Kromatin etki alanlarının dinamik oluşumunu değerlendirmek için bir sistem anahat. Bu sistemi, prc2 aracılı kromatin etki alanlarının hücrelerde işe alınmasını ve yayılmasını takip etmek için kullanıyoruz. Devam eden olayları çözümlemek için işlem herhangi bir zamanda duraklatılmış olabilir.
Bu sistem herhangi bir hücresel süreç dinamik değişiklikleri izlemek için yönelik olabilir ve bu nedenle kromatin etki alanı oluşumuizleme ile sınırlı değildir. CRISPR Tasarım Aracı'nı kullanarak fare embriyonik kök hücrelerinde embriyonik ektoderm gelişiminin veya EED'nin endojen bir kopyasının exon 10 ve 11'ini silmek için kılavuz RNA'lar tasarlayarak başlayın. Kılavuzu RNA'ları el yazması talimatlara göre CRISPR/Cas9 plazmidine kopyala.
Altı kuyulu plaka biçiminde, transfect 200, 000 fare embriyonik kök hücreleri veya mESCs, üreticinin talimatlarına göre transfeksiyon reaktifleri kullanarak her kılavuz RNA bir mikrogram ile. Transfection'dan 24 saat sonra ortamı değiştirin. Transfeksiyondan iki gün sonra, FACS kullanarak GFP pozitif hücreleri izole edin.
Transfeksiyon verimliliği yaklaşık %10 ila %30 arasında değişir, bu nedenle kaplama için yeterli GFP pozitif hücreleri yakalamak için 500,000 hücre yi sıralar. İzole GFP pozitif hücreleri koloni toplama için %0,1 jelatinle önceden kaplanmış 15 santimetrelik plakalara plakalayın. TEK koloniler görünür olana kadar ESC ortamındaki hücreleri yaklaşık bir hafta büyüterek ortamları iki günde bir değiştirdiğinden emin olun.
20 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak en az 48 koloni seçin. Koloniyi tek bir hücreye ayırmadan, Accutase içeren 96 kuyuluk bir plakaya aktarın. Hücreleri ayrıştırmak için kolonileri 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra çok kanallı pipetle her kuyuya 200 mikrolitre ESC ortam ekleyin. İyi bir şekilde karıştırın ve hücreleri iki ayrı 96-well plakaya plakalayın. Genotipleme için plakalardan birini kullanın ve genotipleme sonuçlanana kadar diğerini büyümeye devam edin.
Ticari reaktifler kullanarak ve üreticinin yönergelerini izleyerek plakadan DNA ayıklayın. Taq DNA polimeraz ile genotipleme PCR gerçekleştirmek için silinen siteye yayılan genotipleme astarkullanın. Vahşi tip hücrelere göre homozigot silme ile hücrelerde daha düşük molekül ağırlığı na sahip bir DNA ürünü gözlemleyin.
Tasarım kılavuzu RNA bir CRISPR Tasarım Aracı kullanarak EED exon 9 aşağıdaki intron içinde bir kesim tanıtmak ve el yazması yönlere göre CRISPR/Cas9 plazmid içine klonlamak. Ekson 9'dan sonra EED cDNA dizisini ve T2A-GFP dizisinin C-terminal Flag-HA etiketini içeren bir donör şablonu DNA'sı tasarla, hepsi endojen gen dizisine göre ters yönde. Bir splice-acceptor ve heterolog ters loxP siteleri arasında yuvalanmış bir poliadeniletion dizisi ile kaset flank ve her iki ucundan homoloji silah en az 500 baz çifti içerir.
Donör şablonunu gBlocks Gen Parçaları'nın iki bölümüne bölün ve üreticinin talimatları doğrultusunda Gibson klonlamasını kullanarak pcr Blunt vektörüne birleştirin. Altı kuyulu plaka biçiminde transfect 200, 000 mESCs kılavuz RNA bir mikrogram ve donör şablonları bir mikrogram. Sonra FACS kullanarak GFP pozitif hücreleri izole edin.
El yazması talimatlara göre genotipleme için tek tek kolonileri izole edin. MESC'lerin GFP'nin sızdıran ifadesi olmadığını doğrulamak için akış sitometrisini kullanın ve bunu yaparlarsa, deneye başlamadan önce GFP negatif hücreleri FACS tarafından yalıtın. Beş 15 santimetre plakaları içine hücreleri genişletin ve sıfır saat sekiz gün arasında değişen beş farklı süreler için 5 mikromolar 4-hidroksitamoksifen uygulayarak vahşi tip veya kafes mutant EED ifade neden.
Bundan daha uzun süren tedaviler için 12 saat sonra ortamı değiştirin. GFP kullanarak FACS tarafından başarılı bir şekilde yeniden birleştirilmiş hücreleri izole edin ve yabani tip veya kafes mutant EED'nin yeniden dışa konması için kromatine zamansal birikimini araştırmak için H3K27me2 ve H3K27me3 için ChIP-seq gerçekleştirin. Indükleyici vahşi tip kurtarma ve indükleyici mutant kurtarma sistemleri doğrulamak için, batı leke 4-hidroksitamoksifen tedavisi ile yabani tip veya kafes mutant EED indüksiyon sonra tüm özleri üzerinde yapıldı.
Akış sitometri analizi, ters kasetin başarılı bir şekilde takla attığını gösteren 4-hidroksitamoksifen tedavisinden önce ve sonra i-WT-r hücrelerinde T2A-GFP ekspresyonunun etkinliğini doğrulamak için kullanıldı. H3K27me3'ün ChIP-seq'u yabani tip veya kafes mutantı EED'nin yeniden ifade edilmesinden sonra yapıldı. H3K27me3'ün ortaya çıkışı, ayrık çekirdekleşme bölgelerinde yabani tip EED ekspresyonundan 12 saat sonra, ilk çekirdekleşme bölgelerinden uzak bölgelerde 24 saat olarak gözlenir.
ChIP-seq da H3K27me2, H3K27me3 birikimi öncesinde görünür zamansal birikimi izlemek için kullanılmıştır. H3K27me3 foci ve büyüme de floresan mikroskopi ile görselleştirilmiştir. Vahşi tip EED ifade 12 saat sonra, H3K27me3 foci oluşumu kanıt vardır.
Bu foci sayısı ve boyutu 24 saat artar ve sonunda 36 saat çekirdeğin büyük bölgelerine yayıldı. DNA yapılarının doğru tasarımı istenilen indükedilemez kurtarma sistemi oluşturmak için çok önemlidir. Bu yöntem farelerdeki protein mutasyonlarının zamansal ve özel bir kontrol ünü sağlayabilir.
Bu şekilde, belirli bir dokuda veya gelişimin belirli bir aşamasında mutasyonların etkisini belirleyebilir. Şu anda başka bir kromatin etki alanı, Polycomb baskıcı kompleks 1 dinamik kurulmasını izlemek için bu sistemi kullanıyoruz.
