Name: measuring endoreduplication by flow cytometry of isolated tuber protoplasts
Uploaded: 2018-03-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts at JoVE.com

Bu araştırma Ulusal Bilim Vakfı Ödülü numarası "Heterozygosity, Allelic kompozisyon ve kopya numarası varyasyon patates çözülüyor" 1237969 tarafından finanse edildi ve USDA özel Grant 2014-34141-22266 (Maine Üniversitesi) için RV

Not: Deneysel örnekleri olarak aynı Ploitlik dokusunun yaprak şeklinde uygun denetimleri, genellikle eklemek önemlidir. Bunun nedeni yumru örnekleri 2 C zirvesine küçük ve tanımlamak zor olabilir.
1. hazırlıkları
Not: burada listelenen çözümleri vaktinden önce hazırlanacak ve 4 ° C'de depolanan ancak bu sonraki adımlar sunulan kullanım gününde taze yapılması gerekir.
<ol><li>Uygun bir birim Plasmolysis kuluçka çözüm (PIS) yapmak (15 mL/örnek): 0.55 M mannitol, 2 mM CaCl2, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris tampon pH 7.5 (HCl ile ayarlanabilir).</li>
	<li>Uygun bir birim Plasmolysis yıkama çözüm (PWS) yapmak (15 mL/örnek) olduğu için PIS aynı 0,71 M mannitol ilavesi hariç.</li>
	<li>Değiştirilmiş Galbraith'ın Akış Sitometresi arabellek11 (FCB) 250 mL olun: 13,6 mM sodyum sitrat (TRISODYUM), 8 mM BEZLERİ, 18 mM MgCl2, % 0,4 v/v Triton X-100. Triton X-100 dağıtmak en az 30 dakika karıştırın.</li>
	<li>Filtre sterilize PIS ve Hava Meydanı çözümleri olan bir 0,22 µm asimetrik polyethersulfone (maymun) filtre. Vakum tahrik filtreleme birimleri kullanın.</li>
	<li>
106 µm kafes filtreler lysed önceki için hazırlayın. Süspansiyonlar 106 µm filtreden geçen herhangi bir yöntem kullanılabilir ancak 1,5 mL doğrudan koleksiyonu tüpler içine iç içe olabilir microcentrifuge tüpleri hazırlayın. Not: Bunlar steril olması gerekmez.<ol>
<li>1.5 mL microcentrifuge tüpler kullanıyorsanız, 1 cm uzakta belgili tanımlık uç her microcentrifuge tüp kesti. Sıcak bir tabak veya diğer ısı kaynak ısı kullanarak 1 cm2 adet 106 µm çelik kafes alüminyum folyo bir parçası üzerinde. Onlar erimiş kadar tüp kesme sonu kafes basın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Patates tatmak için tüm toprak ve enkaz kaldırma yıkayın. Not: Yumru boyutu ve yaş deneme gol için uygun olmalıdır ancak sonuçlar kalitesini etkileyecek gibi görünüyor değil. Soğuk hava deposu (4 ° C, % 95 RH) için 8 ay olmuştur yumrular başarıyla bu protokole uyguladınız. Yumrular kusurları (örneğin yumru son rot, içi boş kalp, kahverengi nekrotik alanlar) ile duyarlı olsa da, onlar, mümkünse kaçınılması gerekir.</li>
</ol>2. gün 1: Yumru doku Plasmolyze
Not: Kontrol yaprak örnekleri burada önceki üretmek veya ham ürünleri tercih edilen iseniz, 5.2 atlamayı dahil edilebilir. Laminar akış hood gibi aseptik bir ortamda steril araçlarla gerçekleştirilmelidir.
<ol><li>Yüzey patates yumrular % 75 etanol en az 5 min için daldırma ile sterilize.</li>
	<li>Kaldır yumrular etanol ve hava kuru. Yumru 100 gr büyükse, bu genellikle ~ 5 dk, daha uzun sürer.</li>
	<li>Hazırlamak ve her içine PIS etiketi steril 50 mL konik tüpler için her örnek ve filtre aliquot 15 mL steril.</li>
	<li>
Yaklaşık 1 cm3 sterilize yumrular steril neşter ya da mantar matkap kullanarak istenen dokudan örnek. Not: örnek doku bağlı olarak bir steril cork matkap veya bıçak/neşter kullanabiliriz. Örneğin, ilik isterseniz mantar matkap çekirdeğinden apikal yumru distal ucuna çekmek için kullanılan ve çekirdek orta kısmını örnek. Ancak, patates yumrular asimetrik iç morfolojisi nedeniyle örnek parankimi için daha kesin olabilir veya yumru yarıya indirmek ve istenilen doku bilincin korteks. İç yumru Morfoloji bir tasviri için bkz: şekil 1 .<ol>
<li>Kaba doku içine yaklaşık 3 mm3 adet ve transferi doku konik tüp PIS içeren steril neşter kullanarak doğrayın. Gecede 4 ° C'de kuluçkaya Not: Bu yüzey alanı en üst düzeye çıkarmak için olduğunu böylece PIS, ve daha sonra enzim çözüm tam olarak nüfuz daha kapsamlı sindirim sonucu doku.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig1.jpg"> Şekil 1: patates yumru iç morfolojisi. İlik (P) ile perimedullary parankimi (PM) arasındaki mesafeyi siyah çizgiler ile gösterilmektedir. Parankimi korteks (C) ayıran vasküler ring siyah bir ok ile gösterilir. Stolon sonu (S) ve yumru gözler (E) de etiketlenir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57134/57134fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
3. gün 2: Patates önceki üretmek
Not: Bu laminar akış hood gibi aseptik bir ortamda steril araçlarla gerçekleştirilmelidir.
<ol><li>Hazırlamak ve (0,45 µm maymunlar) uygun bir miktar enzim çözüm (ES) filtre (10 mL/örnek): 0,71 M mannitol, 3 mM CaCl2, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, % 4 Onozuka R-10 cellulase, %0,8 macerozyme R-10, % 1'hemicululase, 10 mM MES arabellek, pH 5.8. Uygun filtreler bu adımda kullanıldığından emin olun; filtreler ile 0,45 µm yatkındır gibi maymunlar, düşük protein bağlayıcı membran filtrasyon sırasında Enzim kaybı en aza indirir, ancak tıkanma için daha küçük boyuta gözenek.</li>
	<li>PIS konik tüpler steril serolojik pipet kullanarak örneklerinden Aspire edin.</li>
	<li>Her örnek ve ters çevirmek için ES 10 mL ekleyin 2-3 kez.</li>
	<li>Örnekleri gecede 29 ° C'de 180 rpm yatay sallayarak ile kuluçkaya. Örnekler en az 16 h için kuluçkaya.</li>
</ol>4. gün 3: Hasat önceki ve yıkama önceki
Not: Aseptik koşullar bu noktada Hayır uzun zaman gerek yoktur.
<ol><li>Örnekleri shaker kaldırmak ve onları ~ 10 dk için yerleşmek izin.</li>
	<li>
Kapalı büyük bir kısmını ES çözüm mümkün olduğunca Aspire edin.
	<ol>
<li>ES çözüm olarak sindirilir dokusunu önlemek için dikkat çekici bir serolojik pipet ile mümkün olduğunca kaldırın.</li>
		<li>Micropipette Kaldır kullanarak kalan herhangi bir ES çözüm tekrar sindirilir doku kaçınarak. Bu en kolay sindirilir doku en altında kalırken ES çözüm kapak doğru akması tüp bir açıyla tutarak yapılır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her örnek için Hava Meydanı 15 mL ekleyin ve yavaşça tersine çevirin 2-3 kez. Önceki 10 dakikadır yerleşmek izin verir.</li>
	<li>PWS serolojik pipet ile kaldırın. Bir micropipette kalan herhangi bir sıvı kaldırmak için kullanın. Not: Bu sırasında Akış Sitometresi örneği çekirdeği bütünlüğünü sağlamak için kesinlikle çok önemli bir adımdır. Sorun gidermede, bu adımı bir örnek başarısızlık büyük olasılıkla kaynak bulundu.</li>
</ol>5. gün 3: Örnek Akış Sitometresi için hazırlamak.
Not: Örnekleri buradan buzda aksi belirtilmedikçe tutulmalıdır.
<ol><li>Propidium iyodür (0.4 mg propidium iyodür/mL FCB) ve RNase çözümleri hazırlamak (0,8 mg RNase A / mL FCB) her FCB içinde eriterek tarafından. Dikkat: Propidium iyodür çok zehirli. Cilt veya gözlerle temas kaçının. Uygun KKE giymek.</li>
	<li>
Buz 1,5 mL ekleyin her örnek için soğuk FCB. Kısaca sallamak ya da girdap ayırmak için her örnek toplanan doku. Yumru doku kümeleri kadar break FCB tam hücreleri nüfuz ve çekirdekleri serbest bırakmak önemlidir. Farklı örnekler az ya da doku ve genotip bağlı olarak ajitasyon gerektirebilir. Not: FCB çekirdeklerin bırakmadan önceki lyses. Bu nedenle tutmak gerekliliğini yıkımı önlemek için buza örnekler.<ol>
<li>Denetim akış sitometresi örnekleri protoplast üretimi adımda dahil değildi Eğer onlar burada dahil edilebilir. Eğer bir kontrol eklemek için küçük yaprak (~ 3 cm2) 1,5 mL buz ince doğrayın soğuk FCB jilet kullanarak. Kontrol örnekleri deneysel örnekleri, tercihen aynı genotip olarak aynı Ploitlik olmalı. Vitro Bitkicik sera veya alan yetiştirilen bitkiler daha temiz doruklarına vermek eğilimindedir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
FCB/doku süspansiyon 1 mL 106 µm gözenekli filtre geçmek. 1.5.1. adımda açıklandığı gibi altına metal kafes erimiş ve kesilmiş ipucu ile 1.5 mL microcentrifuge tüp kullanın. Bu microcentrifuge tüp bir 2 mL microcentrifuge tüp iç içe olabilir ve örnek doğrudan üzerinden geçti. Filtrasyon başka bir yöntem kullanıyorsanız, filtrate buz gibi bir Petri tabak içinde toplanan ve daha sonra 2 mL tüp için transfer. Not: bazen kalan agrega ve hücresel enkaz gözenekli filtre yapışmasına neden. Bu durumda, sadece iki iç içe geçmiş microcentrifuge tüp birkaç kez dokunun enkazı çıkarmak için.</li>
	<li>250 µL RNase çözümde her örnek için ekleyin. Ters çevir ve oda sıcaklığında (RT) 30 dk için kuluçkaya. Not: Bu adım daha az gürültü için Akış Sitometresi sırasında önde gelen örneklerinden, RNA kaldırmak için tasarlanmıştır. Çekirdeklerin kısa ömürlü olduğu için ancak, araştırmacılar kuluçka zamanı azaltmak veya saldırganın saklanıp örnekleri ciddi sorunlar yaşamaya devam ediyorsanız buz üzerinde gerçekleştirmek karar verebilir.</li>
	<li>Propidium iyodür çözüm 125 µL her örnek için ekleyin. Ters çevir ve 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya. Not: Örnek Akış Sitometresi bozulması bile buz üzerinde 2 saat içinde belirgin olduğu gibi en kısa zamanda kullanılmalıdır.</li>
</ol>6. gün 3: Akış Sitometresi patates yumru nükleuslar
Not: Akış Sitometresi işlemi ve yazılım enstrüman ve üreticisine bağlı olarak değişiklik gösterir. Cihazın kullanım kılavuzunda Akış Sitometresi belirli işleyişi hakkında ayrıntılı talimatlar sağlanacaktır.
<ol><li>Vs yan dağılım ve propidium iyodür (PI) vs yan dağılım ileri dağılım Logaritmik ölçek kullanarak iki nokta araziler oluşturun. Ayrıca bir çubuk grafik ile PI x ekseni üzerinde oluşturun. Logaritmik ölçek çekirdeği büyük ölçüde Floresans içinde farklı olabilir olarak tüm olayları içinde ölçekli olduğundan emin olmak için gereklidir.</li>
	<li>
Bir bilinen denetim örnek tüp yük ve böylece tüm olayları ölçekte gerilim ayarlayın. Biz bir örnek genotip dokudan tüp bebek yaprak kullanın. Eğer farklı ploidies örnekleri çalıştırılması için her bir denetimi örneğini dahil edilmelidir.
	<ol>
<li>Not 2 C en yüksek kanal denetimi örneğini alın. Deneysel örnekleri 2C doruklarına aynı konuma düşmek gerekir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir deneysel (yumru) örnek yük ve tekrar tüm olayları ölçek üzerinde olduğundan emin olun. Ayarlamalar eğer gerekli, yineleme adım 2 C kanal tanımlamak için 6,2 doruklarına.</li>
	<li>El ile yan dağılım vs PI çizim kullanarak protoplast çekirdeği kapı.</li>
	<li>Sadece kapı protoplast çekirdeği bölgesinde göstermek için PI çubuk grafik ayarlayın.</li>
	<li>Olaylar için istediğiniz sayıyı örnekleri toplamak. Sık sık araştırmacılar 10,000 geçişli olayları Akış Sitometresi için kullanın; Ancak 2000 etkinlikler yumru protoplast örnekleri için daha fazla örnekleri ve düşük konsantrasyonlarda örnekleriyle uyum sağlamak için kullanın.</li>
	<li>Aşağıdaki formül kullanılarak PI çubuk grafikler üzerinden her örnek EI Hesapla: EI =<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57134/57134eq1.jpg"> 4 C 4 C (endoreduplication bir turu temsil eden) olan çekirdek yüzdesi nerede, 8C 8 C, ve benzeri yüzdesidir. Bkz: çubuk grafikler örnekleri için şekil 4 ve C-değerleri doruklarına.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wilson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The karyoplasmic ratio. 727, (1925).</li><li>Szymanski, D. B., Marks, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLABROUS1+overexpression+and+TRIPTYCHON+alter+the+cell+cycle+and+trichome+cell+fate+in+Arabidopsis.">GLABROUS1 overexpression and TRIPTYCHON alter the cell cycle and trichome cell fate in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 10 (12), 2047-2062 (1998).</li><li>Melaragno, J. E., Mehrotra, B., Coleman, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+endopolyploidy+and+cell+size+in+epidermal+tissue+of+Arabidopsis.">Relationship between endopolyploidy and cell size in epidermal tissue of Arabidopsis.</a> Plant Cell. 5 (11), 1661-1668 (1993).</li><li>Grafi, G., Larkins, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoreduplication+in+maize+endosperm:+involvement+of+M+phase--promoting+factor+inhibition+and+induction+of+S+phase--related+kinases.">Endoreduplication in maize endosperm: involvement of M phase--promoting factor inhibition and induction of S phase--related kinases.</a> Science. 269 (5228), 1262-1264 (1995).</li><li>Schweizer, L., Yerk-Davis, G., Phillips, R., Srienc, F., Jones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+maize+endosperm+development+and+DNA+endoreduplication.">Dynamics of maize endosperm development and DNA endoreduplication.</a> Proc Natl Acad Sci. 92 (15), 7070-7074 (1995).</li><li>Chen, C. T., Setter, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+potato+tuber+cell+division+and+growth+to+shade+and+elevated+CO2.">Response of potato tuber cell division and growth to shade and elevated CO2.</a> Ann Bot. 91 (3), 373-381 (2003).</li><li>Chen, C. T., Setter, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+potato+dry+matter+assimilation+and+partitioning+to+elevated+CO2+at+various+stages+of+tuber+initiation+and+growth.">Response of potato dry matter assimilation and partitioning to elevated CO2 at various stages of tuber initiation and growth.</a> Environ Exp Bot. 80, 27-34 (2012).</li><li>Cheniclet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+expansion+and+endoreduplication+show+a+large+genetic+variability+in+pericarp+and+contribute+strongly+to+tomato+fruit+growth.">Cell expansion and endoreduplication show a large genetic variability in pericarp and contribute strongly to tomato fruit growth.</a> Plant Physiol. 139 (4), 1984-1994 (2005).</li><li>Pirrello, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+fruit+developmental+biology+makes+use+of+flow+cytometry+approaches.">How fruit developmental biology makes use of flow cytometry approaches.</a> Cytometry Part A. 85 (2), 115-125 (2014).</li><li>Chevalier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoreduplication+and+fruit+growth+in+tomato:+evidence+in+favour+of+the+karyoplasmic+ratio+theory.">Endoreduplication and fruit growth in tomato: evidence in favour of the karyoplasmic ratio theory.</a> J Exp Bot. 65 (10), 2731-2746 (2014).</li><li>Galbraith, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+flow+cytometric+analysis+of+the+cell+cycle+in+intact+plant+tissues.">Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissues.</a> Science. 220 (4601), 1049-1051 (1983).</li><li>Dole&#382;el, J., Greilhuber, J., Suda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+with+Plants:+An+Overview.">Flow Cytometry with Plants: An Overview.</a> Flow Cytometry with Plant Cells. , 41-65 (2007).</li><li>Dole&#382;el, J., Barto&#353;, J. A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+DNA+flow+cytometry+and+estimation+of+nuclear+genome+size.">Plant DNA flow cytometry and estimation of nuclear genome size.</a> Ann Bot. 95 (1), 99-110 (2005).</li><li>Doke, N., Tomiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hyphal+wall+components+from+Phytophthora+infestans+on+protoplasts+of+potato+tuber+tissues.">Effect of hyphal wall components from Phytophthora infestans on protoplasts of potato tuber tissues.</a> Phys Plant Path. 16 (2), 169-176 (1980).</li><li>Davis, D. A., Currier, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+the+phytoalexin+elicitors,+arachidonic+and+eicosapentaenoic+acids,+and+other+unsaturated+fatty+acids+on+potato+tuber+protoplasts.">The effect of the phytoalexin elicitors, arachidonic and eicosapentaenoic acids, and other unsaturated fatty acids on potato tuber protoplasts.</a> Physiol Mol Plant Pathol. 28 (3), 431-441 (1986).</li><li>Laimbeer, F. P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplast+isolation+prior+to+flow+cytometry+reveals+clear+patterns+of+endoreduplication+in+potato+tubers,+related+species,+and+some+starchy+root+crops.">Protoplast isolation prior to flow cytometry reveals clear patterns of endoreduplication in potato tubers, related species, and some starchy root crops.</a> Plant Methods. 13 (1), 27 (2017).</li><li>Uijtewaal, B. A., Huigen, D. J., Hermsen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+potato+monohaploids+(2n=x=12)+through+prickle+pollination.">Production of potato monohaploids (2n=x=12) through prickle pollination.</a> Theor Appl Genet. 73 (5), 751-758 (1987).</li><li>Karp, A., Risiott, R., Jones, M. G. K., Bright, S. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+doubling+in+monohaploid+and+dihaploid+potatoes+by+regeneration+from+cultured+leaf+explants.">Chromosome doubling in monohaploid and dihaploid potatoes by regeneration from cultured leaf explants.</a> Plant Cell Tiss Org Cult. 3 (4), 363-373 (1984).</li><li>Doke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+superoxide+anion+by+potato+tuber+protoplasts+during+the+hypersensitive+response+to+hyphal+wall+components+of+Phytophthora+infestans+and+specific+inhibition+of+the+reaction+by+suppressors+of+hypersensitivity.">Generation of superoxide anion by potato tuber protoplasts during the hypersensitive response to hyphal wall components of Phytophthora infestans and specific inhibition of the reaction by suppressors of hypersensitivity.</a> Phys Plant Path. 23 (3), 359-367 (1983).</li><li>Doke, N., Tomiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+the+hypersensitive+response+of+potato+tuber+protoplasts+to+hyphal+wall+components+by+water+soluble+glucans+isolated+from+Phytophthora+infestans.">Suppression of the hypersensitive response of potato tuber protoplasts to hyphal wall components by water soluble glucans isolated from Phytophthora infestans.</a> Phys Plant Path. 16 (2), 177-186 (1980).</li><li>Saxena, P. K., King, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reuse+of+enzymes+for+isolation+of+protoplasts.">Reuse of enzymes for isolation of protoplasts.</a> Plant Cell Rep. 4 (6), 319-320 (1985).</li><li>Sgorbati, S., Levi, M., Sparvoli, E., Trezzi, F., Lucchini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+and+flow+cytometry+of+4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole+(DAPI)-stained+suspensions+of+nuclei+released+from+fresh+and+fixed+tissues+of+plants.">Cytometry and flow cytometry of 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-stained suspensions of nuclei released from fresh and fixed tissues of plants.</a> Physiol Plant. 68 (3), 471-476 (1986).</li><li>Bhojwani, S. S., Dantu, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+and+cell+culture.">Tissue and cell culture.</a> Plant Tissue Culture: An Introductory Text. , 39-50 (2013).</li><li>Flores, H. E., Kaur-Sawhney, R., Galston, A. W., Maramorosch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasts+as+Vehicles+for+Plant+Propagation+and+Improvement.">Protoplasts as Vehicles for Plant Propagation and Improvement.</a> Advances in Cell Culture. 1, 241-279 (1981).</li><li>Reeve, R. M., Timm, H., Weaver, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parenchyma+cell+growth+in+potato+tubers+I.+Different+tuber+regions.">Parenchyma cell growth in potato tubers I. Different tuber regions.</a> Am Potato J. 50 (2), 49-57 (1973).</li><li>Scholes, D. R., Paige, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+ploidy:+a+generalized+response+to+stress.">Plasticity in ploidy: a generalized response to stress.</a> Trends Plant Sci. 20 (3), 165-175 (2015).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Burada sunulan iletişim kuralı diğer Akış Sitometresi hazırlıklar engel araştırmacılar ile endoreduplication patates yumrular, değiştirilmiş olan hücresel içerik ve artan hücre boyutu görünüşte içinde değerlendirmek için bir yol sağlar. Protokol protoplast nesil nükleer bütünlüğü korunarak gürültü ve enkaz azaltmak için bir araç olarak üzerine dayanır. Daha önce araştırmacılar özellikle inatçı Akış Sitometresi örnekleri benzer hazırlıkları açıklanan yanı sıra çeşitli konularda Patogenez19,20gibi çalışmaya yumru önceki kullanılmaktadır. Ancak, bizim bilgi için hiçbiri böyle yumru önceki kullanımı endoreduplication eğitim amacıyla Akış Sitometresi ile birleştirdik. Ayrıca, tipik ham hazırlıkları yanı sıra teknik iki sadece diğer çalışmalar yumru endoreduplication6,7değerlendirmek için kullanılan daha güvenilir olmak önceki kullanımı bulduk. Burada iletişim kuralı, yürütme ve örnek hazırlama, ve bu istihdam tipik bir denemenin sonuçları potansiyel tuzaklar eksikliklerin tartışmak.
Yardımcı programı ve tekrarlanabilirlik yumru Akış Sitometresi protokolünün rağmen ele birkaç zayıflıkları vardır. Başlamak için saat iki gecede incubations gerektiren yoğun iletişim kuralıdır. Ayrıca, protokol bazı pahalı reaktifler, özellikle cellulase ve macerozyme gerektirir. Ayrıca, hazırlıklar özellikle birçok olay istenirse hangi üretilen iş tek bir gün içinde sınırlayabilir bir kaç saat içinde son derece zamana duyarlı, aşağılayıcı. Son olarak, protokol, güvenilir olsa da, tüm bunların çekirdek ve daha düşük kalitede sonuçlar zarar görmesine neden gibi görünüyor içinde numune hazırlama hataları duyarlıdır. Örneğin, mikrobiyal kirlenme sırasında plasmolysis ve işgal üretimi adımları (1-3,4) yanlış aseptik teknik nedeniyle oluşabilir. Örnek her zaman başarı örneği, iyileştirmelerden iken kirlilik, elde edilen çubuk grafikler, çekirdekler için hasar tekrar olasılığı nedeniyle kalitesini önemli ölçüde azaltmak için gibi görünüyor.
Daha önce belirtildiği gibi iletişim kuralının büyük dezavantaj maliyeti, zaman ve hassasiyet hataları vardır. Araştırmacılar bunların her biri azaltmak için ilgili adımları uygulamak isteyebilirsiniz. Maliyet, gelince pek çok örnekleri için iletişim kuralı uygulamak isteyen araştırmacılar enzim konsantrasyonları ve/veya süre sindirim adımın farklı dokular değiştirme düşünebilirsiniz ve genotip yanıt değişiklik gösterebilir. Bu filtre uygulama imkanı içerir ve daha önce gösterdi ama ES geri dönüşüm burada21istihdam. Zamanında bizim gözlem gelince ilk kuluçka (plasmolysis adım) ile dağıtmak ve hala önceki ayıklamak mümkündür; Ancak, onların bütünlüğü ve bereket, hangi olumsuz sonuçları etkiler yaşayacaktır. Örnekleri bozulma azaltmak için araştırmacılar bazı Akış Sitometresi yaklaşımlar örnek bütünlük22korumak için (Örneğin, formaldehit) Fiksajlar kullanımı dahil düşünebilirsiniz. Bu hem bozulmasını önlemek ve sunulan aynı gün meydana gelen örnek protoplast yerine depolama ödemezse ve Akış Sitometresi için izin vermek için yararlı bir araç olabilir. Çekirdeklerin yıpratma engelleyen başka bir aracı ES ve/veya FBC nükleaz inhibitörü eklemek olabilir; 2-mercaptoethanol hiçbir göze çarpan değişiklikler geliştirme sırasında etkilenen iken, diğer inhibitörleri burada sınanmamıştır.
Bizim gözlem tek en kritik adım adım 4.4, kaldırma önce Akış Sitometresi arabellek (FCB) yanı sıra tüm plasmolysis yıkama çözüm olduğunu. Eğer bile küçük bir birim (< 10 µL) kalıntıları, örnekleri çok daha bunun için yoksul ya da bile başarısız örnek açabilir bozulmuş muhtemeldir. Bu enzim çözüm içindeki yabancı maddeleri nedeniyle muhtemeldir (örneğin enzimler, proteaz)23,24 hızlı bir şekilde saat arasında düşük konsantrasyonlarda bile örnek çalıştırır ve kuluçka dönemleri sırasında çekirdeklerin bozulmasına yol açar. Diğer bir önemli faktör PI ve RNase kuluçka adımları süresi kadardır. İletişim kuralında belirtildiği gibi örnekleri düşük çekirdek kaynaklanan araştırmacılar daha fazla numune veya uzun Akış Sitometresi yerleştirmek için aşağıdaki adımları süresini azaltmak karar verebilirsiniz böylece FCB ilavesi çalıştıktan sonra bir kaç saat için kararlı kalmaz konsantrasyonları. Bu da olayların örnek başına toplam sayısını ve çalıştırılması veya daha önce bahsedilen gibi Fiksajlar kullanmayı düşünün için örnekleri arasında tradeoff düşünmeye araştırmacı gerektirir.
Doku ve genotip arasındaki farklar
Sonuçları temsilcisi Protokolü'nün sağlamak üzere iki basit deneyler doku tarafından daha önce raporlanmış değişim onaylamak ve Ploitlik ve genotip etkisini incelemek için tasarlanmıştır. İlik dokusu bir kez daha yüksek EI var bulundu gibi protokol tekrarlanabilir sonuçlar verir doku denemenin sonuçları göstermektedir. Biraz şaşırtıcı daha önce değerlendirildi değil, parankimi doku bir EI değeri önemli ölçüde ilik daha düşük ve benzer kortikal doku vardı. Parankimi hücreleri en az vade sonunda öz ya da beyin hücreleri, genellikle büyüktür bu beklenmedik oldu. Yumrular (90-130 g) tam olarak genişletilmiş ve onların en fazla C-değerleri25ulaştı vade sonunda yumru birim çoğunluğu oluşturan parankimi hücreler için olgun bir mantıklı açıklaması bu. Bu da neden açıklayabilir dihaploid (VT_SUP_19) ve iki katına dihaploid (VT_SUP_19 4 x) cv. üstün yumrular; daha önemli ölçüde daha fazla EI gösterdi yaklaşık olarak eşit büyüklükte yumrular her genotip örneklenmiş, yumrular VT_SUP_19 veya isogenic tetraploid en büyük boyutunu yaratıcı daha küçük iken. Böylece, o-ebilmek var olmak onlar sade bir şekilde büyük EI görüntülenen en fazla ulaşılabilir boyutlarına göre daha büyük oldukları için. Alternatif olarak, fark VT_SUP_19 tetraploid onun progenitör alınan genetik tamamlayıcı bir sonucu olabilir. Dihaploid ayıklama üzerinde tetraploid oluştu genomik azaltılması da yükseltilmiş EI-26katkıda bulunmak için gösterilen bitki çapında stres sonuçlanan zararlı gen maskesi başka bir ihtimal. Yine de, bu dikkatli bir değerlendirme araştırmacılar yumrular ve dokuların seçerken özellikle arasında genotip EI değerleri karşılaştırma için kullanılmak üzere istihdam gerekir göstermektedir.
Gelecek uygulamaları
Bu makalede açıklanan protokol patates anlayış endoreduplication için araştırmacılar ile önemli bir araç sağlar. Bu gelişme karşısında yumru dokulara zaman seyri ve doğal varyasyon değerlendirilmesi endoreduplication, genetik ve çevresel bileşenlerine çalışmaları için izin verebilir. Sonuçta, endoreduplication patates iyileştirme, güvenilir bir aracı değerlendirme gerektiren bir girişim için umut verici bir hedef yapmak.

Endoreduplication bir hücre tipik hücre döngüsü forgoes ve bunun yerine bir alternatif tabii ki DNA ikileşmesi hücresel bölünme olmadan tekrarlanan tur oluşan geliştirme uğrar işlemidir. Elde edilen hücre DNA artmış olacak içerik ve nükleer boyutu hücresel düzenlemesi, genişleme ve uzmanlık bir rol oynadığı düşünülmektedir. Genel olarak, (bir endocycle olarak adlandırdığı) endoreduplication ve DNA içeriği karşılık gelen artış bir tur daha büyük hücre birimle ilişkili, "DNA içeriği artan karyoplasmic teorisi" çöktürülmüş bir gözlem için düzgün gereklidir düzenleyen bir daha büyük, belki de daha fazla karmaşık, hücre1. Bu fenomen dokuların yapısal/savunma (trichomes)2,3, olanlar dahil olmak üzere bir aralıktaki gözlenen yüksek bitkilerde yaygındır Besleyici (Mısır endosperm)4,5ve lavabo/depolama () domates meyve örtüsü; patates yumru)6,7,8 işlevleri. Meyve, o endoreduplication olarak endoreduplication ve meyve gelişimsel dönem9arasında negatif ilişki kanıtladığı meyve örtüsü hızlı büyümenin kolaylaştırıcı bir rol oynar sürülmüştür. Örneğin DNA ile 512 C (512 kez haploit genom) domates meyve örtüsü8' gözlenen içerik içeren hücreler. Ayrıca Chevalier ve ark. (2014) değişiklikler hücre döngüsü genlerin ifadesinde daha büyük meyve10sonra hangi sonuçlara endoreduplication düzeyleri meyve örtüsü içinde artışlara açabilir gösterdi. Bu nedenle, değişiklik endoreduplication teşvik genlerin biyokütle veya verim bitki ıslahı veya genetik manipülasyon yoluyla iyileştirilmesi için potansiyel bir hedef sağlar. Ancak, bu tür gelişme nedenleri daha iyi anlamak ve endoreduplication sonuçlarını şartlı olduğunu.
Endoreduplication en sık sayede çekirdeği, ham doku hazırlıklar11' de yayımlanan propidium iyodür12 (PI) gibi bir DNA'ya bağlanıcı fluorophore ile inkübe Akış Sitometresi ile ölçülür. Filtre uygulanmış örnekleri sonra nerede emisyon dalga boylarında fluorophore için özel dikkat edilmelidir akış sitometresi lazer tarafından iletilir. Her olay (Yani, çekirdeği) floresan yoğunluğu parçacık DNA-içerik ile doğrudan ilişkilidir. Böylece, bilinen bir standarda karşılaştırarak, belirli bir örnek hücrelerinin göreli ve mutlak DNA içeriği hesaplanabilir. Endoreduplication Endeksi (EI) hücresel DNA içeriği (C-değeri) 1 C haploit hücre (protokol 6,7 adımda sunulan formül) DNA içeriğini nerede gözlemleyerek endocycles bir örnek içinde hücre başına ortalama sayısı kurarak belirlenir. Örneğin, diploit bir organizma olarak temel DNA içeriği somatik hücre 2 c. Bir örnek 4 C kaç hücre varsa, karşılık gelen bir endoreduplication turu için veya daha büyük bir EI 0 yakınındaki olurdu; Ancak neredeyse tüm hücreleri 4 C varsa EI yaklaşık 1 olacaktır. Endoreduplication birden fazla mermi daha yüksek bitkiler gözlenen EI değerleri ortak olduğu gibi Ancak, çok daha büyük olabilir. Endoreduplication Endeksi Hesaplama sırasında nispeten basit, çekirdeği göreli zenginliği C-değerleri güvenilir olmasını gerektirir, hangi belirli türler ve doku (patates yumrular dahil) engellemiştir tespit. Bu hücresel anatomi, kimya veya hücre duvarı kompozisyon13 farklılıkları çekirdeklerin yaygın olarak kullanılan doğrudan uygun arabellekleri serbest bırakmak için jilet kullanarak tipik hazırlıkları için inatçı olmak bu örnekler neden muhtemeldir domates meyve örtüsü gibi dokular ile endoreduplication için bir model8çalışmaları.
Patates, söz konusu ham hazırlıklar tutarsız sonuçlar endoreduplication yumru içinde incelenmesi için sadece birkaç çalışmalar, belki de güvenilir bir protokolü kısmen bir eksikliği nedeniyle sınırlı kalır. Bu tür yaklaşımlar de yumru örnekleri ciddi bozulma ve gürültü enkaz, çekirdek değerleri neredeyse imkansız farklı C ile oluşan tepeler farklılaşma yapma şeklinde bir bolluk deneyim yaprakları için çalışırken. Bu belki de hücresel kompozisyon ve yumru hücreleri içinde hücresel enkaz bir bolluk farklılıklar nedeniyle olduğunu (örn. nişasta depolama amyloplasts). Bu engeli aşmak için son zamanlarda Akış Sitometresi patates yumrular, ayırt Peaks'e edinme için daha güvenilir bir iletişim kuralı geliştirilmiştir. Her tepe hücrelerde sıklığı daha sonra farklı genotip veya bir yumru oluşturan farklı dokular için doğru endoreduplication düzeylerini hesaplamak için kullanılabilir. Değiştirilmiş protoplast ayıklama yöntemi14,15 antecedent istihdam Protokolü Akış Sitometresi11patates akrabalar, çeşitlerin ve doku16 içinde önemli farklılıklar gösterdi, daha önce açıklanan . Burada Ploitlik, doku ve yumru boyut bağlamlarda EI değerlendirerek ayrıntılı olarak iletişim kuralı mevcut.

<table><tbody><tr><td>Serological pipette</td><td>Fisher</td><td>13-676-10k</td><td>(sterile)</td></tr><tr><td>Pipet Aid XP (autopipettor)</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Conical tubes (50 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td>(sterile)</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (1.5 mL)</td><td>Globe Scientific</td><td>111558</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (2 mL)</td><td>Globe Scientific</td><td>111552</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum filtration unit (0.22 &amp;micro;m)(aPES)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>564-0020</td><td>(sterile)</td></tr><tr><td>Vacuum filtration unit (0.45 &amp;micro;m)(aPES)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>168-0045</td><td>(sterile)</td></tr><tr><td>Cellulase &quot;Onozuka R-10&quot;</td><td>Yakult</td><td></td><td>contact company</td></tr><tr><td>Macerozyme &quot;Onozuka R-10&quot;</td><td>Yakult</td><td></td><td>contact company</td></tr><tr><td>Hemicellulase</td><td>Sigma</td><td>H2125</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>MES buffer</td><td>Acros Organics</td><td>172590250</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MP Biochemicals</td><td>194854</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (hexahydrate)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M35-500</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride (dihydrate)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Acros Organics</td><td>423922500</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Acros Organics</td><td>17263-0250</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>For flow cytometry preparations</td></tr><tr><td>Ribonuclease A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5000</td><td>For flow cytometry preparations</td></tr><tr><td>Cork borers with punch</td><td>American Scientific</td><td>2093-02</td><td>For sampling desired tissue</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16-31</td><td>For smapling desired tissue</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-920B</td><td>For smapling desired tissue</td></tr><tr><td>106 &amp;micro;m stainless steel mesh or other seive of same pore size</td><td>New Jersey Wire Mesh Co.</td><td></td><td>contact company</td></tr></tbody></table>

measuring endoreduplication by flow cytometry of isolated tuber protoplasts

Endoreduplication, bir hücrenin nükleer genom sonraki sitokinez olmadan çoğaltılması hücreleri artan DNA içeriği ile verimleri ve Hücresel boyutta uzmanlık, geliştirme ve artış ile ilişkilidir. Bitkiler, endoreduplication büyüme ve genişleme belirli doku ve organların kolaylaştırmak için gibi görünüyor. Bunlar arasında karbonhidrat depolama işlevini yerine getirmede önemli hücresel genişleme uğrar (Solanum tuberosum), patates yumru var. Böylece, endoreduplication nasıl yumrular karbon Bu bolluk karşılamak edebiliyoruz önemli bir rol oynayabilir. Ancak, yumrular kaba nükleer yalıtım metotlarından yol hücresel açması yaprakları ile etkin kullanılabilir yöntemleri yumru endoreduplication Index (EI) tahmini engellemektedir. Bu makale farklı genotip elde temsilcisi sonuçları gösteren ve yumru doku bölümlere yumru endoreduplication önceki yalıtım aracılığıyla değerlendirmek için bir teknik sunar. Protokolü'nün önemli sınırlamaları önceki lizis sonra numune hazırlama gibi örnekleri nispeten kısa ömrü için gerekli zaman ve reaktif maliyetlerdir. Protokol teknik varyasyona önemli olmakla birlikte, bu büyük özel hücreler nükleer izolasyon geleneksel yöntemler üzerinde bir gelişme gösterir. Olanakları enzim, Fiksajlar kullanımı ve diğer değişiklikler geri dönüşüm gibi iletişim kuralına iyileştirmeler için önerilmektedir.

Önceki imalatı
Önceki nesil patates yumrular, hangi genel Morfoloji şekil 1' de görüntülenen yinelenebilir Akış Sitometresi sonuçlar elde etmek gereklidir. Araştırmacılar özellikle sorun giderme gereklidir olay bu yüksek kaliteli önceki FCP ek önce üretilen emin olmak isteyebilirsiniz. Önceki çoğunluğu en az çıkıntılar (Şekil 2) küresel olmalı ve belki de yansıtıcı EI farklılıkları boyutu büyük ölçüde farklı olabilir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig2.jpg"> Şekil 2:, edinilen temsilcisi yaprak ve yumru önceki adım 4.4 Protokolü'nün. İzole önceki küresel ve plazma zarı sağlam ile simetrik olmalıdır. Yaprak (A-C) ve yumru (D, E) önceki yanı sıra boyutu endoreduplication farklı düzeylerde gösterebilir bir doku içinde farklılıkları arasındaki büyüklük farkı unutmayın. Amyloplasts yumru önceki içinde görünür ise yaprak önceki kloroplast içerir. Ölçek çubukları 1000 µm. = <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57134/57134fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Akış Sitometresi sonuçlarının değerlendirilmesi
Başarılı veya başarısız bir deney tepeler ve ayırma Akış Sitometresi çubuk genişliği üzerinden gauged. Ölçüm endoreduplication göreli çekirdeklerin her Peak bolluk hesaplama gerektirir gibi sadece varlığı ya da yokluğu doruklarına aralarında anlamlı sınırları çizmek için çok fazla gürültü ise yeterli değil. Şekil 3 araştırmacılar Akış Sitometresi scatter araziler ve çubuk grafikler karşılaşabileceğiniz sonuçları görüntüler. Başarısız örnekleri için olası nedenler tartışma içinde sunulmaktadır.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig3.jpg"> Şekil 3: temsilcisi sonuçları protoplast çekirdekleri sağlam Akış Sitometresi elde edilen ve ilik örnekleri bozulmuş. Sağlam çekirdeği(a)bozulmuş örnekleri (B) Peaks'e değiştirdi, geniş ve çakışan üsleri göstermek, ancak her uygun yazılımı kullanarak hücreler göreli bereket ölçmek için zirveleri arasında temiz ayrılık göster. Sağlam (C) ve (D) örnekleri bozulmuş scatterplots içinde siyah kutular nükleer olay çubuk grafikler ve olayların kümeleme için geçişi çubuk grafik doruklarına genişliğini yansıtılır gösterir. Kapıları dışında olaylar enkaz, ciddi bir şekilde bozulmuş çekirdeği veya diğer toplamları gösterir. PI-H rasgele ölçülür floresan yoğunluğuna karşılık gelir. Örnek yıkımı önlemek için sorun giderme yöntemleri metin içinde ele alınmıştır. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57134/57134fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Dokular arasında Endoreduplication farklar
Daha önce yumru ilik dokusu endoreduplication önemli ölçüde daha fazla düzeyde korteks doku16daha olduğunu bildirdi. Onaylamak ve bu üç farklı dokularda cv. çift endoreduplication düzeyde baktık genişletmek için: ilik, perimedullary parankimi ve korteks, örnek başına 2.000 geçişli olaylarla nüsha olarak çoğaltılır. Sonuçlarımız ilik dokusu hücre başına sırasıyla 1,79 ve 1.12 endocycles aracı ile kortikal doku daha önemli ölçüde daha fazla EI vardır bizim daha önceki gözlem doğruladı (p = 0,018; Öğrenci t-Testi). Biraz şaşırtıcı parankimi doku korteks için benzer bir profil gösterdi ve aynı zamanda ilik dokudan önemli ölçüde farklı (yani 1,14; = p = 0,013; Öğrenci t-Testi). Bu sonuçları şekil 4' te özetlenmiştir.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig4.jpg"> Şekil 4: üç dokularda cv. Superior Endoreduplication. Histogramlar yaprak(a), yumru korteks (B), (C) parankimi ve ilik (D) dokuların o çubuk grafikler hesaplanan EI değeri ile birlikte gösterilir. Her tepe oluşan hücre çekirdeği göreli bereket farklılıkları kolayca özellikle yaprak ve yumru dokular arasında belirgin. C-değerleri her zirve için de görüntülenir. PI-H rasgele ölçülür floresan yoğunluğuna karşılık gelir. EI yumru dokuların karşılaştırmalar burada yıldız işareti gösterir önemli fark E görüntülenir demek (p < 0,05) ve hata çubukları, standart sapma gösterir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57134/57134fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Yumru boyutu ve Ploitlik etkisi
Biz daha önce verilen bir genotip için farklı boyutu ama benzer vade yumrular EI16bir karşılık gelen fark göstermedi, bildirdi. Biz bu sonucu onaylamak gibi Ploitlik ve endoreduplication arasındaki ilişki değerlendirmek amaçladık. Bu deneme için kullandığımız üç farklı genotip dokudan parankimi üç çoğaltır: cv. çift (4 x), VT_SUP_19 (2 x) bir dihaploid olduğu cv. çift prickle tozlaşma17ve VT_SUP_19 tarafından bir iki katına dihaploid olan 4 x elde 18 VT_SUP_19 için isogenic. Biz çoğaltır küçük ve büyük (90-130 g) için bir dizi dahil (< 35 g) yumrular cv. yumrular için diğer iki genotip 90-130 g iken çift için. Yumrular tüm bitkiler tam vade sonunda Yani yetiştirilen sera üzerinden hasat bitkileri üst kısımları senesced vardı. Biz VT_SUP_19 ve onun progenitör çift arasında önemli bir fark gözlendi (p = 0.04); Ancak, VT_SUP_19 ve VT_SUP_19 arasında anlamlı bir fark vardı 4 x (p = 0,69). Bu büyük olasılıkla bir genetik bileşeni olarak maskesiz genomik azaltma tarafından endoreduplication için ise bu Ploitlik, en az bu arka planda dikte edilir değil olduğunu gösterir. Son olarak, biz bir kez daha büyük ve küçük cv. arasında önemli bir fark yoktur üstün yumrular şekil 5' te gösterildiği gibi gözlenen.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig5.jpg"> Şekil 5: Endoreduplication yumrular cv. çift ve diploid (VT_Sup_19) ve tetraploid, iki farklı boyutta (VT_Sup_19 4 x) türevleri. Çubuk grafik için küçük ortalama gösterir (< 35 g) ve büyük (90-130 g) cv. üstün yumrular gibi büyük (90-130 g) yumrular dihaploid VT_SUP_19 ve isogenic iki kat dihaploid VT_SUP_19 4 x. Önemli farklılıklar (p < 0,05) bağlantı mektup rapor tarafından belirtilir. Hata çubukları standart sapma tasvir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57134/57134fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts at JoVE.com

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication izole yumru önceki Akış Sitometresi tarafından ölçme

Burada açıklanan protokol endoreduplication yumrular patates (Solanum tuberosum) içinde ölçmek için bir yöntemdir. Gürültü ve enkaz aşağı akım akış sitometrik analizinde azaltmak için plasmolysis ve işgal ayıklama adımları içerir.

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

measuring-endoreduplication-flow-cytometry-isolated-tuber

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K Görüntüleme.  Virginia Tech. Burada açıklanan protokol endoreduplication yumrular patates (Solanum tuberosum) içinde ölçmek için bir yöntemdir. Gürültü ve enkaz aşağı akım akış sitometrik analizinde azaltmak için plasmolysis ve işgal ayıklama adımları içerir.

Video: Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals are currently not available, methods measuring the impact of potential antiviral agents are required. Here, a dual fluorescence reporter that allows the analysis of the BKPyV non-coding control-region (NCCR) driven early and late promoter activity was constructed to quantify the impact of potential antiviral drugs on viral gene expression via tdTomato and eGFP expression. In addition, by cloning BKPyV-NCCR amplicons which in this protocol have been exemplarily obtained from the blood-derived DNA of immunocompromised renal transplanted patients, the impact of NCCR-rearrangements on viral gene expression can be determined. Following cloning of the patient derived amplicons, HEK293T cells were transfected with the reporter-plasmids, and treated with potential antiviral agents. Subsequently, cells were subjected to FACS-analysis for measuring mean fluorescence intensities 72 h post transfection. To also test the analysis of drugs that have a potential cell cycle inhibiting effect, only transfected and thus fluorescent cells are used. Since this assay is performed in large T Antigen expressing cells, the impact of early and late expression can be analyzed in a mutually independent manner.

In this manuscript, a protocol is presented to perform FACS-based measurement of BK-polyomavirus transcriptional activity by using HEK293T cells transfected with a bidirectional reporter plasmid expressing tdTomato and eGFP. This method further allows to quantitatively determine the influence of novel compounds on viral transcription.

BK-polyomavirus kodlama dışı kontrol bölgesini Akış sitometrisi yoluyla transkripsiyon aktivitesinin ölçümü

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...

Genetik

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing need for the development of methodologies that improve the detection of antigens immobilized on the surface of spores together with their quantification. Flow cytometry-based analyses have been previously proposed as fast, reliable, and specific approaches for detecting labeled cells of B. subtilis. Herein, we propose the use of flow cytometry to evaluate the display efficiency of a fluorescent antibody (FA) on the surface of the spore and quantify the number of spores using counting beads. 
For this, we used ethidium bromide as a DNA marker and an allophycocyanin (APC)-labeled antibody, which was coupled to the spores, as a surface marker. The quantification of spores was performed using counting beads since this technique demonstrates high accuracy in the detection of cells. The labeled spores were analyzed using a flow cytometer, which confirmed the coupling. As a result, it was demonstrated that DNA labeling improved the accuracy of quantification by flow cytometry, for the detection of germinated spores. It was observed that ethidium bromide was not able to label dormant spores; however, this technique provides a more precise determination of the number of spores with fluorescent protein coupled to their surface, thus helping in the development of studies that focus on the use of spores as a biotechnological platform in different applications.

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

This protocol focuses on the use of flow cytometry and counting beads to quantify bacterial spores labeled with ethidium bromide. The method is also efficient for analyzing the covalent coupling of proteins on the surface of intact spores.

Flow Sitometride Bacillus subtilis Spor Sayımı ve Etiket Analizinin İyileştirilmesi

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing ...

Biyokimya

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

Metabolik Etiketleme ve Flow Sitometri ile Hücre Döngüsü İlerleme Kinetik Ölçüm

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Biyoloji

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Hücre Özgül Analizi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floresans Aktif Hücre Ayırma kullanma Leaves

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Budding Maya endositozun kantitatif, kinetik ve Yüksek verim Analizi pHluorin Uygulamaları

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion and the spread of neurodegenerative diseases. The commonly used laboratory strains of the amoeba Dictyostelium discoideum have extremely high fluid uptake rates when grown in nutrient medium, over 90% of which is due to macropinocytosis. In addition, many of the known core components of mammalian macropinocytosis are also present, making it an excellent model system for studying macropinocytosis. Here, the standard technique to measure internalized fluid using fluorescent dextran as a label is adapted to a 96-well plate format, with the samples analyzed by flow cytometry using a high-throughput sampling (HTS) attachment.
Cells are fed non-quenchable fluorescent dextran for a pre-determined length of time, washed by immersion in ice-cold buffer and detached using 5 mM sodium azide, which also stops exocytosis. Cells in each well are then analyzed by flow cytometry. The method can also be adapted to measure membrane uptake and phagocytosis of fluorescent beads or bacteria.
This method was designed to allow measurement of fluid uptake by Dictyostelium in a high-throughput, labor and resource efficient manner. It allows simultaneous comparison of multiple strains (e.g. knockout mutants of a gene) and conditions (e.g. cells in different media or treated with different concentrations of inhibitor) in parallel and simplifies time-courses.

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Macropinocytosis, large-scale non-specific fluid uptake, is important in many areas of clinical biology including immunology, infection, cancer, and neurodegenerative diseases. Here, existing techniques have been adapted to allow high-throughput, single-cell resolution measurement of macropinocytosis in the macropinocytosis model organism Dictyostelium discoideum using flow cytometry.

Dictyostelium discoideum Macropinocytosis akış sitometresi tarafından yüksek üretilen iş ölçümü

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.

Algılama ve ölçme protein Self-montaj In vivo tarafından akış sitometri

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. Epithelial barrier function requires the integrity of intestinal epithelial cells. While epithelial cell proliferation maintains a continuous layer of cells that forms a barrier, epithelial damage leads to barrier dysfunction. As a result, luminal contents can across the intestinal barrier via an unrestricted pathway. Dysfunction of intestinal barrier has been associated with many intestinal diseases, such as inflammatory bowel disease. Isolated mouse intestinal crypts can be cultured and maintained as crypt-villus-like structures, which are termed intestinal organoids or &ldquo;enteroids&rdquo;. Enteroids are ideal to study the proliferation and cell death of intestinal epithelial cells in vitro. In this protocol, we describe a simple method to quantify the number of proliferative and dead cells in cultured enteroids. 5-ethynyl-2&rsquo;-deoxyuridine (EdU) and propidium iodide are used to label proliferating and dead cells in enteroids, and the proportion of proliferating and dead cells are then analyzed by flow cytometry. This is a useful tool to test the effects of drug treatment on intestinal epithelial cell proliferation and cell survival.

The presented protocol uses flow cytometry to quantify the number of proliferating and dead cells in cultured mouse enteroids. This method is helpful to evaluate the effects of drug treatment on organoid proliferation and survival.

Enteroidlerde Proliferatif ve Ölü Hücrelerin Sayısallaştırılması

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic bacteria of special relevance for a wide number of hosts. P. syringae enters the plant from the leaf surface and multiplies rapidly within the apoplast, forming microcolonies that occupy the intercellular space. The constitutive expression of fluorescent proteins by the bacteria allows for visualization of the microcolonies and monitoring of the development of the infection at the microscopic level. Recent advances in single-cell analysis have revealed the large complexity reached by clonal isogenic bacterial populations. This complexity, referred to as phenotypic heterogeneity, is the consequence of cell-to-cell differences in gene expression (not linked to genetic differences) among the bacterial community. To analyze the expression of individual loci at the single-cell level, transcriptional fusions to fluorescent proteins have been widely used. Under stress conditions, such as those occurring during colonization of the plant apoplast, P. syringae differentiates into distinct subpopulations based on the heterogeneous expression of key virulence genes (i.e., the Hrp type III secretion system). However, single-cell analysis of any given P. syringae population recovered from plant tissue is challenging due to the cellular debris released during the mechanical disruption intrinsic to the inoculation and bacterial extraction processes. The present report details a method developed to monitor the expression of P. syringae genes of interest at the single-cell level during the colonization of Arabidopsis and bean plants. The preparation of the plants and the bacterial suspensions used for inoculation using a vacuum chamber are described. The recovery of endophytic bacteria from infected leaves by apoplastic fluid extraction is also explained here. Both the bacterial inoculation and bacterial extraction methods are empirically optimized to minimize plant and bacterial cell damage, resulting in bacterial preparations optimal for microscopy and flow cytometry analysis.

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

The present protocol describes a method that allows single-cell gene expression analysis on Pseudomonas syringae populations grown within the plant apoplast.

Bitki Dokusu İçindeki Pseudomonas syringae Genlerinin Ekspresyonunun Tek Hücreli Analizi

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

Flow Cytometry Assay to Quantify Oxidative Stress: An Assay to Quantify Reactive Oxygen Species in Intestinal Organoids Using Fluorogenic Probes

Source: Stedman, A., et al., <a href="https://app.jove.com/v/62880">Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates a flow cytometry assay to quantify the ROS levels in 3D intestinal organoids obtained from GFP-expressing transgenic mice. This method provides an in vitro experimental model to investigate the efficacy of test compounds on ROS production.

Oksidatif Stresi Ölçmek için Akış Sitometrisi Deneyi: Florojenik Problar Kullanarak Bağırsak Organoidlerindeki Reaktif Oksijen Türlerini Ölçmek İçin Bir Test

Source: Stedman, A., et al., Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe.&#160;J. ...