Name: zygotic fluorescence recovery after photo-bleaching analysis for chromatin looseness that allows full-term development
Uploaded: 2018-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
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우리 감사 사토시 Kishigami, 사야카 와카야마, 히로 아키 Nagatomo, 사토시의 카 미 무라, 그리고가 나 Kishida 중요 한 의견 및 기술 지원 제공. 이 작품의 지;에 국립 대학 개혁을 승진 시키기를 위한 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 프로그램에 의해 부분적으로 투자 되었다 과학 (16 H 02593)의 승진, 아사 다 과학 재단과 T.W. 다케다 과학 재단에 대 한 일본 사회 Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다.

이 연구는 관심과 야마나시 대학의 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에서 권장 사항을 따라에서 수행 되었다. 프로토콜 야마나시 대학의 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 (허가 번호: A24-50). 모든 수술 tribromoethanol 마 취하에 수행 했다 하 고 고통을 최소화 하기 위해 모든 노력 했다. 절차 및 타임 테이블의 그림된 개요는 각각 그림 1 및 표 1에 표시 됩니다.
1. 메신저 RNA (eGFP H2B mRNA의체 외에서 전사)의 준비
<ol><li>하지 의 30 U 템플릿 DNA pTOPO eGFP H2B3,7 의 5 µ g을 선형화 나 37 ° C에서 50 µ L에서 하룻밤.</li>
	<li>전기 이동 법에 의해 완전히 소화 여부 확인에 대 한 소화 DNA의 1.5 µ L를 수집 합니다.<ol>
<li>1.5 µ L와 소화 되지 않은 DNA 전기 이동 법 및 2 %agarose 젤의 우물에 염료를 각각, 로드의 3-5 µ L를 적용 합니다. 참고: 완전히 소화, 단일 밴드 (약 5 kb) 관찰 됩니다. 소화 되지 않은 DNA는 서로 다른 위치에 표시 되는 컨트롤으로 사용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DdH2O의 151.5 µ L를 더하고 200 µ L 나머지를 페 놀/클로 프롬/isoamyl 알콜 (25:24:1)의 DNA를 소화.<ol>
<li>적극적으로 소용돌이 의해 혼합.</li>
		<li>15 분 동안 최대 속도로 원심.</li>
	</ol>
</li>
	<li>복구는 상쾌한 고 클로 프롬의 200 µ L를 추가 합니다.<ol>
<li>적극적으로 소용돌이 의해 혼합.</li>
		<li>15 분 동안 최대 속도로 원심.</li>
	</ol>
</li>
	<li>복구는 상쾌한 고 20 µ L 3 M 나트륨 아세테이트 및 ethachinmate의 1.5 µ L를 추가 합니다.<ol>
<li>적극적으로 소용돌이 의해 혼합.</li>
		<li>100% 에탄올의 550 µ L을 추가 하 고 적극적으로 소용돌이 의해 혼합.</li>
		<li>15 분 동안 최대 속도로 원심.</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 70% 에탄올과 펠 릿을 세척.</li>
		<li>5-10 분에 대 한 증발에 의해 건조 한 펠 릿.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nuclease 무료 물 8 µ L에서 침전 된 플라스 미드 DNA를 분해.</li>
	<li>플라스 미드 농도 평가 (예상된 농도 300-500 ng / µ L) 제조업체의 지시에 따라 nanodrop와 함께.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 총 반응 볼륨의 20 µ L에서 템플릿으로 eGFP H2B 1 µ g의 정제 DNA와 인코딩 mRNA 녹음 방송 생체 외에서 수행 합니다.<ol>
<li>녹음 방송 생체 외에서 후 물 36 μ를 추가한 다음 (로 하지 않고 폴 리 A) 전기 이동 법에 의해 분석에 대 한 합성된 mRNA의 56 µ L에서 1.5 µ L를 복구 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 합성된 mRNA를 100 µ L 반응 볼륨에 대 한 폴 리 A 미행을 수행 합니다.</li>
	<li>폴 리의 eGFP H2B 꼬리 mRNA 리튬 염화 물 해결책 강수량의 60 µ L을 추가 하 고 적극적으로 섞는다.<ol>
<li>30 분-30 ° C에 냉각 하십시오.</li>
		<li>15 분 동안 최대 속도로 원심.</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 70% 에탄올과 펠 릿을 세척.</li>
		<li>5-10 분에 대 한 증발에 의해 건조 한 펠 릿.</li>
	</ol>
</li>
	<li>30 분 동안 55 ° C에 난방에 의해 nuclease 무료 물 20 µ L와 펠 릿을 디졸브.</li>
	<li>Nanodrop와 침전 된 mRNA의 농도 평가 합니다. 사용까지 nuclease 무료 물과 저장소-80 ° C에서 500 ng / µ L를 희석.</li>
	<li>확인 기본 설정된 mRNA 생산; 제목/없이 mRNA의 1 µ L (얻은 1.8.1 1.12 단계, 각각) 폴 리 꼬리 0.1 mg/mL ethidium 평범한 사람의 1.5 µ L와 3 µ L 전기 이동 법 분석 샘플 로드 염료의 혼합. 적용 된 볼륨 5.5 µ L 이었다입니다. 참고: 폴 리 A 미행에 성공 하면 폴 리는 미행 없이 mRNA에 비해 이동된 밴드 관찰 해야 (그림 2A).</li>
</ol>2입니다. Vasectomized 남성 생쥐의 준비
<ol><li>ICR 남성 쥐 체중 규모를 사용 하 여 8-12 개월에 무게.</li>
	<li>0.7-0.9 mL 1.2 %tribromoethanol 마 취와 함께 남성 쥐를 주사 intraperitoneally. 참고: 마 취의 크기는 마우스의 크기에 따라 달라 집니다. 예를 들어 마우스 무게 40 g tribromoethanol 마 취의 0.8 mL로 주사 된다.</li>
	<li>70% 에탄올과 베리 젖은.</li>
	<li>작은 베리에 (3-5 m m)를 잘라 이며가 위의 도움으로 근육 벽에 절 개를 확인 합니다. 참고:가 위, 집게 청소 되어야 한다 70% 에탄올과 수술을 시작 하기 전에.</li>
	<li>집게와 지방 패드를 살짝 밖으로 당겨. 그러면, 고환과 vas deferens 나타납니다. 참고: Vas deferens 는 U 자형 튜브와 빨간 혈관.</li>
	<li>수술 봉합 두 지점에서 vas deferens 에서 고 묶인된 점 사이의 중간 부분을 잘라.</li>
	<li>부드럽게 다시 지방 패드와 고환에 밀어 베리.<ol>
<li>나머지 고환으로 수술을 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>외과 봉합과 두 개의 바늘으로 근육 벽에 바느질도 해요.</li>
</ol>3입니다. 시험관
<ol><li>8-10 주 오래 된 여성 B6D2F1 주사 7.5 IU 말 chorionic 생식 샘 자극 호르몬 (eCG)와 인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG) 46-50 h 간격에 intraperitoneally (BDF1) 쥐.</li>
	<li>Capacitation 및 수정을 1 일전 30 mm 접시에는 IVF에 대 한 300 µ L 인간의 튜 유체 (HTF)8 미디어의 방울을 준비 하 고 실험실 벤치에 미네랄 오일이 방울 커버 다음 하룻밤 인큐베이터에 preincubate.</li>
	<li>자 궁 경부 전위에 의해 성숙 된 남성 ICR 마우스를 희생. Cauda epididymis 27 G 바늘으로 해 부와 정자를 수집 합니다. 38 ° c.에 1-2 h HTF 미디어의 capacitation 300 µ L에 대 한 문화</li>
	<li>hCG 주사 후 16 h는 자 궁 경부 전위에 의해 슈퍼 ovulated 여성 쥐를 희생. 수 란 관 ampulla HTF 미디어 옆 미네랄 오일으로 전송 하 고 후 적 운 세포와 복잡 한 oocytes에서에서 그릴이 수 란 관 ampulla 30 G 바늘 preincubated 인공 HTF 매체에. 참고: 일부 여성 쥐 슈퍼 배 란 치료에도 불구 하 고 배 란 자주 표시 되지 않습니다. 확대 수 란 관 ampulla 배 란의 표시 이다입니다.</li>
	<li>Capacitation, 후 2-3 µ L capacitated 정자의 수정을 HTF 미디어 ovulated oocytes 수집 된로 전송 합니다.</li>
	<li>1 시간 후에 수정, 수정 란된 zygotes 수집 하 고 hyaluronidase CZB9 미디어에서 10 분 100 µ g/mL에서 그들을 치료. 참고: 수정을 제대로 수행 되 면 수정, 후 1 h 2nd 북극 시체와 함께 수정된 zygotes 관찰 된다. 또는 낮은 품질 정자를 사용 하는 경우 2차 극 체와 작은 zygotes만 관찰 된다. 또한, 많은 sperms 수정을 위해 사용 하는 경우 polyspermy 발생 합니다. 적절 한 인공 zygotes 남성과 여성 pronuclei로 이끌어 낸다. 이러한 기준을 사용 하 여 수정을 잘 되었는지를 찾아야 가능 하다.<ol>
<li>CZB 미디어에서 세척, 후 두 번째 극 시체 zygotes eGFP H2B mRNA와 microinjection를 주제.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 준비 실 및 Microinjection의 펫
<ol><li>희석 RNA eGFP H2B nuclease 무료 물 250 ng / µ L의 농도를 사용 하 여 인코딩.</li>
	<li>PVP-HTF의 2-3 방울을 준비 및 eGFP H2B mRNA, 삭제 하 고 5-6 방울 Hepes 버퍼링 60 mm 접시에 드랍 스 CZB (H-CZB). 미네랄 오일이 방울을 커버. 참고: 이러한 준비는 실험실 벤치에 수행할 수 있습니다. 공기 흐름을 층 류 캐비닛을 사용 하 여에 대 한 필요가 있다.</li>
	<li>Micropipette 끌어당기는 사람와 붕 규 산 유리를 끌어 (예를 들어, P = 500, 열 = 825, 풀 30, 벨 = = 120, 및 시간 = 200)</li>
	<li>중단 후 피 펫, 팁은 microforge를 사용 하 여 30 °의 주위에 가져온된 유리 microinjection 피 펫 팁 (−300 다시 µ m) 주변을 구 부.</li>
</ol>5입니다. microinjection
<ol><li>Micromanipulator mRNA 주입 중 한 피와 zygotes의 살인을 방지 하기 위해 무대에 플레이트 히터를 끕니다.</li>
	<li>워시와 HEPES 버퍼링 HTF에 주사 바늘의 내부 코트 10% 포함 된 PVP (PVP-HTF).</li>
	<li>2차 극 체 (그림 2B)와 수정된 zygotes 수집 하 고는 micromanipulator와 연결 된 현미경 단계의 상공에 20-25 zygotes 전송.</li>
	<li>도움말에서 붕 규 산 유리 모 세관으로 희석된 eGFP H2B mRNA를 채우십시오.</li>
	<li>들고 피 펫과 접합 자 누른 다음 zona pellucida 및 피에 조 드라이브 cytosolic 막 휴식.</li>
	<li>약 10 주사는 zygotes의 세포질에 mRNA의 pL. 더 이상 인큐베이터 밖에 zygotes 경작으로 인 한 피해를 방지 하기 위해 10 분 이내 mRNA-주입 완료. 참고: 사출 볼륨 2nd 극 몸 만큼 큰 해야 합니다. 주입 하는 mRNA의 양을 너무 크면, 모바일 분수에 영향을 미칠 수 있습니다 무료 eGFP H2B 분수 발생 가능 하다.</li>
	<li>microinjection, 후 10 분 이상 3 방울에 세척 하 고 zFRAP 분석까지 38 ° C에 CZB에 주입된 zygotes 문화.</li>
</ol>6입니다. zFRAP 분석
<ol><li>zFRAP 분석, 이전 1 h 레이저 confocal 현미경의 단계에 연결 된 핫 플레이트에 설정. 38 ° c.에 온도 설정</li>
	<li>위에 6-10 µ L HEPES 버퍼 CZB 미디어의 60 m m 유리 하단 접시에 미네랄 오일으로 덮여와 따뜻한 히터 zygote 컬렉션까지.</li>
	<li>8-수정 후 12 h, 수집 5-10 zygotes eGFP H2B 표현 및 전송의 6-10 µ L로 미리 예 열 HEPES 버퍼 CZB 중간 드롭. 참고: 인큐베이터 밖에 더 이상 경작을 피하기 위해, 5-10 eGFP H2B 표현 zygotes 각 분석에서 사용 되었다. 1 시간 이내 5 ~ 10 zygotes는 분석할 수 있습니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 표백 및 이미징 조건을 설정 합니다. 경우는 confocal 레이저 스캐닝 현미경 (자료 테이블)는 아래와 같습니다.<ol>
<li>사용 오일 렌즈 X 60 (60 X 60 X 1.35 / 기름). 참고: 높은 배율 (높은 수 가늠 구멍) 쇼 높은 감도와 렌즈.</li>
		<li>스캐닝 속도 4.0 µs/픽셀 및 크기 "512" "수집 설정" (보충 그림 1)로 설정 합니다.</li>
		<li>증가 디지털 확대/축소 "5" (보충 그림 1). 참고: 높은 줌 초점 드리프트 발생 하거나 하지 여부를 인식 해야 합니다.</li>
		<li>염료 (보충 그림 1) 목록과 다음 선택 "EGFP"를 엽니다. 1.6 관측 시간 설정 s (간격 "무료 실행" 설정으로 설정 되어) (보충 그림 1) 참고: 더 많은 관찰 포인트 더 자세한 데이터를 하지만 그것은 또한 phototoxicity를 발생할 수 있습니다. ZFRAP 분석에서 1.6 s 관측 시간 chromatin 풀림의 부모의 비대칭을 감지 하기에 충분 한 것으로 보인다.</li>
		<li>총 (보충 그림 1)에서 12 그림의 수를 설정 합니다.</li>
		<li>"자극 설정" 패널을 시작 하 고 UseScanner에 "기본"을 클릭 합니다. 스캐닝 속도 10.0 µs/픽셀으로 설정 합니다. "시리즈에 활성화"를 클릭 하 고 설정 PreActivation "3 프레임" 및 활성화 시간으로 "5 초" (보충 그림 1).</li>
		<li>"포커스 x 2" 클릭 하 고 포커스를 설정 하 고 "중지".</li>
		<li>표백 및 이미징 레이저 전원 설정 (477 nm) 110 및 15 µW에 각각으로 조정 "게이지 전원 레이저" (보충 그림 1). 참고: 매우 강한 표백 정량 분석에 대 한 어려움을 일으키는 원인이 되는 더 큰 표백된 지역에 발생할 수 있습니다. 레이저 힘의 측정, 전력 측정기를 사용 합니다. 그것은 레이저 파워 레이저 힘의 시간 관련 저하의 효과 피하기 위해를 확인 하는 것이 중요입니다.</li>
		<li>자극 설정 패널에서 "클립 Rect" (보충 그림 1)를 클릭 합니다. (투자 수익; 빨강; 관심 영역을 설정 투자 수익 #1B) 40 x 40 픽셀 (7.6 μ m2). 준비 참조 영역 (REF; 녹색; 투자 수익 #2), 그리고 배경 (BG; 파랑; 투자 수익 #3)를 사용 하 여 "ROI 복사" 및 "ROI 붙여넣기" (마우스 오른쪽 클릭 버튼). 참고: 픽셀 크기는 커서가 ROI에 있을 때 마우스의 오른쪽 버튼을 클릭 하 여 호출할 수 있습니다 "ROI 관리자"를 통해 설정할 수 있습니다. 이후 그들은 zFRAP 점수의 분산을 표준화할 수 있습니다 나은 사람이 되도록 큰 ROIs 생각 된다. 그러나, ROI의 너무 큰 사용할 수 없습니다이 분석을 위해 그것은 어려운 핵소체 전조 몸 (일)을 방지 하기 때문에. 이 구획 eGFP H2B chromatin에서 자유를 생각 하 고 보여준 놀라운 높은 이동성3했다. 투자 수익 및 REF 영역 가능한 분리 되어야 한다. 이 두 영역은 긴밀, 표백 수 있습니다 또한 영향을 미칠 REF의 지역.</li>
		<li>도구 모음에서 "라이브"를 클릭 한 다음 "라이브 플롯" (보충 그림 1)을 시작 합니다. 참고: 라이브 작 각 ROI 내의 형광 신호 강도 나타냅니다 및 HV를 사용 하 여 레이저 파워를 조정 하기 위해 사용 됩니다. 투자 수익을 선택 하지 않으면 아무 강도 라이브 플롯 패널에 감지 것 참고.</li>
		<li>투자 수익 위치 결정 참고: 투자 수익 pronuclei의 원하는 위치로 드래그 하 여 이동할 수 있습니다. (1) 핵소체, 방지 하 고 (2)는 nucleoplasm에 전체 투자 수익 적합. 투자 수익에 핵 막 (세포질)의 영역 외부 영역을 포함 하지 않습니다. 쉽게 투자 수익 세포질 포함 여부 eGFP H2B의 형광을 찾을 수 있도록 eGFP H2B의 지역화는 매우는 nucleoplasm로 제한 됩니다. 남성 pronuclei 2차 극 체 근처 지역화 종종 여성 보다 더 큰이 어 경향이 있다. 이러한 기준을 사용 하 여, 하는 동안 남성 또는 여성 pronuclei 판단.</li>
		<li>"포커스 x 2" 클릭 (추가 그림 1)는 HV 파워 게이지 채널의 EGFP 위한 형광 강도 약 2000으로 조정 (형광 강도 "라이브 음모" 창에서 볼 수 있습니다).</li>
	</ol>
</li>
	<li>"시간" 및 다음 "XY" (보충 그림 1) zFRAP 분석 시작을 클릭 합니다. 참고: "시간" 버튼 선택 적절 한 "t" "XY" 버튼에 표시 됩니다.<ol>
<li>클릭 "시리즈 완료" (보충 그림 1), FRAP 이미징 후 나타나는 "XY 버튼" 근처 고 FRAP 분석 데이터.</li>
		<li>"2D 이미지 보기 XXXXX" 의해 기본 명명 된 파일 (oib. 파일 형식)으로 "다른 이름으로 저장" 파일을 저장 (Ctrl + Shift + S 또한 사용할 수 있습니다).</li>
		<li>REF, 수익과 BG를 선택 하 고 다음을 클릭 합니다 (Ctrl + A 또한 사용할 수 있습니다) "2D 이미지 보기" 창에서 "시리즈의 분석".</li>
		<li>행 FRAP 데이터를 취득 하 고 "저장" 라이브 작 창에서 버튼을 클릭. 참고: 행 FRAP 양적 데이터를 csv 파일로 저장 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ZFRAP 통제, 형광 관찰에서 효과 피하기 위해 유리 하단 접시의 가장자리에 가까이 있는 드롭에서 mRNA와 주입 zygotes의 일부를 넣어.</li>
</ol>7. 데이터 계산
<ol><li>사용 하는 동안 얻은 정량적 데이터 참조3,7 일부 수정 (참조 추가 하 고 아래 엑셀 파일)와 같이 "복구 곡선" 및 "모바일 분수" Excel에서 그래프를 확인 합니다.</li>
	<li>각 시간 지점에 대 한 12 그림에 투자 수익 및 REF의 BG의 값을 빼서 상대 강도 계산 합니다.</li>
	<li>심판의 투자 수익의 값을 나눕니다. 그 결과, 각 시간 지점에서 12 상대 강도 표준화 된 점수를 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>3 이미지를 표백 하는 사진 전에 찍은 투자 수익에 대 한 상대 점수 평균을 계산 합니다.</li>
	<li>복구 속도 계산 합니다. 나누기 12 사진 (7.1.3에 획득) 표백 하기 전에 상대 점수의 평균 (7.1.2에서 획득) 각 시간 지점에서 촬영 한 이미지에 투자 수익에 대 한 상대 점수를 획득 합니다. 이 점수를 사용 하 여 복구 곡선 그리기 (그림 2E).</li>
	<li>표백 속도 계산 합니다. 참고: 표백 비율 (%) = 100-4번째 이미지의 복구 속도.</li>
	<li>다음과 같이10,,1112 에서 수식을 사용 하 여 모바일 분수 (MF) 계산 MF (%) = (끝점)-에서 12번째 복구 속도 4일 복구 속도 비율 × 100 표백 /.</li>
</ol>8. 배아 전송
<ol><li>8-12 개월 vasectomized 남성 ICR 마우스 배아 하룻밤 같은 장에 될 하 여 전송 하기 전에 밤에 성숙된 ICR 여성 친구.</li>
	<li>ZFRAP 분석 되었고 냉동 단계로 개발 결정 배아를 수집 합니다.</li>
	<li>0.7-0.9 mL 1.2 %tribromoethanol 마 취 또는 0.35-0.45 mL 배아 전송 전에 0.75/4/5mg/kg medetomidine/midazolam/butorphanol 혼합된 대리인의 intraperitoneally 여성 쥐를 주입. 참고: 마 취의 볼륨은 생쥐의 몸 무게에 의해 결정 됩니다. Tribromoethanol: 0.2 mL/10 g의 몸 무게; medetomidine/midazolam/butorphanol 에이전트 혼합: 몸 무게의 0.1 mL/10 g.<ol>
<li>0.5 일 게시물 coitum (dpc)에서 질 플러그 pseudopregnant 여성 ICR 생쥐의 oviducts에 이들 2 세포 단계 배아를 전송 합니다.</li>
		<li>배아 전송 후 37 ° C에서 설정 하는 그들이 깨어 때까지 히터에 여성 쥐를 넣어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>18.5 dpc에서 대리 모 자 궁 경부 전위에 의해 희생 하 고 제왕 절 개에 의해 zFRAP 분석 zygotes에서 파생 된 새끼를 복구 합니다. 일부 복구 된 새끼 양 어머니에 게 전달 했다 고 그들의 몸 무게는 각 주를 평가 했다.</li>
</ol>

<ol>
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L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+1-cell+embryos+from+different+strains+of+mice+in+CZB+medium.">Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium.</a> Biology of reproduction. 42, 432-440 (1990).</li><li>Bae, J., Sung, B. H., Cho, I. H., Song, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-actin-dependent+regulation+of+NESH+dynamics+in+rat+hippocampal+neurons.">F-actin-dependent regulation of NESH dynamics in rat hippocampal neurons.</a> PLoS One. 7, e34514 (2012).</li><li>Dieteren, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+mitochondrial+translation+differently+affects+the+live+cell+dynamics+of+complex+I+subunits.">Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits.</a> Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).</li><li>Subramanian, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2A.Z+acidic+patch+couples+chromatin+dynamics+to+regulation+of+gene+expression+programs+during+ESC+differentiation.">H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation.</a> PLoS Genet. 9, e1003725 (2013).</li><li>Hayashi-Takanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+epigenetic+histone+modifications+in+single+cells+using+Fab-based+live+endogenous+modification+labeling.">Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling.</a> Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).</li><li>Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+and+retrospective+analysis+of+DNA+methylation+in+mouse+preimplantation+embryos+by+live+cell+imaging.">Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging.</a> Dev Biol. 304, 409-419 (2007).</li><li>Puschendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRC1+and+Suv39h+specify+parental+asymmetry+at+constitutive+heterochromatin+in+early+mouse+embryos.">PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos.</a> Nat Genet. 40, 411-420 (2008).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 연구에서 밝혀, zFRAP 분석 전체 용어 개발,이 방법은 분자 이벤트와 배아 발달 잠재력 사이 협회를 공개 하는 매우 유용한 도구 제안에 중요 한 손상을 발생 하지 않습니다. 그 세포의 차동 잠재력 된다 2 셀 단계 배아의 높은 ES 세포의 상태 처럼 2 셀으로 프로그래밍 하는 동안 chromatin 설사 변경으로 2 세포 단계 태아5와 비교 합니다. 따라서, zygotic chromatin 설사 배아 발달 잠재력...

수정, 후 염색 질 구조를 동적으로 변경 하 고 zygotic 염색 질 구조는 다음 결국 설립된1,2. 아버지 pronuclei에이 기간 동안 지배적인 chromatin 단백질 히스톤으로 protamine에서 변경 됩니다. 결과 chromatin sperms와 몇 가지 포인트 (예, 히스톤 변형 구성, 히스톤 수정) 여성 oocytes에서 매우 다르다. 따라서, 형성된 zygotic chromatin 이후의 배아 발달에 대 한 중요 한 것으로 생각 된다. 그러나, 오랜 기간 동안 zygotic chromatin 구조의 세부 정보를 공개 하는 노력에 불구 하 고 방법을 zygotes의 품질을 평가 하거나 1 셀 단계에서 그들의 전체-용어 개발의 염색 질 구조를 분석 하 여 예측 하는 적 설립.
이전 연구에서 그것은 발견을 zygotes 매우 느슨하게 chromatin 구조3. 현재, chromatin 풀림 또는 개방 세포 분화 배아 줄기 (ES) 세포4잠재력에 대 한 중요 한 요소가 될 여겨진다. ES 세포 자연, 동질성을 전시 하지 않습니다 하지만 오히려 다른 유형의; ES 세포 식민지, 일부 정도 높은 감 별 법 잠재력 blastomeres 2 셀 단계 배아의 비교를 획득. 상태 처럼 2 셀으로이 전환 중 ES에서 chromatin 설사 2 세포 단계 태아5와 비교에 변화 세포. 따라서, chromatin 설사 세포질 감 별 법 잠재력과 그것은 가능한 광범위 하 게 chromatin zygotes에서 열리는 중요 한 것 zygotic 개발 잠재력의 평가 위해 유용 하는 것 같다.
라이브 영상 때문에이 메서드는 후속 개발 및도 전체 용어 개발6수 있습니다 ontogenesis 동안 분자 이벤트의 분석을 허용 하는 강력한 도구입니다. 라이브 이미징 방법 중 하나로 FRAP 분석 preimplantation 배아와 ES 세포3,,45chromatin 설사 검사를 사용 되었습니다. Zygotic chromatin 설사 FRAP 분석 개발 전체-용어에 해로운 효과 없이 분석할 수 있습니다, 만약 1 셀 단계에서 배아의 품질 평가 대 한 유용한 도구 수 있습니다. 그러나,이 실험 방법으로 전체 용어 개발에 효과 있다 하지 조사 되었습니다. 최근, FRAP를 사용 하 여 zygotic chromatin 풀림을 평가 하는 실험 시스템 개발 되었다. 왜냐하면이 zygotes 위한 새로운 관측 시스템, 그것 zygotic FRAP (zFRAP) 되 나 했다. zFRAP 전체 용어 개발을 비판적으로 미치지 않았다 고 되었습니다 보고 다른 곳에서7. 이 보고서에서이 실험 방법의 프로토콜을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>Confocal laser scaning microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td>FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)</td></tr><tr><td>Thermo plate</td><td>Tokai Hit</td><td>TP-110RH26</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Micro manupilator</td><td>Narishige</td><td>MMO-202ND</td><td></td></tr><tr><td>Pieze Micro Micromanipulator</td><td>Prime tech</td><td>PMAS-CT150</td><td></td></tr><tr><td>35 mm culture dish</td><td>Falcom</td><td>351008</td><td>35 x 100 mm style; for IVF</td></tr><tr><td>60 mm culture dish</td><td>Falcom</td><td>351007</td><td>60 x 15 mm style; for embryo culture</td></tr><tr><td>50 mm culture dish</td><td>Falcom</td><td>351006</td><td>50 x 9 mm style; for manipulation on the stage</td></tr><tr><td>50 mm glass bottom dish</td><td>Matsunami</td><td>D910400</td><td>50 mm dish, 27 mm &amp;phi; hole size; for FRAP analysis</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Organic spceiality chemicals</td><td>625071</td><td>For FRAP analysis on the glass bottom dishes</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma</td><td>M8410-1L</td><td>For IVF and embryo culture</td></tr><tr><td>glass capillary</td><td>Drummond</td><td>1-000-1000</td><td>For handling mouse zygotes</td></tr><tr><td>Borosilicate glass</td><td>Prime tech</td><td>B100-75-10-PT</td><td>For microinjection of mRNA</td></tr><tr><td>Micropipett puller</td><td>Sutter instrument</td><td>P-97/IVF</td><td>For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 &amp;micro;m, inner diameter: 10 &amp;micro;m)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>&amp;nbsp;Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit</td><td>Thermo&lt;br/&gt; Fisher scientific</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Poly (A) tailing kit</td><td>Thermo&lt;br/&gt; Fisher scientific</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>PVP solution 10% (PVP-HTF)</td><td>IrvineSceientific</td><td>99311</td><td>HEPES buffered HTF containing 10% PVP</td></tr><tr><td>Sodium HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>pTOPO eGFP-H2B</td><td></td><td></td><td>Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)</td></tr><tr><td>NorthernMax Gly Sample loading Dye&amp;nbsp;</td><td>Thermo&lt;br/&gt; Fisher scientific</td><td>AM8551</td><td>For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA</td></tr><tr><td>Phenol chloroform isamyl alcohol</td><td>nacalai tesque</td><td>25970-14</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>nacalai tesque</td><td>&amp;nbsp;08401-65</td><td></td></tr><tr><td>Not I</td><td>TOYOBO</td><td>NOT-111X</td><td></td></tr><tr><td>Ethachinmate</td><td>WAKO</td><td>318-01793</td><td></td></tr><tr><td>3664 Otical power meter</td><td>Hioki</td><td>3664</td><td>&amp;nbsp;Power meter for laser power</td></tr><tr><td>Stereomicmicroscope</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr></tbody></table>

zygotic fluorescence recovery after photo-bleaching analysis for chromatin looseness that allows full-term development

라이브 영상 ontogenesis 동안 분자 이벤트의 분석을 허용 하는 강력한 도구입니다. 최근, chromatin 풀림 또는 개방 만능 배아 줄기 세포의 세포질 감 별 법 잠재력에 포함 될 표시 되었습니다. 그것은 이전에 비해 알려졌다 배아 줄기 세포와 zygotes 항구 그들의 totipotency와의 연결을 제안 하는 매우 느슨하게 chromatin 구조를. 그러나, 지금까지 그것은 되지 해결 되었습니다이 매우 느슨하게/오픈 chromatin 구조 배아 발달 잠재력에 대 한 중요 한 인지. 현재 연구에서이 가설을 시험 하는 실험 시스템 형광에 의해 분석 된 어떤 zygotes 사진 표백 후 복구 기간 어떤 뜻깊은 손상도 없이 개발할 수 있는 개발 되었다. 중요 한 것은,이 실험적인 시스템만 보온병 플레이트 히터 confocal 레이저 스캐닝 현미경 이외에 필요 합니다. 이 연구의 결과 분석 (FRAP) 분석 사진 표백 zygotic chromatin에서 분자 이벤트 전체 기간 개발에 대 한 중요 한 인지 조사를 사용할 수 있는 후 그 형광 복구를 좋습니다.

eGFP H2B zFRAP 분석
제대로 생산 mRNA eGFP-H2B, 미행 (그림 2A) 폴 리로 인 한 이동된 밴드 볼, 인코딩 수정 (그림 2B) 후 1-3 h 2 극 시체 zygotes의 세포질으로 주입 했다. 8 12 수정 후 h, 2 pronuclei eGFP H2B의 식을 보여주는 함께 zygotes 수집 하 고 zFRAP 분석 (그림 2C)를 받게 했다. ?...

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Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development

Chromatin 설사 blastomeres의 발달 잠재력에 관련 된 것 처럼 보인다. 그러나, 그것은 알 수 없습니다 여부 chromatin 설사 배아에 대 한 발달 잠재력에 대 한 신뢰할 수 있는 인덱스로 사용할 수 있습니다. 여기, chromatin 설사 평가 zygotes 만기를 개발할 수 있는 실험 시스템 설명 하고있다.

Zygotic 형광 복구 사진 표백 후 전체 기간 개발을 허용 하는 Chromatin 풀림에 대 한 분석

Live imaging is a powerful tool that allows for the analysis of molecular events during ontogenesis. Recently, chromatin looseness or openness has been ...

zygotic-fluorescence-recovery-after-photo-bleaching-analysis-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.8K 조회수.  University of Yamanashi. Chromatin 설사 blastomeres의 발달 잠재력에 관련 된 것 처럼 보인다. 그러나, 그것은 알 수 없습니다 여부 chromatin 설사 배아에 대 한 발달 잠재력에 대 한 신뢰할 수 있는 인덱스로 사용할 수 있습니다. 여기, chromatin 설사 평가 zygotes 만기를 개발할 수 있는 실험 시스템 설명 하고있다.

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Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

연구

발생학

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (smFISH) 신진 효 모 무성 한 성장 및 감수 분열 분석

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

유전학

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

라이트 시트 기반의 형광 생활의 현미경 또는 고정 및 스테인드<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; 배아

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains

The organization and structure of chromatin domains are unique to individual cell lineages. Their misregulation might lead to a loss in cellular identity and/or disease. Despite tremendous efforts, our understanding of the formation and propagation of chromatin domains is still limited. Chromatin domains have been studied under steady-state conditions, which are not conducive to following the initial events during their establishment. Here, we present a method to inducibly reconstruct chromatin domains and follow their re-formation as a function of time. Although, first applied to the case of PRC2-mediated repressive chromatin domain formation, it could be easily adapted to other chromatin domains. The modification of and/or the combination of this method with genomics and imaging technologies will provide invaluable tools to study the establishment of chromatin domains in great detail. We believe that this method will revolutionize our understanding of how chromatin domains form and interact with each other.

A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains

This method is designed to follow formation of PRC2-mediated chromatin domains in cell lines, and the method can be adapted to many other systems.

크로마틴 도메인의 드 노보 형성을 연구하는 방법

The organization and structure of chromatin domains are unique to individual cell lineages. Their misregulation might lead to a loss in cellular identity ...

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk of conceiving an aneuploid fetus increases dramatically and this phenomenon is known as the maternal age effect. One requirement for accurate chromosome segregation during the meiotic divisions is maintenance of sister chromatid cohesion during the extended prophase period that oocytes experience. Cytological evidence in both humans and model organisms suggests that meiotic cohesion deteriorates during the aging process. In addition, segregation errors in human oocytes are most prevalent during meiosis I, consistent with premature loss of arm cohesion. The use of model organisms is critical for unraveling the mechanisms that underlie age-dependent loss of cohesion. Drosophila melanogaster offers several advantages for studying the regulation of meiotic cohesion in oocytes. However, until recently, only genetic tests were available to assay for loss of arm cohesion in oocytes of different genotypes or under different experimental conditions. Here, a detailed protocol is provided for using fluorescence in situ hybridization (FISH) to directly visualize defects in arm cohesion in prometaphase I and metaphase I arrested Drosophila oocytes. By generating a FISH probe that hybridizes to the distal arm of the X chromosome and collecting confocal Z stacks, a researcher can visualize the number of individual FISH signals in three dimensions and determine whether sister chromatid arms are separated. The procedure outlined makes it possible to quantify arm cohesion defects in hundreds of Drosophila oocytes. As such, this method provides an important tool for investigating the mechanisms that contribute to cohesion maintenance as well as the factors that lead to its demise during the aging process.

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

This manuscript presents a detailed method for generating X-chromosome arm probes and performing fluorescence in situ hybridization (FISH) to examine the state of sister chromatid cohesion in prometaphase and metaphase I arrested Drosophila oocytes. This protocol is suitable for determining whether meiotic arm cohesion is intact or disrupted in different genotypes.

Prometaphase 팔 응집력과 분열의 상태를 모니터링 하려면 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 나 초파리 Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

배아 줄기 세포 생활에서 염색질 단백질 역학을 측정하는 Assays (FRAP 및 플립)를 Photobleaching

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

생물학

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

셀 무료 분석은 유사 분열의 끝에서 염색질 Decondensation을 공부하기

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

분열 효모 성적 라이프 사이클의 현미경

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

고급 단백질 단백질 상호 작용 및 DNA 병 변에서 속도 론 연구에 Confocal 현미경 검사 법 기술

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.

Zygotic 형광 복구 사진 표백 후 전체 기간 개발을 허용 하는 Chromatin 풀림에 대 한 분석

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