우리 감사 사토시 Kishigami, 사야카 와카야마, 히로 아키 Nagatomo, 사토시의 카 미 무라, 그리고가 나 Kishida 중요 한 의견 및 기술 지원 제공. 이 작품의 지;에 국립 대학 개혁을 승진 시키기를 위한 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 프로그램에 의해 부분적으로 투자 되었다 과학 (16 H 02593)의 승진, 아사 다 과학 재단과 T.W. 다케다 과학 재단에 대 한 일본 사회 Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다.

이 연구는 관심과 야마나시 대학의 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에서 권장 사항을 따라에서 수행 되었다. 프로토콜 야마나시 대학의 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 (허가 번호: A24-50). 모든 수술 tribromoethanol 마 취하에 수행 했다 하 고 고통을 최소화 하기 위해 모든 노력 했다. 절차 및 타임 테이블의 그림된 개요는 각각 그림 1 및 표 1에 표시 됩니다.
1. 메신저 RNA (eGFP H2B mRNA의체 외에서 전사)의 준비
<ol><li>하지 의 30 U 템플릿 DNA pTOPO eGFP H2B3,7 의 5 µ g을 선형화 나 37 ° C에서 50 µ L에서 하룻밤.</li>
	<li>전기 이동 법에 의해 완전히 소화 여부 확인에 대 한 소화 DNA의 1.5 µ L를 수집 합니다.<ol>
<li>1.5 µ L와 소화 되지 않은 DNA 전기 이동 법 및 2 %agarose 젤의 우물에 염료를 각각, 로드의 3-5 µ L를 적용 합니다. 참고: 완전히 소화, 단일 밴드 (약 5 kb) 관찰 됩니다. 소화 되지 않은 DNA는 서로 다른 위치에 표시 되는 컨트롤으로 사용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DdH2O의 151.5 µ L를 더하고 200 µ L 나머지를 페 놀/클로 프롬/isoamyl 알콜 (25:24:1)의 DNA를 소화.<ol>
<li>적극적으로 소용돌이 의해 혼합.</li>
		<li>15 분 동안 최대 속도로 원심.</li>
	</ol>
</li>
	<li>복구는 상쾌한 고 클로 프롬의 200 µ L를 추가 합니다.<ol>
<li>적극적으로 소용돌이 의해 혼합.</li>
		<li>15 분 동안 최대 속도로 원심.</li>
	</ol>
</li>
	<li>복구는 상쾌한 고 20 µ L 3 M 나트륨 아세테이트 및 ethachinmate의 1.5 µ L를 추가 합니다.<ol>
<li>적극적으로 소용돌이 의해 혼합.</li>
		<li>100% 에탄올의 550 µ L을 추가 하 고 적극적으로 소용돌이 의해 혼합.</li>
		<li>15 분 동안 최대 속도로 원심.</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 70% 에탄올과 펠 릿을 세척.</li>
		<li>5-10 분에 대 한 증발에 의해 건조 한 펠 릿.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nuclease 무료 물 8 µ L에서 침전 된 플라스 미드 DNA를 분해.</li>
	<li>플라스 미드 농도 평가 (예상된 농도 300-500 ng / µ L) 제조업체의 지시에 따라 nanodrop와 함께.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 총 반응 볼륨의 20 µ L에서 템플릿으로 eGFP H2B 1 µ g의 정제 DNA와 인코딩 mRNA 녹음 방송 생체 외에서 수행 합니다.<ol>
<li>녹음 방송 생체 외에서 후 물 36 μ를 추가한 다음 (로 하지 않고 폴 리 A) 전기 이동 법에 의해 분석에 대 한 합성된 mRNA의 56 µ L에서 1.5 µ L를 복구 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 합성된 mRNA를 100 µ L 반응 볼륨에 대 한 폴 리 A 미행을 수행 합니다.</li>
	<li>폴 리의 eGFP H2B 꼬리 mRNA 리튬 염화 물 해결책 강수량의 60 µ L을 추가 하 고 적극적으로 섞는다.<ol>
<li>30 분-30 ° C에 냉각 하십시오.</li>
		<li>15 분 동안 최대 속도로 원심.</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 70% 에탄올과 펠 릿을 세척.</li>
		<li>5-10 분에 대 한 증발에 의해 건조 한 펠 릿.</li>
	</ol>
</li>
	<li>30 분 동안 55 ° C에 난방에 의해 nuclease 무료 물 20 µ L와 펠 릿을 디졸브.</li>
	<li>Nanodrop와 침전 된 mRNA의 농도 평가 합니다. 사용까지 nuclease 무료 물과 저장소-80 ° C에서 500 ng / µ L를 희석.</li>
	<li>확인 기본 설정된 mRNA 생산; 제목/없이 mRNA의 1 µ L (얻은 1.8.1 1.12 단계, 각각) 폴 리 꼬리 0.1 mg/mL ethidium 평범한 사람의 1.5 µ L와 3 µ L 전기 이동 법 분석 샘플 로드 염료의 혼합. 적용 된 볼륨 5.5 µ L 이었다입니다. 참고: 폴 리 A 미행에 성공 하면 폴 리는 미행 없이 mRNA에 비해 이동된 밴드 관찰 해야 (그림 2A).</li>
</ol>2입니다. Vasectomized 남성 생쥐의 준비
<ol><li>ICR 남성 쥐 체중 규모를 사용 하 여 8-12 개월에 무게.</li>
	<li>0.7-0.9 mL 1.2 %tribromoethanol 마 취와 함께 남성 쥐를 주사 intraperitoneally. 참고: 마 취의 크기는 마우스의 크기에 따라 달라 집니다. 예를 들어 마우스 무게 40 g tribromoethanol 마 취의 0.8 mL로 주사 된다.</li>
	<li>70% 에탄올과 베리 젖은.</li>
	<li>작은 베리에 (3-5 m m)를 잘라 이며가 위의 도움으로 근육 벽에 절 개를 확인 합니다. 참고:가 위, 집게 청소 되어야 한다 70% 에탄올과 수술을 시작 하기 전에.</li>
	<li>집게와 지방 패드를 살짝 밖으로 당겨. 그러면, 고환과 vas deferens 나타납니다. 참고: Vas deferens 는 U 자형 튜브와 빨간 혈관.</li>
	<li>수술 봉합 두 지점에서 vas deferens 에서 고 묶인된 점 사이의 중간 부분을 잘라.</li>
	<li>부드럽게 다시 지방 패드와 고환에 밀어 베리.<ol>
<li>나머지 고환으로 수술을 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>외과 봉합과 두 개의 바늘으로 근육 벽에 바느질도 해요.</li>
</ol>3입니다. 시험관
<ol><li>8-10 주 오래 된 여성 B6D2F1 주사 7.5 IU 말 chorionic 생식 샘 자극 호르몬 (eCG)와 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG) 46-50 h 간격에 intraperitoneally (BDF1) 쥐.</li>
	<li>Capacitation 및 수정을 1 일전 30 mm 접시에는 IVF에 대 한 300 µ L 인간의 튜 유체 (HTF)8 미디어의 방울을 준비 하 고 실험실 벤치에 미네랄 오일이 방울 커버 다음 하룻밤 인큐베이터에 preincubate.</li>
	<li>자 궁 경부 전위에 의해 성숙 된 남성 ICR 마우스를 희생. Cauda epididymis 27 G 바늘으로 해 부와 정자를 수집 합니다. 38 ° c.에 1-2 h HTF 미디어의 capacitation 300 µ L에 대 한 문화</li>
	<li>hCG 주사 후 16 h는 자 궁 경부 전위에 의해 슈퍼 ovulated 여성 쥐를 희생. 수 란 관 ampulla HTF 미디어 옆 미네랄 오일으로 전송 하 고 후 적 운 세포와 복잡 한 oocytes에서에서 그릴이 수 란 관 ampulla 30 G 바늘 preincubated 인공 HTF 매체에. 참고: 일부 여성 쥐 슈퍼 배 란 치료에도 불구 하 고 배 란 자주 표시 되지 않습니다. 확대 수 란 관 ampulla 배 란의 표시 이다입니다.</li>
	<li>Capacitation, 후 2-3 µ L capacitated 정자의 수정을 HTF 미디어 ovulated oocytes 수집 된로 전송 합니다.</li>
	<li>1 시간 후에 수정, 수정 란된 zygotes 수집 하 고 hyaluronidase CZB9 미디어에서 10 분 100 µ g/mL에서 그들을 치료. 참고: 수정을 제대로 수행 되 면 수정, 후 1 h 2nd 북극 시체와 함께 수정된 zygotes 관찰 된다. 또는 낮은 품질 정자를 사용 하는 경우 2차 극 체와 작은 zygotes만 관찰 된다. 또한, 많은 sperms 수정을 위해 사용 하는 경우 polyspermy 발생 합니다. 적절 한 인공 zygotes 남성과 여성 pronuclei로 이끌어 낸다. 이러한 기준을 사용 하 여 수정을 잘 되었는지를 찾아야 가능 하다.<ol>
<li>CZB 미디어에서 세척, 후 두 번째 극 시체 zygotes eGFP H2B mRNA와 microinjection를 주제.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 준비 실 및 Microinjection의 펫
<ol><li>희석 RNA eGFP H2B nuclease 무료 물 250 ng / µ L의 농도를 사용 하 여 인코딩.</li>
	<li>PVP-HTF의 2-3 방울을 준비 및 eGFP H2B mRNA, 삭제 하 고 5-6 방울 Hepes 버퍼링 60 mm 접시에 드랍 스 CZB (H-CZB). 미네랄 오일이 방울을 커버. 참고: 이러한 준비는 실험실 벤치에 수행할 수 있습니다. 공기 흐름을 층 류 캐비닛을 사용 하 여에 대 한 필요가 있다.</li>
	<li>Micropipette 끌어당기는 사람와 붕 규 산 유리를 끌어 (예를 들어, P = 500, 열 = 825, 풀 30, 벨 = = 120, 및 시간 = 200)</li>
	<li>중단 후 피 펫, 팁은 microforge를 사용 하 여 30 °의 주위에 가져온된 유리 microinjection 피 펫 팁 (−300 다시 µ m) 주변을 구 부.</li>
</ol>5입니다. microinjection
<ol><li>Micromanipulator mRNA 주입 중 한 피와 zygotes의 살인을 방지 하기 위해 무대에 플레이트 히터를 끕니다.</li>
	<li>워시와 HEPES 버퍼링 HTF에 주사 바늘의 내부 코트 10% 포함 된 PVP (PVP-HTF).</li>
	<li>2차 극 체 (그림 2B)와 수정된 zygotes 수집 하 고는 micromanipulator와 연결 된 현미경 단계의 상공에 20-25 zygotes 전송.</li>
	<li>도움말에서 붕 규 산 유리 모 세관으로 희석된 eGFP H2B mRNA를 채우십시오.</li>
	<li>들고 피 펫과 접합 자 누른 다음 zona pellucida 및 피에 조 드라이브 cytosolic 막 휴식.</li>
	<li>약 10 주사는 zygotes의 세포질에 mRNA의 pL. 더 이상 인큐베이터 밖에 zygotes 경작으로 인 한 피해를 방지 하기 위해 10 분 이내 mRNA-주입 완료. 참고: 사출 볼륨 2nd 극 몸 만큼 큰 해야 합니다. 주입 하는 mRNA의 양을 너무 크면, 모바일 분수에 영향을 미칠 수 있습니다 무료 eGFP H2B 분수 발생 가능 하다.</li>
	<li>microinjection, 후 10 분 이상 3 방울에 세척 하 고 zFRAP 분석까지 38 ° C에 CZB에 주입된 zygotes 문화.</li>
</ol>6입니다. zFRAP 분석
<ol><li>zFRAP 분석, 이전 1 h 레이저 confocal 현미경의 단계에 연결 된 핫 플레이트에 설정. 38 ° c.에 온도 설정</li>
	<li>위에 6-10 µ L HEPES 버퍼 CZB 미디어의 60 m m 유리 하단 접시에 미네랄 오일으로 덮여와 따뜻한 히터 zygote 컬렉션까지.</li>
	<li>8-수정 후 12 h, 수집 5-10 zygotes eGFP H2B 표현 및 전송의 6-10 µ L로 미리 예 열 HEPES 버퍼 CZB 중간 드롭. 참고: 인큐베이터 밖에 더 이상 경작을 피하기 위해, 5-10 eGFP H2B 표현 zygotes 각 분석에서 사용 되었다. 1 시간 이내 5 ~ 10 zygotes는 분석할 수 있습니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 표백 및 이미징 조건을 설정 합니다. 경우는 confocal 레이저 스캐닝 현미경 (자료 테이블)는 아래와 같습니다.<ol>
<li>사용 오일 렌즈 X 60 (60 X 60 X 1.35 / 기름). 참고: 높은 배율 (높은 수 가늠 구멍) 쇼 높은 감도와 렌즈.</li>
		<li>스캐닝 속도 4.0 µs/픽셀 및 크기 "512" "수집 설정" (보충 그림 1)로 설정 합니다.</li>
		<li>증가 디지털 확대/축소 "5" (보충 그림 1). 참고: 높은 줌 초점 드리프트 발생 하거나 하지 여부를 인식 해야 합니다.</li>
		<li>염료 (보충 그림 1) 목록과 다음 선택 "EGFP"를 엽니다. 1.6 관측 시간 설정 s (간격 "무료 실행" 설정으로 설정 되어) (보충 그림 1) 참고: 더 많은 관찰 포인트 더 자세한 데이터를 하지만 그것은 또한 phototoxicity를 발생할 수 있습니다. ZFRAP 분석에서 1.6 s 관측 시간 chromatin 풀림의 부모의 비대칭을 감지 하기에 충분 한 것으로 보인다.</li>
		<li>총 (보충 그림 1)에서 12 그림의 수를 설정 합니다.</li>
		<li>"자극 설정" 패널을 시작 하 고 UseScanner에 "기본"을 클릭 합니다. 스캐닝 속도 10.0 µs/픽셀으로 설정 합니다. "시리즈에 활성화"를 클릭 하 고 설정 PreActivation "3 프레임" 및 활성화 시간으로 "5 초" (보충 그림 1).</li>
		<li>"포커스 x 2" 클릭 하 고 포커스를 설정 하 고 "중지".</li>
		<li>표백 및 이미징 레이저 전원 설정 (477 nm) 110 및 15 µW에 각각으로 조정 "게이지 전원 레이저" (보충 그림 1). 참고: 매우 강한 표백 정량 분석에 대 한 어려움을 일으키는 원인이 되는 더 큰 표백된 지역에 발생할 수 있습니다. 레이저 힘의 측정, 전력 측정기를 사용 합니다. 그것은 레이저 파워 레이저 힘의 시간 관련 저하의 효과 피하기 위해를 확인 하는 것이 중요입니다.</li>
		<li>자극 설정 패널에서 "클립 Rect" (보충 그림 1)를 클릭 합니다. (투자 수익; 빨강; 관심 영역을 설정 투자 수익 #1B) 40 x 40 픽셀 (7.6 μ m2). 준비 참조 영역 (REF; 녹색; 투자 수익 #2), 그리고 배경 (BG; 파랑; 투자 수익 #3)를 사용 하 여 "ROI 복사" 및 "ROI 붙여넣기" (마우스 오른쪽 클릭 버튼). 참고: 픽셀 크기는 커서가 ROI에 있을 때 마우스의 오른쪽 버튼을 클릭 하 여 호출할 수 있습니다 "ROI 관리자"를 통해 설정할 수 있습니다. 이후 그들은 zFRAP 점수의 분산을 표준화할 수 있습니다 나은 사람이 되도록 큰 ROIs 생각 된다. 그러나, ROI의 너무 큰 사용할 수 없습니다이 분석을 위해 그것은 어려운 핵소체 전조 몸 (일)을 방지 하기 때문에. 이 구획 eGFP H2B chromatin에서 자유를 생각 하 고 보여준 놀라운 높은 이동성3했다. 투자 수익 및 REF 영역 가능한 분리 되어야 한다. 이 두 영역은 긴밀, 표백 수 있습니다 또한 영향을 미칠 REF의 지역.</li>
		<li>도구 모음에서 "라이브"를 클릭 한 다음 "라이브 플롯" (보충 그림 1)을 시작 합니다. 참고: 라이브 작 각 ROI 내의 형광 신호 강도 나타냅니다 및 HV를 사용 하 여 레이저 파워를 조정 하기 위해 사용 됩니다. 투자 수익을 선택 하지 않으면 아무 강도 라이브 플롯 패널에 감지 것 참고.</li>
		<li>투자 수익 위치 결정 참고: 투자 수익 pronuclei의 원하는 위치로 드래그 하 여 이동할 수 있습니다. (1) 핵소체, 방지 하 고 (2)는 nucleoplasm에 전체 투자 수익 적합. 투자 수익에 핵 막 (세포질)의 영역 외부 영역을 포함 하지 않습니다. 쉽게 투자 수익 세포질 포함 여부 eGFP H2B의 형광을 찾을 수 있도록 eGFP H2B의 지역화는 매우는 nucleoplasm로 제한 됩니다. 남성 pronuclei 2차 극 체 근처 지역화 종종 여성 보다 더 큰이 어 경향이 있다. 이러한 기준을 사용 하 여, 하는 동안 남성 또는 여성 pronuclei 판단.</li>
		<li>"포커스 x 2" 클릭 (추가 그림 1)는 HV 파워 게이지 채널의 EGFP 위한 형광 강도 약 2000으로 조정 (형광 강도 "라이브 음모" 창에서 볼 수 있습니다).</li>
	</ol>
</li>
	<li>"시간" 및 다음 "XY" (보충 그림 1) zFRAP 분석 시작을 클릭 합니다. 참고: "시간" 버튼 선택 적절 한 "t" "XY" 버튼에 표시 됩니다.<ol>
<li>클릭 "시리즈 완료" (보충 그림 1), FRAP 이미징 후 나타나는 "XY 버튼" 근처 고 FRAP 분석 데이터.</li>
		<li>"2D 이미지 보기 XXXXX" 의해 기본 명명 된 파일 (oib. 파일 형식)으로 "다른 이름으로 저장" 파일을 저장 (Ctrl + Shift + S 또한 사용할 수 있습니다).</li>
		<li>REF, 수익과 BG를 선택 하 고 다음을 클릭 합니다 (Ctrl + A 또한 사용할 수 있습니다) "2D 이미지 보기" 창에서 "시리즈의 분석".</li>
		<li>행 FRAP 데이터를 취득 하 고 "저장" 라이브 작 창에서 버튼을 클릭. 참고: 행 FRAP 양적 데이터를 csv 파일로 저장 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ZFRAP 통제, 형광 관찰에서 효과 피하기 위해 유리 하단 접시의 가장자리에 가까이 있는 드롭에서 mRNA와 주입 zygotes의 일부를 넣어.</li>
</ol>7. 데이터 계산
<ol><li>사용 하는 동안 얻은 정량적 데이터 참조3,7 일부 수정 (참조 추가 하 고 아래 엑셀 파일)와 같이 "복구 곡선" 및 "모바일 분수" Excel에서 그래프를 확인 합니다.</li>
	<li>각 시간 지점에 대 한 12 그림에 투자 수익 및 REF의 BG의 값을 빼서 상대 강도 계산 합니다.</li>
	<li>심판의 투자 수익의 값을 나눕니다. 그 결과, 각 시간 지점에서 12 상대 강도 표준화 된 점수를 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>3 이미지를 표백 하는 사진 전에 찍은 투자 수익에 대 한 상대 점수 평균을 계산 합니다.</li>
	<li>복구 속도 계산 합니다. 나누기 12 사진 (7.1.3에 획득) 표백 하기 전에 상대 점수의 평균 (7.1.2에서 획득) 각 시간 지점에서 촬영 한 이미지에 투자 수익에 대 한 상대 점수를 획득 합니다. 이 점수를 사용 하 여 복구 곡선 그리기 (그림 2E).</li>
	<li>표백 속도 계산 합니다. 참고: 표백 비율 (%) = 100-4번째 이미지의 복구 속도.</li>
	<li>다음과 같이10,,1112 에서 수식을 사용 하 여 모바일 분수 (MF) 계산 MF (%) = (끝점)-에서 12번째 복구 속도 4일 복구 속도 비율 × 100 표백 /.</li>
</ol>8. 배아 전송
<ol><li>8-12 개월 vasectomized 남성 ICR 마우스 배아 하룻밤 같은 장에 될 하 여 전송 하기 전에 밤에 성숙된 ICR 여성 친구.</li>
	<li>ZFRAP 분석 되었고 냉동 단계로 개발 결정 배아를 수집 합니다.</li>
	<li>0.7-0.9 mL 1.2 %tribromoethanol 마 취 또는 0.35-0.45 mL 배아 전송 전에 0.75/4/5mg/kg medetomidine/midazolam/butorphanol 혼합된 대리인의 intraperitoneally 여성 쥐를 주입. 참고: 마 취의 볼륨은 생쥐의 몸 무게에 의해 결정 됩니다. Tribromoethanol: 0.2 mL/10 g의 몸 무게; medetomidine/midazolam/butorphanol 에이전트 혼합: 몸 무게의 0.1 mL/10 g.<ol>
<li>0.5 일 게시물 coitum (dpc)에서 질 플러그 pseudopregnant 여성 ICR 생쥐의 oviducts에 이들 2 세포 단계 배아를 전송 합니다.</li>
		<li>배아 전송 후 37 ° C에서 설정 하는 그들이 깨어 때까지 히터에 여성 쥐를 넣어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>18.5 dpc에서 대리 모 자 궁 경부 전위에 의해 희생 하 고 제왕 절 개에 의해 zFRAP 분석 zygotes에서 파생 된 새끼를 복구 합니다. 일부 복구 된 새끼 양 어머니에 게 전달 했다 고 그들의 몸 무게는 각 주를 평가 했다.</li>
</ol>

<ol>
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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+mitochondrial+translation+differently+affects+the+live+cell+dynamics+of+complex+I+subunits.">Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits.</a> Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).</li><li>Subramanian, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2A.Z+acidic+patch+couples+chromatin+dynamics+to+regulation+of+gene+expression+programs+during+ESC+differentiation.">H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation.</a> PLoS Genet. 9, e1003725 (2013).</li><li>Hayashi-Takanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+epigenetic+histone+modifications+in+single+cells+using+Fab-based+live+endogenous+modification+labeling.">Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling.</a> Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).</li><li>Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+and+retrospective+analysis+of+DNA+methylation+in+mouse+preimplantation+embryos+by+live+cell+imaging.">Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging.</a> Dev Biol. 304, 409-419 (2007).</li><li>Puschendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRC1+and+Suv39h+specify+parental+asymmetry+at+constitutive+heterochromatin+in+early+mouse+embryos.">PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos.</a> Nat Genet. 40, 411-420 (2008).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 연구에서 밝혀, zFRAP 분석 전체 용어 개발,이 방법은 분자 이벤트와 배아 발달 잠재력 사이 협회를 공개 하는 매우 유용한 도구 제안에 중요 한 손상을 발생 하지 않습니다. 그 세포의 차동 잠재력 된다 2 셀 단계 배아의 높은 ES 세포의 상태 처럼 2 셀으로 프로그래밍 하는 동안 chromatin 설사 변경으로 2 세포 단계 태아5와 비교 합니다. 따라서, zygotic chromatin 설사 배아 발달 잠재력...

수정, 후 염색 질 구조를 동적으로 변경 하 고 zygotic 염색 질 구조는 다음 결국 설립된1,2. 아버지 pronuclei에이 기간 동안 지배적인 chromatin 단백질 히스톤으로 protamine에서 변경 됩니다. 결과 chromatin sperms와 몇 가지 포인트 (예, 히스톤 변형 구성, 히스톤 수정) 여성 oocytes에서 매우 다르다. 따라서, 형성된 zygotic chromatin 이후의 배아 발달에 대 한 중요 한 것으로 생각 된다. 그러나, 오랜 기간 동안 zygotic chromatin 구조의 세부 정보를 공개 하는 노력에 불구 하 고 방법을 zygotes의 품질을 평가 하거나 1 셀 단계에서 그들의 전체-용어 개발의 염색 질 구조를 분석 하 여 예측 하는 적 설립.
이전 연구에서 그것은 발견을 zygotes 매우 느슨하게 chromatin 구조3. 현재, chromatin 풀림 또는 개방 세포 분화 배아 줄기 (ES) 세포4잠재력에 대 한 중요 한 요소가 될 여겨진다. ES 세포 자연, 동질성을 전시 하지 않습니다 하지만 오히려 다른 유형의; ES 세포 식민지, 일부 정도 높은 감 별 법 잠재력 blastomeres 2 셀 단계 배아의 비교를 획득. 상태 처럼 2 셀으로이 전환 중 ES에서 chromatin 설사 2 세포 단계 태아5와 비교에 변화 세포. 따라서, chromatin 설사 세포질 감 별 법 잠재력과 그것은 가능한 광범위 하 게 chromatin zygotes에서 열리는 중요 한 것 zygotic 개발 잠재력의 평가 위해 유용 하는 것 같다.
라이브 영상 때문에이 메서드는 후속 개발 및도 전체 용어 개발6수 있습니다 ontogenesis 동안 분자 이벤트의 분석을 허용 하는 강력한 도구입니다. 라이브 이미징 방법 중 하나로 FRAP 분석 preimplantation 배아와 ES 세포3,,45chromatin 설사 검사를 사용 되었습니다. Zygotic chromatin 설사 FRAP 분석 개발 전체-용어에 해로운 효과 없이 분석할 수 있습니다, 만약 1 셀 단계에서 배아의 품질 평가 대 한 유용한 도구 수 있습니다. 그러나,이 실험 방법으로 전체 용어 개발에 효과 있다 하지 조사 되었습니다. 최근, FRAP를 사용 하 여 zygotic chromatin 풀림을 평가 하는 실험 시스템 개발 되었다. 왜냐하면이 zygotes 위한 새로운 관측 시스템, 그것 zygotic FRAP (zFRAP) 되 나 했다. zFRAP 전체 용어 개발을 비판적으로 미치지 않았다 고 되었습니다 보고 다른 곳에서7. 이 보고서에서이 실험 방법의 프로토콜을 설명 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1022">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:260px;">Confocal laser scaning microscope</td>
			<td style="width:208px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">FV1200</td>
			<td style="width:435px;">FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">Thermo plate</td>
			<td style="width:208px;">Tokai Hit</td>
			<td style="width:119px;">TP-110RH26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:208px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Micro manupilator</td>
			<td style="width:208px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">MMO-202ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">Pieze Micro Micromanipulator</td>
			<td style="width:208px;">Prime tech</td>
			<td style="width:119px;">PMAS-CT150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">35 mm culture dish</td>
			<td style="width:208px;">Falcom</td>
			<td style="width:119px;">351008</td>
			<td>35 x 100 mm style; for IVF</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">60 mm culture dish</td>
			<td style="width:208px;">Falcom</td>
			<td style="width:119px;">351007</td>
			<td>60 x 15 mm style; for embryo culture</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">50 mm culture dish</td>
			<td style="width:208px;">Falcom</td>
			<td style="width:119px;">351006</td>
			<td>50 x 9 mm style; for manipulation on the stage</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">50 mm glass bottom dish</td>
			<td style="width:208px;">Matsunami</td>
			<td style="width:119px;">D910400</td>
			<td>50 mm dish, 27 mm &#966; hole size; for FRAP analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:208px;">Organic spceiality chemicals</td>
			<td style="width:119px;">625071</td>
			<td>For FRAP analysis on the glass bottom dishes</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:208px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8410-1L</td>
			<td>For IVF and embryo culture</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">glass capillary</td>
			<td style="width:208px;">Drummond</td>
			<td style="width:119px;">1-000-1000</td>
			<td>For handling mouse zygotes</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">Borosilicate glass</td>
			<td style="width:208px;">Prime tech</td>
			<td style="width:119px;">B100-75-10-PT</td>
			<td>For microinjection of mRNA</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:260px;">Micropipett puller</td>
			<td style="width:208px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:119px;">P-97/IVF</td>
			<td style="width:435px;">For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 &#181;m, inner diameter: 10 &#181;m)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">Microforge</td>
			<td style="width:208px;">&#160;Narishige</td>
			<td>MF-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:260px;">mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit</td>
			<td style="width:208px;">Thermo 
			Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:260px;">Poly (A) tailing kit</td>
			<td style="width:208px;">Thermo 
			Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">PVP solution 10% (PVP-HTF)</td>
			<td style="width:208px;">IrvineSceientific</td>
			<td style="width:119px;">99311</td>
			<td>HEPES buffered HTF containing 10% PVP</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">Sodium HEPES</td>
			<td style="width:208px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">pTOPO eGFP-H2B</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:260px;">NorthernMax Gly Sample loading Dye&#160;</td>
			<td style="width:208px;">Thermo 
			Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM8551</td>
			<td>For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">Phenol chloroform isamyl alcohol</td>
			<td style="width:208px;">nacalai tesque</td>
			<td style="width:119px;">25970-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">Chloroform</td>
			<td style="width:208px;">nacalai tesque</td>
			<td style="width:119px;">&#160;08401-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">Not I</td>
			<td style="width:208px;">TOYOBO</td>
			<td style="width:119px;">NOT-111X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">Ethachinmate</td>
			<td style="width:208px;">WAKO</td>
			<td style="width:119px;">318-01793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:260px;">3664 Otical power meter</td>
			<td style="width:208px;">Hioki</td>
			<td style="width:119px;">3664</td>
			<td>&#160;Power meter for laser power</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:260px;">Stereomicmicroscope</td>
			<td style="width:208px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

zygotic fluorescence recovery after photo-bleaching analysis for chromatin looseness that allows full-term development

라이브 영상 ontogenesis 동안 분자 이벤트의 분석을 허용 하는 강력한 도구입니다. 최근, chromatin 풀림 또는 개방 만능 배아 줄기 세포의 세포질 감 별 법 잠재력에 포함 될 표시 되었습니다. 그것은 이전에 비해 알려졌다 배아 줄기 세포와 zygotes 항구 그들의 totipotency와의 연결을 제안 하는 매우 느슨하게 chromatin 구조를. 그러나, 지금까지 그것은 되지 해결 되었습니다이 매우 느슨하게/오픈 chromatin 구조 배아 발달 잠재력에 대 한 중요 한 인지. 현재 연구에서이 가설을 시험 하는 실험 시스템 형광에 의해 분석 된 어떤 zygotes 사진 표백 후 복구 기간 어떤 뜻깊은 손상도 없이 개발할 수 있는 개발 되었다. 중요 한 것은,이 실험적인 시스템만 보온병 플레이트 히터 confocal 레이저 스캐닝 현미경 이외에 필요 합니다. 이 연구의 결과 분석 (FRAP) 분석 사진 표백 zygotic chromatin에서 분자 이벤트 전체 기간 개발에 대 한 중요 한 인지 조사를 사용할 수 있는 후 그 형광 복구를 좋습니다.

eGFP H2B zFRAP 분석
제대로 생산 mRNA eGFP-H2B, 미행 (그림 2A) 폴 리로 인 한 이동된 밴드 볼, 인코딩 수정 (그림 2B) 후 1-3 h 2 극 시체 zygotes의 세포질으로 주입 했다. 8 12 수정 후 h, 2 pronuclei eGFP H2B의 식을 보여주는 함께 zygotes 수집 하 고 zFRAP 분석 (그림 2C)를 받게 했다. ?...

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Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development

Chromatin 설사 blastomeres의 발달 잠재력에 관련 된 것 처럼 보인다. 그러나, 그것은 알 수 없습니다 여부 chromatin 설사 배아에 대 한 발달 잠재력에 대 한 신뢰할 수 있는 인덱스로 사용할 수 있습니다. 여기, chromatin 설사 평가 zygotes 만기를 개발할 수 있는 실험 시스템 설명 하고있다.

Zygotic 형광 복구 사진 표백 후 전체 기간 개발을 허용 하는 Chromatin 풀림에 대 한 분석

Live imaging is a powerful tool that allows for the analysis of molecular events during ontogenesis. Recently, chromatin looseness or openness has been ...

zygotic-fluorescence-recovery-after-photo-bleaching-analysis-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.8K 조회수.  University of Yamanashi. Chromatin 설사 blastomeres의 발달 잠재력에 관련 된 것 처럼 보인다. 그러나, 그것은 알 수 없습니다 여부 chromatin 설사 배아에 대 한 발달 잠재력에 대 한 신뢰할 수 있는 인덱스로 사용할 수 있습니다. 여기, chromatin 설사 평가 zygotes 만기를 개발할 수 있는 실험 시스템 설명 하고있다.

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Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

연구

발생학

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and organ formation during development. Determining the locations and levels of such chromatin features in vivo will provide valuable information about the spatio-temporal regulation of genomic elements, and will support aspirations to mimic embryonic tissue development in vitro. The most commonly used method for genome-wide and high-resolution profiling is chromatin immunoprecipitation followed by next-generation sequencing (ChIP-Seq). This protocol outlines how yolk-rich embryos such as those of the frog Xenopus can be processed for ChIP-Seq experiments, and it offers simple command lines for post-sequencing analysis. Because of the high efficiency with which the protocol extracts nuclei from formaldehyde-fixed tissue, the method allows easy upscaling to obtain enough ChIP material for genome-wide profiling. Our protocol has been used successfully to map various DNA-binding proteins such as transcription factors, signaling mediators, components of the transcription machinery, chromatin modifiers and post-translational histone modifications, and for this to be done at various stages of embryogenesis. Lastly, this protocol should be widely applicable to other model and non-model organisms as more and more genome assemblies become available.

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

The question of how chromatin regulators and chromatin states affect the genome in vivo is key to our understanding of how early cell fate decisions are made in the developing embryo. ChIP-Seq&#8212;the most popular approach to investigate chromatin features at a global level&#8212;is outlined here for Xenopus embryos.

염색질 레귤레이터 및 미국에서의 게놈 전체의 스냅 샷<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em칩 서열 번호&gt; 태아

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by pre-globular, globular, heart, torpedo and cotyledon stages. This progressive development is under the tight regulation of a complex molecular network. Harvesting sufficient early embryos at a similar stage of development is essential for investigating the cellular and molecular regulation of early embryogenesis. This is not straightforward since early embryogenesis undergoes rapid morphogenesis in a short while e.g. 8 days for Medicago truncatula to reach the early cotyledon stage. Here, we address the issue by two approaches. The first one establishes a linkage between embryo development and pod morphology in helping indicate the stage of the zygotic embryo. This is particularly based on the number of pod spirals and development of the spines. An alternative way to complement the in vivo studies is via culturing leaf explants to produce somatic embryos. The medium includes an unusual hormone combination - an auxin (1-naphthaleneacetic acid), a cytokinin (6-benzylaminopurine), abscisic acid and gibberellic acid. The different stages can be discerned growing out of the callus without dissection.

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

모델 콩과 식물에서 초기 배아 발달의 규정 유학을위한 접합체 및 체세포 배아를 얻기위한 프로토콜<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

핵소체 염색질 조직을 바탕으로 마우스 전 정부 난 모세포의 분리 및 특성

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

해부 현미경을 사용하여 시간 경과 영상과 Zebrafish의 신장 개발의 분석 광학 단면에 대한 장착

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor &#946;, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor &#945;. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

개발<em&gt; 체외</em&gt; 분석은 중간 엽 세포를 시행 한 상피 - 중간 엽 전환의 수축 기능을 평가하는

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...