Bu araştırma Ulusal Bilim Vakfı Ödülü numarası "Heterozygosity, Allelic kompozisyon ve kopya numarası varyasyon patates çözülüyor" 1237969 tarafından finanse edildi ve USDA özel Grant 2014-34141-22266 (Maine Üniversitesi) için RV

Not: Deneysel örnekleri olarak aynı Ploitlik dokusunun yaprak şeklinde uygun denetimleri, genellikle eklemek önemlidir. Bunun nedeni yumru örnekleri 2 C zirvesine küçük ve tanımlamak zor olabilir.
1. hazırlıkları
Not: burada listelenen çözümleri vaktinden önce hazırlanacak ve 4 ° C'de depolanan ancak bu sonraki adımlar sunulan kullanım gününde taze yapılması gerekir.
<ol><li>Uygun bir birim Plasmolysis kuluçka çözüm (PIS) yapmak (15 mL/örnek): 0.55 M mannitol, 2 mM CaCl2, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris tampon pH 7.5 (HCl ile ayarlanabilir).</li>
	<li>Uygun bir birim Plasmolysis yıkama çözüm (PWS) yapmak (15 mL/örnek) olduğu için PIS aynı 0,71 M mannitol ilavesi hariç.</li>
	<li>Değiştirilmiş Galbraith'ın Akış Sitometresi arabellek11 (FCB) 250 mL olun: 13,6 mM sodyum sitrat (TRISODYUM), 8 mM BEZLERİ, 18 mM MgCl2, % 0,4 v/v Triton X-100. Triton X-100 dağıtmak en az 30 dakika karıştırın.</li>
	<li>Filtre sterilize PIS ve Hava Meydanı çözümleri olan bir 0,22 µm asimetrik polyethersulfone (maymun) filtre. Vakum tahrik filtreleme birimleri kullanın.</li>
	<li>
106 µm kafes filtreler lysed önceki için hazırlayın. Süspansiyonlar 106 µm filtreden geçen herhangi bir yöntem kullanılabilir ancak 1,5 mL doğrudan koleksiyonu tüpler içine iç içe olabilir microcentrifuge tüpleri hazırlayın. Not: Bunlar steril olması gerekmez.<ol>
<li>1.5 mL microcentrifuge tüpler kullanıyorsanız, 1 cm uzakta belgili tanımlık uç her microcentrifuge tüp kesti. Sıcak bir tabak veya diğer ısı kaynak ısı kullanarak 1 cm2 adet 106 µm çelik kafes alüminyum folyo bir parçası üzerinde. Onlar erimiş kadar tüp kesme sonu kafes basın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Patates tatmak için tüm toprak ve enkaz kaldırma yıkayın. Not: Yumru boyutu ve yaş deneme gol için uygun olmalıdır ancak sonuçlar kalitesini etkileyecek gibi görünüyor değil. Soğuk hava deposu (4 ° C, % 95 RH) için 8 ay olmuştur yumrular başarıyla bu protokole uyguladınız. Yumrular kusurları (örneğin yumru son rot, içi boş kalp, kahverengi nekrotik alanlar) ile duyarlı olsa da, onlar, mümkünse kaçınılması gerekir.</li>
</ol>2. gün 1: Yumru doku Plasmolyze
Not: Kontrol yaprak örnekleri burada önceki üretmek veya ham ürünleri tercih edilen iseniz, 5.2 atlamayı dahil edilebilir. Laminar akış hood gibi aseptik bir ortamda steril araçlarla gerçekleştirilmelidir.
<ol><li>Yüzey patates yumrular % 75 etanol en az 5 min için daldırma ile sterilize.</li>
	<li>Kaldır yumrular etanol ve hava kuru. Yumru 100 gr büyükse, bu genellikle ~ 5 dk, daha uzun sürer.</li>
	<li>Hazırlamak ve her içine PIS etiketi steril 50 mL konik tüpler için her örnek ve filtre aliquot 15 mL steril.</li>
	<li>
Yaklaşık 1 cm3 sterilize yumrular steril neşter ya da mantar matkap kullanarak istenen dokudan örnek. Not: örnek doku bağlı olarak bir steril cork matkap veya bıçak/neşter kullanabiliriz. Örneğin, ilik isterseniz mantar matkap çekirdeğinden apikal yumru distal ucuna çekmek için kullanılan ve çekirdek orta kısmını örnek. Ancak, patates yumrular asimetrik iç morfolojisi nedeniyle örnek parankimi için daha kesin olabilir veya yumru yarıya indirmek ve istenilen doku bilincin korteks. İç yumru Morfoloji bir tasviri için bkz: şekil 1 .<ol>
<li>Kaba doku içine yaklaşık 3 mm3 adet ve transferi doku konik tüp PIS içeren steril neşter kullanarak doğrayın. Gecede 4 ° C'de kuluçkaya Not: Bu yüzey alanı en üst düzeye çıkarmak için olduğunu böylece PIS, ve daha sonra enzim çözüm tam olarak nüfuz daha kapsamlı sindirim sonucu doku.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig1.jpg"> Şekil 1: patates yumru iç morfolojisi. İlik (P) ile perimedullary parankimi (PM) arasındaki mesafeyi siyah çizgiler ile gösterilmektedir. Parankimi korteks (C) ayıran vasküler ring siyah bir ok ile gösterilir. Stolon sonu (S) ve yumru gözler (E) de etiketlenir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57134/57134fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
3. gün 2: Patates önceki üretmek
Not: Bu laminar akış hood gibi aseptik bir ortamda steril araçlarla gerçekleştirilmelidir.
<ol><li>Hazırlamak ve (0,45 µm maymunlar) uygun bir miktar enzim çözüm (ES) filtre (10 mL/örnek): 0,71 M mannitol, 3 mM CaCl2, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, % 4 Onozuka R-10 cellulase, %0,8 macerozyme R-10, % 1'hemicululase, 10 mM MES arabellek, pH 5.8. Uygun filtreler bu adımda kullanıldığından emin olun; filtreler ile 0,45 µm yatkındır gibi maymunlar, düşük protein bağlayıcı membran filtrasyon sırasında Enzim kaybı en aza indirir, ancak tıkanma için daha küçük boyuta gözenek.</li>
	<li>PIS konik tüpler steril serolojik pipet kullanarak örneklerinden Aspire edin.</li>
	<li>Her örnek ve ters çevirmek için ES 10 mL ekleyin 2-3 kez.</li>
	<li>Örnekleri gecede 29 ° C'de 180 rpm yatay sallayarak ile kuluçkaya. Örnekler en az 16 h için kuluçkaya.</li>
</ol>4. gün 3: Hasat önceki ve yıkama önceki
Not: Aseptik koşullar bu noktada Hayır uzun zaman gerek yoktur.
<ol><li>Örnekleri shaker kaldırmak ve onları ~ 10 dk için yerleşmek izin.</li>
	<li>
Kapalı büyük bir kısmını ES çözüm mümkün olduğunca Aspire edin.
	<ol>
<li>ES çözüm olarak sindirilir dokusunu önlemek için dikkat çekici bir serolojik pipet ile mümkün olduğunca kaldırın.</li>
		<li>Micropipette Kaldır kullanarak kalan herhangi bir ES çözüm tekrar sindirilir doku kaçınarak. Bu en kolay sindirilir doku en altında kalırken ES çözüm kapak doğru akması tüp bir açıyla tutarak yapılır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her örnek için Hava Meydanı 15 mL ekleyin ve yavaşça tersine çevirin 2-3 kez. Önceki 10 dakikadır yerleşmek izin verir.</li>
	<li>PWS serolojik pipet ile kaldırın. Bir micropipette kalan herhangi bir sıvı kaldırmak için kullanın. Not: Bu sırasında Akış Sitometresi örneği çekirdeği bütünlüğünü sağlamak için kesinlikle çok önemli bir adımdır. Sorun gidermede, bu adımı bir örnek başarısızlık büyük olasılıkla kaynak bulundu.</li>
</ol>5. gün 3: Örnek Akış Sitometresi için hazırlamak.
Not: Örnekleri buradan buzda aksi belirtilmedikçe tutulmalıdır.
<ol><li>Propidium iyodür (0.4 mg propidium iyodür/mL FCB) ve RNase çözümleri hazırlamak (0,8 mg RNase A / mL FCB) her FCB içinde eriterek tarafından. Dikkat: Propidium iyodür çok zehirli. Cilt veya gözlerle temas kaçının. Uygun KKE giymek.</li>
	<li>
Buz 1,5 mL ekleyin her örnek için soğuk FCB. Kısaca sallamak ya da girdap ayırmak için her örnek toplanan doku. Yumru doku kümeleri kadar break FCB tam hücreleri nüfuz ve çekirdekleri serbest bırakmak önemlidir. Farklı örnekler az ya da doku ve genotip bağlı olarak ajitasyon gerektirebilir. Not: FCB çekirdeklerin bırakmadan önceki lyses. Bu nedenle tutmak gerekliliğini yıkımı önlemek için buza örnekler.<ol>
<li>Denetim akış sitometresi örnekleri protoplast üretimi adımda dahil değildi Eğer onlar burada dahil edilebilir. Eğer bir kontrol eklemek için küçük yaprak (~ 3 cm2) 1,5 mL buz ince doğrayın soğuk FCB jilet kullanarak. Kontrol örnekleri deneysel örnekleri, tercihen aynı genotip olarak aynı Ploitlik olmalı. Vitro Bitkicik sera veya alan yetiştirilen bitkiler daha temiz doruklarına vermek eğilimindedir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
FCB/doku süspansiyon 1 mL 106 µm gözenekli filtre geçmek. 1.5.1. adımda açıklandığı gibi altına metal kafes erimiş ve kesilmiş ipucu ile 1.5 mL microcentrifuge tüp kullanın. Bu microcentrifuge tüp bir 2 mL microcentrifuge tüp iç içe olabilir ve örnek doğrudan üzerinden geçti. Filtrasyon başka bir yöntem kullanıyorsanız, filtrate buz gibi bir Petri tabak içinde toplanan ve daha sonra 2 mL tüp için transfer. Not: bazen kalan agrega ve hücresel enkaz gözenekli filtre yapışmasına neden. Bu durumda, sadece iki iç içe geçmiş microcentrifuge tüp birkaç kez dokunun enkazı çıkarmak için.</li>
	<li>250 µL RNase çözümde her örnek için ekleyin. Ters çevir ve oda sıcaklığında (RT) 30 dk için kuluçkaya. Not: Bu adım daha az gürültü için Akış Sitometresi sırasında önde gelen örneklerinden, RNA kaldırmak için tasarlanmıştır. Çekirdeklerin kısa ömürlü olduğu için ancak, araştırmacılar kuluçka zamanı azaltmak veya saldırganın saklanıp örnekleri ciddi sorunlar yaşamaya devam ediyorsanız buz üzerinde gerçekleştirmek karar verebilir.</li>
	<li>Propidium iyodür çözüm 125 µL her örnek için ekleyin. Ters çevir ve 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya. Not: Örnek Akış Sitometresi bozulması bile buz üzerinde 2 saat içinde belirgin olduğu gibi en kısa zamanda kullanılmalıdır.</li>
</ol>6. gün 3: Akış Sitometresi patates yumru nükleuslar
Not: Akış Sitometresi işlemi ve yazılım enstrüman ve üreticisine bağlı olarak değişiklik gösterir. Cihazın kullanım kılavuzunda Akış Sitometresi belirli işleyişi hakkında ayrıntılı talimatlar sağlanacaktır.
<ol><li>Vs yan dağılım ve propidium iyodür (PI) vs yan dağılım ileri dağılım Logaritmik ölçek kullanarak iki nokta araziler oluşturun. Ayrıca bir çubuk grafik ile PI x ekseni üzerinde oluşturun. Logaritmik ölçek çekirdeği büyük ölçüde Floresans içinde farklı olabilir olarak tüm olayları içinde ölçekli olduğundan emin olmak için gereklidir.</li>
	<li>
Bir bilinen denetim örnek tüp yük ve böylece tüm olayları ölçekte gerilim ayarlayın. Biz bir örnek genotip dokudan tüp bebek yaprak kullanın. Eğer farklı ploidies örnekleri çalıştırılması için her bir denetimi örneğini dahil edilmelidir.
	<ol>
<li>Not 2 C en yüksek kanal denetimi örneğini alın. Deneysel örnekleri 2C doruklarına aynı konuma düşmek gerekir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir deneysel (yumru) örnek yük ve tekrar tüm olayları ölçek üzerinde olduğundan emin olun. Ayarlamalar eğer gerekli, yineleme adım 2 C kanal tanımlamak için 6,2 doruklarına.</li>
	<li>El ile yan dağılım vs PI çizim kullanarak protoplast çekirdeği kapı.</li>
	<li>Sadece kapı protoplast çekirdeği bölgesinde göstermek için PI çubuk grafik ayarlayın.</li>
	<li>Olaylar için istediğiniz sayıyı örnekleri toplamak. Sık sık araştırmacılar 10,000 geçişli olayları Akış Sitometresi için kullanın; Ancak 2000 etkinlikler yumru protoplast örnekleri için daha fazla örnekleri ve düşük konsantrasyonlarda örnekleriyle uyum sağlamak için kullanın.</li>
	<li>Aşağıdaki formül kullanılarak PI çubuk grafikler üzerinden her örnek EI Hesapla: EI =<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57134/57134eq1.jpg"> 4 C 4 C (endoreduplication bir turu temsil eden) olan çekirdek yüzdesi nerede, 8C 8 C, ve benzeri yüzdesidir. Bkz: çubuk grafikler örnekleri için şekil 4 ve C-değerleri doruklarına.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wilson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The karyoplasmic ratio. 727, (1925).</li><li>Szymanski, D. B., Marks, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLABROUS1+overexpression+and+TRIPTYCHON+alter+the+cell+cycle+and+trichome+cell+fate+in+Arabidopsis.">GLABROUS1 overexpression and TRIPTYCHON alter the cell cycle and trichome cell fate in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 10 (12), 2047-2062 (1998).</li><li>Melaragno, J. E., Mehrotra, B., Coleman, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+endopolyploidy+and+cell+size+in+epidermal+tissue+of+Arabidopsis.">Relationship between endopolyploidy and cell size in epidermal tissue of Arabidopsis.</a> Plant Cell. 5 (11), 1661-1668 (1993).</li><li>Grafi, G., Larkins, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoreduplication+in+maize+endosperm:+involvement+of+M+phase--promoting+factor+inhibition+and+induction+of+S+phase--related+kinases.">Endoreduplication in maize endosperm: involvement of M phase--promoting factor inhibition and induction of S phase--related kinases.</a> Science. 269 (5228), 1262-1264 (1995).</li><li>Schweizer, L., Yerk-Davis, G., Phillips, R., Srienc, F., Jones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+maize+endosperm+development+and+DNA+endoreduplication.">Dynamics of maize endosperm development and DNA endoreduplication.</a> Proc Natl Acad Sci. 92 (15), 7070-7074 (1995).</li><li>Chen, C. T., Setter, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+potato+tuber+cell+division+and+growth+to+shade+and+elevated+CO2.">Response of potato tuber cell division and growth to shade and elevated CO2.</a> Ann Bot. 91 (3), 373-381 (2003).</li><li>Chen, C. T., Setter, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+potato+dry+matter+assimilation+and+partitioning+to+elevated+CO2+at+various+stages+of+tuber+initiation+and+growth.">Response of potato dry matter assimilation and partitioning to elevated CO2 at various stages of tuber initiation and growth.</a> Environ Exp Bot. 80, 27-34 (2012).</li><li>Cheniclet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+expansion+and+endoreduplication+show+a+large+genetic+variability+in+pericarp+and+contribute+strongly+to+tomato+fruit+growth.">Cell expansion and endoreduplication show a large genetic variability in pericarp and contribute strongly to tomato fruit growth.</a> Plant Physiol. 139 (4), 1984-1994 (2005).</li><li>Pirrello, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+fruit+developmental+biology+makes+use+of+flow+cytometry+approaches.">How fruit developmental biology makes use of flow cytometry approaches.</a> Cytometry Part A. 85 (2), 115-125 (2014).</li><li>Chevalier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoreduplication+and+fruit+growth+in+tomato:+evidence+in+favour+of+the+karyoplasmic+ratio+theory.">Endoreduplication and fruit growth in tomato: evidence in favour of the karyoplasmic ratio theory.</a> J Exp Bot. 65 (10), 2731-2746 (2014).</li><li>Galbraith, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+flow+cytometric+analysis+of+the+cell+cycle+in+intact+plant+tissues.">Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissues.</a> Science. 220 (4601), 1049-1051 (1983).</li><li>Dole&#382;el, J., Greilhuber, J., Suda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+with+Plants:+An+Overview.">Flow Cytometry with Plants: An Overview.</a> Flow Cytometry with Plant Cells. , 41-65 (2007).</li><li>Dole&#382;el, J., Barto&#353;, J. A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+DNA+flow+cytometry+and+estimation+of+nuclear+genome+size.">Plant DNA flow cytometry and estimation of nuclear genome size.</a> Ann Bot. 95 (1), 99-110 (2005).</li><li>Doke, N., Tomiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hyphal+wall+components+from+Phytophthora+infestans+on+protoplasts+of+potato+tuber+tissues.">Effect of hyphal wall components from Phytophthora infestans on protoplasts of potato tuber tissues.</a> Phys Plant Path. 16 (2), 169-176 (1980).</li><li>Davis, D. A., Currier, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+the+phytoalexin+elicitors,+arachidonic+and+eicosapentaenoic+acids,+and+other+unsaturated+fatty+acids+on+potato+tuber+protoplasts.">The effect of the phytoalexin elicitors, arachidonic and eicosapentaenoic acids, and other unsaturated fatty acids on potato tuber protoplasts.</a> Physiol Mol Plant Pathol. 28 (3), 431-441 (1986).</li><li>Laimbeer, F. P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplast+isolation+prior+to+flow+cytometry+reveals+clear+patterns+of+endoreduplication+in+potato+tubers,+related+species,+and+some+starchy+root+crops.">Protoplast isolation prior to flow cytometry reveals clear patterns of endoreduplication in potato tubers, related species, and some starchy root crops.</a> Plant Methods. 13 (1), 27 (2017).</li><li>Uijtewaal, B. A., Huigen, D. J., Hermsen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+potato+monohaploids+(2n=x=12)+through+prickle+pollination.">Production of potato monohaploids (2n=x=12) through prickle pollination.</a> Theor Appl Genet. 73 (5), 751-758 (1987).</li><li>Karp, A., Risiott, R., Jones, M. G. K., Bright, S. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+doubling+in+monohaploid+and+dihaploid+potatoes+by+regeneration+from+cultured+leaf+explants.">Chromosome doubling in monohaploid and dihaploid potatoes by regeneration from cultured leaf explants.</a> Plant Cell Tiss Org Cult. 3 (4), 363-373 (1984).</li><li>Doke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+superoxide+anion+by+potato+tuber+protoplasts+during+the+hypersensitive+response+to+hyphal+wall+components+of+Phytophthora+infestans+and+specific+inhibition+of+the+reaction+by+suppressors+of+hypersensitivity.">Generation of superoxide anion by potato tuber protoplasts during the hypersensitive response to hyphal wall components of Phytophthora infestans and specific inhibition of the reaction by suppressors of hypersensitivity.</a> Phys Plant Path. 23 (3), 359-367 (1983).</li><li>Doke, N., Tomiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+the+hypersensitive+response+of+potato+tuber+protoplasts+to+hyphal+wall+components+by+water+soluble+glucans+isolated+from+Phytophthora+infestans.">Suppression of the hypersensitive response of potato tuber protoplasts to hyphal wall components by water soluble glucans isolated from Phytophthora infestans.</a> Phys Plant Path. 16 (2), 177-186 (1980).</li><li>Saxena, P. K., King, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reuse+of+enzymes+for+isolation+of+protoplasts.">Reuse of enzymes for isolation of protoplasts.</a> Plant Cell Rep. 4 (6), 319-320 (1985).</li><li>Sgorbati, S., Levi, M., Sparvoli, E., Trezzi, F., Lucchini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+and+flow+cytometry+of+4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole+(DAPI)-stained+suspensions+of+nuclei+released+from+fresh+and+fixed+tissues+of+plants.">Cytometry and flow cytometry of 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-stained suspensions of nuclei released from fresh and fixed tissues of plants.</a> Physiol Plant. 68 (3), 471-476 (1986).</li><li>Bhojwani, S. S., Dantu, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+and+cell+culture.">Tissue and cell culture.</a> Plant Tissue Culture: An Introductory Text. , 39-50 (2013).</li><li>Flores, H. E., Kaur-Sawhney, R., Galston, A. W., Maramorosch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protoplasts+as+Vehicles+for+Plant+Propagation+and+Improvement.">Protoplasts as Vehicles for Plant Propagation and Improvement.</a> Advances in Cell Culture. 1, 241-279 (1981).</li><li>Reeve, R. M., Timm, H., Weaver, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parenchyma+cell+growth+in+potato+tubers+I.+Different+tuber+regions.">Parenchyma cell growth in potato tubers I. Different tuber regions.</a> Am Potato J. 50 (2), 49-57 (1973).</li><li>Scholes, D. R., Paige, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+ploidy:+a+generalized+response+to+stress.">Plasticity in ploidy: a generalized response to stress.</a> Trends Plant Sci. 20 (3), 165-175 (2015).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Burada sunulan iletişim kuralı diğer Akış Sitometresi hazırlıklar engel araştırmacılar ile endoreduplication patates yumrular, değiştirilmiş olan hücresel içerik ve artan hücre boyutu görünüşte içinde değerlendirmek için bir yol sağlar. Protokol protoplast nesil nükleer bütünlüğü korunarak gürültü ve enkaz azaltmak için bir araç olarak üzerine dayanır. Daha önce araştırmacılar özellikle inatçı Akış Sitometresi örnekleri benzer hazırlıkları açıklanan yanı sıra çeşitli konularda Patogenez19,20gibi çalışmaya yumru önceki kullanılmaktadır. Ancak, bizim bilgi için hiçbiri böyle yumru önceki kullanımı endoreduplication eğitim amacıyla Akış Sitometresi ile birleştirdik. Ayrıca, tipik ham hazırlıkları yanı sıra teknik iki sadece diğer çalışmalar yumru endoreduplication6,7değerlendirmek için kullanılan daha güvenilir olmak önceki kullanımı bulduk. Burada iletişim kuralı, yürütme ve örnek hazırlama, ve bu istihdam tipik bir denemenin sonuçları potansiyel tuzaklar eksikliklerin tartışmak.
Yardımcı programı ve tekrarlanabilirlik yumru Akış Sitometresi protokolünün rağmen ele birkaç zayıflıkları vardır. Başlamak için saat iki gecede incubations gerektiren yoğun iletişim kuralıdır. Ayrıca, protokol bazı pahalı reaktifler, özellikle cellulase ve macerozyme gerektirir. Ayrıca, hazırlıklar özellikle birçok olay istenirse hangi üretilen iş tek bir gün içinde sınırlayabilir bir kaç saat içinde son derece zamana duyarlı, aşağılayıcı. Son olarak, protokol, güvenilir olsa da, tüm bunların çekirdek ve daha düşük kalitede sonuçlar zarar görmesine neden gibi görünüyor içinde numune hazırlama hataları duyarlıdır. Örneğin, mikrobiyal kirlenme sırasında plasmolysis ve işgal üretimi adımları (1-3,4) yanlış aseptik teknik nedeniyle oluşabilir. Örnek her zaman başarı örneği, iyileştirmelerden iken kirlilik, elde edilen çubuk grafikler, çekirdekler için hasar tekrar olasılığı nedeniyle kalitesini önemli ölçüde azaltmak için gibi görünüyor.
Daha önce belirtildiği gibi iletişim kuralının büyük dezavantaj maliyeti, zaman ve hassasiyet hataları vardır. Araştırmacılar bunların her biri azaltmak için ilgili adımları uygulamak isteyebilirsiniz. Maliyet, gelince pek çok örnekleri için iletişim kuralı uygulamak isteyen araştırmacılar enzim konsantrasyonları ve/veya süre sindirim adımın farklı dokular değiştirme düşünebilirsiniz ve genotip yanıt değişiklik gösterebilir. Bu filtre uygulama imkanı içerir ve daha önce gösterdi ama ES geri dönüşüm burada21istihdam. Zamanında bizim gözlem gelince ilk kuluçka (plasmolysis adım) ile dağıtmak ve hala önceki ayıklamak mümkündür; Ancak, onların bütünlüğü ve bereket, hangi olumsuz sonuçları etkiler yaşayacaktır. Örnekleri bozulma azaltmak için araştırmacılar bazı Akış Sitometresi yaklaşımlar örnek bütünlük22korumak için (Örneğin, formaldehit) Fiksajlar kullanımı dahil düşünebilirsiniz. Bu hem bozulmasını önlemek ve sunulan aynı gün meydana gelen örnek protoplast yerine depolama ödemezse ve Akış Sitometresi için izin vermek için yararlı bir araç olabilir. Çekirdeklerin yıpratma engelleyen başka bir aracı ES ve/veya FBC nükleaz inhibitörü eklemek olabilir; 2-mercaptoethanol hiçbir göze çarpan değişiklikler geliştirme sırasında etkilenen iken, diğer inhibitörleri burada sınanmamıştır.
Bizim gözlem tek en kritik adım adım 4.4, kaldırma önce Akış Sitometresi arabellek (FCB) yanı sıra tüm plasmolysis yıkama çözüm olduğunu. Eğer bile küçük bir birim (< 10 µL) kalıntıları, örnekleri çok daha bunun için yoksul ya da bile başarısız örnek açabilir bozulmuş muhtemeldir. Bu enzim çözüm içindeki yabancı maddeleri nedeniyle muhtemeldir (örneğin enzimler, proteaz)23,24 hızlı bir şekilde saat arasında düşük konsantrasyonlarda bile örnek çalıştırır ve kuluçka dönemleri sırasında çekirdeklerin bozulmasına yol açar. Diğer bir önemli faktör PI ve RNase kuluçka adımları süresi kadardır. İletişim kuralında belirtildiği gibi örnekleri düşük çekirdek kaynaklanan araştırmacılar daha fazla numune veya uzun Akış Sitometresi yerleştirmek için aşağıdaki adımları süresini azaltmak karar verebilirsiniz böylece FCB ilavesi çalıştıktan sonra bir kaç saat için kararlı kalmaz konsantrasyonları. Bu da olayların örnek başına toplam sayısını ve çalıştırılması veya daha önce bahsedilen gibi Fiksajlar kullanmayı düşünün için örnekleri arasında tradeoff düşünmeye araştırmacı gerektirir.
Doku ve genotip arasındaki farklar
Sonuçları temsilcisi Protokolü'nün sağlamak üzere iki basit deneyler doku tarafından daha önce raporlanmış değişim onaylamak ve Ploitlik ve genotip etkisini incelemek için tasarlanmıştır. İlik dokusu bir kez daha yüksek EI var bulundu gibi protokol tekrarlanabilir sonuçlar verir doku denemenin sonuçları göstermektedir. Biraz şaşırtıcı daha önce değerlendirildi değil, parankimi doku bir EI değeri önemli ölçüde ilik daha düşük ve benzer kortikal doku vardı. Parankimi hücreleri en az vade sonunda öz ya da beyin hücreleri, genellikle büyüktür bu beklenmedik oldu. Yumrular (90-130 g) tam olarak genişletilmiş ve onların en fazla C-değerleri25ulaştı vade sonunda yumru birim çoğunluğu oluşturan parankimi hücreler için olgun bir mantıklı açıklaması bu. Bu da neden açıklayabilir dihaploid (VT_SUP_19) ve iki katına dihaploid (VT_SUP_19 4 x) cv. üstün yumrular; daha önemli ölçüde daha fazla EI gösterdi yaklaşık olarak eşit büyüklükte yumrular her genotip örneklenmiş, yumrular VT_SUP_19 veya isogenic tetraploid en büyük boyutunu yaratıcı daha küçük iken. Böylece, o-ebilmek var olmak onlar sade bir şekilde büyük EI görüntülenen en fazla ulaşılabilir boyutlarına göre daha büyük oldukları için. Alternatif olarak, fark VT_SUP_19 tetraploid onun progenitör alınan genetik tamamlayıcı bir sonucu olabilir. Dihaploid ayıklama üzerinde tetraploid oluştu genomik azaltılması da yükseltilmiş EI-26katkıda bulunmak için gösterilen bitki çapında stres sonuçlanan zararlı gen maskesi başka bir ihtimal. Yine de, bu dikkatli bir değerlendirme araştırmacılar yumrular ve dokuların seçerken özellikle arasında genotip EI değerleri karşılaştırma için kullanılmak üzere istihdam gerekir göstermektedir.
Gelecek uygulamaları
Bu makalede açıklanan protokol patates anlayış endoreduplication için araştırmacılar ile önemli bir araç sağlar. Bu gelişme karşısında yumru dokulara zaman seyri ve doğal varyasyon değerlendirilmesi endoreduplication, genetik ve çevresel bileşenlerine çalışmaları için izin verebilir. Sonuçta, endoreduplication patates iyileştirme, güvenilir bir aracı değerlendirme gerektiren bir girişim için umut verici bir hedef yapmak.

Endoreduplication bir hücre tipik hücre döngüsü forgoes ve bunun yerine bir alternatif tabii ki DNA ikileşmesi hücresel bölünme olmadan tekrarlanan tur oluşan geliştirme uğrar işlemidir. Elde edilen hücre DNA artmış olacak içerik ve nükleer boyutu hücresel düzenlemesi, genişleme ve uzmanlık bir rol oynadığı düşünülmektedir. Genel olarak, (bir endocycle olarak adlandırdığı) endoreduplication ve DNA içeriği karşılık gelen artış bir tur daha büyük hücre birimle ilişkili, "DNA içeriği artan karyoplasmic teorisi" çöktürülmüş bir gözlem için düzgün gereklidir düzenleyen bir daha büyük, belki de daha fazla karmaşık, hücre1. Bu fenomen dokuların yapısal/savunma (trichomes)2,3, olanlar dahil olmak üzere bir aralıktaki gözlenen yüksek bitkilerde yaygındır Besleyici (Mısır endosperm)4,5ve lavabo/depolama () domates meyve örtüsü; patates yumru)6,7,8 işlevleri. Meyve, o endoreduplication olarak endoreduplication ve meyve gelişimsel dönem9arasında negatif ilişki kanıtladığı meyve örtüsü hızlı büyümenin kolaylaştırıcı bir rol oynar sürülmüştür. Örneğin DNA ile 512 C (512 kez haploit genom) domates meyve örtüsü8' gözlenen içerik içeren hücreler. Ayrıca Chevalier ve ark. (2014) değişiklikler hücre döngüsü genlerin ifadesinde daha büyük meyve10sonra hangi sonuçlara endoreduplication düzeyleri meyve örtüsü içinde artışlara açabilir gösterdi. Bu nedenle, değişiklik endoreduplication teşvik genlerin biyokütle veya verim bitki ıslahı veya genetik manipülasyon yoluyla iyileştirilmesi için potansiyel bir hedef sağlar. Ancak, bu tür gelişme nedenleri daha iyi anlamak ve endoreduplication sonuçlarını şartlı olduğunu.
Endoreduplication en sık sayede çekirdeği, ham doku hazırlıklar11' de yayımlanan propidium iyodür12 (PI) gibi bir DNA'ya bağlanıcı fluorophore ile inkübe Akış Sitometresi ile ölçülür. Filtre uygulanmış örnekleri sonra nerede emisyon dalga boylarında fluorophore için özel dikkat edilmelidir akış sitometresi lazer tarafından iletilir. Her olay (Yani, çekirdeği) floresan yoğunluğu parçacık DNA-içerik ile doğrudan ilişkilidir. Böylece, bilinen bir standarda karşılaştırarak, belirli bir örnek hücrelerinin göreli ve mutlak DNA içeriği hesaplanabilir. Endoreduplication Endeksi (EI) hücresel DNA içeriği (C-değeri) 1 C haploit hücre (protokol 6,7 adımda sunulan formül) DNA içeriğini nerede gözlemleyerek endocycles bir örnek içinde hücre başına ortalama sayısı kurarak belirlenir. Örneğin, diploit bir organizma olarak temel DNA içeriği somatik hücre 2 c. Bir örnek 4 C kaç hücre varsa, karşılık gelen bir endoreduplication turu için veya daha büyük bir EI 0 yakınındaki olurdu; Ancak neredeyse tüm hücreleri 4 C varsa EI yaklaşık 1 olacaktır. Endoreduplication birden fazla mermi daha yüksek bitkiler gözlenen EI değerleri ortak olduğu gibi Ancak, çok daha büyük olabilir. Endoreduplication Endeksi Hesaplama sırasında nispeten basit, çekirdeği göreli zenginliği C-değerleri güvenilir olmasını gerektirir, hangi belirli türler ve doku (patates yumrular dahil) engellemiştir tespit. Bu hücresel anatomi, kimya veya hücre duvarı kompozisyon13 farklılıkları çekirdeklerin yaygın olarak kullanılan doğrudan uygun arabellekleri serbest bırakmak için jilet kullanarak tipik hazırlıkları için inatçı olmak bu örnekler neden muhtemeldir domates meyve örtüsü gibi dokular ile endoreduplication için bir model8çalışmaları.
Patates, söz konusu ham hazırlıklar tutarsız sonuçlar endoreduplication yumru içinde incelenmesi için sadece birkaç çalışmalar, belki de güvenilir bir protokolü kısmen bir eksikliği nedeniyle sınırlı kalır. Bu tür yaklaşımlar de yumru örnekleri ciddi bozulma ve gürültü enkaz, çekirdek değerleri neredeyse imkansız farklı C ile oluşan tepeler farklılaşma yapma şeklinde bir bolluk deneyim yaprakları için çalışırken. Bu belki de hücresel kompozisyon ve yumru hücreleri içinde hücresel enkaz bir bolluk farklılıklar nedeniyle olduğunu (örn. nişasta depolama amyloplasts). Bu engeli aşmak için son zamanlarda Akış Sitometresi patates yumrular, ayırt Peaks'e edinme için daha güvenilir bir iletişim kuralı geliştirilmiştir. Her tepe hücrelerde sıklığı daha sonra farklı genotip veya bir yumru oluşturan farklı dokular için doğru endoreduplication düzeylerini hesaplamak için kullanılabilir. Değiştirilmiş protoplast ayıklama yöntemi14,15 antecedent istihdam Protokolü Akış Sitometresi11patates akrabalar, çeşitlerin ve doku16 içinde önemli farklılıklar gösterdi, daha önce açıklanan . Burada Ploitlik, doku ve yumru boyut bağlamlarda EI değerlendirerek ayrıntılı olarak iletişim kuralı mevcut.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Serological pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-676-10k</td>
			<td>(sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Aid XP (autopipettor)</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>4-000-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes (50 ml)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>(sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>111558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 ml)</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>111552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration unit (0.22&#181;m)(aPES)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>564-0020</td>
			<td>(sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration unit (0.45&#181;m)(aPES)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td>(sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase &#34;Onozuka R-10&#34;</td>
			<td>Yakult</td>
			<td></td>
			<td>contact company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme &#34;Onozuka R-10&#34;</td>
			<td>Yakult</td>
			<td></td>
			<td>contact company</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemicellulase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES buffer</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>172590250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>MP Biochemicals</td>
			<td>194854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (hexahydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M35-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (dihydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>423922500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>17263-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4170</td>
			<td>For flow cytometry preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonuclease A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5000</td>
			<td>For flow cytometry preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork borers with punch</td>
			<td>American Scientific</td>
			<td>2093-02</td>
			<td>For smapling desired tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16-31</td>
			<td>For smapling desired tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-920B</td>
			<td>For smapling desired tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>106um stainless steel mesh or other seive of same pore size</td>
			<td>New Jersey Wire Mesh Co.</td>
			<td></td>
			<td>contact company</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring endoreduplication by flow cytometry of isolated tuber protoplasts

Endoreduplication, bir hücrenin nükleer genom sonraki sitokinez olmadan çoğaltılması hücreleri artan DNA içeriği ile verimleri ve Hücresel boyutta uzmanlık, geliştirme ve artış ile ilişkilidir. Bitkiler, endoreduplication büyüme ve genişleme belirli doku ve organların kolaylaştırmak için gibi görünüyor. Bunlar arasında karbonhidrat depolama işlevini yerine getirmede önemli hücresel genişleme uğrar (Solanum tuberosum), patates yumru var. Böylece, endoreduplication nasıl yumrular karbon Bu bolluk karşılamak edebiliyoruz önemli bir rol oynayabilir. Ancak, yumrular kaba nükleer yalıtım metotlarından yol hücresel açması yaprakları ile etkin kullanılabilir yöntemleri yumru endoreduplication Index (EI) tahmini engellemektedir. Bu makale farklı genotip elde temsilcisi sonuçları gösteren ve yumru doku bölümlere yumru endoreduplication önceki yalıtım aracılığıyla değerlendirmek için bir teknik sunar. Protokolü'nün önemli sınırlamaları önceki lizis sonra numune hazırlama gibi örnekleri nispeten kısa ömrü için gerekli zaman ve reaktif maliyetlerdir. Protokol teknik varyasyona önemli olmakla birlikte, bu büyük özel hücreler nükleer izolasyon geleneksel yöntemler üzerinde bir gelişme gösterir. Olanakları enzim, Fiksajlar kullanımı ve diğer değişiklikler geri dönüşüm gibi iletişim kuralına iyileştirmeler için önerilmektedir.

Önceki imalatı
Önceki nesil patates yumrular, hangi genel Morfoloji şekil 1' de görüntülenen yinelenebilir Akış Sitometresi sonuçlar elde etmek gereklidir. Araştırmacılar özellikle sorun giderme gereklidir olay bu yüksek kaliteli önceki FCP ek önce üretilen emin olmak isteyebilirsiniz. Önceki çoğunluğu en az çıkıntılar (Şekil 2) küresel olmalı ve belki de yansıtıcı EI farklılıkları boyutu büyük ölçüde farklı olabilir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig2.jpg"> Şekil 2:, edinilen temsilcisi yaprak ve yumru önceki adım 4.4 Protokolü'nün. İzole önceki küresel ve plazma zarı sağlam ile simetrik olmalıdır. Yaprak (A-C) ve yumru (D, E) önceki yanı sıra boyutu endoreduplication farklı düzeylerde gösterebilir bir doku içinde farklılıkları arasındaki büyüklük farkı unutmayın. Amyloplasts yumru önceki içinde görünür ise yaprak önceki kloroplast içerir. Ölçek çubukları 1000 µm. = <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57134/57134fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Akış Sitometresi sonuçlarının değerlendirilmesi
Başarılı veya başarısız bir deney tepeler ve ayırma Akış Sitometresi çubuk genişliği üzerinden gauged. Ölçüm endoreduplication göreli çekirdeklerin her Peak bolluk hesaplama gerektirir gibi sadece varlığı ya da yokluğu doruklarına aralarında anlamlı sınırları çizmek için çok fazla gürültü ise yeterli değil. Şekil 3 araştırmacılar Akış Sitometresi scatter araziler ve çubuk grafikler karşılaşabileceğiniz sonuçları görüntüler. Başarısız örnekleri için olası nedenler tartışma içinde sunulmaktadır.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig3.jpg"> Şekil 3: temsilcisi sonuçları protoplast çekirdekleri sağlam Akış Sitometresi elde edilen ve ilik örnekleri bozulmuş. Sağlam çekirdeği(a)bozulmuş örnekleri (B) Peaks'e değiştirdi, geniş ve çakışan üsleri göstermek, ancak her uygun yazılımı kullanarak hücreler göreli bereket ölçmek için zirveleri arasında temiz ayrılık göster. Sağlam (C) ve (D) örnekleri bozulmuş scatterplots içinde siyah kutular nükleer olay çubuk grafikler ve olayların kümeleme için geçişi çubuk grafik doruklarına genişliğini yansıtılır gösterir. Kapıları dışında olaylar enkaz, ciddi bir şekilde bozulmuş çekirdeği veya diğer toplamları gösterir. PI-H rasgele ölçülür floresan yoğunluğuna karşılık gelir. Örnek yıkımı önlemek için sorun giderme yöntemleri metin içinde ele alınmıştır. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57134/57134fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Dokular arasında Endoreduplication farklar
Daha önce yumru ilik dokusu endoreduplication önemli ölçüde daha fazla düzeyde korteks doku16daha olduğunu bildirdi. Onaylamak ve bu üç farklı dokularda cv. çift endoreduplication düzeyde baktık genişletmek için: ilik, perimedullary parankimi ve korteks, örnek başına 2.000 geçişli olaylarla nüsha olarak çoğaltılır. Sonuçlarımız ilik dokusu hücre başına sırasıyla 1,79 ve 1.12 endocycles aracı ile kortikal doku daha önemli ölçüde daha fazla EI vardır bizim daha önceki gözlem doğruladı (p = 0,018; Öğrenci t-Testi). Biraz şaşırtıcı parankimi doku korteks için benzer bir profil gösterdi ve aynı zamanda ilik dokudan önemli ölçüde farklı (yani 1,14; = p = 0,013; Öğrenci t-Testi). Bu sonuçları şekil 4' te özetlenmiştir.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig4.jpg"> Şekil 4: üç dokularda cv. Superior Endoreduplication. Histogramlar yaprak(a), yumru korteks (B), (C) parankimi ve ilik (D) dokuların o çubuk grafikler hesaplanan EI değeri ile birlikte gösterilir. Her tepe oluşan hücre çekirdeği göreli bereket farklılıkları kolayca özellikle yaprak ve yumru dokular arasında belirgin. C-değerleri her zirve için de görüntülenir. PI-H rasgele ölçülür floresan yoğunluğuna karşılık gelir. EI yumru dokuların karşılaştırmalar burada yıldız işareti gösterir önemli fark E görüntülenir demek (p < 0,05) ve hata çubukları, standart sapma gösterir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57134/57134fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Yumru boyutu ve Ploitlik etkisi
Biz daha önce verilen bir genotip için farklı boyutu ama benzer vade yumrular EI16bir karşılık gelen fark göstermedi, bildirdi. Biz bu sonucu onaylamak gibi Ploitlik ve endoreduplication arasındaki ilişki değerlendirmek amaçladık. Bu deneme için kullandığımız üç farklı genotip dokudan parankimi üç çoğaltır: cv. çift (4 x), VT_SUP_19 (2 x) bir dihaploid olduğu cv. çift prickle tozlaşma17ve VT_SUP_19 tarafından bir iki katına dihaploid olan 4 x elde 18 VT_SUP_19 için isogenic. Biz çoğaltır küçük ve büyük (90-130 g) için bir dizi dahil (< 35 g) yumrular cv. yumrular için diğer iki genotip 90-130 g iken çift için. Yumrular tüm bitkiler tam vade sonunda Yani yetiştirilen sera üzerinden hasat bitkileri üst kısımları senesced vardı. Biz VT_SUP_19 ve onun progenitör çift arasında önemli bir fark gözlendi (p = 0.04); Ancak, VT_SUP_19 ve VT_SUP_19 arasında anlamlı bir fark vardı 4 x (p = 0,69). Bu büyük olasılıkla bir genetik bileşeni olarak maskesiz genomik azaltma tarafından endoreduplication için ise bu Ploitlik, en az bu arka planda dikte edilir değil olduğunu gösterir. Son olarak, biz bir kez daha büyük ve küçük cv. arasında önemli bir fark yoktur üstün yumrular şekil 5' te gösterildiği gibi gözlenen.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57134/57134fig5.jpg"> Şekil 5: Endoreduplication yumrular cv. çift ve diploid (VT_Sup_19) ve tetraploid, iki farklı boyutta (VT_Sup_19 4 x) türevleri. Çubuk grafik için küçük ortalama gösterir (< 35 g) ve büyük (90-130 g) cv. üstün yumrular gibi büyük (90-130 g) yumrular dihaploid VT_SUP_19 ve isogenic iki kat dihaploid VT_SUP_19 4 x. Önemli farklılıklar (p < 0,05) bağlantı mektup rapor tarafından belirtilir. Hata çubukları standart sapma tasvir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57134/57134fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts at JoVE.com

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication izole yumru önceki Akış Sitometresi tarafından ölçme

Burada açıklanan protokol endoreduplication yumrular patates (Solanum tuberosum) içinde ölçmek için bir yöntemdir. Gürültü ve enkaz aşağı akım akış sitometrik analizinde azaltmak için plasmolysis ve işgal ayıklama adımları içerir.

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

measuring-endoreduplication-flow-cytometry-isolated-tuber

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K Görüntüleme.  Virginia Tech. Burada açıklanan protokol endoreduplication yumrular patates (Solanum tuberosum) içinde ölçmek için bir yöntemdir. Gürültü ve enkaz aşağı akım akış sitometrik analizinde azaltmak için plasmolysis ve işgal ayıklama adımları içerir.

Video: Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP FCM: Sitometrisi ile Algılandı Immunoprecipitation

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Biyoloji

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Akış Sitometri Plazma Membran GLUT4 Translokasyon Kantitatif Ölçüm

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Fare Mayotik Hücreler Sitometrisi Arıtma

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

Metabolik Etiketleme ve Flow Sitometri ile Hücre Döngüsü İlerleme Kinetik Ölçüm

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Ozmotik Su Geçirgenliği Katsayısı (P Ölçme<sub&gt; F</sub&gt;) Küresel Hücreleri: Bir Örnek olarak İzole Bitki protoplastlan

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Sitometrisi ile Böbrek Hücrelerine sitozolik kalsiyum Ölçümleri

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

İzole Mitokondri Akış Sitometrisi ile Dış Zar Proteinleri imüno

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

LED Thermo Akışı - Akım Sitometrisi ile optogenetics birleştiren

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Spektral Sitometrisi ile Katı Dokular İzole Hücre Cezalar Analizi

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...