlayıcı Şekil 1). Not: Çok güçlü ağartma Nicel analiz zorluğa neden oluyor daha büyük bir ağartılmış alan neden olabilir. Lazer Güç ölçüm için bir güç ölçer kullanın. Lazer güç zamanla ilgili bir bozulma etkisini önlemek için lazer güç onaylamak önemlidir.</li>
		<li>"Küçük Rect" (Tamamlayıcı Şekil 1) uyarıcı ayar panelinde tıklatın. Faiz (ROI; kırmızı; bölgesi ayarlayın YG #1B) 40 x 40 piksel (7.6 µm2) olarak. Hazırlamak bir başvuru bölgesi (REF; yeşil; Yatırım getirisi #2) ve bir arka plan (BG; mavi; Yatırım getirisi #3) kullanarak "ROI" kopyalayıp "ROI" (fare sağ tıklatma düğmesi). Not: Piksel boyutunu imleç yatırım getirisi üzerinde olduğunda fare sağ tuşa basarak denilen "ROI Yöneticisi" aracılığıyla ayarlanabilir. Daha büyük ROIs zFRAP puan dağılımı standartlaştırmak bu yana daha iyi olduğu düşünülür. Çekirdekçik habercisi vücut (NEH) önlemek zorlaştırıyor çünkü ancak, çok büyük bir yatırım getirisi, bu çözümleme için kullanılamaz. eGFP-H2B bu yerde kromatin ücretsiz olduğu düşünülen ve dikkate değer daha yüksek hareketlilik3gösterdi. Yatırım getirisi ve REF alanları mümkün olduğunca ayrılmalıdır. Bu iki bölgeye yakın iseniz, ağartma REF bölge da etkileyebilir.</li>
		<li>"Canlı" araç çubuğunda tıklatın ve "Live çıkart" (Tamamlayıcı Şekil 1) başlatın. Not: Canlı çizim floresans sinyal yoğunluğu içinde her yatırım getirisini gösterir ve lazer güç HV kullanarak ayarlamak için kullanılır. Yatırım getirisi seçilmemişse, hiçbir yoğunluğu canlı Arsa panelde algılanan unutmayın.</li>
		<li>Yatırım getirisi konum belirleme Not: Yatırım getirisi pronuclei istediğiniz konuma sürükleyerek hareket edebilir. (1) olmak emin çekirdekçik önlemek ve uygun (2) tüm ROI nucleoplasm. ROI içinde nükleer membran (sitoplazma) alanı dışında bölge içermez. Böylece ROI sitoplazma içerir olup olmadığını ya da değil eGFP-H2B floresans bulmak kolay eGFP-H2B lokalizasyonu nucleoplasm son derece sınırlıdır. Erkek pronuclei kez 2nd kutup cesedin yanında lokalize kadın daha büyük olma eğilimindedirler. Bu kriterler kullanırken, erkek veya kadın pronuclei Yargıç.</li>
		<li>"Odak x 2" tıklatın (Tamamlayıcı Şekil 1) ve sonra HV güç gage kanal için EGFP içine floresan yoğunluğu yaklaşık 2000'e ayarlayın (floresan yoğunluğu "canlı komplo" penceresinde görülebilir).</li>
	</ol>
</li>
	<li>ZFRAP analiz başlamak için "Zaman" ve sonra "XY" (Tamamlayıcı Şekil 1)'i tıklatın. Not: "Zaman" düğmesini uygun seçtiyseniz, "t" "XY" butonunu görünür.<ol>
<li>"Sıkı bağlamak görüntüleme"XY düğmesi"yakın ve sıkı bağlamak analiz verileri elde etmek sonra görünen bitmiş serisi" (Tamamlayıcı Şekil 1),'ı tıklatın.</li>
		<li>Kurtarmak belgili tanımlık eğe "2B görünümü-görüntü XXXXX" tarafından tercih edilen adlandırılmış dosya (ÖİB. dosya biçimi) olarak "farklı kaydet" (Ctrl + Shift + S da kullanılabilir).</li>
		<li>Yatırım getirisi, REF ve BG seçin ve tıklatın (Ctrl + A da kullanılabilir) "2B görünümü görüntü" penceresinde "serisi analizi".</li>
		<li>Satır sıkı bağlamak veri elde etmek ve sonra "Kaydet" canlı çizim penceresinde düğmesini tıklatın. Not: Satır sıkı bağlamak nicel veri bir csv dosyası olarak kaydedilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ZFRAP kontrol için bazı etkisi floresans gözlem önlemek için cam alt yemekleri kenarında yakın açılan mRNA ile enjekte zigotları koymak.</li>
</ol>7. veri hesaplama
<ol><li>Kullanırken elde edilen nicel veri olun "kurtarma eğrisi" ve "mobil kısmı" tarafından Excel grafiği (bkz. aşağıdaki ile tamamlayıcı excel dosyası) bazı değişikliklerle başvurular3,7 gösterildiği gibi.</li>
	<li>Göreli yoğunluğunu 12 resimleri her zaman için yatırım getirisi ve REF BG değerini çıkararak hesaplar.</li>
	<li>ROI değeri bu hakem tarafından bölün. Sonuç olarak, her zaman bir noktada 12 standart göreli yoğunluğunu puanları elde edilebilir.</li>
	<li>3 görüntüleri ağartma fotoğraf daha önce alınan yatırım getirisi için göreli puan ortalamasını hesaplamak.</li>
	<li>Kurtarma oranını hesaplamak. 12 göreli puanları için yatırım getirisi, (7.1.2 elde edilen.) her zaman bir noktada (7.1.3 elde edilen.) fotoğraf beyazlatma daha önce göreli puanı ortalama tarafından çekilen görüntüler elde Böl. Bu sınavların kullanarak kurtarma eğri çizme (Şekil 2E).</li>
	<li>Ağartma oranını hesaplamak. Not: ağartma oranı (%) = 100 - 4th görüntü iyileşme oranı.</li>
	<li>Aşağıdaki10,11,12 olarak formül kullanarak mobil kesir (MF) hesaplama MF (%) = 12inci kurtarma oranı (bitiş noktası) - 4th iyileşme oranı / beyazlatma hızı × 100.</li>
</ol>8. embriyo transferi
<ol><li>8-12 ayda bir gece embriyo transferi önce gecede aynı kafese olmalarına izin vererek vasectomized erkek ICR fareler ile olgunlaştı ICR kadın dostum.</li>
	<li>ZFRAP analiz edilmiş ve iki hücreli aşamaya geliştirmek için kararlı embriyo toplamak.</li>
	<li>İntraperitoneally dişi fareler 0,35 - 0.75/4/5mg/kg medetomidine/midazolam/butorphanol karışık ajanların embriyo transferi önce 0,45 mL veya 0.7 - 0.9 mL % 1.2 tribromoethanol anestezi ile enjekte. Not: Anestezi hacmi fareler vücut ağırlığı tarafından belirlenir. Tribromoethanol: 0.2 mL/10 g vücut ağırlığının; medetomidine/midazolam/butorphanol ajanlar karışık: vücut ağırlığı 0.1 mL/10 g.<ol>
<li>Oviducts 0,5 gün sonrası coitum (dpc), vajinal bir fiş ile pseudopregnant kadın ICR farelerin içine bu iki hücreli sahne embriyo transfer.</li>
		<li>Embriyo transferi sonra onlar uyanıncaya kadar 37 ° C'de ayarla ısıtıcı dişi fareler koyun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>18,5 dpc, taşıyıcı anne tarafından servikal çıkığı kurban ve zFRAP analiz zigotları sezaryenle türetilmiş pups kurtarmak. Bazı ve kurtarılan yavrularını üvey annesine teslim edildi ve kendi vücut ağırlıkları her hafta değerlendirildi.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Burton, A., Torres-Padilla, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+and+development:+a+unique+heterochromatin+organization+in+the+preimplantation+mouse+embryo.">Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo.</a> Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).</li><li>Okada, Y., Yamaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+modifications+and+reprogramming+in+paternal+pronucleus:+sperm,+preimplantation+embryo,+and+beyond.">Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond.</a> Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).</li><li>Ooga, M., Fulka, H., Hashimoto, S., Suzuki, M. G., Aoki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+chromatin+structure+in+mouse+preimplantation+embryos+by+fluorescent+recovery+after+photobleaching.">Analysis of chromatin structure in mouse preimplantation embryos by fluorescent recovery after photobleaching.</a> Epigenetics. 11, 85-94 (2016).</li><li>Meshorer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperdynamic+plasticity+of+chromatin+proteins+in+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells.</a> Dev Cell. 10, 105-116 (2006).</li><li>Boskovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+chromatin+mobility+supports+totipotency+and+precedes+pluripotency+in+vivo.">Higher chromatin mobility supports totipotency and precedes pluripotency in vivo.</a> Genes Dev. 28, 1042-1047 (2014).</li><li>Yamagata, K., Ueda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live-cell+imaging+of+mammalian+preimplantation+development+and+derivation+process+of+pluripotent+stem+cells+from+the+embryos.">Long-term live-cell imaging of mammalian preimplantation development and derivation process of pluripotent stem cells from the embryos.</a> Dev Growth Differ. 55, 378-389 (2013).</li><li>Ooga, M., Wakayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRAP+analysis+of+chromatin+looseness+in+mouse+zygotes+that+allows+full-term+development.">FRAP analysis of chromatin looseness in mouse zygotes that allows full-term development.</a> PLoS One. 12, e0178255 (2017).</li><li>Quinn, P., Begley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+human+seminal+plasma+and+mouse+accessory+gland+extracts+on+mouse+fertilization+in+vitro.">Effect of human seminal plasma and mouse accessory gland extracts on mouse fertilization in vitro.</a> Australian journal of biological sciences. 37, 147-152 (1984).</li><li>Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+1-cell+embryos+from+different+strains+of+mice+in+CZB+medium.">Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium.</a> Biology of reproduction. 42, 432-440 (1990).</li><li>Bae, J., Sung, B. H., Cho, I. H., Song, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-actin-dependent+regulation+of+NESH+dynamics+in+rat+hippocampal+neurons.">F-actin-dependent regulation of NESH dynamics in rat hippocampal neurons.</a> PLoS One. 7, e34514 (2012).</li><li>Dieteren, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+mitochondrial+translation+differently+affects+the+live+cell+dynamics+of+complex+I+subunits.">Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits.</a> Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).</li><li>Subramanian, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2A.Z+acidic+patch+couples+chromatin+dynamics+to+regulation+of+gene+expression+programs+during+ESC+differentiation.">H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation.</a> PLoS Genet. 9, e1003725 (2013).</li><li>Hayashi-Takanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+epigenetic+histone+modifications+in+single+cells+using+Fab-based+live+endogenous+modification+labeling.">Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling.</a> Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).</li><li>Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+and+retrospective+analysis+of+DNA+methylation+in+mouse+preimplantation+embryos+by+live+cell+imaging.">Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging.</a> Dev Biol. 304, 409-419 (2007).</li><li>Puschendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRC1+and+Suv39h+specify+parental+asymmetry+at+constitutive+heterochromatin+in+early+mouse+embryos.">PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos.</a> Nat Genet. 40, 411-420 (2008).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu çalışmada ortaya gibi zFRAP analiz bu yöntem Birliği arasında moleküler olaylar ve embriyonik gelişim potansiyeli ortaya çıkarmak için çok yararlı bir araçtır düşündüren tam dönemlik gelişmeye kritik hasar neden olmaz. , ES hücre hangi tarafından bu hücreleri fark potansiyeli bu iki hücreli sahne embriyolar, olarak yüksek olur, devlet gibi iki hücresine yeniden programlama sırasında kromatin gevşekliği bu iki hücreli sahne embriyo5ile karşılaştırılabilir de?...

Gübreleme sonra dinamik olarak değişmiş kromatin yapısı, ve zygotic kromatin yapısı sonra sonunda kurulan1,2. Baba tarafından pronuclei, bu döneminde sırasında baskın kromatin protein histon protamine değiştirilir. Elde edilen kromatin son derece spermlerinin ve birkaç puan (Örneğin, histon varyant kompozisyon, histon değişiklik) dişi yumurta farklıdır. Böylece, kurulan zygotic kromatin sonraki embriyonik geliştirme için önemli olduğu düşünülmektedir. Ancak, uzun sürelerle zygotic kromatin yapısı ayrıntıları ortaya çıkarmak için çabalara rağmen yöntemleri zigotları niteliğini değerlendirmek için veya onların kromatin yapısı analiz ederek tam dönemlik gelişimleri tek hücreli aşamada tahmin etmek hiç var kurulan.
Önceki çalışmada, bu zigotları son derece gevşetti kromatin yapısı3var keşfedilir. Şu anda, kromatin gevşeklik veya açıklık hücresel farklılaşma (ES) embriyonik kök hücreleri4' te potansiyel için önemli bir faktör olduğuna inanılıyor. ES hücreleri homojenliği doğada sergi değil, ama oldukça heterojen; ES Hücre koloniler halinde bazı geçici bir daha yüksek farklılaşma potansiyeli iki hücreli sahne embriyo blastomeres için karşılaştırılabilir elde etmek. Devlet gibi iki hücresine bu geçiş sırasında ES kromatin gevşekliği iki hücreli sahne embriyo5ile karşılaştırılabilir nedir içine değişiklikler hücreleri. Böylece, kromatin gevşekliği önemli hücresel farklılaşma potansiyeli için kapsamlı kromatin zigotları içinde açmak mümkün olduğu zygotic gelişim potansiyeli değerlendirme için yararlı gibi görünüyor.
Canlı görüntüleme sonraki geliştirme ve hatta tam dönemlik geliştirme6için bu yöntem sağlar beri moleküler olayların analizi için ontogeni sırasında sağlayan güçlü bir araçtır. Canlı görüntüleme yöntemlerinden birini kromatin gevşekliği Preimplantasyon embriyo ve ES hücreleri3,4,5incelemek için sıkı bağlamak Analizi kullanılmıştır. Zygotic kromatin gevşekliği tam dönemlik geliştirme üzerinde zararlı bir etkisi olmadan sıkı bağlamak analiz tarafından çözümlenebilir, embriyo kalitesi değerlendirme tek hücreli aşamada için değerli bir araç olabilir. Ancak, bu deneysel yöntem tarafından tam dönemlik geliştirme etkileri inceledik değil. Son zamanlarda, deneysel bir sistemi zygotic kromatin gevşekliği değerlendirmek için sıkı bağlamak kullanarak geliştirilmiştir. Çünkü bu zigotları için yeni bir gözlem sistemi, zygotic sıkı bağlamak (zFRAP) olarak adlandırdığı oldu. zFRAP eleştirel tam dönemlik geliştirme etkilemez mi ve oldu başka bir yerde7bildirdi. Bu raporda, bu deneysel yöntemin protokolü tanımlanır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1022">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:260px;">Confocal laser scaning microscope</td>
			<td style="width:208px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">FV1200</td>
			<td style="width:435px;">FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">Thermo plate</td>
			<td style="width:208px;">Tokai Hit</td>
			<td style="width:119px;">TP-110RH26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:208px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Micro manupilator</td>
			<td style="width:208px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">MMO-202ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">Pieze Micro Micromanipulator</td>
			<td style="width:208px;">Prime tech</td>
			<td style="width:119px;">PMAS-CT150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">35 mm culture dish</td>
			<td style="width:208px;">Falcom</td>
			<td style="width:119px;">351008</td>
			<td>35 x 100 mm style; for IVF</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">60 mm culture dish</td>
			<td style="width:208px;">Falcom</td>
			<td style="width:119px;">351007</td>
			<td>60 x 15 mm style; for embryo culture</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">50 mm culture dish</td>
			<td style="width:208px;">Falcom</td>
			<td style="width:119px;">351006</td>
			<td>50 x 9 mm style; for manipulation on the stage</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">50 mm glass bottom dish</td>
			<td style="width:208px;">Matsunami</td>
			<td style="width:119px;">D910400</td>
			<td>50 mm dish, 27 mm &#966; hole size; for FRAP analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:208px;">Organic spceiality chemicals</td>
			<td style="width:119px;">625071</td>
			<td>For FRAP analysis on the glass bottom dishes</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:208px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8410-1L</td>
			<td>For IVF and embryo culture</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">glass capillary</td>
			<td style="width:208px;">Drummond</td>
			<td style="width:119px;">1-000-1000</td>
			<td>For handling mouse zygotes</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">Borosilicate glass</td>
			<td style="width:208px;">Prime tech</td>
			<td style="width:119px;">B100-75-10-PT</td>
			<td>For microinjection of mRNA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:260px;">Micropipett puller</td>
			<td style="width:208px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:119px;">P-97/IVF</td>
			<td style="width:435px;">For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 &#181;m, inner diameter: 10 &#181;m)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">Microforge</td>
			<td style="width:208px;">&#160;Narishige</td>
			<td>MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:260px;">mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit</td>
			<td style="width:208px;">Thermo 
			Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:260px;">Poly (A) tailing kit</td>
			<td style="width:208px;">Thermo 
			Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">PVP solution 10% (PVP-HTF)</td>
			<td style="width:208px;">IrvineSceientific</td>
			<td style="width:119px;">99311</td>
			<td>HEPES buffered HTF containing 10% PVP</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">Sodium HEPES</td>
			<td style="width:208px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">pTOPO eGFP-H2B</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:260px;">NorthernMax Gly Sample loading Dye&#160;</td>
			<td style="width:208px;">Thermo 
			Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM8551</td>
			<td>For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">Phenol chloroform isamyl alcohol</td>
			<td style="width:208px;">nacalai tesque</td>
			<td style="width:119px;">25970-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">Chloroform</td>
			<td style="width:208px;">nacalai tesque</td>
			<td style="width:119px;">&#160;08401-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">Not I</td>
			<td style="width:208px;">TOYOBO</td>
			<td style="width:119px;">NOT-111X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">Ethachinmate</td>
			<td style="width:208px;">WAKO</td>
			<td style="width:119px;">318-01793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">3664 Otical power meter</td>
			<td style="width:208px;">Hioki</td>
			<td style="width:119px;">3664</td>
			<td>&#160;Power meter for laser power</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:260px;">Stereomicmicroscope</td>
			<td style="width:208px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zygotic fluorescence recovery after photo-bleaching analysis for chromatin looseness that allows full-term development

Canlı görüntüleme moleküler olayların analizi için ontogeni sırasında sağlayan güçlü bir araçtır. Son zamanlarda, kromatin gevşeklik veya açıklık pluripotent embriyonik kök hücre hücresel farklılaşma potansiyeli dahil olmak gösterilmiştir. Bu daha önce kıyasla bildirildi embriyonik kök hücreleri ile onların totipotency ile dernek düşündüren bir son derece gevşetti kromatin yapısı zigotları liman. Bu son derece gevşetti/aç kromatin yapısı embriyonik gelişim potansiyeli için önemli olup olmadığını ancak, şimdiye kadar bu giderilmiş değil. Bu da çalışmanın, floresans tarafından analiz edildi hangi zigotları içinde fotoğraf ağartma sonra kurtarma terime önemli zarar vermeden gelişebilir bir deneysel sistem bu hipotez incelemek için geliştirilmiştir. Önemlisi, bu deneysel sistem sadece bir termos-tabak ısıtıcı ek olarak confocal bir lazer mikroskobu tarama gerekir. Sonra çözümleme (sıkı bağlamak) fotoğraf ağartma zygotic kromatin moleküler olaylarda tam dönemlik geliştirme için önemli olup olmadığını araştırmak için kullanılabilir Bu çalışma bulguları bu floresan kurtarma öneririz.

eGFP-H2B ile zFRAP Analizi
Düzgün üretilen eGFP-H2B, ötelenen bir grup tarafından poly bir takip (Şekil 2A) neden olduğu gibi görülen kodlama mRNA zigotları 1-3 h 2 bir kutup gövdeli sitoplazma içine tohumlama (Şekil 2B) sonra enjekte ettiler. 8'e 12 h tohumlama sonra 2 pronuclei eGFP-H2B ifade gösterilen ile zigotları toplanmış ve zFRAP Analize (<strong c...

Watch this Scientific Journal Video about Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development at JoVE.com

Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development

Kromatin gevşeklik blastomeres gelişim potansiyelini yer gibi görünüyor. Ancak, kromatin gevşekliği güvenilir bir dizin olarak embriyoların gelişim potansiyeli için kullanılıp kullanılamayacağını bilinmemektedir. Burada, kromatin gevşekliği tarafından değerlendirilmiş zigotları tam dönem için gelişebilir bir deneysel sistem tarif edilmiştir.

Zygotic floresan kurtarma fotoğraf ağartma sonra analiz için tam dönemlik geliştirme sağlar kromatin gevşeklik

Live imaging is a powerful tool that allows for the analysis of molecular events during ontogenesis. Recently, chromatin looseness or openness has been ...

zygotic-fluorescence-recovery-after-photo-bleaching-analysis-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.8K Görüntüleme.  University of Yamanashi. Kromatin gevşeklik blastomeres gelişim potansiyelini yer gibi görünüyor. Ancak, kromatin gevşekliği güvenilir bir dizin olarak embriyoların gelişim potansiyeli için kullanılıp kullanılamayacağını bilinmemektedir. Burada, kromatin gevşekliği tarafından değerlendirilmiş zigotları tam dönem için gelişebilir bir deneysel sistem tarif edilmiştir.

Video: Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

Fotoçevrim sonra Floresans Bozunma kullanarak Oturma balığı Embriyolar protein stabilitesi ölçümü (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Gelişim Biyolojisi

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and organ formation during development. Determining the locations and levels of such chromatin features in vivo will provide valuable information about the spatio-temporal regulation of genomic elements, and will support aspirations to mimic embryonic tissue development in vitro. The most commonly used method for genome-wide and high-resolution profiling is chromatin immunoprecipitation followed by next-generation sequencing (ChIP-Seq). This protocol outlines how yolk-rich embryos such as those of the frog Xenopus can be processed for ChIP-Seq experiments, and it offers simple command lines for post-sequencing analysis. Because of the high efficiency with which the protocol extracts nuclei from formaldehyde-fixed tissue, the method allows easy upscaling to obtain enough ChIP material for genome-wide profiling. Our protocol has been used successfully to map various DNA-binding proteins such as transcription factors, signaling mediators, components of the transcription machinery, chromatin modifiers and post-translational histone modifications, and for this to be done at various stages of embryogenesis. Lastly, this protocol should be widely applicable to other model and non-model organisms as more and more genome assemblies become available.

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

The question of how chromatin regulators and chromatin states affect the genome in vivo is key to our understanding of how early cell fate decisions are made in the developing embryo. ChIP-Seq&#8212;the most popular approach to investigate chromatin features at a global level&#8212;is outlined here for Xenopus embryos.

Kromatin Regülatörleri ve Devletleri&#39;nde genom Anlık<em&gt; Ksenopus</emChIP-Sıra tarafından&gt; Embriyolar

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by pre-globular, globular, heart, torpedo and cotyledon stages. This progressive development is under the tight regulation of a complex molecular network. Harvesting sufficient early embryos at a similar stage of development is essential for investigating the cellular and molecular regulation of early embryogenesis. This is not straightforward since early embryogenesis undergoes rapid morphogenesis in a short while e.g. 8 days for Medicago truncatula to reach the early cotyledon stage. Here, we address the issue by two approaches. The first one establishes a linkage between embryo development and pod morphology in helping indicate the stage of the zygotic embryo. This is particularly based on the number of pod spirals and development of the spines. An alternative way to complement the in vivo studies is via culturing leaf explants to produce somatic embryos. The medium includes an unusual hormone combination - an auxin (1-naphthaleneacetic acid), a cytokinin (6-benzylaminopurine), abscisic acid and gibberellic acid. The different stages can be discerned growing out of the callus without dissection.

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

Model Baklagil Erken Embriyo Geliştirme Yönetmeliği incelenmesi için zigotik ve somatik embriyolar Elde protokolleri<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Embriyonik Fare Heart Immunofluorescence kullanarak kardiyomiyosit Geliştirme Analizi

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

Nucleolar Kromatin Teşkilatı dayanarak Fare Antral OOSİT İzolasyonu ve Karakterizasyonu

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor &#946;, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor &#945;. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

Bir Gelişimi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deney Mezenkimal Hücreleri Uyguladığımız Epitel-Mezenkimal Geçiş kasılma Fonksiyonu değerlendirin

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Zygotic floresan kurtarma fotoğraf ağartma sonra analiz için tam dönemlik geliştirme sağlar kromatin gevşeklik

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler