Bu yöntem, araştırmacıların bazal ön beyin ve yüz arasındaki doku etkileşimlerini değerlendirmelerini sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, değerlendirme için bazal ön beyni izole etmesi ve analizi karıştıracak nöral krest hücreleri ile kontaminasyonu önlemesidir. Bu tekniğin zor kısmı, ön beynin konakçıdan çıkarılması ve donör doku ile değiştirilmesidir.
Prosedürü gösteren, Dr. Ralph Marcucio'nun laboratuvarından bir araştırma bilimcisi olan Diane Hu olacak. Başlamak için, DMEM ortamını nötr kırmızı, cam transfer pipeti ve keskinleştirilmiş tungsten ile hazırlayın. 10 mililitrelik bir şırınga ve 18 gauge iğne kullanarak, yumurta kabuğunun sivri ucundan 0.5 mililitre albümin çıkarın.
Makas noktasını kullanarak kabuğun üstüne küçük bir delik açın. Daha sonra deliğin üzerine bir bant parçası yerleştirin ve embriyoyu ortaya çıkarmak için dairesel bir açıklık kesin. Embriyoyu nötr kırmızı ile lekeleyin.
Evre yedi veya sekiz embriyonun bazal ön beyninin sol tarafından doku greftleri toplayın. Ön beynin bir parçasını hafifçe kesmek için kavisli keskinleştirilmiş tungsten iğneleri kullanın. Altta yatan endodermi dahil etmemek için, iğneyi ön beynin altına ve nöral tüpün eksenine paralel olarak kaydırın.
Cam transfer pipetini kullanarak grefti donör embriyodan alın ve boyamak için iki dakika boyunca nötr kırmızı içeren DDEM'ye aktarın. Daha sonra lekeli grefti engraftmana hazır olana kadar nötr kırmızı içermeyen DMEM'ye yerleştirin. Döllenmiş yumurtaları beyaz Leghorn tavuğundan 37 santigrat derecede Hamburger-Hamilton etap yedi ila sekizinci aşamaya kadar nemlendirilmiş bir odada kuluçkaya yatırın.
Daha önce gösterildiği gibi embriyoları açığa çıkarın. Keskinleştirilmiş tungsten iğneleri kullanarak, grefti yerleştirmek için 0.3 x 0.2 milimetrelik bir bazal ön beyin parçasını kesip çıkararak greft bölgesini hazırlayın. Altta yatan endodermin aşırı bozulmasından kaçının, bu da yumurta sarısı granülleri yapılan herhangi bir yırtılmadan sızmaya başlayacağı için belirgin olacaktır.
Grefti konakçıya aktardıktan sonra, konağın dökülmüş bazal ön beyninin yerini alacak şekilde grefti konumlandırın. Bandı deliğin üzerine sıkıca yerleştirin ve embriyoları analize hazır olana kadar 37 santigrat derece inkübatöre geri döndürün. Başlangıçta, bıldırcın dokularının civciv embriyolarına nakledilmesiyle kimeralar oluşturuldu.
QCPN antikoru kullanılarak bıldırcın hücreleri görselleştirildi ve konakçı dokulardan ayırt edildi. Bıldırcın-civciv sistemi, greftin tamamının sadece sinir dokusundan oluştuğunu ve diğer hücre tipleriyle kontamine olmadığını doğruladı. Bıldırcın dokusunun ördek embriyolarına nakli, daha hızlı gelişen bıldırcın beyni nedeniyle ciddi şekilde deforme olmuş kimeralara yol açtı.
Bu nedenle, ördek dokularının tavuk embriyolarına nakli yapıldı. Ortaya çıkan ördek-civciv kimeraları, beynin morfolojinin düzenlenmesine katıldığını göstermektedir. Kimeralarda Sonic kirpi ekspresyonunu değerlendirmek için tüm dağ C2 hibridizasyonu kullanıldı.
Morfolojiye benzer şekilde, kimeranın ördek tarafındaki Sonic kirpi ifadesi daha ördek benzeri görünüyordu. Ev sahibi siteyi hazırlamak pratik gerektirir. Çok sayıda embriyo hayatta kalamaz, bu nedenle çok sayıda kimera oluşturmak, analiz için uygun örneklerin sağlanmasına yardımcı olabilir.
Bu yöntem, beyinden gelen sinyallerin frontonazal ektodermal bölgedeki Sonic hedgehog ekspresyon alanını nasıl şekillendirdiğini değerlendirmeyi mümkün kılmıştır.
