Biz cömertçe döllenmiş yumurta sağlamak için Tyson Foods Inc tanımak istiyorum. Shanna Arnold, bu protokolün çekimler sırasında etkili oldu. Trenis Palmer Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü (F31 National Cancer Institute) altında Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen CCSRI Hibe # 700.537 JDL ve NIH / NCI hibe # CA120711-01A1 ve AZ CA120711-01A1 tarafından desteklenmiştir.

1. Xenografting için yumurta (spontan metastaz) hazırlanması <ol><li> Yeni bırakılmış döllenmiş tavuk yumurtası, 10 gün ve 100 ° F% 60 nem için dönen bir inkübatör inkübe edilir. Yumurta, her saat başı dört kez döndürülür. </li><li> Gelişim günde 10 yumurta, kendi taraflarında bir yumurta rafa yerleştirilir. Kaz-boyun lambası veya diğer bir uygun ışık kaynağı, künt sonunda airsac bulunan yumurta kabuğu içine ışık tutarak mum yumurtalar için kullanılır. </li><li> Chorioallantoic ven bulunur ve işaretlenir. Bu bağlamda, birkaç büyük kan damarlarının birleştiği kabuğunun üst kısmında yer almaktadır. Bu şube noktada kan damarı CAM, aşağı düşer ve embriyo bağlanır. 1cm kare kutusu ven dal noktası yaklaşık 1cm uzakta kabuğu üzerinde kalem ile çizilmiş. Alan ve meydanın çevresine iyot batırılmış bir pamuklu bir bez kullanılarak temizlenebilir. </li><li> Bir silikon karpit taşlama taşı (Dremel parçası # 84.922) hava kesesi içine yumurtanın künt sonuna kadar açılmış bir delik ile donatılmış dönen bir kesme aleti (Dremel) kullanma. Bu aynı aracı kullanarak bir delik kabuğu membran kısa duruş, yumurtanın üstüne önceden çizilmiş bir kare içinde delinmiş. 25-gauge şırınga iğnesinin ucunda ince bir frez ile yatan CAM gözyaşı dikkatli olmak kabuğu zarı küçük bir delik yapmak için kullanılır. CAM ¼ &quot;Tygon boru airsac delik karşı yerleştirilen bir parça ile donatılmış otomatik bir pipet yardımı ile oluşturulan hafif bir emme kullanarak kare alanda kabuğu zarı daha sonra ayrılmış. Emme başvurusu üzerine, bir hava cebi delik meydanında altında CAM kabuğu başarıyla uzak düşmüş olduğu anlamına olmalıdır. CAM bırakılır sonra, hava kesesi ve chorioallantoic ven yakınındaki meydanda bulunan delik delik bir parça bant laboratuvar bant ile kapatılır. Yumurta daha sonra tümör hücrelerinin aşılama beklentisiyle 100 ° F ve% 60 nem sabit bir inkübatör içine yerleştirilir. Sıralı bir tasviri için şekil 1&#39;e bakınız. </li></ol> 2. Yumurta intravenöz enjeksiyon için hazırlanması (deneysel metastaz) <ol><li> Yeni bırakılmış döllenmiş tavuk yumurtası, 12 gün ve 100 ° F% 60 nem için dönen bir inkübatör inkübe edilir. Yumurta, her saat başı dört kez döndürülür. </li><li> 12 yumurta gelişim gününde, kendi taraflarında bir yumurta rafa yerleştirilir. Kaz-boyun lambası veya diğer bir uygun ışık kaynağı, künt sonunda airsac bulunan yumurta kabuğu içine ışık tutarak mum yumurtalar için kullanılır. </li><li> Chorioallantoic ven bulunur ve işaretlenir. 0.5 cm dikdörtgen 1cm doğrudan damar yukarıdaki kabuğu üzerinde kalem ile çizilir. Alan ve meydanın çevresine iyot batırılmış bir pamuklu bir bez kullanılarak temizlenebilir. </li><li> Dremmel matkap ucu (# 118) kullanılarak çizilmiş yerde kabuğu küçük bir pencere oluşturulur. Pencere sonradan mineral yağ damla şeffaf hale yatan kabuğu zar maruz kaldırılır. Bir grafik tasviri için Şekil 5A bakın. </li><li> Bu noktada hava kesesi ve chorioallantoic ven yakınındaki meydanda bulunan delik delik bir parça bant laboratuvar bant ile kapatılır. Yumurta daha sonra tümör hücreleri enjekte beklentisiyle 100 ° F ve% 60 nem sabit bir inkübatör içine yerleştirilir. </li></ol> 3. Tümör hücrelerinin aşılama veya enjeksiyon için hazırlanması. <ol><li> Xenografting için herhangi bir kalıntı medya, tripsin, EDTA veya kaldırmak için, tümör hücrelerinin tripsin / EDTA kullanarak kendi kültür yemeklerinden müstakil ve fosfat 10 ciltlik ile yıkanır tamponlu salin (PBS). </li><li> IV enjeksiyon için, kültürlü hücreler enzimatik olmayan hücre-ayrılma çözümü kullanarak müstakil, ve serum ücretsiz DMEM ile yıkanır. ve) </li><li> Hücreler bir hemasitometre sayılır ve aşılama için 10-40 milyon hücre / ml PBS içinde yeniden süspanse, ya da alternatif olarak 1 milyon hücre / ml IV enjeksiyon için serum serbest DMEM yeniden süspanse. </li></ol> 4. Yeni maruz CAM (Spontan metastaz) tümör hücreleri üzerine Aşılama <ol><li> Yumurtalar inkübatör kaldırılır ve yerini yeni bir hava cebi oluşmuştur önceden çizilmiş bir kare kesilmiş küçük bir pencere. Bu en kolay bir kesim tekerlek (# 409 dairesel kesme tekerleği ile Dremel aleti) ile donatılmış bir döner alet ile yapılır. Kabuğu olan küçük bir bölümü çıkarın ve altta yatan CAM ortaya çıkarmak için bir çift iğne-burun forseps kullanılır. </li><li> Pamuk uçlu bir aplikatör (Fisher Marka # 23-400-001) CAM 5 kez aşınır. Biraz pamuk kan belirgin olmalıdır. CAM zarar hemen sonra, hücre süspansiyonu 25μl hasarlı bölgeye yerleştirilir. Optimal hücrelerinin sayısı tespit empirically ama 0.5X10 5 1x10 6 arasında olabilir. yumurtanın pencere bandı ile ağzı sıkıca kapatılmış ve civciv hücrelerini yerleşmek için izin vermek için 10-15 dakika ayakta kalan. 15 dakika sonra yumurtaları sabit kuvöz iade edilir. </li><li> Tümörler, özel uygulama ve tümör hücre hattında kullanılan niteliğine bağlı olarak 5-8 gün büyümeye izin verilir. Sıralı bir tasviri için şekil 1&#39;e bakınız. </li></ol> 5. Tümör hücrelerinin enjeksiyonu (Deneysel metastaz) <ol><li> Hücre süspansiyonu 30 Gauge insülin şırınga 100μl kullanarak her bir embriyo allantoik damar içine enjekte edilir, yumurta, sabit bir inkübatör döndü ve bir ek 1-7 gün boyunca orada kaldı. </li><li> Farklı zaman noktalarında, akciğer veya düşük CAM her embriyo hasat ve aşağıda açıklandığı gibi, tümör hücrelerinin tespiti için işlenmiş. </li></ol> 6. Hasat tümörler ve piliç dokuların <ol><li> A diseksiyon alanı hazırlanır. Tahlil, çok hassas bir PCR yaklaşım kullanarak insan DNA nicel metastatik hücreler algılar. Bu nedenle eksojen DNA ile kontaminasyonu önlemek için çok önemlidir. Diseksiyonlarının özel bir alanda yapılmaktadır ve her hayvan arasında diseksiyonları boyunca araçları temizlenir. Primer tümörün ve iç organların kaldırmak için bir takım kaldırmak için, bir takım yumurta kesmek için bir set: diseksiyon süreci boyunca, araçlar 3 ayrı set kullanılan örnekleri çapraz kontaminasyon önlemek için. Buna ek olarak, dört yıkama kapları, her bir hayvan arasındaki araçlar durulama sıralı için kullanılır. Bu yıkar sırayla şunlardır: 1) çift distile su, 2) çift distile su, 3) çamaşır suyu ve 4)% 70 etanol. </li><li> Yumurta sabit kuvöz kaldırılır ve hayvanları uyutmak ve euthanize 15 dakika boyunca buz üzerinde yerleştirilir. Pencereler tümörler görünür hale gelmesi gibi açılır. Bazı kabuğu kaldırarak büyük pencereler açılması gerekebilir. CAM primer tümör rezeke tartılır ve histoloji için işlenmiş. </li><li> Radyal eşit parçaya kabuk keserek civciv kabuğu kaldırılır. Embriyo kesim kabuk dekante ve temiz bir tekne meme tartmak yan aktarılır. Hayvan taze, temiz bir araç seti ile disseke edilir. Hayvan sternum ile kesim tarafından açıldı. Embriyo, karaciğer ya sağ ya da sol lob toplanan bir parça açıktır. Taşlık bağlı yemek borusu hafifçe çekerek ve kesme organlar bağlamak visera daha sonra iç organları tarafından kaldırılır. Akciğerler kesip toplamak için göğüs kafesi, göğüs plakası ayrılır açıldı ve kalp kaldırılır. Bu noktada, akciğer dört kenarından kesmek mümkün (baş en yakın üst göğüs kafesi, trakea ve sağ tarafta birlikte diyafram yakınında alt sol tarafındaki). Tutarlılık uğruna, aynı akciğer her hayvan toplanır. Hasat doku örnekleri daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de saklanır veya DNA izolasyonu için hemen işlenebilir. </li></ol> 7. Genomik DNA izolasyonu ve kantitatif PCR Analizi <ol><li> Genomik DNA SYBR Green Özü-N-Amp Doku PCR kiti (Sigma-Aldrich Katalog # XNATRG) kullanarak dokular elde edilir. Edilen DNA temiz bir Eppendorf tüp aktarılır ve -20 ° C&#39;de saklanır veya hemen kullanılabilir. Sonraki PCR reaksiyonu kullanmadan önce nükleaz ücretsiz su DNA 01:50 sulandırmak için önemlidir. Alternatif olarak, DNA standart DNA ekstraksiyonu protokolleri (Zijlstra ve ark, 2002) herhangi bir sayı kullanılarak elde edilebilir. </li><li> İnsan DNA&#39;sı kullanarak insan Alu dizileri için kantitatif PCR özel civciv dokularda tespit edilmiştir. Kantitatif PCR SYBR yeşil amplifikasyon Exract-N-Amp kiti kullanılarak yapılır Alu-spesifik primerler kullanılarak. SYBR yeşil, tampon, tuzlar dNTP, Taq polimeraz ve Jumpstart Taq Antikor içeren bir 2x reaksiyon karışımı PCR kiti ile birlikte gelir. Reaksiyon karışımı, her astar 0.4μM, 15μl nihai hacmi oluşur. Çoğu durumda edilen DNA kullanılarak 01:50 nicel veri sağlayacaktır seyreltilmiş için, ancak, en uygun miktarda DNA ampirik optimize edilmesi gerekebilir. Tavuk GAPDH primerler PCR Alu dizileri için aşağıdaki koşullar altında çalışan bir iç kontrol sistemi olarak kullanılır: polimeraz aktivasyon 95 ° C &#39;de 2 dakika süreyle 95 30 döngüleri takip ° 30 s, 63 ° C için 30 sn 72 ° C, 30 s. Tavuk GAPDH reaksiyon koşulları ancak 40 döngü PCR uzatmak için gerekli olabilir Alüminyum için açıklanan aynıdır. </li><li> Metastaz Kantitatif analiz, kontrol grubu (Schmittgen ve Livak, 2008 deney grupları karşılaştıran ΔΔCt yöntemi kullanılarak yapılır. Zijlstra ve ark, 2002). Alternatif bir standart eğri Özü-N-Amp kiti (Zijlstra ve ark, 2002) kullanılarak çıkarılan insan tümör hücreleri dilüsyon serileri kullanılarak oluşturulabilir. İstatistiksel anlamlılık Öğrenci T-test veya deney ve kontrol grupları Anova analizi kullanılarak değerlendirilmiştir. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. Tavuk embriyo metastaz modeli. A) önemli adımlar kesiti modelin görünümünü gösteren dört panel diyagram: 1. Inkübasyon 10 gün sonra. CAM yakın maksimum boyutuna ulaştı. Arterler ve damarlar belirgin bir yumurtanın üst karşı konumlandırılmış alantoyik ven görünür. 2. Kabuğu iki delik delme hemen sonra yumurta: airsac içine bir allantoik ven için ek noktasına bitişik. 3. Hafif bir vakum sonra görünüm airsac tahliye ve CAM bırakmak için kullanılır olmuştur. Tümör hücreleri (mavi) düştü CAM uygulanır. 4. Aşılı tümör hücresinin büyümesini sağlayan sonra, tavuk embriyo dokusu ile birlikte tümör analiz için hasat B) modelin seri tasviri: 1. Kuluçkalık yumurtalar, 2. Allantoik ven konumu, 3 işaretleniyor. Kabuğu üzerinde herhangi bir delik, 4. CAM Damlama, 5. Kesme, aşılama tümör hücresi, 6 için bir açılış. Tümör hücrelerinin uygulamak, 7. Buz üzerinde yumurta Soğutma önce doku toplama, 8. 7 gün sonra büyüme tümör Hasat. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 CAM tümörlerin Histolojisi. Tümör taşıyan chorioallantoic membran alınan dokular, formalin, kesitli sabit ve trikrom boyası ile işlendi. A) CAM büyüme yedi gün sonra tümör HEp3. B ve C, A gösteren, tümör ve stroma büyütülmüş bölgeleri göstermektedir. D) normalleri CAM. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3. Kantitatif boyuna metastaz analizi. Yüksek veya düşük metastatik yeteneği (HEp3 M (Yüksek) ve sırasıyla HEp3 M (Düşük)) baş ve boyun kanseri tanısı HEp3 için Varyantlar Alu PCR kullanarak yaymak için yeteneklerini analiz edildi. On hayvanlar 7 gün süresi için her zaman bir noktada analiz edildi. Bu örnekler # doku cells/50mg olarak bir standart eğri karşı nicel ve daha sonra ifade edildi. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Şekil 4. Hayvanlarda spontan metastaz hücreleri metastaz inhibe antikor 1A5 inhibisyon ile tedavi edildi. Tümörler, gün-10 embriyoların CAM uygulanan 5x10 5 HEp3 hücreleri kullanılarak oluşturulmuştur . Hayvanların yarısı anti-CD151 antikoru 1A5 ile tedavi edilen tümör hücrelerinin uyguladıktan sonra üç gün. Tümör taşıyan hayvanlar akciğerler iki gün sonra hasat edilir ve kantitatif gerçek zamanlı alüminyum PCR tabi tutuldu. ChGAPDH Tersine kantitatif gerçek zamanlı PCR host genomik DNA eşdeğer miktarda (ΔΔCt yöntemi (kantitatif iki grup karşılaştırmak için B kullanılmıştır) varlığını doğrulamak için kullanılmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig5.jpg" alt="Şekil 5"/> Şekil 5. Metastatik kaskad tutuklama, büyüme ve intravasation değerlendirilmesi. Tutuklama, büyüme hızı ve intravasation oranı: Temelde, ikincil bir organ metastazı üç yönlerini katkılarıyla tanımlanır. Bu deneysel metastaz (A) ve spontan metastaz (B) bir kombinasyonu kullanılarak belirlenebilir. 2saat yazılan enjeksiyon tutuklama hücre sayısı olarak tanımlanan deneysel metastaz (A) kullanarak tespit edildi. Tutuklandı hücrelerin hayatta kalma ve büyüme, hücre sayısı 24 saat sonrası enjeksiyon değişikliği olarak belirlenmiştir. Büyüme 3-7 gün sırasında proliferasyon oranı olarak tanımlanır. Intravasation spontan metastaz (B) intravasated hücrelerinin sayısı, değeri 6 gün metastatik yükünün büyüme öngördüğü aşması 7 gün metastatik yükünü hediye olarak tanımlanır kullanılarak belirlenir. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig6.jpg" alt="Şekil 6"/> Şekil 6. CAM metastatik görselleştirme genişleme. GFP ifade HEp3 hücrelerinin gelişim 12. günde intravenöz enjekte edildi. 1, 3 ve 5 günde bir yumurta kurban CAM bir bölüm ve bir floresan stereo mikroskop ile görüntülendi. Kabuğu koyu yeşil arka tarafından oluşturulan, damarsal siyah çizgiler olarak görünür ve tümör hücrelerinin parlak yeşil noktalar olarak görünür.

<ol>
	<li>Ghiso, A. g. u. i. r. r. e., Kovalski, J. A., K, ., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+dormancy+induced+by+downregulation+of+urokinase+receptor+in+human+carcinoma+involves+integrin+and+MAPK+signaling.">Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling.</a> J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).</li><li>Chambers, A. F., Shafir, R., Ling, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+system+for+studying+metastasis+using+the+embryonic+chick.">A model system for studying metastasis using the embryonic chick.</a> Cancer research. 42, 4018-4025 (1982).</li><li>Chambers, A. F., Wilson, S. M., Tuck, A. B., Denhardt, G. H., Cairncross, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+metastatic+properties+of+a+variety+of+mouse,+rat,+and+human+cells+in+assays+in+nude+mice+and+chick+embryos.">Comparison of metastatic properties of a variety of mouse, rat, and human cells in assays in nude mice and chick embryos.</a> In Vivo. 4, 215-219 (1990).</li><li>Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+effect+of+matrix+metalloproteinase+down-regulation+on+vascular+intravasation+and+metastasis+of+human+fibrosarcoma+cells+selected+in+vivo+for+high+rates+of+dissemination.">Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination.</a> Cancer Res. 65, 10959-10969 (2005).</li><li>Hahn-Dantona, E., Ramos-DeSimone, N., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+proMMP-9+by+a+plasmin/MMP-3+cascade+in+a+tumor+cell+model.+Regulation+by+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases.">Activation of proMMP-9 by a plasmin/MMP-3 cascade in a tumor cell model. Regulation by tissue inhibitors of metalloproteinases.</a> Ann N Y Acad Sci. 878, 372-387 (1999).</li><li>Kim, J., Yu, W., Kovalski, K., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+specific+proteases+in+cancer+cell+intravasation+as+revealed+by+a+novel+semiquantitative+PCR-based+assay.">Requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay.</a> Cell. 94, 353-362 (1998).</li><li>Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+embryonic+and+tumor+neovasculature+using+viral+nanoparticles.">Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles.</a> Nat Protoc. 5, 1406-1417 (2010).</li><li>Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+nanoparticles+as+tools+for+intravital+vascular+imaging.">Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging.</a> Nat Med. 12, 354-360 (2006).</li><li>Ossowski, L., Reich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+malignant+phenotype+of+a+human+carcinoma+conditioned+by+growth+environment.">Changes in malignant phenotype of a human carcinoma conditioned by growth environment.</a> Cell. 33, 323-333 (1983).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3, 1101-1108 (2008).</li><li>Testa, J. E., Brooks, P. C., Lin, J. M., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+expression+cloning+with+an+antimetastatic+monoclonal+antibody+identifies+a+tetraspanin+(PETA-3/CD151)+as+an+effector+of+human+tumor+cell+migration+and+metastasis.">Eukaryotic expression cloning with an antimetastatic monoclonal antibody identifies a tetraspanin (PETA-3/CD151) as an effector of human tumor cell migration and metastasis.</a> Cancer Res. 59, 3812-3820 (1999).</li><li>Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Inhibition+of+Tumor+Cell+Intravasation+and+Subsequent+Metastasis+via+Regulation+of+In+Vivo+Tumor+Cell+Motility+by+the+Tetraspanin+CD151.">The Inhibition of Tumor Cell Intravasation and Subsequent Metastasis via Regulation of In Vivo Tumor Cell Motility by the Tetraspanin CD151.</a> Cancer Cell. 13, 221-234 (2008).</li><li>Zijlstra, A., Mellor, R., Panzarella, G., Aimes, R. T., Hooper, J. D., Marchenko, N. D., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+rate-limiting+steps+in+the+metastatic+cascade+using+human-specific+real-time+polymerase+chain+reaction.">A quantitative analysis of rate-limiting steps in the metastatic cascade using human-specific real-time polymerase chain reaction.</a> Cancer Res. 62, 7083-7092 (2002).</li></ol>

Civciv CAM kanser biyolojisi ve metastatik ilerlemesi çeşitli yönlerini incelemek için bir model sistem olarak on yıllardır kullanılmaktadır. Dormansi analizi de dahil olmak üzere çeşitli gruplar tarafından bu modelde, metastatik yetenekleri Prensibi değerlendirme yapılmıştır (Aguirre Ghiso ve ark, 1999; Ossowski ve Reich, 1983), doku yeniden yapılanma (Deryugina ve ark, 2005; Hahn- DANTONA ve ark, 1999) ve metastaz (Zijlstra ve ark, 2008; Zijlstra ve ark, 2...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> 1X Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartalı Medium (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;nun Fosfat Tamponlu Salin (D-PBS) (1X), sıvı </td><td> Invitrogen </td><td> 14190250 </td><td> pH: 7.4 </td></tr><tr><td> Tripsin, EDTA 4NA% 0,05 (1X), sıvı </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td> Sporcu çıkım </td><td> Berry Hill </td><td> 1550HA </td><td rowspan="2"> Bu inkübatörler en hazır bazılarıdır. Ancak, video, farklı ekipman gösterecektir. </td></tr><tr><td> Sporcu inkübatör </td><td> Berry Hill </td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td> Dremel döner aracı </td><td> Dremel </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hiçbir Dremel kesme tekerlekleri. 36 </td><td> Dremel </td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td> Taşınabilir Pipet Yardım </td><td> Balıkçı </td><td> 1368115E </td><td></td></tr><tr><td> Pamuk Aplikatörler Uçlu </td><td> Balıkçı </td><td> 23-400-001) </td><td></td></tr><tr><td> Döllenmiş yumurta </td><td> Çeşitli </td><td></td><td> Birçok farklı satıcı kullanılabilir. Yumurta yaklaşık 35-55 gram olmalı. Onları yaş arasında 36 ve 55 hafta olmalıdır bırakır tavuklar. </td></tr><tr><td> Hemasitometre </td><td> Hausser Bilimsel, VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td> Fiber-optik mikroskop aydınlatıcı </td><td> Amscope </td><td> HL250-AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> 25 iğne </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green Özü-N-Amp Doku PCR Kiti </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> XNATRG </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model

Primer tümörün metastaz kanser hücrelerinin yayılmasını sırasında, işgal, çevre dokulara ve uzak organlara yayılabilir. Metastaz, birçok doku tipleri, a değişken zaman dilimlerinde, içerir ve genellikle zor araştırmak ve ölçmek için, organların içinde derin meydana karmaşık bir süreçtir. Buna ek olarak, metastatik sürecinin etkinliği zor tümör hücre davranışı tek bir yönü katkısını değerlendirmektir metastatik kaskad birden fazla adımlar etkilenir. Bunun bir sonucu olarak, metastaz testlerin sık metastaz çalışma mutlaka gerçekçi bir bağlam sağlamak için deney hayvanlarında yapılmaktadır. Ne yazık ki, bu modellerin daha da kompleks fizyolojisi karmaşıktır. Civciv embriyo chorioallantoic membran (CAM), tümör hücrelerinin xenografting alıcı kabuğu altında bulunan iyi vaskülarize ekstra embriyonik doku erişilebilirlik nedeniyle eşsiz bir metastaz okuyan birçok sınırlamalar üstesinden in vivo modeldir. (Şekil 1). Ayrıca, doğal civciv embriyo immünyetmezligi beri, CAM kolayca engraftman hem normal ve tümör dokularının destekler. En önemlisi, kuş CAM başarıyla büyüme, istila, anjiyogenez ve mikroçevresinin itilme dahil olmak üzere birçok kanser hücresi özellikleri destekler. Bu kanser metastazı yol ve yeni potansiyel terapötikler metastatik kanser cevabı tahmin etmek yollarının araştırılması için model son derece yararlı hale getirir. Türlerin belirli Alu PCR yaygın hücrelerinin algılama kantitatif 25 hücreleri gibi birkaç kişi tarafından kolonize organlarda metastaz değerlendirmek için mümkün kılar. İnsan Epidermoid Karsinomu hücre hattı (HEp3) kullanarak kanser hücrelerinin spontan civciv karaciğer ve akciğer gibi uzak organlara metastaz analiz etmek için bu modeli kullanın. Ayrıca, Alu-PCR protokolü kullanılarak testin duyarlılığı ve tekrarlanabilirlik intravasation, tutuklama, ekstravazasyon ve kolonizasyon metastaz bireysel unsurları olarak analiz etmek ve ölçmek için bir araç olarak göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model at JoVE.com

Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

Kantitatif PCR kullanarak, köklü civciv CAM modeli, uzak organlara insan tümör hücreleri metastaz kantitatif analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Kuş Embriyo Model kullanarak Kanser metastaz Kantitatif Analiz

During metastasis cancer cells disseminate from the primary tumor, invade into surrounding tissues, and spread to distant organs. Metastasis is a complex ...

quantitative-analysis-of-cancer-metastasis-using-an-avian-embryo-model

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Medicine

Unit 1

Cancer

SCIENTISTS IN ACTION

18.9K Görüntüleme.  Vanderbilt University. Kantitatif PCR kullanarak, köklü civciv CAM modeli, uzak organlara insan tümör hücreleri metastaz kantitatif analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Video: Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Murin Mesane Kanseri bir Ortotopik Model

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Tıp

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment for melanoma remains surgical excision, therefore, the key to extended survival is early detection 2,3. Considering the large numbers of patients diagnosed every year and the limitations in accessing specialized care quickly, the development of objective in vivo diagnostic instruments to aid the diagnosis is essential. New techniques to detect skin cancer, especially non-invasive diagnostic tools, are being explored in numerous laboratories. Along with the surgical methods, techniques such as digital photography, dermoscopy, multispectral imaging systems (MelaFind), laser-based systems (confocal scanning laser microscopy, laser doppler perfusion imaging, optical coherence tomography), ultrasound, magnetic resonance imaging, are being tested. Each technique offers unique advantages and disadvantages, many of which pose a compromise between effectiveness and accuracy versus ease of use and cost considerations. Details about these techniques and comparisons are available in the literature 4.
Infrared (IR) imaging was shown to be a useful method to diagnose the signs of certain diseases by measuring the local skin temperature. There is a large body of evidence showing that disease or deviation from normal functioning are accompanied by changes of the temperature of the body, which again affect the temperature of the skin 5,6. Accurate data about the temperature of the human body and skin can provide a wealth of information on the processes responsible for heat generation and thermoregulation, in particular the deviation from normal conditions, often caused by disease. However, IR imaging has not been widely recognized in medicine due to the premature use of the technology 7,8 several decades ago, when temperature measurement accuracy and the spatial resolution were inadequate and sophisticated image processing tools were unavailable. This situation changed dramatically in the late 1990s-2000s. Advances in IR instrumentation, implementation of digital image processing algorithms and dynamic IR imaging, which enables scientists to analyze not only the spatial, but also the temporal thermal behavior of the skin 9, allowed breakthroughs in the field.
In our research, we explore the feasibility of IR imaging, combined with theoretical and experimental studies, as a cost effective, non-invasive, in vivo optical measurement technique for tumor detection, with emphasis on the screening and early detection of melanoma 10-13. In this study, we show data obtained in a patient study in which patients that possess a pigmented lesion with a clinical indication for biopsy are selected for imaging. We compared the difference in thermal responses between healthy and malignant tissue and compared our data with biopsy results. We concluded that the increased metabolic activity of the melanoma lesion can be detected by dynamic infrared imaging.

We demonstrated that malignant pigmented lesions with increased metabolic activity generate quantifiable amounts of heat and the measurement of the transient thermal response of the skin to a cooling excitation allows quantitative identification of melanoma and other skin cancers (vs. non-proliferative nevi) at an early stage of the disease.

Kantitatif Görselleştirme ve Dinamik Termal Görüntüleme Deri Kanseri Tespiti

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

Meme Kanseri Beyin metastaz tümör Hipoksi Dynamics in vivo Biyoparlaklık Görüntüleme Fare Modeli

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Manyetik Rezonans Görüntüleme, Volumetrik Bilgisayarlı Tomografi ve Ultrason Kullanımı Meme Kanseri Kemik metastazı bir Nude Rat Model Angiogenezis Multi-modal Görüntüleme

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

Kemik Metastaz Modelleri

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

Rekabetçi bir mürin Kemik İliği Transplantasyon Modelinde Donör Hücre Aşı belirleme Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR kullanarak

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

İnsan Prostat Kanser metastaz Ortotopik fare modeli

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Meme Kanseri Bir Roman Transgenik Fare Modeli: Adenovirüs-Kretasedekine ile epiteli Hedefleme ile Metastatik Meme Kanseri Başlatma

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Kantitatif Real Time PCR kullanarak Beyin Omurilik Sıvısı MicroRNA Profil

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

İçi periton Yumurtalık Kanseri Metastaz kantitasyonu

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States.  Mortality is due to diagnosis of 75% of ...